JP2842694B2 - 核酸類似物アッセイ法 - Google Patents
核酸類似物アッセイ法Info
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- JP2842694B2 JP2842694B2 JP7500415A JP50041595A JP2842694B2 JP 2842694 B2 JP2842694 B2 JP 2842694B2 JP 7500415 A JP7500415 A JP 7500415A JP 50041595 A JP50041595 A JP 50041595A JP 2842694 B2 JP2842694 B2 JP 2842694B2
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- JP
- Japan
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- nucleic acid
- amplification
- group
- analog
- acid analog
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- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、核酸類似物またはそれらがハイブリダイズ
する核酸配列を定量測定または半定量測定することがで
きる核酸類似物のアッセイ法に関する。
する核酸配列を定量測定または半定量測定することがで
きる核酸類似物のアッセイ法に関する。
現在、核酸増幅法は、汎用されている。これらの技術
としては、最も汎用されている技術であり、EP−Ａ−02
00362およびEP−Ａ−0201184に開示されている「PCR」
（ポリメラーゼ連鎖反応）法が挙げられるが、EP−Ａ−
0320308に開示されている「LCR」（リガーゼ連鎖反応）
法、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA）第87巻、第1874頁〜第1878頁、1990年
３月およびネイチャー（Nature）第350巻、第6313号、
第91頁〜第92頁、1991年３月７日に開示されている、い
わゆる「NASBA」法または「3SR」法、ならびにニューク
リイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Researc
h）、第20巻、第1691頁〜第1696頁に開示されている「S
DA」法も挙げられる。
としては、最も汎用されている技術であり、EP−Ａ−02
00362およびEP−Ａ−0201184に開示されている「PCR」
（ポリメラーゼ連鎖反応）法が挙げられるが、EP−Ａ−
0320308に開示されている「LCR」（リガーゼ連鎖反応）
法、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA）第87巻、第1874頁〜第1878頁、1990年
３月およびネイチャー（Nature）第350巻、第6313号、
第91頁〜第92頁、1991年３月７日に開示されている、い
わゆる「NASBA」法または「3SR」法、ならびにニューク
リイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Researc
h）、第20巻、第1691頁〜第1696頁に開示されている「S
DA」法も挙げられる。
現在、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅系から定量的
情報を得るための多くのストラテジーが存在する。最も
簡単な方法では、試験試料によって生産された増幅DNA
の量を、既知量の同一DNAを用いて調製した１組の標準
的な反応と直接比較する。試料中に存在するDNAの量とP
CRアッセイにおいて最終的に形成された増幅産生物の量
との間に比例関係があることが判明した。しかしなが
ら、PCR法の指数関数的な性質は、試料管と既知量のDNA
を含有する分離管との間の増幅効率の小さな差異が、最
終的な産生量において大きくかつ予想外の差異を導くで
あろうということを意味する［ギルリランド（Gillilan
d）ら（1990）、プロシーディングズ・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エ
イ、87、2725−2729］。したがって、試料管および標準
管からのPCR産生物の量の間のこのような直接的な比較
は、基本的に欠点を有するものである。この問題を解決
するために、多くの別法が提案された。これらの方法と
しては、試料の限界希釈の使用［サング（Thang）ら（1
991）AIDS、５、678−681］または内部もしくは外部標
準の共増幅（co−amplification）法［ケロッグ（Kello
g）ら（1990）アナリティカル・バイオケミストリー（A
nal.Biochem.）、189、202−208］が挙げられる。限界
希釈法は、正の反応のポアソン分布分析を使用して、試
料中の標的配列の量を計算する非常に簡単なストラテジ
ーである。試料中の鋳型DNAの初期量と得られた増幅産
生物の量との間にある比例関係は、限定された範囲内の
出発DNAの量について維持されるだけなので、限界希釈
法は、基本的な限界を有する。共増幅法の別法は、より
信頼性のあるアプローチを提供することができる。すな
わち、それらは、同一管内の標的DNAと共増幅された標
準との比率の測定を頼みにする。しかしながら、それら
は、なお、多くの困難を有している。試料DNA中にも存
在する偏在的に発現された遺伝子のような内部標準の共
増幅は、標的配列と参照配列との間に存在する増幅効率
の差異によってその有用性において限定される。これ
は、非制御法で得られた産生物の相対量に影響を及ぼす
であろう。標的DNAと同様の長さおよび同一のプライマ
ー認識配列を有する外部鋳型の共増幅の別法は、ある程
度までは、定量的なPCRアッセイについて最も好結果の
ストラテジーである［ギルリランドら、プロシーディン
グズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・ユー・エス・エイ、87、2725−2729］が、それ
は、なお、３つの大きな欠点を有する。第１の問題点
は、標的DNAからの産生物および共増幅した参照標準
を、通常、ゲル電気泳動法によって分離しなければなら
ず、分離した産生物を定量化して、産生物の比率を決定
しなければならないという点である。通常、外部コンペ
ティター鋳型の異なる希釈度で４つ以上の反応が行わ
れ、標準曲線を得るためにこれらの全ての反応からの産
生物をスキャンしなければならない。したがって、外部
競争PCRアプローチは、異なるPCRフラグメントを分離す
る能力を有する測定方法に制限され、これは、該方法を
さらに複雑かつ高価にする。外部競争PCRアプローチの
有用性を制限する第２の因子は、PCR産生物が、例え
ば、ビオチン標識PCR産生物は、マイクロウエル表面に
固定化されたキャプチャープローブにハイブリダイズす
ることによって捕獲され、次いで、ウエル中で発色を導
くアジピン酵素コンジュゲートプローブによって検出さ
れるという一般的に使用される方法で、前分離なしで直
接検出されるべきである場合に使用することができない
ということである。このタイプのアッセイにおける対照
試料と試験試料との間の区別は、さらなるウエルおよび
異なるキャプチャープローブの使用を必要とする。外部
競争PCRアプローチの第３の欠点は、外部標準を、試料
からの標的DNAと正確に同一の増幅特性を有するように
注意して設計しなければならないということである。こ
れを行うのは容易でなく、かかる外部標準を構築するた
めにかなりの技術および費用を必要とし、各アッセイ
は、アッセイ開発費用を非常に増加させる新しい外部標
準を有しなければならない。
情報を得るための多くのストラテジーが存在する。最も
簡単な方法では、試験試料によって生産された増幅DNA
の量を、既知量の同一DNAを用いて調製した１組の標準
的な反応と直接比較する。試料中に存在するDNAの量とP
CRアッセイにおいて最終的に形成された増幅産生物の量
との間に比例関係があることが判明した。しかしなが
ら、PCR法の指数関数的な性質は、試料管と既知量のDNA
を含有する分離管との間の増幅効率の小さな差異が、最
終的な産生量において大きくかつ予想外の差異を導くで
あろうということを意味する［ギルリランド（Gillilan
d）ら（1990）、プロシーディングズ・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エ
イ、87、2725−2729］。したがって、試料管および標準
管からのPCR産生物の量の間のこのような直接的な比較
は、基本的に欠点を有するものである。この問題を解決
