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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Zusammensetzungen, Vorrichtungen und
Verfahren zur Vereinfachung und Verbesserung der Empfindlichkeit und Spezifität der in
situ-Polymerase-Kettenreaktion, ein Verfahren zur Amplifizierung und zum Nachweis
spezifischer Nukleinsäuresequenzen in einzelnen Zellen, und sie kann im Bereich der Zellbiologie,
forensischen Wissenschaft und der klinischen, Veterinär- und Pflanzenpathologie verwendet
werden.
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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren zur Steigerung der Konzentration
einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe um viele Größenordnungen. Das
PCR-Verfahren ist in den US-Patenten Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,965,188 offenbart.
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Die sogenannten in situ-Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren sind entwickelt worden, um
Zielsequenzen in den Zellen oder Organellen nachzuweisen, aus denen sie stammen (zum
Überblick über das Gebiet siehe Nagai et al., 1987, Intl. J. Gyn. Path. 6, 366-379).
Typischerweise erfordert in situ-Hybridisierung (1) Vorbereitung eines histochemischen Schnitts oder
cytochemischen Abstrichs, chemisch fixiert (z. B. mit Formaldehyd), um die proteinähnlichen
subzellularen Strukturen zu stabilisieren, und Auflagern auf einen Mikroskop-Objektträger,
(2) chemische Denaturierung der Nukleinsäure in der zellulären Präparation, (3) Anlagern
einer markierten Nukleinsäuresonde an eine komplementäre Zielsequenz in der denaturierten
zellulären DNA und (4) lokalisierter Nachweis der Markierung, die an das Ziel angelagert ist,
normalerweise durch mikroskopische Untersuchung von immobilisierten nicht-isotopischen
(Absorptions- oder Fluoreszenzfärbung) oder isotopischen (autoradiographisch) Signalen, die
direkt oder indirekt durch die Sondenmarkierung erzeugt werden. Jedoch ist herkömmliche in
situ-Hybridisierung nicht sehr empfindlich, generell benötigt sie 10 bis 100 Kopien der
Zielnukleinsäure pro Zelle, um die Anwesenheit der Zielsequenz in dieser Zelle anzuzeigen.
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In letzter Zeit wurde die mit der PCR-Amplifikation von Zielsequenzen verbundene
Empfindlichkeitssteigerung mit der Ziellokalisierung von in situ-Hybridisierung verbunden, um in
situ-PCR
herzustellen, wobei die PCR in chemisch fixierten Zellen durchgeführt wird, bevor
die fixierten Zellen auf einen Mikroskop-Objektträger gelagert werden und die amplifizierte
Nukleinsäure wird lokalisiert durch mikroskopische Untersuchung der Autoradiographien
nach isotopischer Markierungsuntersuchung (Haase et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87, 4971-4975). Die Zellen können während der in situ-Amplifikation gelöst sein.
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In situ-PCR erfordert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen zwei gegensätzlichen
Erfordernissen von PCR in einer zellulären Präparation: die Zell- und subzellulären (z. B. Kern-)
Membranen müssen ausreichend permeabilisiert werden, um es extern zugefügten
PCR-Reagenzien zu ermöglichen, die Zielnukleinsäure zu erreichen, jedoch müssen sie ausreichend
intakt und nicht porös sein, um Diffusion von amplifizierten Nukleinsäuren aus den Zellen
oder subzellulären Kompartimenten, in denen sie durchgeführt wird, zurückzuhalten.
Zusätzlich muss die amplifizierte Nukleinsäure in ihrem Kompartiment ausreichend konzentriert
sein, um ein mikroskopisch sichtbares Signal zu geben, jedoch muss sie ausreichend verdünnt
sein, damit sie sich nicht wieder zwischen den Denaturierungs- und
Sondenanlagerungsschriften anlagert. Haase et al., supra, verwendeten Paraformaldehydfixierung von Zellen, um
ausreichende aber nicht überschüssige Permeabilität herzustellen.
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Haase et al., supra, verwendeten Serien von PCR-Primerpaaren, um eine Serie von
überlappenden Zielsequenzen in dem Genom des Zielorganismus zu spezifizieren, um die
Zurückhaltung von amplifizierten Zielnukleinsäuren, in dem zellulären Kompartiment, in dem dies
durchgeführt wurde, zu verbessern. Es wurde erwartet, dass das resultierende PCR-Produkt so
groß ist (größer als 1000 Basenpaare), dass seine Diffusion von der Ursprungsstelle
größtenteils zurückgehalten werden sollte. Jedoch reduziert die Verwendung von einer Vielzahl
Primerpaaren ernstlich die Praktizierbarkeit von in situ-PCR, nicht nur wegen des Aufwands,
der mit der Herstellung von so vielen synthetischen Oligonukleotiden verbunden ist, sondern
viel schwerwiegender, weil viele PCR-Zielorganismen, besonders pathogene Viren, genetisch
so plastisch sind, dass es schwer ist, wenigstens einige kurze Sequenzen, die ausreichend
unveränderlich sind, um gute Primer und Sondenstellen darzustellen, zu finden. Andere
wichtige Zielsequenzen wie aktivierte Onkogene, inaktivierte Tumorsuppressorgene und onkogene
chromosomale Translokationen schließen somatische Punktmutationen und chromosomale
Umordnungen ein, die von den parentalen Sequenzen unterschieden werden können, wenn
verhältnismäßig kurze PCR-Produkte von einzelnen Primerpaaren amplifiziert werden. Vielfache
Primerpaare und lange Strukturen würden das Erreichen einer Spezifität, die häufig
benötigt wird, um krebsartige Zellen von ihren normalen Nachbarn zu unterscheiden,
verhindern. Vielfache Primerpaare setzen die PCR auch auf anderem Weg aufs Spiel; sie fördern
Primer-Dimerisierung und Fehl-Priming, reduzieren die Empfindlichkeit und Spezifität und
steigern die Wahrscheinlichkeit von falsch-negativen Ergebnissen, da nicht-spezifische
Amplifikation radikal die Ausbeute von amplifizierten Zielsequenzen reduziert.
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Die vorliegende Erfindung steigert den Nutzen, die Empfindlichkeit und Spezifität von in
situ-PCR und beseitigt jeglichen Bedarf für Mehrfach-Primerpaare, um eine einzelne
Zielsequenz nachzuweisen. Auf diese Weise wird ermöglicht, dass die in situ-PCR zwischen Allelen
unterscheiden kann.
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In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren der in situ-Polymerase-
Kettenreaktion (PCR) zur Verfügung mit gesteigerter Amplifikationsspezifität und
Empfindlichkeit. Diese Verbesserung schließt die Vorenthaltung von wenigstens einem PCR-Reagenz
von einer Präparation, umfassend fixierte Zellen, PCR-Reagenzien und optional ein
Einzelstrang-DNA-Bindeprotein, ein, bis die Präparation auf eine Temperatur in dem ungefähren
Bereich von 50º bis 80ºC erhitzt wurde, in dem unspezifische Reaktionen der Nukleinsäure-
Polymerase unerwünscht sind. Das Verfahren gilt gleichermaßen, wenn
Nukleinsäure-Amplifikation durchgeführt wird, bevor oder nachdem die fixierten Zellen auf einen Mikroskop-
Objektträger gebracht wurden.
