DE69401661T2

DE69401661T2 - Nukleinsaeure-analog testverfahren

Info

Publication number: DE69401661T2
Application number: DE69401661T
Authority: DE
Inventors: Christopher John Stanley
Original assignee: PNA Diagnostics ApS Denmark
Current assignee: PNA Diagnostics ApS Denmark
Priority date: 1993-06-02
Filing date: 1994-05-31
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2014-06-01
Also published as: EP0701627A1; JP2842694B2; WO1994028171A1; ES2098948T3; AU6802994A; DK0701627T3; GB9311386D0; JPH08510384A; EP0701627B1; US5912145A; DE69401661D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Analysenverfahren unter Beteiligung von Nucleinsäure-Analoga, mit denen sich quantitative oder halbquantitative Bestimmungen derartiger Analoga oder Nucleinsäure-Sequenzen, an welche sie hybridisieren, vornehmen lassen.
Die Anwendung von Nucleinsäure-Amplifikationstechniken ist heute weit verbreitet. Dazu gehören die "PCR"-Methoden (Polymerase-Kettenreaktion), die in EP-A-0 200 362 und EP A-0 201 184 beschrieben sind und bei denen es sich um die Technik handelt, die am weitverbreitetsten angewandt wird, aber auch die "LCR" (Ligase-Kettenreaktion), die in EP-A- 0 320 308 beschrieben ist, die sogenannte "NASBA"- oder "3SR"-Technik, die in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87, S. 1874-1878, März 1990, und in Nature, Bd. 350, Nr. 6313, S. 91-92, 7. März 1991, beschrieben ist, sowie das in "Nucleic Acid Research", Bd. 20, S. 1691-1696 beschriebene "SDA"-Verfahren.
Es gibt jetzt eine Reihe von Strategien, um quantitative Informationen über Amplifikationssysteme wie etwa die Polymerase-Kettenreaktion zu erhalten. Beim einfachsten Verfahren wird die durch die Testprobe erzeugte Menge an amplifizierter DNA direkt mit einem Satz von Standardreaktionen verglichen, die mit bekannten Mengen der gleichen DNA vorbereitet werden. Es wurde gezeigt, daß eine lineare Beziehung zwischen der in der Probe vorhandenen DNA-Menge und der Menge an Amplifikationsprodukt besteht, das schließlich beim PCR-Assay gebildet wird. Da jedoch der PCR-Prozeß vom Wesen her exponentiell ist, bedeutet dies, daß geringe Unterschiede im Wirkungsgrad der Amplifikation zwischen dem Proberöhrchen und den anderen Röhrchen, welche die bekannten Mengen an DNA enthalten, zu großen und nicht vorhersagbaren Unterschieden in der Ausbeute an Endprodukt führen (Gilliland et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2725-2729). Ein derartiger direkter Vergleich zwischen der Menge an PCR-Produkt aus der Probe und aus den Röhrchen mit den Standards ist daher grundsätzlich fehlerhaft. Zur Lösung dieses Problems wurde eine Reihe alternativer Verfahren vorgeschlagen. Dazu gehört die Anwendung einer Grenzverdünnung der Probe (Thang et al. (1991) AIDS 5, 678- 681) oder die Co-Amplifikation innerer oder externer Standards (Kellog et al. (1990) Anal. Biochem. 189, 202- 208). Das Verfahren der Grenzverdünnung ist eine recht einfache Strategie, bei der eine Poisson-Verteilungsanalyse der positiven Reaktionen angewandt wird, um die Menge an Zielsequenz in der Probe zu berechnen. Das Verfahren der Grenzverdünnung weist eine grundsätzliche Einschränkung auf, da die lineare Beziehung, die zwischen der Anfangsmenge der Matrizen-DNA in der Probe und der erhaltenen Menge an Amplifikationsprodukt nur innerhalb eines begrenzten Bereichs der Menge an Ausgangs-DNA beibehalten wird. Daher ist die Methode sehr ungenau, wenn Proben untersucht werden, die sehr unterschiedliche Mengen an Ziel-DNA enthalten. Die alternativen Verfahren der Co- Amplifikation können insofern einen verläßlicheren Ansatz bereitstellen, als sie auf der Messung des Verhältnisses von Ziel-DNA und einem co-amplifizierten Standard im gleichen Röhrchen beruhen. Allerdings gibt es auch hier immer noch eine Reihe von Schwierigkeiten. Die Co- Amplifikation von inneren Standards wie etwa ubiquitär exprimierten Genen, die ebenfalls in der Proben-DNA vorhanden sind, wird hinsichtlich ihrer Brauchbarkeit eingeschränkt durch den unterschiedlichen Amplifikationswirkungsgrad, der zwischen Ziel- und Vergleichssequenz besteht. Dadurch werden die relativen Mengen der erhalten Produkte in