するために、多くの別法が提案された。これらの方法と
しては、試料の限界希釈の使用［サング（Thang）ら（1
991）AIDS、５、678−681］または内部もしくは外部標
準の共増幅（co−amplification）法［ケロッグ（Kello
g）ら（1990）アナリティカル・バイオケミストリー（A
nal.Biochem.）、189、202−208］が挙げられる。限界
希釈法は、正の反応のポアソン分布分析を使用して、試
料中の標的配列の量を計算する非常に簡単なストラテジ
ーである。試料中の鋳型DNAの初期量と得られた増幅産
生物の量との間にある比例関係は、限定された範囲内の
出発DNAの量について維持されるだけなので、限界希釈
法は、基本的な限界を有する。共増幅法の別法は、より
信頼性のあるアプローチを提供することができる。すな
わち、それらは、同一管内の標的DNAと共増幅された標
準との比率の測定を頼みにする。しかしながら、それら
は、なお、多くの困難を有している。試料DNA中にも存
在する偏在的に発現された遺伝子のような内部標準の共
増幅は、標的配列と参照配列との間に存在する増幅効率
の差異によってその有用性において限定される。これ
は、非制御法で得られた産生物の相対量に影響を及ぼす
であろう。標的DNAと同様の長さおよび同一のプライマ
ー認識配列を有する外部鋳型の共増幅の別法は、ある程
度までは、定量的なPCRアッセイについて最も好結果の
ストラテジーである［ギルリランドら、プロシーディン
グズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・ユー・エス・エイ、87、2725−2729］が、それ
は、なお、３つの大きな欠点を有する。第１の問題点
は、標的DNAからの産生物および共増幅した参照標準
を、通常、ゲル電気泳動法によって分離しなければなら
ず、分離した産生物を定量化して、産生物の比率を決定
しなければならないという点である。通常、外部コンペ
ティター鋳型の異なる希釈度で４つ以上の反応が行わ
れ、標準曲線を得るためにこれらの全ての反応からの産
生物をスキャンしなければならない。したがって、外部
競争PCRアプローチは、異なるPCRフラグメントを分離す
る能力を有する測定方法に制限され、これは、該方法を
さらに複雑かつ高価にする。外部競争PCRアプローチの
有用性を制限する第２の因子は、PCR産生物が、例え
ば、ビオチン標識PCR産生物は、マイクロウエル表面に
固定化されたキャプチャープローブにハイブリダイズす
ることによって捕獲され、次いで、ウエル中で発色を導
くアジピン酵素コンジュゲートプローブによって検出さ
れるという一般的に使用される方法で、前分離なしで直
接検出されるべきである場合に使用することができない
ということである。このタイプのアッセイにおける対照
試料と試験試料との間の区別は、さらなるウエルおよび
異なるキャプチャープローブの使用を必要とする。外部
競争PCRアプローチの第３の欠点は、外部標準を、試料
からの標的DNAと正確に同一の増幅特性を有するように
注意して設計しなければならないということである。こ
れを行うのは容易でなく、かかる外部標準を構築するた
めにかなりの技術および費用を必要とし、各アッセイ
は、アッセイ開発費用を非常に増加させる新しい外部標
準を有しなければならない。
WO−Ａ−93/25706には、高親和性をもって核酸にハイ
ブリダイズする能力を有するある種の核酸類似物を使用
して、PCRなどの核酸増幅方法を阻害できることが開示
されている。好ましい核酸類似物は、WO−Ａ−92/20703
に開示されている。
ブリダイズする能力を有するある種の核酸類似物を使用
して、PCRなどの核酸増幅方法を阻害できることが開示
されている。好ましい核酸類似物は、WO−Ａ−92/20703
に開示されている。
今、存在する核酸類似物の量に対するかかる核酸増幅
法の好結果の阻害の依存性が、試料中に存在する核酸の
量に関する情報、または、存在する核酸類似物の量につ
いての情報を得るための手段を提供することが認識され
た。
法の好結果の阻害の依存性が、試料中に存在する核酸の
量に関する情報、または、存在する核酸類似物の量につ
いての情報を得るための手段を提供することが認識され
た。
したがって、本発明は、存在する核酸種との選択的な
相互作用によって増幅法を有意に阻害する核酸類似物の
存在下、核酸増幅法を行い（ここで、核酸の量または核
酸類似物の量は、共にではないが、知られているが、ま
たは、後で測定される）、増幅法の成功、失敗、また
は、成功の度合いを測定し、これにより、存在する該核
酸種または核酸類似物の量に関する情報を得ることから
なるアッセイ法を提供するものである。
相互作用によって増幅法を有意に阻害する核酸類似物の
存在下、核酸増幅法を行い（ここで、核酸の量または核
酸類似物の量は、共にではないが、知られているが、ま
たは、後で測定される）、増幅法の成功、失敗、また
は、成功の度合いを測定し、これにより、存在する該核
酸種または核酸類似物の量に関する情報を得ることから
なるアッセイ法を提供するものである。
ほとんどの場合、それは、未知量で存在する核酸種で
あると考えられ、好ましくは、これは、増幅用の鋳型で
ある。
あると考えられ、好ましくは、これは、増幅用の鋳型で
ある。
当該方法は、好ましくは、増幅法を阻害するために存
在することが必要であるその相対量に関する情報を得る
ために、１種類以上の異なる量の核酸類似物または１種
類以上の希釈度の試料を使用して、１回以上、当該アッ
セイ法を繰り返すことからなる。
在することが必要であるその相対量に関する情報を得る
ために、１種類以上の異なる量の核酸類似物または１種
類以上の希釈度の試料を使用して、１回以上、当該アッ
セイ法を繰り返すことからなる。
好ましくは、一連の既知の相対量の核酸種および核酸
類似物を使用して同一の増幅法を行うことによって、検
量線を確立する。
類似物を使用して同一の増幅法を行うことによって、検
量線を確立する。
かくして、既知量の核酸を使用して、核酸類似物濃度
に対する特定の核酸鋳型濃度での増幅産生量の検量線を
確立することができる。次いで、未知量の核酸を含有す
る試料についてアッセイ法を行うことができ、好ましく
は、増幅法が成功から失敗まで移動する、希釈度を同定
するための核酸類似物の種々の希釈度で多くのアッセイ
を同時に行う。増幅の阻害に必要とされる核酸類似物の
量は、存在する核酸鋳型の量に比例するので、これによ
り、初期に存在する核酸の量の半定量的評価が得られる
であろう。かくして、プラスミドx ngに基づく検量線が
濃度ｙμＭの核酸類似物で好結果の増幅から失敗まで移
動することが見いだされた場合、阻害のために濃度2yμ
Ｍの核酸類似物を必要とする試料は、鋳型約2x ngを含
有するであろう。
に対する特定の核酸鋳型濃度での増幅産生量の検量線を
確立することができる。次いで、未知量の核酸を含有す
る試料についてアッセイ法を行うことができ、好ましく
は、増幅法が成功から失敗まで移動する、希釈度を同定
するための核酸類似物の種々の希釈度で多くのアッセイ
を同時に行う。増幅の阻害に必要とされる核酸類似物の
量は、存在する核酸鋳型の量に比例するので、これによ
り、初期に存在する核酸の量の半定量的評価が得られる
であろう。かくして、プラスミドx ngに基づく検量線が
濃度ｙμＭの核酸類似物で好結果の増幅から失敗まで移
動することが見いだされた場合、阻害のために濃度2yμ
Ｍの核酸類似物を必要とする試料は、鋳型約2x ngを含
有するであろう。
阻害による定量化（QI）について言及するこの新しい
方法によって提供される多くの重要な長所がある。第１
に、QI法は、比率アプローチではなく、そこで、増幅の
ための内部標準を要求すること、または、外部標準を苦
労して構築することは、必要ではない。QI PCR法では、
例えば、核酸類似物をプライマーに対して指向させるこ
とができ、これは、該配列がすでに知られているので非
常に簡単に行われる。QI法は、外部標準アプローチにお
いて行われなければならないような分離および定量化さ
れなければならない２つの産生物を産生しない。故に、
QI法は、マイクロプレートウエルにおけるハイブリダイ
ゼーションのような産生物検出の好ましい方法によく適
している。QI法は、試料の希釈を必要とせず、結果の複
雑な数学的処理を必要としない。したがって、QI法は、
限定希釈法よりもかなり優れている。QI法は、結果が限
界値のみとの比較によってスコア付けされるので、個々
の管における増幅効率の変化によってあまり影響を及ぼ
されない。
方法によって提供される多くの重要な長所がある。第１
に、QI法は、比率アプローチではなく、そこで、増幅の
ための内部標準を要求すること、または、外部標準を苦
労して構築することは、必要ではない。QI PCR法では、
例えば、核酸類似物をプライマーに対して指向させるこ
とができ、これは、該配列がすでに知られているので非
常に簡単に行われる。QI法は、外部標準アプローチにお