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In einem zweiten Aspekt ist das verbesserte in situ-PCR-Verfahren auf die bessere Spezifität
und Empfindlichkeit gerichtet, die aus dem Zufügen eines Einzelstrang-DNA-Bindeproteins
(SSB) in das Reaktionsgemisch in einer Konzentration, die nicht-spezifische
Polymerasereaktionen stört, ohne spezifische Zielanreicherung zu blockieren, resultiert. Eine Vielzahl von
natürlich auftretenden, genetisch veränderten oder vollständig synthetischen Polypeptiden mit
SSB-Aktivität können in situ-PCR begünstigen. Dieser zweite Aspekt ist auch unabhängig
von der zeitlichen Abfolge der Nukleinsäure-Amplifikation und Zellanlagerung auf
Objektträgern.
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In einem dritten Aspekt ist die Erfindung auf eine thermische Kreisprozesseinrichtung
[thermal cycler] gerichtet, die verwendet wird, um PCR-Amplifikation zu automatisieren, wobei
die Probenkammer, die verwendet wird, um Hitze schnell zu und von der Reaktion zu
befördern, die Mikroskop-Objektträger hält. In einer Ausführungsform umfasst die Probenkammer
einen Metallblock, der eine horizontale flache Oberfläche hat, so bemessen, um eine oder
mehrere Mikroskop-Objektträger mit ihren größten Ausdehnungen horizontal ausgerichtet zu
halten. Die flache Oberfläche kann auf dem Grund einer Vertiefung liegen, die geeignet ist
zum Halten einer flachen Mineralöldampfbarriere, die Trocknen der in situ-PCR-Präparation
während des thermalen Kreisprozesses verhindert. In einer anderen Ausführungsform umfasst
die Kammer einen Metallblock, der eine oder mehrere Kerben beinhaltet, die im wesentlichen
die Mikroskop-Objektträger eng einschließen, wobei deren größte Ausdehnungen an einer
etwa vertikalen Ebene ausgerichtet sind. Solche eine Ausrichtung steigert wesentlich die
Anzahl der Objektträger, die zu einem Zeitpunkt analysiert werden können. In einer dritten
Ausführungsform hält die Kammer eine sich bewegende Hitzetransferflüssigkeit und
beinhaltet Halterungen zur Sicherung der Mikroskop-Objektträger in dem Flüssigkeitsstrom. Die
dritte Ausführungsform umfasst auch Plastikhüllen, die die Mikroskop-Objektträger umhüllen
und sie vor Austrocknung oder PCR-Reagenzauswaschung schützen.
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Die ersten beiden Aspekte der vorliegenden Erfindung verbessern die Spezifität und
Empfindlichkeit von in situ-PCR; sie reduzieren die Möglichkeit von falsch-negativen
Ergebnissen, weil auch Zellen, die nur eine Einzelkopie der Zielnukleinsäuresequenz enthalten,
zuverlässig nachgewiesen werden können. Die gesteigerte Spezifität vereinfacht den Nachweis von
amplifizierten Nukleinsäuren. Wo in situ-Nukleinsäureanalyse traditionell das Anlagern von
markierten Sondennukleinsäuren, die eine Sequenz komplementär zu der Zielsequenz
enthielten, erforderte, erlaubt die hohe Amplifikationsspezifität den zuverlässigen Nachweis von
markierten Primern, die in längeren Nukleinsäuren eingeschlossen sind, mit verringerter Sorge
um falsch-positive Ergebnisse, die auftreten könnten bei Primereinbau in nicht-spezifisch
amplifizierte Nukleinsäuren. Deshalb ist ein zusätzlicher Untersuchungsschritt nicht länger
notwendig, aber kann noch angewendet werden. Die gesteigerte Empfindlichkeit vereinfacht
auch den Nachweis von amplifizierten Nukleinsäuren nach in situ-PCR, durch die Herstellung
von so vielen Analyten, dass nicht-isotopische Signale autoradiographisch nachgewiesene
isotopische Signale ersetzen können. Absorptions-, Fluoreszenz- und
Chemilumineszenzsignale sind schneller, einfacher und sicherer zu registrieren als radioaktiver Zerfall. Die
Einführung des nicht-isotopischen Nachweises sollte den Anreiz von in situ-PCR bei klinischen
Pathologen und anderen Praktikern von Routineuntersuchungen (im Gegensatz zu
biologischer und medizinischer Forschung) steigern.
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Die ersten beiden Aspekts der Erfindung steigern auch stark die Praktikabilität und
Allgemeingültigkeit von in situ-PCR durch Entfernen der Notwendigkeit von
Vielfach-Primerpaaren zum empfindlichen Nachweis einer einzelnen Zielsequenz. Neben den Kosten sind
multiple Primerpaare schwer anzuwenden auf hoch-polymorphe Zielorganismen wie viele
Retroviren oder auf allelspezifische Amplifikationen, wie sie für den PCR-Nachweis von vielen
onkogenen somatischen Mutationen erforderlich sind. Nun, da Einzel-Primerpaare für in situ-
PCR ausreichen, wird die Methode die gleiche Breite von Anwendungen haben wie
herkömmliche PCR. Solche speziellen Anpassungen wie Multiplex-PCR, degeneriertes Priming,
verschachteltes ("nested") Priming, allelspezifische Amplifikation, einseitige PCR und RNA-
PCR können in situ mit gesteigerter Zuverlässigkeit im Methodentransfer erprobt werden.
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Der zweite Aspekt der Erfindung ist auch eine signifikante Verbesserung.
HotStartTM-Verfahren blockieren nur Voramplifizierungs-Nebenreaktionen, die nicht-spezifische Produkte
liefern; SSBs scheinen auch Fehl-Priming zu reduzieren, das während des thermischen
Kreisprozesses auftritt. Deshalb reduzieren SSBs effektiver nicht-spezifische Amplifikation. Das
Einschließen von SSB in das PCR-Reaktionsgemisch beseitigt auch die Notwendigkeit, ein
manuelles HotStartTM-Verfahren durchzuführen, das einiges Bedienungsfachwissen erfordert,
um einen zeitlich genau festgelegten Zusatz von fehlendem PCR-Reagenz zu erreichen, ohne
die in situ-PCR-Präparation zu beschädigen oder auszutrocknen. Ein Verfahren, bei dem alle
Komponenten des Testsystems bei Raumtemperatur zusammengesetzt und mit einer
Dampfbarriere bedeckt werden, bevor das Heizen begonnen wird, ist zuverlässiger als eines, das die
Handhabung von heißen Materialien und Dampfbarrierezusatz zu einem heißen System
erfordert.
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Durch Vereinfachung der Routineanwendung von in situ-PCR weiten die ersten beiden
Aspekte der Erfindung den ultrasensiblen Nachweis von Nukleinsäuren auf neue Märkte und
praktische Probleme aus, wie sie in der klinischen, Veterinär- und Pflanzenpathologie
vorliegen. Diese Fachrichtungen sind häufig auf Informationen hinsichtlich der
Analytenlokalisierung in biologischen Proben angewiesen, um kritische Entscheidungen zu treffen;
herkömmliche PCR liefert nicht leicht diese Information. Weiterhin ist in situ-PCR praktisch immun
gegen die Erstellung von falsch-positiven Resultaten durch Kontamination von Reaktionen
mit amplifiziertem Ziel aus vorhergehenden Reaktionen, da der Analyt subzelluläre
Lokalisierung zeigt, normalerweise im Kern. Zusätzlich erlaubt z. B. Vielfach-Färbung für
Zelloberflächen-Antigene Krankheitsdiagnosen und Prognose basierend auf Infektionsraten von
zellulären Subpopulationen. In situ-PCR, angewendet auf Blut oder Biopsieproben von Patienten,
von denen angenommen wird, dass sie mit einem lymphotrophischen Retrovirus wie HIV-1
infiziert sind, sollten nützliche Vorhersageinformationen wie die Fraktion von CD4
(Oberflächenantigen) plus Zellen, die integrierte virale Genome oder virale Partikel tragen, liefern.