unkontrollierbarer Weise beeinflußt. Das alternative Verfahren der Co-Amplifikation einer externen Matrize, die eine vergleichbare Länge und die gleichen Primer- Erkennungssequenzen wie die Ziel-DNA besitzt, stellt bislang die erfolgreichste Strategie für einen quantitativen PCR-Assay dar (Gilliland et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 2725-2729), weist aber noch immer drei größere Nachteile auf. Das erste Problem ist, daß das Produkt aus der Ziel-DNA und die co-amplifizierten Vergleichsstandards getrennt werden müssen, normalerweise durch Gelelektrophorese, und die getrennten Produkte zur Bestimmung des Produktverhältnisses quantifiziert werden müssen. Normalerweise werden vier Reaktionen oder mehr mit verschiedenen Verdünnungen der externen Konkurrenz-Matrize durchgeführt, und die Produkte aus all diesen Reaktionen müssen erfaßt werden, um eine Eichkurve zu ergeben. Daher ist der Ansatz der externen kompetitiven PCR auf Meßverfahren beschränkt, bei denen die verschiedenen PCR- Fragmente getrennt werden können, wodurch sich das Verfahren weiter kompliziert und verteuert. Der zweite Faktor, der die Brauchbarkeit des Ansatzes der externen kompetitiven PCR einschränkt, ist, daß er sich nicht anwenden läßt, wenn die PCR-Produkte direkt ohne vorherige Trennung nachzuweisen sind; z.B. werden bei einem üblicherweise angewandten Verfahren Biotin-markierte PCR- Produkte durch Hybridisieren an eine Abfangsonde abgefangen, die an der Oberfläche einer Mikrotiterplattenmulde immobilisiert ist, und anschließend mit Hilfe einer Avidin-Enzym-konjugierten Sonde nachgewiesen, was zur Erzeugung einer Färbung in der Mulde führt. Für die Unterscheidung zwischen Kontroll- und Testproben ist bei diesem Assay-Typ die Verwendung zusätzlicher Mulden und verschiedener Abfangsonden erforderlich. Der dritte Nachteil des Ansatzes der externen kompetitiven PCR ist, daß der externe Standard sorgfältig ausgearbeitet sein muß, damit er exakt die gleichen Amplifikationseigenschaften wie die Ziel-DNA aus der Probe aufweist. Dies ist nicht einfach zu erreichen, und es erfordert einiges an Können und Aufwand, solch einen externen Standard aufzubauen, und jeder Assay braucht einen neuen externen Standard, was die Entwicklungskosten der Analyse stark in die Höhe treibt.
WO-A-93/25706 (veröffentlicht nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung) offenbart, daß bestimmte Nucleinsäure-Analoga, die imstande sind, mit hoher Affinität an Nucleinsäuren zu hybridisieren, zur Hemmung von Nucleinsäure-Amplifikationsprozessen wie etwa PCR eingesetzt werden können. Die bevorzugten Nucleinsäure- Analoga sind in WO-A-92/20703 beschrieben.
Es ist jetzt erkannt worden, daß durch die Abhängigkeit einer erfolgreichen Hemmung eines derartigen Nucleinsäure- Amplifikationsprozesses von der Menge des vorhandenen Nucleinsäure-Analogons ein Hilfsmittel zum Herleiten von Informationen über die Menge einer in einer Probe vorhandenen Nucleinsäure oder über die Menge eines vorhandenen Nucleinsäure-Analogons bereitgestellt wird.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Analysenverfahren bereit, umfassend den Versuch der Durchführung eines Nucleinsäure-Amplifikationsprozesses in Gegenwart eines Nudeinsäure-Analogons, das in hinreichender Menge den Amplifikationsprozeß durch selektive Wechselwirkung mit einer vorhandenen Nucleinsäure-Spezies hemmt, wobei die Menge der Nucleinsäure oder die Menge des Nucleinsäure- Analogons, nicht aber beide, bekannt sind oder später anderweitig bestimmt werden, durchzuführen, Bestimmung des Erfolgs, des Fehlschlags oder des Ausmaßes des Erfolgs des Amplifikationszprozesses und dadurch Herleitung von Informationen über die Menge der vorhandenen Nucleinsäure- Spezies oder des Nucleinsäure-Analogons, wobei diese Nucleinsäure-Spezies eine Matrize für die Amplifikation ist.
Meist wird davon ausgegangen, daß es die Nucleinsäure- Spezies sein wird, die in unbekannter Menge vorhanden ist, und diese ist vorzugsweise eine Matrize für die Amplifikation.