いて行われなければならないような分離および定量化さ
れなければならない２つの産生物を産生しない。故に、
QI法は、マイクロプレートウエルにおけるハイブリダイ
ゼーションのような産生物検出の好ましい方法によく適
している。QI法は、試料の希釈を必要とせず、結果の複
雑な数学的処理を必要としない。したがって、QI法は、
限定希釈法よりもかなり優れている。QI法は、結果が限
界値のみとの比較によってスコア付けされるので、個々
の管における増幅効率の変化によってあまり影響を及ぼ
されない。
QI法は、半定量的測定によく適している。動的な範囲
は、選択された核酸類似物の濃度範囲に依存して、非常
に大きくても非常に小さくてもよい。QI法は、１種類の
濃度の阻害剤を使用して簡単なYES/NOの回答を与えるこ
とができるか、または、マルチプルウエル中での多くの
種類の濃度を使用してほぼ定量的な結果を提供すること
ができる。試料DNA濃度の誤った分類に関して、QI法の
不正確さは、限界値だけでの産生物増幅法における変化
の関数である。
は、選択された核酸類似物の濃度範囲に依存して、非常
に大きくても非常に小さくてもよい。QI法は、１種類の
濃度の阻害剤を使用して簡単なYES/NOの回答を与えるこ
とができるか、または、マルチプルウエル中での多くの
種類の濃度を使用してほぼ定量的な結果を提供すること
ができる。試料DNA濃度の誤った分類に関して、QI法の
不正確さは、限界値だけでの産生物増幅法における変化
の関数である。
核酸類似物は、好ましくは、相補的配列の核酸にハイ
ブリダイズして、配列において該類似物に対応する慣用
のデオキシリボヌクレオチドと核酸との間のハイブリッ
ドよりも加熱による変性に対して安定であるハイブリッ
ドを形成させる能力を有する。
ブリダイズして、配列において該類似物に対応する慣用
のデオキシリボヌクレオチドと核酸との間のハイブリッ
ドよりも加熱による変性に対して安定であるハイブリッ
ドを形成させる能力を有する。
好ましくは、核酸類似物は、骨格がポリアミド骨格で
あるペプチド核酸であり、ここで、リガンドは、該骨格
におけるアザ窒素原子に直接または間接的に結合されて
おり、該リガンドは、主に骨格において４〜８個の介在
原子によってお互いに分離されている窒素原子を有す
る。
あるペプチド核酸であり、ここで、リガンドは、該骨格
におけるアザ窒素原子に直接または間接的に結合されて
おり、該リガンドは、主に骨格において４〜８個の介在
原子によってお互いに分離されている窒素原子を有す
る。
好ましくは、核酸類似物は、一本の鎖から他の鎖を離
すような方法で、一本の鎖が該類似物に相補的な配列を
有する二本鎖核酸にハイブリダイズする能力を有する。
すような方法で、一本の鎖が該類似物に相補的な配列を
有する二本鎖核酸にハイブリダイズする能力を有する。
好ましくは、核酸類似物は、一般式1: ［式中、 ｎは、少なくとも２であり； L1〜Lnは、各々、独立して、水素、ヒドロキシ、（C1
〜C4）アルカノイル、天然核塩基、非天然核塩基、芳香
族基、DNAインターカレーター、核塩基結合基、複素環
基、およびレポーターリガンドからなる群から選択され
るが、通常、少なくとも１つのＬは、天然核塩基などの
核塩基結合基であり、好ましくは、少なくとも90％のＬ
は、かかる核塩基結合基であり； C1〜Cnは、各々、（CR6R7）ｙであり、ここで、R
6は、水素であり、R7は、天然アルファアミノ酸の側鎖
からなる群から選択されるか、または、R6およびR7は、
独立して、水素、（C2〜C6）アルキル、アリール、アラ
ルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1〜C6）アル
コキシ、（C1〜C6）アルキルチオ、NR3R4およびSR5（こ
こで、R3およびR4は、以下の定義と同じであり、R5は、
水素、（C1〜C6）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシま
たはアルキルチオ置換（C1〜C6）アルキルである）から
なる群から選択されるか、または、R6およびR7は、一緒
になって、脂肪族環または複素環系を完成し； D1〜Dnは、各々、（CR6R7）ｚであり、ここで、R6お
よびR7は、前記定義と同じであり； ｙおよびｚは、各々、０または１〜10の整数であり、
ｙ＋ｚの合計は、２〜10、好ましくは、２よりも上であ
り、最も好ましくは、ｙおよびｚの各々が１または２で
あり； G1〜Gn-1は、各々、いずれかの方向の、−NR3CO−、
−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であり、ここ
で、R3は、下記定義と同じであり； A1〜AnおよびB1〜Bnは、各々、 （ａ）Ａが、式（II a）、（II b）、（II c）または
（II d）で示される基であり、Ｂが、ＮまたはR3N+であ
るか；または （ｂ）Ａが、式（II d）で示される基であり、ＢがCHで
あるように選択され： （ここで、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑは、各々、０または１〜５の整数であり、
ｐ＋ｑの合計は、10以下であり； ｒおよびｓは、各々、０または１〜５の整数であり、
ｒ＋ｓの合計は、10以下であり； R1およびR2は、各々、独立して、水素、ヒドロキシ−
またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換されてい
てもよい（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキ
シ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群か
ら選択され； R3およびR4は、各々、独立して、水素、（C1〜C4）ア
ルキル、ヒドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキ
ルチオ−置換（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコ
キシ、アルキルチオおよびアミノからなる群から選択さ
れる）； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
R′Ｒ″または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性誘導体であ
り、 Ｉは、−NR′Ｒ″であり、ここで、Ｒ′およびＲ″
は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポー
ターリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプ
チド、タンパク、炭水化物、脂質、ステロイド、ヌクレ
オシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、ヌクレ
オチド三リン酸、オリゴヌクレオチド（オリゴリボヌク
レオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方
を含む）、オリゴヌクレオシドならびに可溶性および不
溶性ポリマーからなる群から選択される］ で示される。
〜C4）アルカノイル、天然核塩基、非天然核塩基、芳香
族基、DNAインターカレーター、核塩基結合基、複素環
基、およびレポーターリガンドからなる群から選択され
るが、通常、少なくとも１つのＬは、天然核塩基などの
核塩基結合基であり、好ましくは、少なくとも90％のＬ
は、かかる核塩基結合基であり； C1〜Cnは、各々、（CR6R7）ｙであり、ここで、R
6は、水素であり、R7は、天然アルファアミノ酸の側鎖
からなる群から選択されるか、または、R6およびR7は、
独立して、水素、（C2〜C6）アルキル、アリール、アラ
ルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1〜C6）アル
コキシ、（C1〜C6）アルキルチオ、NR3R4およびSR5（こ
こで、R3およびR4は、以下の定義と同じであり、R5は、
水素、（C1〜C6）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシま
たはアルキルチオ置換（C1〜C6）アルキルである）から
なる群から選択されるか、または、R6およびR7は、一緒
になって、脂肪族環または複素環系を完成し； D1〜Dnは、各々、（CR6R7）ｚであり、ここで、R6お
よびR7は、前記定義と同じであり； ｙおよびｚは、各々、０または１〜10の整数であり、
ｙ＋ｚの合計は、２〜10、好ましくは、２よりも上であ
り、最も好ましくは、ｙおよびｚの各々が１または２で
あり； G1〜Gn-1は、各々、いずれかの方向の、−NR3CO−、
−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であり、ここ