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Die modifizierten Heizblöcke dieser Erfindung werden die Geschwindigkeit und
Zuverlässigkeit von in situ-PCR, durchgeführt auf Mikroskop-Objektträgern, steigern, durch
Beschleunigen und Vereinheitlichen des Hitzetransfers, der während des thermalen Kreisprozesses
auftritt.
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Um das Verständnis der Erfindung zu fördern, werden nachstehend Definitionen für die
folgenden Ausdrücke bereitgestellt.
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"PCR" bezieht sich auf ein Verfahren der Amplifizierung einer oder mehrerer spezifischer
Nukleinsäuresequenzen, wobei (1) Oligonulcleotid-Primer, die die Enden der zu
amplifizierenden Sequenz bestimmen, an Einzelstrang-Nukleinsäuren in einer Testprobe angelagert
werden, (2) eine Nukleinsäure-Polymerase das 3'-Ende des angelagerten Primers verlängert,
um einen Nukleinsäurestrang, der in der Sequenz komplementär zu der Nukleinsäure ist, an
die die Primer angelagert wurden, herzustellen, (3) die resultierende
Doppelstrang-Nukleinsäure denaturiert wird, um zwei Einzelstrang-Nulcleinsäuren zu gewinnen und (4) die
Verfahren der Primer-Anlagerung, Primer-Verlängerung und Produktdenaturierung häufig genug
wiederholt werden, um leicht zu identifizierende und zu messende Mengen der Sequenz, die
durch die Primer definiert ist, herzustellen. Praktische Kontrolle der aufeinanderfolgenden
Anlagerungs-, Verlängerungs- und Denaturierungsschritte wird durchgeführt durch Variieren
der Temperatur des Reaktionsbehälters, normalerweise in sich wiederholender zyklischer Art.
Anlagerung und Verlängerung erfolgt optimal in dem Temperaturbereich von 40º bis 80ºC
(exakte Werte hängen von der Primer-Konzentration und den Sequenzen ab), wohingegen
Denaturierung Temperaturen in dem Bereich 80º bis 100ºC erfordert (der exakte Wert hängt
von der Zielsequenz und Konzentration ab).
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Dieser "thermische Kreisprozess" wird normalerweise durch eine thermische
Kreisprozesseinrichtung automatisiert, ein Instrument, das schnell (in einem Zeitraum von einer bis mehreren
Minuten) eine Probenkammer heizt und kühlt, einen teilweise oder vollständig
eingeschlossenen Behälter, der das Gefäß, in dem die Nukleinsäure-Amplifikation stattfindet und das
Hitzetransfermedium, das direkt das PCR-Gefäß kontaktiert, hält. Am häufigsten ist die
Probenkammer ein "Probenblock", normalerweise hergestellt aus Metall, vorzugsweise Aluminium.
Herkömmlich enthalten Probenblöcke Vertiefungen, konstruiert, um eng an die
Plastik-Mikrozentrifugenröhrchen, in denen PCR-Amplifizierung normalerweise durchgeführt wird, zu
passen. Der Probenblock der vorliegenden Erfindung ersetzt einige oder alle dieser konischen
Vertiefungen durch flache Oberflächen oder Schlitze, konstruiert, um das Heizen und Kühlen
von Mikroskop-Objektträgern zu optimieren. Weniger häufig ist die Probenkammer eine
Kammer, durch die sich heiße oder kalte Hitzetransferflüssigkeit wie Luft oder Wasser an
Reaktionsröhrchen, die in die Flüssigkeit getaucht werden, vorbeibewegt.
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Der Begriff "PCR-Reagenzien" bezieht sich auf Chemikalien, getrennt von
Testproben-Nukleinsäure, die benötigt werden, um Nukleinsäure-Amplifizierung möglich zu machen. Sie
bestehen aus fünf Klassen von Bestandteilen: (1) ein wässriger Puffer, (2) ein wasserlösliches
Magnesiumsalz, (3) wenigstens vier Desoxyribonukleosid-Triphosphate (dNTPs), (4)
Oligonukleotid-Primer (normalerweise zwei für jede Zielsequenz, mit Sequenzen, die das 5'-Ende
von zwei komplementären Strängen der doppelsträngigen Zielsequenz definieren) und (5) eine
Polynukleotid-Polymerase, vorzugsweise eine DNA-Polymerase, insbesondere bevorzugt eine
thermostabile DNA-Polymerase, die Temperaturen zwischen 90º und 100ºC tolerieren kann
für eine Gesamtlaufzeit von wenigstens 10 Minuten, ohne mehr als etwa die Hälfte ihrer
Aktivität zu verlieren.
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Die vier herkömmlichen dNTPs sind Desoxythymidin-Triphosphat (dTTP), Desoxyadenosin-
Triphosphat (dATP), Desoxycytidin-Triphosphat (dCTP) und Desoxyguanosin-Triphosphat
(dGTP). Sie können angereichert oder manchmal ersetzt werden durch dNTPs, die
Basenanaloga mit Watson-Crick-Basenpaarung wie die herkömmlichen vier Basen enthalten. Beispiele
für solche Analoga schließen Desoxyuridin-Triphosphat (dUTP) und dUTP-tragende
molekulare Markierungen wie etwa Biotin und Digoxigenin, kovalent gebunden an die Uracilbase
durch Spacer-Arme, ein.
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Während ein "vollständiger Satz" von PCR-Reagenzien sich auf die Gesamtkombination von
essenziellen Reaktanten mit Ausnahme der Testproben-Nukleinsäure bezieht, fehlt einem
"Teilsatz" von PCR-Reagenzien wenigstens eine der essenziellen Reagenzien mit Ausnahme
des wässrigen Puffers. Die "Ergänzung" oder der "komplementäre Teilsatz" zu einem ersten
PCR-Reagenz Teilsatz besteht aus allen Reagenzien, die in dem ersten Teilsatz fehlen. PCR-
"Reaktanten" bezieht sich auf die PCR-Reagenzien plus Testproben-Nukleinsäure.
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"HotStartTM-PCR" bezieht sich auf PCR-Amplifikation, in der ein Teilsatz von Reagenzien
getrennt von ihrer Ergänzung und der Testprobe gehalten wird, bis die letzteren Bestandteile
auf eine Temperatur zwischen etwa 50º und etwa 80ºC erhitzt wurden, heiß genug, um nicht-
spezifische Polymeraseaktivität zu minimieren. Nachdem alle PCR-Reaktanten gemischt
wurden, wurde der thermische Kreisprozess mit kontrollierter Reaktionstemperatur gestartet, so
dass sie nie unter etwa 50ºC fällt, bis die Amplifizierung vollständig ist.
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"Fixierte Zellen" bezieht sich auf eine Probe von biologischen Zellen, die chemisch behandelt
wurden, um zelluläre Strukturen zu stärken, genauer Membranen gegen Zerstörung durch
Lösungsmittelwechsel, Temperaturveränderungen, mechanischen Stress und Trocknung.
Zellen können entweder in Suspension fixiert werden oder während sie in einer Gewebeprobe
enthalten sind, wie sie während Autopsie, Biopsie oder Chirurgie erhalten werden.
Zell-Fixative sind normalerweise Chemikalien, die die Proteinbestandteile von zellulären Strukturen
quervernetzen, am häufigsten durch Reagieren mit Protein-Aminogruppen. Bevorzugte
Fixative sind gepuffertes Formalin, 95%iger Ethanol, Formaldehyd, Paraformaldehyd oder
Glutaraldehyd. Fixierte Zellen können auch mit Proteinasen behandelt werden, Enzymen, die
Proteine verdauen, oder mit Surfaktanzien oder organischen Lösungsmitteln, die Membranlipide
lösen, um die Permeabilität von fixierten Zellmembranen für PCR-Reagenzien zu vergrößern.