Vorzugsweise umfaßt das Verfahren des weiteren das einoder mehrmalige Wiederholen des versuchten Assay-Prozesses mit einer oder mehreren verschiedenen Mengen des Nucleinsäure-Analogons oder einer oder mehreren Verdünnungen der Probe, um so Informationen über die relativen Mengen derselben herzuleiten, die vorhanden sein müssen, um den Amplifikationsprozeß zu hemmen.
Vorzugsweise wird eine Eichkurve erstellt, indem der gleiche Amplifikationsprozeß mit einer Reihe bekannter relativer Mengen an Nucleinsäure-Spezies und Nucleinsäure- Analogon durchgeführt wird.
Unter Verwendung bekannter Mengen der Nucleinsäure läßt sich somit eine Eichkurve der Amplifikationsproduktmenge bei einer bestimmten Matrizennucleinsäure-Konzentration gegen die Konzentration des Nucleinsäure-Analogons erstellen. Der Assay-Prozeß kann dann mit einer Probe durchgeführt werden, die eine unbekannte Menge an Nucleinsäure enthält, wobei vorzugsweise gleichzeitig eine Reihe von Assay-Durchläufen bei unterschiedlichen Verdünnungen des Nucleinsäure-Analogons durchgeführt wird, um die Verdünnung zu bestimmen, bei welcher der Amplifikationsprozeß vom Erfolg in den Fehlschlag übergeht.
Dadurch ergibt sich eine halbquantitative Bestimmung der ursprünglich vorhandenen Menge an Nucleinsäure, da die Menge an Nucleinsäure-Analogon, die für die Hemmung der Amplifikation erforderlich ist, proportional zur Menge vorhandener Matrizen-Nucleinsäure ist. Findet man also, daß eine Eichkurve auf der Grundlage von x ng Plasmid bei einer Konzentration an Nucleinsäure-Analogon von y µM von der erfolgreichen Amplifikation in den Fehlschlag übergeht, so enthält eine Probe, die eine Konzentration an Nucleinsäure- Analogon von 2y µM zur Hemmung erfordert, ungefähr 2x ng Matrize.
Es sind eine Reihe bedeutender Vorteile, die durch dieses neue Verfahren bereitgestellt werden, das wir als Quantifizierung durch Inhibierung (QI) bezeichnen. Zunächst ist das QI-Verfahren kein Verhältnisansatz, und damit ist es nicht notwendig, einen inneren Standard für die Amplifikation zu suchen oder mühselig einen externen Standard aufzubauen. Bei einem QI-PCR-Verfahren beispielsweise kann das Nucleinsäure-Analogon gegen die Primer gerichtet sein, und dies ist sehr einfach zu erreichen, da die Sequenzen bereits bekannt sind. Beim QI-Verfahren entstehen nicht zwei Produkte, die getrennt und quantifiziert werden müssen, wie es beim Ansatz des externen Standards der Fall ist. Daher ist das QI-Verfahren gut für die beliebteren Methoden des Produktnachweises wie etwa Hybridisierung in einer Mikrotiterplattenmulde geeignet. Beim QI-Verfahren ist keine Verdünnung der Probe erforderlich, und es ist keine komplizierte mathematische Aufbereitung der Ergebnisse notwendig. Daher ist das QI-Verfahren der Grenzverdünnungsmethode weit überlegen. Das QI-Verfahren bleibt durch die Schwankungen des Amplifikationswirkungsgrads in den einzelnen Röhrchen weitgehend unbeeinflußt, da die Ergebnisse allein durch Vergleich mit einem Schwellenwert bewertet werden.
Das QI-Verfahren ist gut geeignet für halbquantitative Messungen. Je nach gewähltem Konzentrationsbereich des Nucleinsäure-Analogons kann der dynamische Bereich sehr groß oder sehr klein sein. Beim QI-Verfahren kann eine einzige Konzentration eines Inhibitors angewandt werden, um eine einfache JA/NEIN-Antwort zu ergeben, oder viele Konzentrationen in zahlreichen Mulden, um ein nahezu quantitatives Ergebnis zu erbringen. Bezüglich falscher Einordnung der Konzentration der DNA-Probe hängt die Ungenauigkeit des QI-Verfahrens ausschließlich von Schwankungen beim Produkt-Amplifikationsprozeß am Schwellenpunkt ab.
Vorzugsweise kann das Nucleinsäure-Analogon an eine Nucleinsäure komplementärer Sequenz hybridisieren, um ein Hybrid zu bilden, das stabiler gegen Denaturierung durch Wärme ist als ein Hybrid zwischen dem herkömmlichen Deoxyribonucleotid, das in der Sequenz dem Analogon entspricht, und der Nucleinsäure.
Vorzugsweise ist das Nucleinsäure-Analogon eine Peptidnucleinsäure, bei der das Gerüst ein Polyamid-Gerüst ist, wobei jeder Ligand direkt oder indirekt an ein Aza-Stickstoff-Atom im Gerüst gebunden ist, und die Liganden tragenden Stickstoff-Atome vorwiegend durch 4 bis 8 dazwischenliegende Atome voneinander getrennt sind.