で、R3は、下記定義と同じであり； A1〜AnおよびB1〜Bnは、各々、 （ａ）Ａが、式（II a）、（II b）、（II c）または
（II d）で示される基であり、Ｂが、ＮまたはR3N+であ
るか；または （ｂ）Ａが、式（II d）で示される基であり、ＢがCHで
あるように選択され： （ここで、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑは、各々、０または１〜５の整数であり、
ｐ＋ｑの合計は、10以下であり； ｒおよびｓは、各々、０または１〜５の整数であり、
ｒ＋ｓの合計は、10以下であり； R1およびR2は、各々、独立して、水素、ヒドロキシ−
またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換されてい
てもよい（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキ
シ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群か
ら選択され； R3およびR4は、各々、独立して、水素、（C1〜C4）ア
ルキル、ヒドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキ
ルチオ−置換（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコ
キシ、アルキルチオおよびアミノからなる群から選択さ
れる）； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
R′Ｒ″または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性誘導体であ
り、 Ｉは、−NR′Ｒ″であり、ここで、Ｒ′およびＲ″
は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポー
ターリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプ
チド、タンパク、炭水化物、脂質、ステロイド、ヌクレ
オシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、ヌクレ
オチド三リン酸、オリゴヌクレオチド（オリゴリボヌク
レオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方
を含む）、オリゴヌクレオシドならびに可溶性および不
溶性ポリマーからなる群から選択される］ で示される。
さらに好ましくは、核酸類似物、一般式III、IVまた
はV: ［式中、 Ｌは、各々、独立して、水素、フェニル、複素環基、
天然核塩基、および非天然核塩基からなる群から選択さ
れ； R7は、各々、独立して、水素および天然アルファアミ
ノ酸の側鎖からなる群から選択され； ｎは、１よりも大きな整数であり、 ｋ、ｌおよびｍは、各々、独立して、０または１〜５
の整数であり； ｐは、各々、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり； Riは、Ｈまたは−COCH3である］ で示される化合物からなる。
はV: ［式中、 Ｌは、各々、独立して、水素、フェニル、複素環基、
天然核塩基、および非天然核塩基からなる群から選択さ
れ； R7は、各々、独立して、水素および天然アルファアミ
ノ酸の側鎖からなる群から選択され； ｎは、１よりも大きな整数であり、 ｋ、ｌおよびｍは、各々、独立して、０または１〜５
の整数であり； ｐは、各々、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり； Riは、Ｈまたは−COCH3である］ で示される化合物からなる。
好ましい核酸類似物の合成法は、WO−Ａ−92/20703に
開示されている。
開示されている。
実施例１ エグホルム，エム（Egholm,M.）、ブシャート，オー
（Buchardt,O.）、ニールセン，ピー・イー（Nielsen,
P.E.）およびベアウ，アール・エイチ（Berg,R.H.）（1
992）ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエティ（J.Amer.Chem.Soc.）114、1895−1897および
エグホルム，エム、ブシャート，オー、ニールセン，ピ
ー・イーおよびベアウ，アール・エイチ（1992）ジャー
ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ11
4、9677−9678における記載に従って、PNA T10−LysNH2
を合成した。相補的オリゴヌクレオチド５′−GATCCT10
Gおよび５′−GATCCA10GをBluescript KS＋プラスミド
［ストラータジーン（Stratagene）］のBamH I部位で個
々の鎖にクローン化することによって、プラスミドpT10
KSを構築した。99bpのPCRフラグメント（この実施例で
使用されるPNAについての標的部位を有しない）をBlues
cript KS＋プラスミドのSma I部位にクローン化するこ
とによって、対照プラスミドpCKSを構築した。標準的な
技術を使用して、組換えイー・コリ（E.coli）JM103の
選択されたクローンからプラスミドを選択し、CsCl勾配
液中での浮遊密度遠心法によって精製し、次いで、ジデ
オキシ法によって配列決定した。
（Buchardt,O.）、ニールセン，ピー・イー（Nielsen,
P.E.）およびベアウ，アール・エイチ（Berg,R.H.）（1
992）ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエティ（J.Amer.Chem.Soc.）114、1895−1897および
エグホルム，エム、ブシャート，オー、ニールセン，ピ
ー・イーおよびベアウ，アール・エイチ（1992）ジャー
ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ11
4、9677−9678における記載に従って、PNA T10−LysNH2
を合成した。相補的オリゴヌクレオチド５′−GATCCT10
Gおよび５′−GATCCA10GをBluescript KS＋プラスミド
［ストラータジーン（Stratagene）］のBamH I部位で個
々の鎖にクローン化することによって、プラスミドpT10
KSを構築した。99bpのPCRフラグメント（この実施例で
使用されるPNAについての標的部位を有しない）をBlues
cript KS＋プラスミドのSma I部位にクローン化するこ
とによって、対照プラスミドpCKSを構築した。標準的な
技術を使用して、組換えイー・コリ（E.coli）JM103の
選択されたクローンからプラスミドを選択し、CsCl勾配
液中での浮遊密度遠心法によって精製し、次いで、ジデ
オキシ法によって配列決定した。
PCR反応において、以下のオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用した：リバースプライマー（５′−CACACAGG
AAACAGCTATGAC、配列番号１）およびフォワードプライ
マー（５′−GTAAAACGACGGCCAGT、配列番号２）。各プ
ラスミド1ng、各プライマー0.2μＭ、dNTP 200μＭ、Tr
is−HCl 10mM（25℃でpH8.3）、KCl 10mMおよびMgCl23m
Mを含有する容量50μｌで、PCR増幅法を行った。
マーを使用した：リバースプライマー（５′−CACACAGG
AAACAGCTATGAC、配列番号１）およびフォワードプライ
マー（５′−GTAAAACGACGGCCAGT、配列番号２）。各プ
ラスミド1ng、各プライマー0.2μＭ、dNTP 200μＭ、Tr
is−HCl 10mM（25℃でpH8.3）、KCl 10mMおよびMgCl23m
Mを含有する容量50μｌで、PCR増幅法を行った。
使用したPNAの濃度は、０μＭ、13.2μＭ、6.6μＭ、
3.2μＭ、1.6μＭ、0.8μＭ、0.4μＭおよび0.2μＭで
あった。
3.2μＭ、1.6μＭ、0.8μＭ、0.4μＭおよび0.2μＭで
あった。
PCR反応をパラフィン油２滴で覆い、90℃で２分間イ
ンキュベートした後、ストッフェル（Stoffel）ポリメ
ラーゼ［パーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer
Cetus）］3Uの添加によって増幅プロセスを開始した。
全実験において、LEP増幅器［IgGバイオテック（IgG Bi
otech）］を使用した。標準的なPCRサイクルプロフィー
ルは、96℃、２分−55℃、３分−35℃、１分−65℃、２
分−35サイクルであった。