Solche Behandlungen müssen der Fixierung folgen, um sicherzustellen, dass
Membranstrukturen nicht vollständig auseinanderfallen, wenn die Lipide entfernt werden oder die Proteine
teilweise gespalten werden. Proteasebehandlung folgt bevorzugt auf Fixierung für mehr als 1
Stunde und folg weniger bevorzugt auf kürzere Fixierungsintervalle. Zum Beispiel ist eine 10
Minuten-Fixierung in gepuffertem Formalin ohne Proteasebehandlung Standard, nachdem
suspendierte Zellen (z. B. aus Blut) durch Zentrifugation auf einen Objektträger gebracht
wurden durch Cytospin-Verfahren, die auf cytochemischem Gebiet Standard sind.
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"Histochemische Schnitte" bezieht sich auf eine feste Probe biologischen Materials, das
gefroren oder chemisch fixiert wurde und durch Einbettung in ein Wachs oder Plastik gehärtet
wurde, in eine dünne Scheibe geschnitten wurde, normalerweise einige Mikrometer dick, und
auf einen Mikroskop-Objektträger gebracht wurde.
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"Cytochemischer Abstrich" bezieht sich auf eine Lösung von Zellen wie Blutzellen, die
chemisch fixiert und auf einen Mikroskop-Objektträger gebracht wurden.
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"In situ-PCR" bezieht sich auf PCR-Amplifikation durchgeführt in fixierten Zellen, so dass
die spezifisch amplifizierte Nukleinsäure im wesentlichen in der Zelle oder in der
subzellularen Struktur enthalten ist, die ursprünglich die Ziel-Nukleinsäuresequenz, die der spezifischen
Amplifikation unterzogen wurde, enthielt. Die Zellen können in wässriger Lösung sein oder
können Teil eines histologischen Schnitts oder cytochemischen Abstrichs sein. Bevorzugt
werden die Zellen für PCR-Reagenzien durchlässig gemacht durch Proteaseverdau oder durch
Lipidextraktion mit Surfaktanzien oder organischen Lösungsmitteln. Eine "in
situ-PCR-Präparation" besteht aus einer Kombination von fixierten Zellen mit einem Teilsatz oder
vollständigen Satz von PCR-Reagenzien.
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"Dampfbarriere" bezieht sich auf ein organisches Material, in dem Wasser unlöslich ist, das
eine PCR-Reaktion oder Präparation so bedeckt, dass im wesentlichen der Wasserverlust an
die Atmosphäre während des thermischen Kreisprozesses reduziert wird. Bevorzugte
Dampfbarrieren-Materialien sind flüssige Wasserkohlenstoffe wie Mineralöl oder Paraffinöl, obwohl
auch einige synthetische organische Polymere wie Fluorkohlenstoffe und Silikongummi als
effektive PCR-Dampfbarrieren dienen können. Wachse, die bei Temperaturen unter 50ºC fest
sind und flüssig bei höheren Temperaturen, sind ebenso geeignete Dampfbarrieren. Die
Dampfbarriere kann ein dünner Plastikfilm sein, der in eine Hülle, die vollständig die in situ-
PCR-Präparation umschließt, gebracht wird oder der auf einem Mikroskop-Objektträger, der
eine in situ-PCR-Präparation trägt, geklebt ist, so, dass die Reaktion von der Atmosphäre
isoliert ist.
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"Einzelstrang-DNA-Bindeprotein" (SSB) bezieht sich auf ein Polypeptid, das an Einzelstrang-
DNA stärker bindet als an Doppelstrang-DNA. Natürlich vorkommende SSBs schließen das
Bakteriophagen T4 Gen 32-Protein, das filamentöser Bakteriophage-Gen 5-Protein, das SSB
aus E. coli mit einem Untereinheit-Molekulargewicht von 19 kD, das 30
kD-Bewegungsprotein von Tobamovirus und Agrobacterium tumefaciens vir E2-Protein ein.
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"Nachweis" von PCR-amplifizierter Nukleinsäure bezieht sich auf das Verfahren der
Beobachtung, Lokalisierung oder Quantifizierung eines analytischen Signals, von dem
angenommen wird, dass es spezifisch mit dem Produkt der PCR-Amplifizierung in Zusammenhang
steht, wie von PCR-Reaktanten unterschieden. Das analytische Signal kann aus sichtbarer
oder ultravioletter Absorption oder Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder den
photographischen oder autoradiographischen Bildern der Absorption, Fluoreszenz, Chemilumineszenz
oder Ionisierungsstrahlung resultieren. Der Nachweis von in situ-PCR-Produkten schließt die
mikroskopische Beobachtung oder Dokumentation solcher Signale ein. Das Signal wird direkt
oder indirekt von einem molekularen "Marker" abgeleitet, der an einen PCR-Primer oder
dNTP oder an eine Nukleinsäuresonde geheftet ist, wobei der Marker ein radioaktives Atom,
ein Chromophor, ein Fluorophor, ein chemiluminszentes Reagenz oder ein Enzym sein kann,
das in der Lage ist, ein gefärbtes, fluoreszentes oder chemilumineszentes Produkt herzustellen,
oder eine Bindungsgruppe, die in der Lage ist, eine Reaktion mit einem anderen Molekül oder
Partikel einzugehen, das ein analytisches Signal direkt trägt oder katalytisch herstellt.
Gewöhnliche Bindungsgruppen sind Biotin, das fest an Streptavidin oder Avidin bindet,
Digoxigenin, das fest an anti-Digoxigenin-Antikörper bindet, und Fluorescein, das fest an anti-
Fluorescein-Antikörper bindet. Das Avidin, Streptavidin und die Antikörper können leicht an
Chromophoren, Fluorophoren, radioaktive Atome oder Enzyme, die in der Lage sind,
gefärbte, fluoreszente oder chemilumineszente Signale herzustellen, gebunden werden.
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"Nukleinsäureprobe" bezieht sich auf ein Oligonulcleotid oder Polynukleotid, das eine
Sequenz enthält, die komplementär zu einem Teil oder der ganzen PCR-Zielsequenz ist, und
ebenso eine Markierung enthält, die verwendet werden kann, um Zellen in einer in situ-PCR-
Präparation zu lokalisieren, die die Markierung nach Mischung mit Nukleinsäuresonde und
unter Lösungs- und Temperaturbedingungen, die Sondenanlagerung an
spezifisch-amplifizierte Nukleinsäure fördern, beibehält.
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Ein bevorzugtes Verfahren zur Fixierung von Zellproben für in situ-PCR gemäß der
vorliegenden Erfindung besteht darin, sie in 10% Formalin, 0,1 M Na Phosphat, pH 7,0, für einen
Zeitraum von 10 Minuten bis 24 Stunden bei Raumtemperatur zu inkubieren. Die Zellen
können eine Suspension sein, so wie sie aus Blut oder einer Blutfraktion wie "buffy coat"
gewonnen würden, oder können ein festes Gewebe sein, wie es aus Biopsie, Autopsie oder
chirurgischen Verfahren, die in der klinischen Pathologie gut bekannt sind, gewonnen würden. Wenn
PCR in Zellsuspension durchgeführt werden soll, werden die suspendierten Zellen
vorzugsweise nach Formalinfixierung zentrifugiert, in phosphatgepufferter Saline resuspendiert und
wieder zentrifugiert, um das Fixativ zu entfernen. Die gewaschenen pelletierten Zellen können
in PCR-Puffer resuspendiert und direkt in ein PCR-Röhrchen gegeben werden. Wenn PCR auf
einem Mikroskop-Objektträger durchgeführt werden soll, werden die suspendierten Zellen
vorzugsweise durch Cytospin auf dem Objektträger hinterlegt, 10 Minuten in gepuffertem
Formalin fixiert, 1 Minute in Wasser gewaschen und 1 Minute in 95% Ethanol gewaschen.