Vorzugsweise kann das Nucleinsäure-Analogon an eine doppelsträngige Nucleinsäure hybridisieren, in der ein Strang eine zu dem Analogon komplementäre Sequenz aufweist, um so den anderen Strang von diesem einen Strang zu verdrängen.
Vorzugsweise hat das Nucleinsäure-Analogon die allgemeine Formel 1: Formel 1
worin:
n wenigstens 2 ist;
jedes der L¹ bis Ln unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkanoyl, natürlich vorkommenden Nucleobasen, nicht natürlich vorkommenden Nucleobasen, aromatischen Einheiten, DNA-intercalierenden Agenzien, Nucleobase-bindenden Gruppen, heterocyclischen Einheiten und Reporter-Liganden, doch ist normalerweise wenigstens ein L eine Nucleobase-bindende Gruppe, etwa eine natürlich vorkommende Nucleobase, und vorzugsweise sind wenigstens 90% der L-Gruppen Nucleobase-bindende Gruppen; jedes der C¹ bis Cn (CR&sup6;R&sup7;)y ist, wobei R&sup6; Wasserstoff ist und R&sup7; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Seitenketten natürlich vorkommender α-Aminosäuren, oder R&sup6; und R&sup7; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub2;-C&sub6;)-Alkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkoxy, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkylthio, NR³R&sup4; und SR&sup5;, wobei R³ und R&sup4; wie nachstehend definiert sind und R&sup5; Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl, hydroxy-, alkoxy- oder alkylthiosubstituiertes (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl ist, oder R&sup6; und R&sup7; zusammengenommen ein alicyclisches oder heterocyclisches System vervollständigen;
jedes der D¹ bis Dn (CR&sup6;R&sup7;)z ist, wobei R&sup6; und R&sup7; wie vorstehend definiert sind;
y und z jeweils null oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind, wobei die Summe y + z 2 bis 10 ist (vorzugsweise größer als 2, und meistbevorzugt y und z jeweils 1 oder 2 sind);
G¹ bis Gn-1 jeweils -NR³CO-, -NR³CS-, -NR³SO- oder -NR³SO&sub2;- in beiden Orientierungen sind, wobei R³ wie nachstehend definiert ist;
jedes der A¹ bis An und B¹ bis Bn so ausgewählt sind, daß:
(a) A eine Gruppe der Formel (IIa), (IIb), (IIc) oder (IId) ist, und B N oder R³N&spplus; ist; oder
(b) A eine Gruppe der Formel (IId) ist, und B CH ist; Formel
worin:
X O, S, Se, NR³, CH&sub2; oder C(OH&sub3;)&sub2; ist;
Y eine Einfachbindung, 0, 5 oder NR&sup4; ist;
p und q jeweils null oder ganze Zahlen von 1 bis 5 sind, wobei die Summe p+q nicht größer als 10 ist;
r und 5 jeweils null oder ganze Zahlen von 1 bis 5 sind, wobei die Summe r+s nicht größer als 10 ist;
R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, das hydroxy- oder alkoxy- oder alkylthiosubstituiert sein kann, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Amino und Halogen; und
R³ und R&sup4; jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, hydroxy- oder alkoxy- oder alkylthiosubstituiertem (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio und Amino;
Q -CO&sub2;H, -CONR'R", -SO&sub3;H oder -SO&sub2;NR'R" oder ein aktiviertes Derivat von -CO&sub2;H oder -SO&sub3;H ist; und
I -NHR'R" ist, wobei R' und R" unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Schutzgruppen für Amino, Reporter-Liganden, intercalierenden Agenzien, Chelatbildnern, Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Steroiden, Nucleosiden, Nucleotiden, Nucleotiddiphosphaten, Nucleotidtriphosphaten, Oligonucleotiden, darunter sowohl Oligoribonucleotide als auch Oligodeoxyribonucleotide, Oligonucleosiden sowie löslichen und nichtlöslichen Polymeren.
Mehrbevorzugt umfaßt das Nucleinsäure-Analogon eine Verbindung der allgemeinen Formel III, IV oder V: Formel III Formel IV Formel V
worin:
L jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff 1 Phenyl, heterocyclischen Einheiten, natürlich vorkommenden Nucleobasen und nicht natürlich vorkommenden Nucleobasen;
R¹ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten natürlich vorkommender α-Aminosäuren;
n ein ganze Zahl größer 1 ist;
k, l und m jeweils unabhängig null oder ein ganze Zahl von 1 bis 5 sind;
p jeweils null oder 1 ist;
Rh OH, NH&sub2; oder -NHLysNH&sub2; ist; und
Ri H oder -COCH&sub3; ist.
Techniken für die Synthese bevorzugter Nucleinsäure-Analoga finden sich in WO-A-92/20703.