ンキュベートした後、ストッフェル（Stoffel）ポリメ
ラーゼ［パーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer
Cetus）］3Uの添加によって増幅プロセスを開始した。
全実験において、LEP増幅器［IgGバイオテック（IgG Bi
otech）］を使用した。標準的なPCRサイクルプロフィー
ルは、96℃、２分−55℃、３分−35℃、１分−65℃、２
分−35サイクルであった。
PNA/DNA複合体の形成がPCRプライマー結合および伸長
より先に起こったことを確認するために、通常の３工程
PCRサイクルを、PCRプライマーのTmをかなり超えている
温度である55℃での異なるPNAアニーリング工程で拡大
した。
より先に起こったことを確認するために、通常の３工程
PCRサイクルを、PCRプライマーのTmをかなり超えている
温度である55℃での異なるPNAアニーリング工程で拡大
した。
PCR法から得られた産生物をゲル電気泳動法によって
分離し、標準的な方法を使用して臭化エチジウムを使用
して染色した。染色されたゲルのポラロイド（Polaroid
TM）写真を撮り、バンドの強さを肉眼による検査によっ
て評価した。
分離し、標準的な方法を使用して臭化エチジウムを使用
して染色した。染色されたゲルのポラロイド（Polaroid
TM）写真を撮り、バンドの強さを肉眼による検査によっ
て評価した。
第１表は、増加する量のPNA T10−LysNH2の存在下で
のPCR阻害の結果を示す。前記の２つのプラスミド鋳
型：すなわち、A10標的部位を含有する246bpのフラグメ
ントの増幅を導くpT10KSプラスミドおよび329bpの非鋳
型フラグメントの増幅を導くpCKSを使用した。
のPCR阻害の結果を示す。前記の２つのプラスミド鋳
型：すなわち、A10標的部位を含有する246bpのフラグメ
ントの増幅を導くpT10KSプラスミドおよび329bpの非鋳
型フラグメントの増幅を導くpCKSを使用した。
以下の表現法を使用して、PCR反応のクランプ（clam
p）能を示す：＋＋＝PCR産生物、＋＝若干のPCR産生物
および−＝PCR産生物なし;NT＝試験されなかった。
p）能を示す：＋＋＝PCR産生物、＋＝若干のPCR産生物
および−＝PCR産生物なし;NT＝試験されなかった。
PNA T10−LysNH2が存在しないか、または、1.6μＭ以
下の濃度で存在する場合、pT10KSプラスミドは、予想さ
れた246bpのPCRフラグメントの合成を導く。しかしなが
ら、3.2μＭ以上の濃度のPNA T10−LysNH2では、全く産
生されない。産生物が存在しないのは、PCR反応に対す
るPNA T10−LysNH2の非特異的阻害効果によるものでは
ない。というのは、使用した再高濃度（13.2μＭ）の場
合でさえ、PNA T10−LysNH2は、pCKS制御プラスミドか
ら予想される329bpのフラグメントの増幅を阻害しない
からである。これにより、PNA T10−LysNH2は、配列特
異的な方法で、その同起源の標的DNAの増幅を妨害でき
ることが判明する。阻害の濃度依存性は非常に急勾配で
ある。
下の濃度で存在する場合、pT10KSプラスミドは、予想さ
れた246bpのPCRフラグメントの合成を導く。しかしなが
ら、3.2μＭ以上の濃度のPNA T10−LysNH2では、全く産
生されない。産生物が存在しないのは、PCR反応に対す
るPNA T10−LysNH2の非特異的阻害効果によるものでは
ない。というのは、使用した再高濃度（13.2μＭ）の場
合でさえ、PNA T10−LysNH2は、pCKS制御プラスミドか
ら予想される329bpのフラグメントの増幅を阻害しない
からである。これにより、PNA T10−LysNH2は、配列特
異的な方法で、その同起源の標的DNAの増幅を妨害でき
ることが判明する。阻害の濃度依存性は非常に急勾配で
ある。
実質的には、0.8μＭのPNAでは阻害は観察されない
が、1.6μＭでは、75％を超える阻害が生じ、3.2μＭの
PNAでは全阻害が見られる。
が、1.6μＭでは、75％を超える阻害が生じ、3.2μＭの
PNAでは全阻害が見られる。
未知量のpT10KSプラスミドを含有する試料を採取し、
前記方法を繰り返して、前記で使用したPNAの濃度を使
用する阻害のプロフィールが第１図で示される結果に適
合している試料プラスミドの希釈を見つけ、そこで、プ
ラスミドの濃度を確立する。
前記方法を繰り返して、前記で使用したPNAの濃度を使
用する阻害のプロフィールが第１図で示される結果に適
合している試料プラスミドの希釈を見つけ、そこで、プ
ラスミドの濃度を確立する。
しかしながら、さらに好ましくは、増幅を阻害するた
めに必要とされるPNAの臨界量（μＭ）を見つけ、前記
結果から導き出された1ng/3.2μＭのファクターによっ
てこの量と鋳型DNAの量（ng）との間の比例を信頼する
ことによって鋳型の量を簡単に計算することができる。
めに必要とされるPNAの臨界量（μＭ）を見つけ、前記
結果から導き出された1ng/3.2μＭのファクターによっ
てこの量と鋳型DNAの量（ng）との間の比例を信頼する
ことによって鋳型の量を簡単に計算することができる。
実施例２ この実施例で使用したプラスミドおよびプライマー
は、以下のとおりである。
は、以下のとおりである。
プラスミドp62−１ 該プラスミドを２つの工程で構築した。まず、PNA62
（Ｈ−TGTACGTCACAACTA−Gly−NH2）の認識配列を含む
相補的オリゴヌクレオチド（５′−GATCCTGTACGTCACAAC
TA−３′、配列番号３および５′−GATCTAGTTGTGACGTAC
AG−３′、配列番号４）をプラスミドpUC19のBmaH I部
位にクローン化して、p62を得た。次に、p62のPst I/Hi
nd III部位にイー・コリ（E.coli）フェイズλゲノムの
556bpのPst I/Hind IIIフラグメントをクローン化し
て、p62−１を得た。
（Ｈ−TGTACGTCACAACTA−Gly−NH2）の認識配列を含む
相補的オリゴヌクレオチド（５′−GATCCTGTACGTCACAAC
TA−３′、配列番号３および５′−GATCTAGTTGTGACGTAC
AG−３′、配列番号４）をプラスミドpUC19のBmaH I部
位にクローン化して、p62を得た。次に、p62のPst I/Hi
nd III部位にイー・コリ（E.coli）フェイズλゲノムの
556bpのPst I/Hind IIIフラグメントをクローン化し
て、p62−１を得た。
プライマー 以下の配列を有する２つのプライマーを合成した：リ
バースプライマー５′−GAAACAGCTATGAC−３′、配列番
号５およびフォワードプライマー５′−TGTACGTCACAACT
A−３′、配列番号６（フォワードプライマーの配列
は、PNA62の配列と同一である）。PCR反応において、フ
ォワードプライマーおよびリバースプライマーは、p62
−１とプラスミドと一緒に、659bpのフラグメントの増
幅を導く。
バースプライマー５′−GAAACAGCTATGAC−３′、配列番
号５およびフォワードプライマー５′−TGTACGTCACAACT
A−３′、配列番号６（フォワードプライマーの配列
は、PNA62の配列と同一である）。PCR反応において、フ
ォワードプライマーおよびリバースプライマーは、p62
−１とプラスミドと一緒に、659bpのフラグメントの増
幅を導く。
1ng、5ngまたは25ngのプラスミドp62−１、リバース
およびフォワードPCRプライマーおよび種々のPNA 62を
含有するPCR反応を設定した。各PCR反応（50μｌ）は、
dNTP 200μＭ、Tris−HCl（20℃でpH9.9）10mM、KCl 50
mM、MgCl21.5mM、0.01％ゼラチン、0.1％Triton X−10
0、supertaq酵素［ストラータジーン（Stratagene）］1
U、２つのPCRプライマー各10pmolならびに下記第２表に
示されるPNAおよびp62−１プラスミドを含有した。PCR
条件は、96℃で２分、65℃で２分、35℃で30秒、70℃で
２分−30サイクルであった。PCR反応クランプ能は、以
下の表現法を使用して示す：＋＋＝PCR産生物；＋＝若
干のPCR産生物および−＝PCR産生なし。
およびフォワードPCRプライマーおよび種々のPNA 62を
含有するPCR反応を設定した。各PCR反応（50μｌ）は、
dNTP 200μＭ、Tris−HCl（20℃でpH9.9）10mM、KCl 50
mM、MgCl21.5mM、0.01％ゼラチン、0.1％Triton X−10
0、supertaq酵素［ストラータジーン（Stratagene）］1
U、２つのPCRプライマー各10pmolならびに下記第２表に
示されるPNAおよびp62−１プラスミドを含有した。PCR
条件は、96℃で２分、65℃で２分、35℃で30秒、70℃で
２分−30サイクルであった。PCR反応クランプ能は、以