Alternativ können suspendierte Zellen in einem Zentrifugenröhrchen pelletiert werden und das
Pellet kann in Paraffin eingebettet werden und wie eine Gewebeprobe behandelt werden.
Gewebeproben können weiterbehandelt werden und dann in Paraffin eingebettet und
verkleinert werden auf eine Serie von 4-5 um Schnitten durch Mikrotom-Verfahren, die Standard in
der klinischen Pathologie sind. Histochemische Schnitte werden direkt auf einem Mikroskop-
Objektträger platziert. In beiden Fällen werden die Mikroskop-Objektträger bevorzugt mit 2%
3-Aminopropyltriethoxysilan in Aceton behandelt und luftgetrocknet. Nachdem Abstriche
oder Schnitte auf die Objektträger gebracht wurde, werden die Objektträger bei etwa 60ºC für
etwa 1 Stunden erhitzt. Paraffin-eingebettete-Schnitte können deparaffinisiert werden durch
zwei aufeinanderfolgende 5 Minuten-Waschungen in Xylen und zwei aufeinanderfolgende 5
Minuten-Waschungen in 100% Ethanol, wobei alle Waschschritte bei Raumtemperatur mit
leichter Bewegung stattfinden.
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Die Auswahl von PCR-Primer-Sequenzen, Vorbereitung von PCR-Reagenzien und
Reaktionsgemischen und Konstruktion und Durchführen von PCR-Reaktionen sind gut bekannte
Verfahren in der PCR-Technik. In dem Fall, dass Nukleinsäure-Amplifikation auf
suspendierten Zellen in einem Standard-PCR-Röhrchen durchgeführt wird, werden die Zellen wie in
herkömmlichen PCR-Testproben behandelt: in dem Reaktionsgemisch, kurz bevor die
Amplifikation begonnen wird, werden die Zellen verdünnt, bei einer Gesamtzellzahl im Bereich
etwa von 100 bis etwa 106. Um den ersten Aspekt der Erfindung in einem Reaktionsröhrchen
durchzuführen, ist die einzige Abwandlung der herkömmlichen PCR-Praxis, dass wenigstens
ein Reagenz, vorzugsweise das Enzym, aber auch möglicherweise Primer oder dNTPs oder
MgCl&sub2;
aus dem Reaktionsgemisch weggelassen werden. Nachdem 50 bis 100 ul Mineralöl in
das Reaktionsröhrchen gegeben wurden, wird das Röhrchen in eine thermische
Kreisprozesseinrichtung gebracht, von der viele Versionen kommerziell erhältlich sind, und erhitzt auf eine
Temperatur zwischen etwa 50º und etwa 80ºC, vorzugsweise zwischen 70º und 80ºC.
Während das Röhrchen bei dieser Temperatur gehalten wird, wird das fehlender Reagenz unter die
Dampibarriere mit einer Standard-Handpipette, vorzugsweise in einem 5 bis 15 ul Volumen-
PCR-Puffer geliefert. Wenn mehrere Proben simultan in verschiedenen Röhrchen amplifiziert
werden, wird eine frische Pipettenspitze verwendet, um das fehlende Reagenz (Reagenzien)
zu jedem Röhrchen zuzufügen, um Kreuzkontaminationen zu verhindern. Nachdem alle
Röhrchen vorbereitet und geschlossen wurden, wird das Standard-drei-Temperatur-thermische
Kreisprozessprogramm von Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung für etwa 10 bis 40
Kreisprozessen unter der Kontrolle eines thermischen Kreisprozess-Mikroprozessors
durchgeführt. Alternativ und häufig bevorzug wird eine Serie von zwei-Temperatur-Kreisprozessen
durchgeführt, wobei Anlagerung und Verlängerung bei einer einzelnen Temperatur
durchgeführt werden; normalerweise ist dies für stringente Anlagerung von Primern an Vorlagen
optimiert. Weil die Reaktionsraten bei zellulären Präparationen etwas verzögert werden
können im Vergleich zu zellfreien Nukleinsäuren, kann es notwendig sein, die Dauer der
Denaturierung, Anlagerung, Verlängerung oder Anlagerungs-Verlängerungs-Kreisprozess-Segmente
bis auf ein Mehrfaches der Standardwerte von Testproben mit zellfreier Nukleinsäure zu
steigern. Diese Anpassung wird leicht durch Ausprobieren durchgeführt, wobei man nach
Bedingungen sucht, die die Intensität des Signals, das sich während des Nachweises von
amplifizierten Nukleinsäuren zeigt, maximieren oder die die Anzahl der benötigten Zyklen, um eine
gegebene Signalintensität zu erreichen, minimieren. Ein ähnliches Optimierungsverfahren
kann verwendet werden für MgCl&sub2;, dNTP, Primer und Enzymkonzentrationen in dem
Reaktionsgemisch; diese Parameter zeigen häufig verschiedene Optima für verschiedene Ziele.
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Um den zweiten Aspekt der Erfindung in einem Reaktionsröhrchen durchzuführen, werden
verschiedene Veränderungen der bevorzugten Art und Weise, die beschrieben wurde,
benötigt. Es besteht keine Notwendigkeit, das vorstehend beschriebene manuelle
HotStartTM-Verfahren durchzuführen; alle Reaktanten können gemischt und die Dampfbarriere kann bei
Raumtemperatur zugefügt werden, bevor der thermische Kreisprozess gestartet wird.
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Es ist jedoch wichtig, dass die Reagenzien in einer Reihenfolge gemischt werden, so dass das
SSB nicht zuletzt zugefügt wird. Vorzugsweise wird SSB mit Primern vorgemischt und die
beiden Reagenzien werden zusammen den übrigen Reaktanten zugefügt. Die optimale
Quantität von SSB wird mit der Identität des SSB und mit der Quantität von Einzelstrang-DNA in
jeder Reaktion variieren und kann durch Ausprobieren gemäß den oben gegebenen Kriterien
zur Optimierung von thermalen Kreisprozessparametern bestimmt werden. Da zelluläre
Präparationen normalerweise wenig Einzelstrang-DNA enthalten sollten, erlaubt die Menge der
Primer in einer Reaktion die Annäherung der optimalen Quantität der SSB auf die folgende
Art: (1) ermittle die Gesamtmole von allen Primern von der Anzahl der verwendeten Primer,
ihre Konzentration und das Reaktionsvolumen; (2) teile die durchschnittliche Primerlänge
durch den bekannten Wert für den "Footprint" des speziell verwendeten SSB und runde auf zu
der nächsten ganzen Zahl; (3) multipliziere diese Ganzzahl der Gesamtmole von Primern, um
die Gesamtmole von SSB, die benötigt werden, um mit allen Primern zu reagieren, zu
erhalten, und (4) füge eine Menge von SSB gleich zu dem 0,5- bis 2-fachen der kalkulierten
minimalen Menge von SSB zu. Weitere Anpassungen können durch Ausprobieren durchgeführt
werden. Der SSB-"Footprint" ist die Anzahl von Nukleotiden, die eine SSB-Bindestelle
besetzen. Die folgenden angenäherten SSB-"Footprints" wurden in der Forschungsliteratur
beschrieben: 8 Nukleotide für Bakteriophage T4-Gen 32-Protein; zwischen 33 und 65
Nukleotiden pro E. coli-SSB-Tetramer; 5 Nukleotide pro filamentöser Phage-Gen 5-Proteinmonomer;
4 bis 7 Nukleotide pro 30 kD Tobamovirus-Bewegungsproteinmonomer; 30 Nukleotide pro
64 kD Agrobacterium tumefaciens vir E2-Proteinmonomer.