Beispiel 1

Die PNA T&sub1;&sub0;-LysNH&sub2; wurde synthetisiert wie in M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen und R.H. Berg, (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114, 1895-1897, und M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen und R.H. Berg, (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114, 9677-9678. Das Plasmid pT10KS wurde aufgebaut durch Klonieren der komplementären Oligonucleotide 5'-GATCCT&sub1;&sub0;G und 5'-GATCCA&sub1;&sub0;G in die betreffenden Stränge an der BamHI- Stelle des BluescriptKS+-Plasmids (Stratagene). Das Kontrollplasmid pCKS wurde aufgebaut durch Klonieren eines 99 bp-PCR-Fragments (ohne Zielorte für die in diesem Beispiel verwendete PNA) in die SmaI-Stelle des BluescriptKS+-Plasmids. Unter Anwendung der üblichen Techniken wurden Plasmide aus selektierten Klonen von rekombinantem E. coli-JM103 isoliert, durch Schwebedichte- Zentrifugation in CsCl-Gradienten gereinigt und mit Hilfe des Dideoxy-Verfahrens sequenziert.
Bei den PCRS wurden die folgenden Oligonucleotid-Primer verwendet: reverser Primer (5'-CACACAGGAAACAGCTATGAC - SEQ1) und Vorwärts-Primer (5'-GTAAAACGACGGCCAGT - SEQ2). Die PCR-Amplifikationen wurden in einem Volumen von 50 µl durchgeführt, enthaltend 1 ng eines jeden Plasmids, 0,2 µM eines jeden Primers, 200 µM DNTP, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 (bei 25ºC), 10 mM KCl und 3 mM MgCl&sub2;.
Die Konzentrationen an eingesetzter PNA betrugen 0 µM, 13,2 µM, 6,6 µM, 3,2 µM, 1,6 µM, 0,8 µM, 0,4 µM und 0,2 µM.
Die PCRS wurden mit 2 Tropfen Paraffinöl überschichtet und 2 Minuten lang bei 90ºC inkubiert, ehe der Amplifikationsprozeß durch Zugabe von 3 E Stoffel-Polymerase (Perkin Eimer Cetus) eingeleitet wurde. Bei allen Experimenten wurde ein LEP-Amplifikationsgerät (IgG Biotech) verwendet, und die Standard-PCR-Durchlaufprofile waren 96ºC, 2 min - 55 ºC, 3 min - 35ºC, 1 min - 65ºC, 2 min - 35 Durchläufe.
Um sicherzustellen, daß die Bildung der PNA/DNA-Komplexe vor dem Binden und Verlängern der PCR-Primer eintritt, wurde der normale Dreistufen-PCR-Zyklus erweitert um einen separaten PNA-Reassoziationsschritt bei 55ºC, einer Temperatur, die deutlich oberhalb der Tm der PCR-Primer liegt.
Die aus dem PCR-Prozeß resultierenden Produkte wurden durch Gelelektrophorese getrennt und unter Anwendung der üblichen Techniken mit Ethidiumbromid angefärbt. Vom angefärbten Gel wurde eine Polaroid -Aufnahme gemacht, und die Intensität der Banden wurde durch visuelle Prüfung ausgewertet.
Tabelle 1 zeigt das Ergebnis der PCR-Hemmung in Gegenwart steigender Mengen der PNA T&sub1;&sub0;LysNH&sub2;. Es wurden die beiden vorstehend beschriebenen Plasmid-Matrizen verwendet, nämlich das pT10KS-Plasmid, das die Amplifikation eines einen A&sub1;&sub0;-Zielort enthaltenden 246 bp-Fragments steuert, und das Kontroll-Plasmid pCKS, dae die Amplifikation eines Nicht-Zielfragments mit 329 bp steuert.
Die Fähigkeit zur Blockierung der PCR ist unter Anwendung der folgenden Schreibweise angegeben: ++ = PCR-Produkt; + = etwas PSR-Produkt; und - = kein PCR-Produkt; NG = nicht geprüft. Tabelle 1
Wenn die PNA T&sub1;&sub0;LysNH&sub2; entweder fehlt oder in einer Konzentration gleich oder unter 1,6 µM vorhanden ist, dann steuert das pT10KS-Plasmid die Synthese des erwarteten 246 bp-PCR-Fragments. Bei einer Konzentration von oder etwa 3,2 µM PNA T&sub1;&sub0;LysNH&sub2; jedoch wird kein Produkt gebildet. Das Fehlen des Produkts liegt nicht an einer unspezifischen hemmenden Wirkung der PNA T&sub1;&sub0;LysNH&sub2; auf die PCR, da die PNA T&sub1;&sub0;LysNH&sub2; selbst bei der höchsten angewandten Konzentration (13,2 µM) die Amplifikation des erwarteten 329 bp-Fragments aus dem pCKS-Kontrollplasmid nicht hemmt. Somit ist ersichtlich, daß die PNA T&sub1;&sub0;LysNH&sub2; die Amplifikation ihrer zugehörigen Ziel-DNA in einer sequenzspezifischen Weise verhindern kann. Die Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung ist recht steil.
Bei 0,8 µM PNA wird praktisch keine Hemmung beobachtet, während 75% Hemmung bei 1,6 µM eintritt, und vollständige Hemmung bei 3,2 µM zu erkennen ist.
Mit einer Probe, die eine unbekannte Menge des pT10KS-Plasmids enthält, kann das vorstehende Verfahren wiederholt werden, mit dem Versuch, eine Verdünnung des Probenplasmids zu finden, bei der das Profil der Hemmung mit den vorstehend angewandten PNA-Konzentrationen mit den in Figur 1 gezeigten Ergebnissen übereinstimmt, womit die Konzentration des Plasmids ermittelt ist.
Mehrbevorzugt allerdings kann einfach die Menge an Matrize berechnet werden, indem man die kritische PNA-Menge in µM findet, die zur Hemmung der Amplifikation erforderlich ist, und auf die Proportionalität zwischen dieser und der Menge an Matrizen-DNA in ng mit dem aus den obigen Ergebnissen abgeleiteten Faktor von 1 ng/3,2 µM zurückgreift.