下の表現法を使用して示す：＋＋＝PCR産生物；＋＝若
干のPCR産生物および−＝PCR産生なし。
プラスミド1ngを使用した場合、PCR反応を有効にクラ
ンプするPNAの濃度は、65nMであることが判明した。プ
ラスミド標的の量が５倍（1ngから5ngに）増加すると、
有効なクランピングに必要とされたPNA濃度は、比例し
て325nMに増加した。同様に、初期プラスミド標的が25
倍増加すると、生じるべき有効なクランピングのために
は、25倍増加したPNA（1.63μＭ）が必要であった。か
くして、QIまたはPCRクランプ法を使用して、反応にお
ける標的の初期量を定量化することができる。
ンプするPNAの濃度は、65nMであることが判明した。プ
ラスミド標的の量が５倍（1ngから5ngに）増加すると、
有効なクランピングに必要とされたPNA濃度は、比例し
て325nMに増加した。同様に、初期プラスミド標的が25
倍増加すると、生じるべき有効なクランピングのために
は、25倍増加したPNA（1.63μＭ）が必要であった。か
くして、QIまたはPCRクランプ法を使用して、反応にお
ける標的の初期量を定量化することができる。
5ngを含有する試料の定量的プラスミド含量が知られ
ており、それにより、プラスミド1ngで得られた結果か
ら容易に導き出すことができ、検量線として使用され、
65nMの切断図（cut−off figure）は、未知の（5ngのプ
ラスミド）試料の増幅の有効なクランピングについて見
られた。
ており、それにより、プラスミド1ngで得られた結果か
ら容易に導き出すことができ、検量線として使用され、
65nMの切断図（cut−off figure）は、未知の（5ngのプ
ラスミド）試料の増幅の有効なクランピングについて見
られた。
実施例１および実施例２において、唯一の核酸類似物
を使用し、これが１つのPCRプライマー部位だけに対し
て向けられることに注意すべきである。故に、非阻害プ
ライマーによって駆動される線形増幅法は、これらの実
験において生じるであろう。かかる線形増幅物質は、感
度限界のために、本明細書に記載されているゲル電気泳
動法によって検出されない。PCR法の全阻害を達成する
ために、二本鎖核酸標的の両方のプライマーまたは両方
の鎖で向けられる２つの核酸分子を使用することが必要
である。これは、ゲル電気泳動法／臭化エチジウムによ
る染色よりも高感度な検出方法を使用することができる
場合に重要であろう。
を使用し、これが１つのPCRプライマー部位だけに対し
て向けられることに注意すべきである。故に、非阻害プ
ライマーによって駆動される線形増幅法は、これらの実
験において生じるであろう。かかる線形増幅物質は、感
度限界のために、本明細書に記載されているゲル電気泳
動法によって検出されない。PCR法の全阻害を達成する
ために、二本鎖核酸標的の両方のプライマーまたは両方
の鎖で向けられる２つの核酸分子を使用することが必要
である。これは、ゲル電気泳動法／臭化エチジウムによ
る染色よりも高感度な検出方法を使用することができる
場合に重要であろう。
本発明は、前記実施例によって説明された好ましい具
体例について記載されているが、本発明の範囲内で多く
の変形および変更が可能である。
体例について記載されているが、本発明の範囲内で多く
の変形および変更が可能である。
また、本発明は、核酸鋳の配列を増幅するための増幅
プロセス用の試薬、標的核酸の鎖および増幅を防止する
ためのそれに相補的な核酸鎖をそれぞれ増幅されるべき
配列にハイブリダイズするための少なくとも２つの非相
補的核酸類似物配列からなる、試料中の標的核酸量同定
用のキットを含む。
プロセス用の試薬、標的核酸の鎖および増幅を防止する
ためのそれに相補的な核酸鎖をそれぞれ増幅されるべき
配列にハイブリダイズするための少なくとも２つの非相
補的核酸類似物配列からなる、試料中の標的核酸量同定
用のキットを含む。
前記核酸の配列を後記の配列表に詳述する。
以下に、本発明の実施態様について記載する。
（１）存在する核酸種との選択的な相互作用によって増
幅法を有意に阻害する核酸類似物の存在下、核酸増幅法
を行い（ここで、核酸の量または核酸類似物の量は、共
にではないが、知られているか、または、後で測定され
る）、次いで、増幅法の成功、失敗、または、成功の度
合いを測定し、これにより、存在する該核酸種または核
酸類似物の量に関する情報を得ることからなることを特
徴とするアッセイ法。
幅法を有意に阻害する核酸類似物の存在下、核酸増幅法
を行い（ここで、核酸の量または核酸類似物の量は、共
にではないが、知られているか、または、後で測定され
る）、次いで、増幅法の成功、失敗、または、成功の度
合いを測定し、これにより、存在する該核酸種または核
酸類似物の量に関する情報を得ることからなることを特
徴とするアッセイ法。
（２）核酸種が未知の量で存在し、増幅用の鋳型である
前記（１）に記載のアッセイ法。
前記（１）に記載のアッセイ法。
（３）さらに、増幅法を阻害するために存在することが
必要である量に関する情報を得るために、１種類以上の
異なる量の核酸類似物を使用して、１回以上、該アッセ
イ法を繰り返すことからなる前記（２）に記載のアッセ
イ法。
必要である量に関する情報を得るために、１種類以上の
異なる量の核酸類似物を使用して、１回以上、該アッセ
イ法を繰り返すことからなる前記（２）に記載のアッセ
イ法。
（４）核酸類似物が増幅法のプライマーハイブリダイゼ
ーション部位にハイブリダイズする前記（１）〜（３）
のいずれか１つに記載のアッセイ法。
ーション部位にハイブリダイズする前記（１）〜（３）
のいずれか１つに記載のアッセイ法。
（５）核酸類似物が、連結された骨格基から成り立って
いるポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィナミド
またはポリスルホナミド骨格に結合されるリガンドの配
列を含む重合鎖からなり、該類似物が相補鎖の核酸への
ハイブリダイゼーション能を有する前記（１）〜（４）
のいずれか１つに記載のアッセイ法。
いるポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィナミド
またはポリスルホナミド骨格に結合されるリガンドの配
列を含む重合鎖からなり、該類似物が相補鎖の核酸への
ハイブリダイゼーション能を有する前記（１）〜（４）
のいずれか１つに記載のアッセイ法。
（６）核酸類似物が、配列において類似物に対応する慣
用のデオキシリボヌクレオチドと核酸との間のハイブリ
ッドよりも熱による変性に対して安定であるハイブリッ
ドを形成するために相補的配列の核酸へのハイブリダイ
ゼーション能を有する（１）〜（５）のいずれか１つに
記載のアッセイ法。
用のデオキシリボヌクレオチドと核酸との間のハイブリ
ッドよりも熱による変性に対して安定であるハイブリッ
ドを形成するために相補的配列の核酸へのハイブリダイ
ゼーション能を有する（１）〜（５）のいずれか１つに
記載のアッセイ法。
（７）核酸類似物が、骨格がポリアミド骨格であるペプ
チド核酸であり、各リガンドが骨格におけるアザ窒素原
子に直接または間接的に結合し、窒素原子を有する該リ
ガンドが主に４〜８個の介在原子によって骨格において
お互いに分離される前記（１）〜（６）のいずれか１つ
に記載のアッセイ法。
チド核酸であり、各リガンドが骨格におけるアザ窒素原
子に直接または間接的に結合し、窒素原子を有する該リ
ガンドが主に４〜８個の介在原子によって骨格において
お互いに分離される前記（１）〜（６）のいずれか１つ
に記載のアッセイ法。
（８）核酸類似物が、一本の鎖から他の鎖を離すような
方法で、一本の鎖が類似物に対して配列相補性を有する
二本鎖核酸へのハイブリダイゼーション能を有する前記
（１）〜（７）のいずれか１つに記載のアッセイ法。
方法で、一本の鎖が類似物に対して配列相補性を有する
二本鎖核酸へのハイブリダイゼーション能を有する前記
（１）〜（７）のいずれか１つに記載のアッセイ法。
（９）核酸類似物が一般式1: ［式中、 ｎは、少なくとも２であり； L1〜Lnは、各々、独立して、水素、ヒドロキシ、（C1
〜C4）アルカノイル、天然核塩基、非天然核塩基、芳香
族基、DNAインターカレーター、核塩基結合基、複素環
基、およびレポーターリガンドからなる群から選択さ
れ； C1〜Cnは、各々、（CR6R7）ｙであり、ここで、R
6は、水素であり、R7は、天然アルファアミノ酸の側鎖
からなる群から選択されるか、または、R6およびR7は、
独立して、水素、（C2〜C6）アルキル、アリール、アラ
ルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1〜C6）アル
コキシ、（C1〜C6）アルキルチオ、NR3R4およびSR5（こ
こで、R3およびR4は、以下の定義と同じであり、R5は、
水素、（C1〜C6）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシま
たはアルキルチオ置換（C1〜C6）アルキルである）から
なる群から選択されるか、または、R6およびR7は、一緒
になって、脂肪族環または複素環系を完成し； D1〜Dnは、各々、（CR6R7）ｚであり、ここで、R6お
よびR7は、前記定義と同じであり； ｙおよびｚは、各々、０または１〜10の整数であり、
ｙ＋ｚの合計は、２〜10であり； G1〜Gn-1は、各々、いずれかの方向の、−NR3CO−、
−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であり、ここ
で、R3は、下記定義と同じであり； A1〜AnおよびB1〜Bnは、各々、 （ａ）Ａが、式（II a）、（II b）、（II c）または
（II d）で示される基であり、Ｂが、ＮまたはR3N+であ
るか；または （ｂ）Ａが、式（II d）で示される基であり、ＢがCHで
あるように選択され： （ここで、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑは、各々、０または１〜５の整数であり、
ｐ＋ｑの合計は、10以下であり； ｒおよびｓは、各々、０または１〜５の整数であり、
ｒ＋ｓの合計は、10以下であり； R1およびR2は、各々、独立して、水素、ヒドロキシ−
またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換されてい
てもよい（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキ
シ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群か
ら選択され； R3およびR4は、各々、独立して、水素、（C1〜C4）ア
ルキル、ヒドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキ
ルチオ−置換（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコ
キシ、アルキルチオおよびアミノからなる群から選択さ
れる）； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
R′Ｒ″または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性誘導体であ
り、 Ｉは、−NR′Ｒ″であり、ここで、Ｒ′およびＲ″
は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポー
ターリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプ
チド、タンパク、炭水化物、脂質、ステロイド、ヌクレ
オシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、ヌクレ
オチド三リン酸、オリゴヌクレオチド（オリゴリボヌク
レオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方
を含む）、オリゴヌクレオシドならびに可溶性および不
溶性ポリマーからなる群から選択される］ で示される前記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の
アッセイ法。
〜C4）アルカノイル、天然核塩基、非天然核塩基、芳香
族基、DNAインターカレーター、核塩基結合基、複素環
基、およびレポーターリガンドからなる群から選択さ
れ； C1〜Cnは、各々、（CR6R7）ｙであり、ここで、R
6は、水素であり、R7は、天然アルファアミノ酸の側鎖
からなる群から選択されるか、または、R6およびR7は、
独立して、水素、（C2〜C6）アルキル、アリール、アラ
ルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1〜C6）アル
コキシ、（C1〜C6）アルキルチオ、NR3R4およびSR5（こ
こで、R3およびR4は、以下の定義と同じであり、R5は、
水素、（C1〜C6）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシま
たはアルキルチオ置換（C1〜C6）アルキルである）から
なる群から選択されるか、または、R6およびR7は、一緒
になって、脂肪族環または複素環系を完成し； D1〜Dnは、各々、（CR6R7）ｚであり、ここで、R6お
よびR7は、前記定義と同じであり； ｙおよびｚは、各々、０または１〜10の整数であり、
ｙ＋ｚの合計は、２〜10であり； G1〜Gn-1は、各々、いずれかの方向の、−NR3CO−、
−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であり、ここ
で、R3は、下記定義と同じであり； A1〜AnおよびB1〜Bnは、各々、 （ａ）Ａが、式（II a）、（II b）、（II c）または
（II d）で示される基であり、Ｂが、ＮまたはR3N+であ
るか；または （ｂ）Ａが、式（II d）で示される基であり、ＢがCHで
あるように選択され： （ここで、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑは、各々、０または１〜５の整数であり、
ｐ＋ｑの合計は、10以下であり； ｒおよびｓは、各々、０または１〜５の整数であり、
ｒ＋ｓの合計は、10以下であり； R1およびR2は、各々、独立して、水素、ヒドロキシ−
またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換されてい
てもよい（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキ
シ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群か
ら選択され； R3およびR4は、各々、独立して、水素、（C1〜C4）ア
ルキル、ヒドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキ
ルチオ−置換（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコ
キシ、アルキルチオおよびアミノからなる群から選択さ
れる）； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
R′Ｒ″または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性誘導体であ
り、 Ｉは、−NR′Ｒ″であり、ここで、Ｒ′およびＲ″
は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポー
ターリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプ
チド、タンパク、炭水化物、脂質、ステロイド、ヌクレ
オシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、ヌクレ
オチド三リン酸、オリゴヌクレオチド（オリゴリボヌク
レオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方
を含む）、オリゴヌクレオシドならびに可溶性および不
溶性ポリマーからなる群から選択される］ で示される前記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の
アッセイ法。
（10）核酸類似物が一般式III、IVまたはV: ［式中、 Ｌは、各々、独立して、水素、フェニル、複素環基、
天然核塩基、および非天然核塩基からなる群から選択さ
れ； R7は、各々、独立して、水素および天然アルファアミ
ノ酸の側鎖からなる群から選択され； ｎは、１よりも大きな整数であり、 ｋ、ｌおよびｍは、各々、独立して、０または１〜５
の整数であり； ｐは、各々、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり； Riは、Ｈまたは−COCH3である］ で示される化合物からなる前記（９）に記載のアッセイ
法。
天然核塩基、および非天然核塩基からなる群から選択さ
れ； R7は、各々、独立して、水素および天然アルファアミ
ノ酸の側鎖からなる群から選択され； ｎは、１よりも大きな整数であり、 ｋ、ｌおよびｍは、各々、独立して、０または１〜５
の整数であり； ｐは、各々、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり； Riは、Ｈまたは−COCH3である］ で示される化合物からなる前記（９）に記載のアッセイ
法。
（11）核酸中の配列を増幅するための増幅プロセス用の
試薬、標的核酸の鎖およびその増幅を防止するためのそ