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Wenn der erste und zweite Aspekt der Erfindung auf fixierte Zellen, die in einem Standard-
PCR-Röhrchen suspendiert sind, angewendet wird, ist die bevorzugte post-PCR-Behandlung,
die für Mikroskopanalysen erforderlich ist, die gleiche. Die Zellen werden pelletiert und
einmal in phosphatgepufferter Saline gewaschen, bevor sie auf Organosilan-behandelten
Objektträger, wie vorstehend beschrieben, hinterlegt werden, entweder als ein Abstrich oder als ein
Mikrotom-Schnitt durch ein Paraffineingebettetes Pellet. Erhitzen bei 60ºC für 1 Stunde
verbessert die Zellanheftung auf den Objektträger.
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Falls der erste oder zweite Aspekt der Erfindung auf histochemische Schnitte oder
cytochemische Abstriche, die auf Mikroskop-Objektträger aufgebracht sind, angewendet wird,
unterscheidet sich das Amplifikationsverfahren etwas von dem vorstehend beschriebenen für
Reaktionen in PCR-Röhrchen. Eine bevorzugte Art, den ersten Aspekt der Erfindung auf
Mikroskop-Objektträgern durchzuführen, besteht darin, den Schnitt oder Abstrich mit annähernd 5
bis 10 ul eines PCR-Reaktionsgemisches, dem wenigstens ein Reagenz wie ein Enzym fehlt,
zu bedecken. Dann wird ein Plastikdeckgläschen über diese Präparation platziert, der
Mikroskop-Objektträger wird in ein Aluminiumfolienboot platziert, etwa 5 bis 10 mm tief, der
Boden davon ist etwas größer als der Objektträger und das Boot wird auf einen thermischen
Kreisprozessprobenblock platziert. Nachdem der Probenblock auf etwa 80ºC gebracht wird
und bei dieser Temperatur gehalten wird, wird das Deckgläschen gehoben und 2 bis 10 ul der
PCR-Puffer-enthaltenden fehlenden Reagenzien werden quer über die Oberfläche des
Reaktionsgemisches verteilt. Das Deckgläschen wird wieder zurückgelegt, bevor die in situ-PCR-
Präparation austrocknet, ein Tropfen Nagellack wird auf eine Ecke des Deckgläschens
gegeben, um es auf dem Objektträger zu verankern und der Objektträger wird mit genügend
Mineralöl bedeckt, um sicherzustellen, dass alle Deckgläschen einschließlich ihrer Kanten von der
Atmosphäre geschützt sind. Vorzugsweise ist das Öl vorgeheizt, so dass seine Zufügung nicht
vorübergehend die Temperatur der in situ-PCR-Präparation reduziert. Dann wird ein
Standard-zwei-Temperatur- oder -drei-Temperatur-thermischer Kreisprozess von etwa 40 Zyklen
durchgeführt. Wie vorstehend können Kreisprozessparameter, Anzahl der Zyklen und PCR-
Reagenzkonzentrationen der Optimierung bedürfen, um abnormale Heiz- und Kühlkinetiken
der ölbedeckten Mikroskop-Objektträger zu kompensieren, und um mögliche
Reaktionsratenveränderungen, die durch die zelluläre Natur der Testproben verursacht werden, zu
kompensieren. Nach Amplifizierung wird das Mineralöl von dem Objektträger mit einem organischen
Lösungsmittel wie Xylen entfernt und die Objektträger werden mit 100% Ethanol oder einer
abgestuften Serie von Ethanolkonzentrationen getrocknet. Die ölfreie Präparation wird für
etwa 15 Minuten bei etwa 50ºC in 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0, inkubiert,
um nicht-umgesetzte PCR-Reagenzien zu entfernen. Dieser Schritt ist äußerst nützlich, wenn
Primer oder dNTPs markiert wurden.
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Eine bevorzugte Art, den zweiten Aspekt der Erfindung auf Mikroskop-Objektträgern
durchzuführen, besteht darin, dem vorstehend empfohlenen Verfahren für den ersten Aspekt mit
wenigen Veränderungen zu folgen. Das manuelle HotStartTM-Verfahren ist nicht notwendig,
obwohl es auch noch verwendet werden kann. Es wird dem Reagenzgemisch eine Menge an
SSB zugefügt, von der angenommen wird, dass sie ausreicht, um alle Einzelstrang-DNA in
der in situ-PCR-Präparation zu binden. Diese Einschätzung wird, wie vorstehend für die in
situ-PCR,
die in Reaktionsröhrchen durchgeführt wird, beschrieben, durchgeführt. Wie zuvor
ist es wichtig, dass das SSB nicht als letztes Reagenz zugefügt wird; vorzugsweise ist es
vorgemischt mit Primern, der Hauptform von Einzelstrang-DNA. Wenn das manuelle
HotStartTM-Verfahren nicht verwendet wird, wird die Gesamtpräparation gesammelt, mit
einem Plastikdeckgläschen (das auf dem Mikroskop-Objektträger mit einem Tropfen
Nagellack verankert ist) bedeckt, in dem Folienboot platziert und mit Mineralöl bei
Raumtemperatur bedeckt; eine normale Serie von thermischen Kreisprozessen wird verwendet, ohne sie
anfänglich bei 70º bis 80ºC zu halten. Die Ölentfernung nach der PCR und die
Präparationstrocknung werden wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
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Die Nachweisphase der in situ-PCR wird auf die gleiche Art durchgeführt, wenn sie dem
ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung folgt und wenn die PCR in einem Reaktionsröhrchen
oder auf einem Mikroskop-Objektträger durchgeführt wird. Es gibt zwei grundlegende
Nachweisstrategien. Die erste Strategie schließt Markieren entweder der PCR-Primer oder
wenigstens eines der dNTPs mit einem Radioisotop oder einer Bindungsgruppe wie Biotin,
Digoxigenin oder Fluorescein oder mit einer anderen Fluorophore ein. In diesem Fall kann die in die
amplifizierte Nukleinsäure eingebaute Markierung direkt analysiert werden, unter der
Voraussetzung, dass das nicht-umgesetzte markierte Reagenz nach PCR ausgewaschen wurde und
unter der Voraussetzung, dass das Wasch- und Trockenverfahren die amplifizierte
Nukleinsäure nicht von ihrem Ort der Herstellung wegbewegt hat. Die analytische Zuverlässigkeit
dieser einfachen Nachweisstrategien erfordert, dass die Erfindung eine verbesserte in situ-
PCR-Spezifität besitzt, die ausreichend ist, um nicht-spezifische Produkte, die hergestellt
wurden und die groß genug sind, um dem Waschen aus der Präparation zu widerstehen, zu
vernachlässigen. Die logisch zwingendste Kontrollreaktion ist die Anwendung des Verfahrens
auf Zellen, von denen bekannt ist, dass ihnen die Zielsequenz fehlt; die Zuverlässigkeit dieser
vereinfachten Nachweismethode erfordert, dass kein Signal in den Kontrollzellen hergestellt
wird. Häufig sind solche Kontrollzellen in einer histochemischen oder cytochemischen
Präparation anwesend, so dass die Standardanalyse ihre eigene Kontrolle enthält. Eine weniger
zwingende Kontrolle ist die Verwendung von Primern, die sich ausreichend von den
optimalen Primern für die Zielsequenz unterscheiden, so dass sie nicht die Zielsequenz unter den
spezifischen Anlagerungs- und Verlängerungsbedingungen amplifizieren.