Beispiel 2

Das Plasmid und die Primer, die bei diesem Beispiel verwendet wurden, waren wie folgt:

Plasmid p62-1

Das Plasmid wurde in zwei Schritten aufgebaut. Zuerst wurden die komplementären Oligonucleotide (5'-GATCCTGTACGTCACAACTA-3' - SEQ3 und 5'-GATCTAGTTGTGACGTACAG-3' - SEQ4), welche die Erkennungs sequenz für PNA62 (H-TGTACGTCACAACTA-Gly-NH&sub2;) enthalten, in die BamHI-Stelle des Plasmids PUC19 kloniert, um p62 zu ergeben. Zum zweiten wurde ein PstI/HindIII-Fragment des E. coli λ-Phagengenoms mit 556 bp in die PstI/HindIII-Stelle von p62 kloniert, um p62-1 zu ergeben.

Primer

Es wurden zwei Primer mit den folgenden Sequenzen synthetisiert: der reverse Primer 5'-GAAACAGCTATGAC-3' - SEQ5 und der Vorwärts-Primer 5'-TGTACGTCACAACTA-3' - SEQ6 (die Sequenz des Vorwärts-Primers ist identisch mit der Sequenz von PNA62). Bei der PCR steuern der Vorwärts- und der reverse Primer zusammen mit dem Plasmid p62-1 die Amplifikation eines 659 bp-Fragments.
Die PCRS wurden so angesetzt, daß sie 1 ng, 5 ng oder 25 ng Plasmid p62-1, reversen und Vorwärts-PCR-Primer und verschiedene Konzentrationen an PNA62 enthielten. Jede PCR (50 µl) enthielt 200 µM dNTP, 10 mM Tris-HCl, pH 9,9 (20ºC), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01% Gelatine, 0,1% Triton X-100, 1 E Supertag-Enzym (Stratagene), 10 pmol eines jeden der beiden POR-Primer und PNAs und p62-1 wie nachstehend in Tabelle 2 angegeben. Die POR-Bedingungen waren 96ºC, 2 min - 65ºC, 2 min - 35ºC, 30 s - 70ºC, 2 min - 30 Durchläufe. Die Fähigkeit zur Blockierung der PCR ist unter Anwendung der folgenden Schreibweise angegeben: ++ = PCR-Produkt; + = etwas PCR-Produkt; und - = kein PCR-Produkt. Tabelle 2
Bei Verwendung von 1 ng Plasmid wurde die PNA-Konzentration zur wirksamen Blockierung der POR zu 65 nM ermittelt. Bei Erhöhung der Menge an Zielplasmid um das Sfache (von 1 auf 5 ng) erhöhte sich die zur wirksamen Blockierung erforderliche Konzentration proportional auf 325 nM. Gleichermaßen erforderte eine Erhöhung des anfänglichen Zielplasmids um das 25fache eine 25fache Erhöhung der PNA (1,63 µM), damit wirksame Blockierung eintreten konnte. Somit kann das QI- oder PCR-Blockierungsverfahren angewandt werden, um die Anfangsmenge an Zielsubstanz in der Reaktion zu quantifizieren.
Wäre der quantitative Plasmid-Gehalt der 5 ng enthaltenden Probe unbekannt gewesen, so hätte er ohne weiteres aus den mit 1 ng Plasmid erhaltenen, als Eichkurve verwendeten Ergebnissen und der für wirksame Blockierung der Amplifikation der unbekannten Probe (5 ng Plasmid) gefundenen Abschnittszahl für 65 mM ermittelt werden können.
Es sei darauf hingewiesen, daß bei Beispiel 1 und Beispiel 2 nur ein Nucleinsäure-Analogon eingesetzt wird und dieses nur auf eine PCR-Primerstelle gerichtet ist. Daher findet bei diesen Experimenten ein linearer, durch den nichtgehemmten Primer angetriebener Amplifikationsprozeß statt. Ein solches linear amplifiziertes Material läßt sich wegen der Empfindlichkeitsgrenzen nicht mit Hilfe der hier beschriebenen gelelektrophoretischen Methoden nachweisen. Um vollständige Hemmung eines PCR-Prozesses zu erreichen, müssen zwei Nucleinsäure-Moleküle eingesetzt werden, die entweder auf beide Primer oder auf beide Stränge der doppelsträngigen Ziel-Nucleinsäure gerichtet sind. Dies ist von Bedeutung, wenn empfindlichere Nachweismethoden als Gelelektrophorese/Anfärben mit Ethidiumbromid angewandt werden sollen.
Die Erfindung wurde zwar anhand der in den Beispielen erläuterten bevorzugten Ausführungsformen beschrieben, doch sind viele Änderungen und Abwandlungen innerhalb des Umfangs der Erfindung möglich.
Zur Erfindung gehört auch ein Kit für den Einsatz bei der Quantifizierung einer Menge an Ziel-Nucleinsäure in einer Probe, umfassend Reagenzien zur Verwendung bei einem Amplifikationsprozeß, um eine Sequenz in der Nucleinsäure zu amplifizieren, und wenigstens zwei nichtkomplementäre Nucleinsäureanalogon-Sequenzen zur jeweiligen Hybridisierung an die betreffende zu amplifizierende Sequenz in einem Strang der Ziel-Nucleinsäure und einen dazu komplementären Nucleinsäure-Strang, um deren Amplifikation zu verhindern.
Die vorstehend erwähnten Nucleinsäure-Sequenzen finden sich ausführlich in den folgenden Protokollen.