れに相補的な核酸鎖においてそれぞれ増幅されるべき配
列にハイブリダイズするための少なくとも２つの非相補
的核酸類似物配列からなる、試料中の標的核酸量同定用
のキット （12）キットが、さらに、少なくとも２つの増幅プライ
マーを含有し、核酸類似物配列が標的核酸にハイブリダ
イズするためにプライマーと競争するようなものである
前記（11）に記載のキット。
試薬、標的核酸の鎖およびその増幅を防止するためのそ
れに相補的な核酸鎖においてそれぞれ増幅されるべき配
列にハイブリダイズするための少なくとも２つの非相補
的核酸類似物配列からなる、試料中の標的核酸量同定用
のキット （12）キットが、さらに、少なくとも２つの増幅プライ
マーを含有し、核酸類似物配列が標的核酸にハイブリダ
イズするためにプライマーと競争するようなものである
前記（11）に記載のキット。
（13）キットが、さらに、少なくとも２つの増幅プライ
マーを含有し、核酸類似物配列がプライマー結合部位間
で標的核酸をハイブリダイズするようなものである前記
（11）に記載のキット。
マーを含有し、核酸類似物配列がプライマー結合部位間
で標的核酸をハイブリダイズするようなものである前記
（11）に記載のキット。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】存在する核酸種との選択的な相互作用によ
って増幅法を有意に阻害する核酸類似物の存在下、核酸
増幅法を行い（ここで、核酸の量または核酸類似物の量
は、共にではないが、知られているか、または、後で測
定される）、次いで、増幅法の成功、失敗、または、成
功の度合いを測定し、これにより、存在する該核酸種ま
たは核酸類似物の量に関する情報を得ることからなるこ
とを特徴とするアッセイ法。 - 【請求項２】核酸種が未知の量で存在し、増幅用の鋳型
であり、さらに、増幅法を阻害するために存在すること
が必要である量に関する情報を得るために、１種類以上
の異なる量の核酸類似物を使用して、１回以上、該アッ
セイ法を繰り返すことからなる請求項１記載のアッセイ
法。 - 【請求項３】核酸類似物が増幅法のプライマーハイブリ
ダイゼーション部位にハイブリダイズする請求項１また
は２記載のアッセイ法。 - 【請求項４】核酸類似物が、連結された骨格基から成り
立っているポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィ
ナミドまたはポリスルホナミド骨格に結合されるリガン
ドの配列を含む重合鎖からなり、該類似物が相補鎖の核
酸へのハイブリダイゼーション能を有する請求項１〜３
のいずれか１項記載のアッセイ法。 - 【請求項５】核酸類似物が、骨格がポリアミド骨格であ
るペプチド核酸であり、各リガンドが骨格におけるアザ
窒素原子に直接または間接的に結合し、窒素原子を有す
る該リガンドが主に４〜８個の介在原子によって骨格に
おいてお互いに分離される請求項１〜４のいずれか１項
記載のアッセイ法。 - 【請求項６】核酸類似物が、一本の鎖から他の鎖を離す
ような方法で、一本の鎖が類似物に対して配列相補性を
有する二本鎖核酸へのハイブリダイゼーション能を有す
る請求項１〜５のいずれか１項記載のアッセイ法。 - 【請求項７】核酸類似物が一般式1: ［式中、 ｎは、少なくとも２であり； L1〜Lnは、各々、独立して、水素、ヒドロキシ、（C1〜
C4）アルカノイル、天然核塩基、非天然核塩基、芳香族
基、DNAインターカレーター、核塩基結合基、複素環
基、およびレポーターリガンドからなる群から選択さ
れ； C1〜Cnは、各々、（CR6R7）ｙであり、ここで、R6は、
水素であり、R7は、天然アルファアミノ酸の側鎖からな
る群から選択されるか、または、R6およびR7は、独立し
て、水素、（C2〜C6）アルキル、アリール、アラルキ
ル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1〜C6）アルコキ
シ、（C1〜C6）アルキルチオ、NR3R4およびSR5（ここ
で、R3およびR4は、以下の定義と同じであり、R5は、水
素、（C1〜C6）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシまた
はアルキルチオ置換（C1〜C6）アルキルである）からな
る群から選択されるか、または、R6およびR7は、一緒に
なって、脂肪族環または複素環系を完成し； D1〜Dnは、各々、（CR6R7）ｚであり、ここで、R6およ
びR7は、前記定義と同じであり； ｙおよびｚは、各々、０または１〜10の整数であり、ｙ
＋ｚの合計は、２〜10であり； G1〜Gn-1は、各々、いずれかの方向の、−NR3CO−、−N
R3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であり、ここで、R
3は、下記定義と同じであり； A1〜AnおよびB1〜Bnは、各々、 （ａ）Ａが、式（II a）、（II b）、（II c）または
（II d）で示される基であり、Ｂが、ＮまたはR3N+であ
るか；または （ｂ）Ａが、式（II d）で示される基であり、ＢがCHで
あるように選択され： （ここで、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑは、各々、０または１〜５の整数であり、ｐ
＋ｑの合計は、10以下であり； ｒおよびｓは、各々、０または１〜５の整数であり、ｒ
＋ｓの合計は、10以下であり； R1およびR2は、各々、独立して、水素、ヒドロキシ−ま
たはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換されていて
もよい（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、
アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群から選
択され； R3およびR4は、各々、独立して、水素、（C1〜C4）アル
キル、ヒドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキル
チオ−置換（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキ
シ、アルキルチオおよびアミノからなる群から選択され
る）； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
R′Ｒ″または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性誘導体であ
り、 Ｉは、−NR′Ｒ″であり、ここで、Ｒ′およびＲ″は、
独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーター
リガンド、インターカレーター、キレーター、ペプチ
ド、タンパク、炭水化物、脂質、ステロイド、ヌクレオ
シド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、ヌクレオ
チド三リン酸、オリゴヌクレオチド（オリゴリボヌクレ
オチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方を
含む）、オリゴヌクレオシドならびに可溶性および不溶
性ポリマーからなる群から選択される］ で示される請求項１〜６のいずれか１項記載のアッセイ
法。 - 【請求項８】核酸類似物が一般式III、IVまたはV: ［式中、 Ｌは、各々、独立して、水素、フェニル、複素環基、天
然核塩基、および非天然核塩基からなる群から選択さ
れ； R7は、各々、独立して、水素および天然アルファアミノ
酸の側鎖からなる群から選択され； ｎは、１よりも大きな整数であり、 ｋ、ｌおよびｍは、各々、独立して、０または１〜５の
整数であり； ｐは、各々、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり； Riは、Ｈまたは−COCH3である］ で示される化合物からなる請求項７記載のアッセイ法。 - 【請求項９】核酸中の配列を増幅するための増幅プロセ
ス用の試薬、標的核酸の鎖およびその増幅を防止するた
めのそれに相補的な核酸鎖においてそれぞれ増幅される
べき配列にハイブリダイズするための少なくとも２つの
非相補的核酸類似物配列からなる、試料中の標的核酸量
同定用のキット - 【請求項１０】キットが、さらに、少なくとも２つの増
幅プライマーを含有し、核酸類似物配列が標的核酸にハ
イブリダイズするためにプライマーと競争するようなも
のである請求項９記載のキット。 - 【請求項１１】キットが、さらに、少なくとも２つの増
幅プライマーを含有し、核酸類似物配列がプライマー結
合部位間で標的核酸をハイブリダイズするようなもので
ある請求項９記載のキット。
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