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Die zweite Strategie schließt den Nachweis einer ampflifizierten Nukleinsäure durch in situ-
Hybridisierung an eine markierte Nukleinsäureprobe ein: ein Oligonukleotid oder
Polynukleotid mit einer Sequenz, komplementär zu wenigstens einem Teil der amplifizierten
Nukleinsäuresequenz (vorzugsweise unter Ausschluss der Primersequenz). In situ-Hybridisierung, die
in der Histochemie und Cytochemie gut bekannt ist, hat vier grundlegende Schritte:
Denaturierung von DNA in der Testprobe, Anlagerung von Sonde an Testproben-Nukleinsäure unter
stringenten Bedingungen, Waschen der Mikroskop-Objektträger mit einem Lösungsmittel
unter stringenten Bedingungen, um nicht-hybridisierte Sonde zu entfernen, und Nachweis der
Sonde, die auf dem Objektträger zurückgehalten wurde.
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Ungeachtet, welche Nachweisstrategie verwendet wird, sind die Verfahren zur Beobachtung
und zum Nachweis der Anwesenheit und Lokalisierung von Markierung auf dem Mikroskop-
Objektträger die gleichen. Wenn die Markierung ein Radioisotop ist (vorzugsweise ein starker
beta-Strahler wie ³²P oder ¹²&sup5;I) wird der Mikroskop-Objektträger mit "nuclear
track"-Emulsion wie. NTB-2 von Eastman Kodak Co. (Rochester, NY) bedeckt, bei 4ºC für einen
Zeitraum, der durch Ausprobieren bestimmt wird, inkubiert und durch Standardverfahren
entwickelt, um in der Nähe von immobilisierten Markierungen mikroskopisch nachweisbare
Silberkörnchen zu hinterlassen. Verfahren zur ¹²&sup5;I-Markierung von Sonden oder PCR-Produkten
sind beschrieben von Haase et al., supra. Wenn die Markierung eine Fluorophore ist, kann sie
in einem "Fluoreszenzmikroskop mit Anregungs- und Emissionsfiltern, die für die jeweilige
Fluorophore optimiert sind, direkt beobachtet werden. Dieses Nachweisverfahren ist speziell
geeignet für Multiplex-in situ-PCR mit verschiedenen Primerpaaren für verschiedene Ziel-
Nukleinsäuresequenzen. Entweder können verschiedene Fluorophoren an Primer mit
verschiedener Spezifität gebunden werden oder verschiedene Fluorophoren können an Sonden
mit verschiedener Spezifität gebunden werden. Verfahren zur Anheftung von Fluorophoren an
Oligonukleotide und Polynukleotide, vorzugsweise an ihrem 5'-Ende, sind gut bekannt im
Feld der Nukleinsäurechemie und PCR. Wenn die Markierung eine Bindegruppe wie Biotin
oder Digoxigenin ist, wird sie direkt in das PCR-Produkt aufgenommen (durch Primer oder
dNTPs) oder in Sonden durch im wesentlichen die gleichen Verfahren, die verwendet werden,
um andere Markierungen anzuhängen. Jedoch erfordert die Signalerzeugung in diesem Fall
zusätzliche Nachweisschritte. Vorzugsweise wird der Mikroskop-Objektträger in gepuffertem
wässrigem Lösungsmittel inkubiert, das ein kovalentes Konjugat eines Nachweisenzyms und
ein Bindeprotein, spezifisch für die Markierung (Avidin oder Streptavidin für Biotin, ein anti-
Digoxigenin-Antikörper für Digoxigenin, ein anti-Fluorescein-Antikörper für Fluorescein),
enthält. Das bevorzugte Nachweisenzym ist Meerrettichperoxidase oder alkalische
Phosphatase. Nachdem ungebundenes Enzym-Konjugat durch Waschen in einem gepufferten
wässrigen Lösungsmittel entfernt wurde, wird der Mikroskop-Objektträger in einer Lösung, die ein
chromogenes Substrat für das verwendete Enzym enthält, getaucht. Nachdem ein unlöslicher
Farbstoff, das Produkt der Enzymreaktion, an den Punkten auf dem Mikroskop-Objektträger
aufgebracht wurde, wo Enzym-Konjugat gebunden wurde, wird nicht-umgesetztes Substrat
mit Wasser oder gepuffertem wässrigem Lösungsmittel abgewaschen, um zu verhindern, dass
sich über die Zeit eine nicht-spezifische Hintergrundfärbung entwickelt. Die bevorzugten
chromogenischen Substrate, die unlösliche Produkte entwickeln, sind in der Histochemie und
Cytochemie gut bekannt, wie auch die Verfahren zur Färbung und für
Enzym-Konjugatinkubation und Waschung. Die Substrate und Enzym-Konjugate sind kommerziell erhältlich aus
verschiedenen Quellen, die Histochemikern und Cytochemikern gut bekannt sind.
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Ein bevorzugtes Begleitverfahren in den Nachweisschritten der vorliegenden Erfindung ist die
Gegenfärbung von Mikroskop-Objektträgern mit Fluoreszenzfarbstoffen (für
Fluoreszenzmarkierungen) oder mit chromophorischen Farbstoffen (für den autoradiographischen
Nachweis oder enzymatische Herstellung von unlöslichen Chromophoren), die mit anderen
spektralen Eigenschaften als die analytspezifischen Signale emittieren oder absorbieren und die
Zellstrukturen hervorheben, besonders in Zellen, denen die Ziel-Nukleinsäuresequenz fehlt.
Besonders bevorzugt zur Untersuchung von unlöslichen blaugefärbten Ablagerungen durch
Transmissions-Mikroskopie ist die Gegenfärbung durch "nuclear fast red", was Standard in
der Histochemie und Cytochemie ist. Die Verfahren zur Untersuchung von gefärbten in situ-
PCR-Präparationen durch Transmission oder Fluoreszenzmikroskopie sind in der Histochemie
und Cytochemie gut bekannt sowie Methoden zur dauerhaften Dokumentation der
mikroskopischen Bilder, photographisch oder durch digitalisierte Videobilder.
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Wenn der erste oder zweite Aspekt der Erfindung auf fixierte Zellen, die in einem
PCR-Röhrchen gelöst sind, angewendet wurde, ist eine alternative Art des Nachweises zu der
Auflagerung auf einen Objektträger zur mikroskopischen Untersuchung die direkte
Durchflusscytometrie der suspendierten Zellen. Durchflusscytometrie ist am besten angepasst an
Fluoreszenzsignale, entweder aufgenommen in eine amplifizierte Nukleinsäure während in situ-PCR
oder gebunden an eine amplifizierte Nukleinsäure durch Probenhybridisierung nach PCR. Es
ist in jedem Fall wichtig, dass die Zellen durch Sedimentation und Resuspendierung in
markierungsfreiem, gepuffertem, wässrigem Lösungsmittel gewaschen werden, um
sicherzustellen, dass die Markierung, die nicht mit amplifizierten Nukleinsäuren in Zusammenhang steht,
vollständig entfernt wird. Durchflusscytometrie-Verfahren, die Zellbiologen gut bekannt sind,
sind hauptsächlich nützlich für die Zählung der Verteilung von Zellen, die Markierung
enthalten und denen Markierung fehlt, obwohl sie auch die quantitative Verteilung von
Markierung unter den Zellen dokumentieren kann.