Claims

1. Analysenverfahren, umfassend den Versuch einen Nucleinsäure-Amplifikationsprozeß in Gegenwart eines Nucleinsäure-Analogons, das in hinreichender Menge den Amplifikationsprozeß durch selektive Wechselwirkung mit einer vorhandenen Nucleinsäure-Spezies hemmt, wobei die Menge der Nucleinsäure oder die Menge des Nucleinsäure- Analogons, nicht aber beide, bekannt sind oder später anderweitig bestimmt werden, durchzuführen, Bestimmung des Erfolgs, des Fehlschlags oder des Ausmaßes des Erfolgs des Amplifikationszprozesses und dadurch Herleitung von Informationen über die Menge der vorhandenen Nucleinsäure-Spezies oder des Nucleinsäure- Analogons, wobei diese Nucleinsäure-Spezies eine Matrize für die Amplifikation ist.

2. Analysenverfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure-Spezies in unbekannter Menge vorliegt.

3. Analysenverfahren nach Anspruch 2, des weiteren umfassend das ein- oder mehrmalige Wiederholen des beabsichtigten Assay-Prozesses mit einer oder mehreren verschiedenen Mengen des Nucleinsäure-Analogons, um so Informationen über die Menge desselben herzuleiten, die vorhanden sein müssen, um den Amplifikationsprozeß zu hemmen.

4. Analysenverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäure-Analogon an die gleiche Stelle der Nucleinsäure-Spezies hybridisiert, an die ein Primer hybridisieren kann.

5. Analysenverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäure-Analogon einen polymeren Strang umfaßt, der eine Sequenz von Liganden einschließt, die an ein Polyamid-, Polythioamid-, Polysulfinamid- oder Polysulfonamid-Gerüst gebunden sind, welches aus verknüpften Gerüsteinheiten besteht, wobei das Analogon imstande ist, an eine Nucleinsäure komplementärer Sequenz zu hybridisieren.

6. Analysenverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäure-Analogon an eine Nucleinsäure komplementärer Sequenz hybridisieren kann, um ein Hybrid zu bilden, das stabiler gegen Denaturierung durch Wärme ist als ein Hybrid zwischen dem herkömmlichen Deoxyribonucleotid, das in der Sequenz dem Analogon entspricht und der Nucleinsäure.

7. Analysenverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäure-Analogon eine Peptidnucleinsäure ist, bei der das Gerüst ein Polyamid- Gerüst ist, wobei jeder Ligand direkt oder indirekt an ein Aza-Stickstoff-Atom im Gerüst gebunden ist, und die Liganden tragenden Stickstoff-Atome im Gerüst vorwiegend durch 4 bis 8 dazwischenliegende Atome voneinander getrennt sind.

8. Analysenverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäure-Analogon in einer Weise an eine doppelsträngige Nucleinsäure hybridisieren kann, in der ein Strang eine zu dem Analogon komplementäre Sequenz aufweist, so daß der andere Strang von diesem einen Strang verdrängt wird.

9. Analysenverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäure-Analogon die allgemeine Formel 1 aufweist: Formel 1

worin:

n wenigstens 2 ist;

jedes der L¹ bis Ln unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkanoyl, natürlich vorkommenden Nucleobasen, nicht natürlich vorkommenden Nucleobasen, aromatischen Einheiten, DNA-intercalierenden Agenzien, Nucleobasebindenden Gruppen, heterocyclischen Einheiten und Reporter-Liganden, wobei die L¹ bis Ln so ausgewählt sind, daß das Nucleinsäure-Analogon an die Nucleinsäure-Spezies hybridisieren kann;

jedes der C¹ bis Cn (CR&sup6;R&sup7;)y ist, wobei R&sup6; Wasserstoff ist und R&sup7; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Seitenketten natürlich vorkommender a-Aminosäuren, oder R&sup6; und R&sup7; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub2;-C&sub6;)-Alkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkoxy, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkylthio, NR³R&sup4; und SR&sup5;, wobei R³ und R&sup4; wie nachstehend definiert sind und R&sup5; Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl, hydroxy-, alkoxy- oder alkylthiosubstituiertes (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl ist, oder R&sup6; und R&sup7; zusammengenommen ein alicyclisches oder heterocyclisches System vervollständigen;

jedes der D¹ bis Dn (CR&sup6;R&sup7;)z ist, wobei R&sup6; und R&sup7; wie vorstehend definiert sind;

y und z jeweils null oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind, wobei die Summe y + z 2 bis 10 ist;

G¹ bis Gn-1 jeweils -NR³CO-, -NR³CS-, -NR³SO- oder NR³SO&sub2;in beiden Orientierungen sind, wobei R³ wie nachstehend definiert ist;

jedes der A¹ bis An und B¹ bis Bn so ausgewählt sind, daß

(a) A eine Gruppe der Formel (IIa), (IIb), (IIc) oder (IId) ist, und B N oder R³N&spplus; ist; oder

(b) A eine Gruppe der Formel (IId) ist, und B CH ist; Formel

x O, S, Se, NR³, OH&sub2; oder C(OH&sub3;)&sub2; ist;

Y eine Einfachbindung, O, S oder NR&sup4; ist;

p und q jeweils null oder ganze Zahlen von 1 bis 5 sind, wobei die Summe p+q nicht größer als 10 ist;

r und s jeweils null oder ganze Zahlen von 1 bis 5 sind, wobei die Summe r+s nicht größer als 10 ist;

R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, das hydroxy- oder alkoxy- oder alkylthiosubstituiert sein kann, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Amino und Halogen; und

R³ und R&sup4; jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, hydroxy- oder alkoxy- oder alkylthiosubstituiertem (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio und Amino;

Q -CO&sub2;H, -CONR'R", -SO&sub3;H oder -SO&sub2;NR'R" oder ein aktiviertes Derivat von -CO&sub2;H oder -SO&sub3;H ist; und

I -NHR'R" ist, wobei R' und R" unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Schutzgruppen für Amino, Reporter-Liganden, intercalierenden Agenzien, Chelatbildnern, Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Steroiden, Nucleosiden, Nucleotiden, Nucleotiddiphosphaten, Nucleotidtriphosphaten, Oligonucleotiden, darunter sowohl Oligoribonucleotide als auch Oligodeoxyribonucleotide, Oligonucleosiden sowie löslichen und nichtlöslichen Polymeren.

10. Analysenverfahren nach Anspruch 9, wobei das Nucleinsäure-Analogon eine Verbindung der allgemeinen Formel III, IV oder V umfaßt: Formel III

text fehlt Formel IV Formel V

worin:

L jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Phenyl, heterocyclischen Einheiten, natürlich vorkommenden Nucleobasen und nicht natürlich vorkommenden Nucleobasen, so daß das Nucleinsäure-Analogon an die Nucleinsäure-Spezies hybridisieren kann;

R&sup7; jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten natürlich vorkommender α-Aminosäuren;

n ein ganze Zahl größer 1 ist;

k, l und m jeweils unabhängig null oder ein ganze Zahl von 1 bis 5 sind;

p jeweils null oder 1 ist;

Rh OH, NH&sub2; oder -NHLysNH&sub2; ist; und

Ri H oder -COCH&sub3; ist.

11. Kit für den Einsatz bei der Quantifizierung einer Menge an Ziel-Nucleinsäure in einer Probe, umfassend Reagenzien zur Verwendung bei einem Amplifikationsprozeß, um eine Sequenz in der Nucleinsäure zu amplifizieren, und wenigstens zwei nicht zueinander komplementäre Nucleinsäureanalogon- Sequenzen, wobei das erste Analogon an eine zu amplifizierende Sequenz in einem Strang der Ziel- Nucleinsäure hybridisiert, und das zweite Analogon an den dazu komplementären Nucleinsäure-Strang, um deren Amplifikation zu verhindern.

12. Kit nach Anspruch 11, wobei das Kit des weiteren wenigstens zwei Amplifikationsprimer umfaßt und die Nucleinsäureanalogon-Sequenzen derart sind, daß sie mit den Primern um die Hybridisierung an die Ziel-Nucleinsäure konkurrieren.

13. Kit nach Anspruch 11, wobei das Kit des weiteren wenigstens zwei Amplifikationsprimer umfaßt und die Nucleinsäureanalogon-sequenzen derart sind, daß sie an die Ziel-Nucleinsäure zwischen den Primer-Bindungsstellen darin hybridisieren.