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Eine bevorzugte Art, den Probenblock herzustellen und Instrumentaspekt der Erfindung ist
das Herstellungsverfahren für herkömmliche thermische
Kreisprozesseinrichtungs-Probenblöcke zu modifizieren, um gerade die obere Oberfläche zuverändern, so dass sie für Hitzefluss
zu und von Mikroskop-Objektträgern optimiert ist. Zwei sehr unterschiedliche Konstruktionen
werden zur Verfügung gestellt. Erstens, für in situ-PCR-Anwendungen, bei denen sehr wenige
Objektträger gleichzeitig behandelt werden, ist die Deckfläche konstruiert, um flache
horizontale Bereiche herzustellen, die groß genug sind, um Objektträger zu halten, so dass die
großen Ausmaße (Höhe und Breite) horizontal sind. Diese flachen Bereiche können flache
Vertiefungen enthalten, die eine Mineralöl-Dampfbarriere halten, die die Objektträger
bedeckt. Die Bereiche müssen wenigstens etwa 16 mm breit und 77 mm lang sein, um für
herkömmliche Glas-Mikroskop-Objektträger zu passen. Die Vertiefungen müssen wenigstens
etwa 2 mm tief sein, um für einen Objektträger plus Deckgläschen plus Dampfbarriere zu
passen. Diese Konstruktion ist entweder mit dem ersten oder dem zweiten Aspekt der Erfindung
kompatibel.
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Ebenfalls, für in situ-PCR-Anwendungen, bei denen viele Objektträger gleichzeitig behandelt
werden, ist der Block so konstruiert, um viele enge, tiefe, vertikale oder annähernd vertikale
Schlitze zu enthalten, deren Größe so eingestellt ist, um Objektträger zu halten, die seitlich
eingefügt werden mit minimalem Abstand, der den Objektträger von den Metalloberflächen
trennt, die den unteren und oberen Oberflächen des Objektträgers gegenüberstehen. Der
dazwischenliegende Raum wird normalerweise mit Mineralöl oder einer anderen,
nichtflüchtigen Flüssigkeit gefüllt, um eine Dampfbarriere und effizienten Hitzetransfer während des
thermischen Kreisprozesses zur Verfügung zu stellen. Die Ebene eines Schlitzes kann von der
Vertikalen bis zu 45% geneigt sein, um die Schwerkraft zu benutzen, um sicherzustellen, dass
eine Oberfläche der Objektträger das Metall des Probenblocks berührt. Die Schlitze müssen
etwa 15 mm tief, wenigstens 77 mm lang und wenigstens 2 mm breit sein, um für einen
herkömmlichen Objektträger plus Deckgläschen zu passen. Diese Konstruktion ist mit dem
zweiten Aspekt der Erfindung kompatibel, aber ist nicht mit dem ersten Aspekt zu
bevorzugen, da sie den schnellen Zugang zu in situ-PCR-Präparationen zur Deckgläschen-Entfernung,
zur manuellen Zufügung der fehlenden PCR-Reagenz(ien) und zum Zurücklegen der
Objektträger blockiert.
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Viele verschiedene thermische Kreisprozesseinrichtungen sind kommerziell erhältlich, jede
mit einer bestimmten Probenblock-Konstruktion. Jedoch können diese
Probenblock-Konstruktionen durch Bezeichnungen von verschiedenen generellen Eigenschaften beschrieben
werden: (a) Zusammensetzung: praktisch alle sind aus Metall hergestellt, vorzugsweise
Aluminium, um Haltbarkeit und schnellen Hitzetransfer zu fördern; (b) Form und
Gesamtausdehnung von Länge, Breite und Dicke; (c) Boden und gelegentlich Seitenoberflächen sind
konstruiert, um sich mit den Heiz- und Kühlmechanismen einzugliedern, die die Blocktemperatur
bestimmen, wenn die thermische Kreisprozesseinrichtung arbeitet; (d) eine Deckfläche, die
viele Vertiefungen enthält, die so dimensioniert sind, dass sie die kleinen
Plastik-Mikrozentrifugenröhrchen eng halten, vorzugsweise mit etwa 0,5 ml Fassungsvermögen, aber
gelegentlich etwa 1,5 ml, die normalerweise verwendet werden, um
Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen durchzuführen; (e) gelegentlich sind eine oder wenige kleine Vertiefungen in einer
Oberfläche konstruiert, um eng ein Thermoelement oder eine temperaturgesteuerte
Widerstandssonde zu halten, die die Probenblock-Temperatur an den thermischen Kreisprozess-
Kontrollkreislauf zurückmeldet.
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Eine bevorzugte Art, den dritten Aspekt der Erfindung zu realisieren, ist, nur die
Deckoberfläche des Probenblocks zu verändern, wobei die anderen Konstruktionseigenschaften (mit
Ausnahme vielleicht der Blockdicke) im wesentlichen unverändert bleiben, um die Einwirkung
der Erfindung auf die Herstellung und Leistung der thermischen Kreisprozesseinrichtung zu
minimieren. Es ist ebenso bevorzugt, den erfindungsgemäßen Probenblock in der Masse
gleich dem herkömmlichen Probenblock der fraglichen thermischen Kreisprozesseinrichtung
zu machen, um den Einfluss auf Heiz- und Kühlkinetiken zu minimieren.
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Thermische Kreisprozesseinrichtungs-Probenblöcke werden üblicherweise hergestellt durch
maschinelle Bearbeitung eines einzelnen Metallblocks, z. B. mit einem Bohrer, genaue Ausmaße,
Vertiefungen und andere Konturen müssen sich in den Rest der thermischen
Kreisprozesseinrichtung eingliedern. Löcher zur Befestigung des Blocks an den Rest der thermischen
Kreisprozesseinrichtung können mit einem Bohrer hergestellt werden. Die gleichen
Herstellungsverfahren sind geeignet für den Probenblock der vorliegenden Erfindung. Jedoch kann
die geradlinige Form von Vertiefungen, die angepasst ist, um eng an Mikroskop-Objektträger
zu passen, auch leicht durch Stempeln oder maschinelle Bearbeitung (einschließlich Laser
oder Wasserstrahlschneiden) der relativ dünnen Metallblätter, die verbunden sind, um einen
geschichteten Aufbau herzustellen, hergestellt werden. Der gesamte Block kann geschichtet
sein oder nur der obere Teil, der die Mikroskop-Objektträger-Vertiefungen hält, kann
geschichtet und mit einem festen Grundteil verbunden sein, der die Eigenschaften des Blocks
mit dem Rest der thermischen Kreisprozesseinrichtung in Verbindung bringt.
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Ebenso bevorzugt für den dritten Aspekt der Erfindung ist eine Konstruktion des thermischen
Kreisprozesseinrichtungs-Probenblocks, die beides enthält, Vertiefungen, die für Mikroskop-
Objektträger optimiert sind und Vertiefungen, die konstruiert sind, um herkömmliche
Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionsröhrchen zu halten. Vorzugsweise werden die
Reaktionsröhrchen-Vertiefungen eine oder mehrere Reihen an den Kanten des Probenblocks besetzen,
wobei sie den inneren Bereich des Probenblocks für Mikroskop-Objektträger-Vertiefungen
reservieren. Diese Art kann auch am besten umgesetzt werden, wenn die anderen
Probenblock-Eigenschaften, einschließlich Masse des Metalls, unverändert bleiben. Die Herstellung
wird am einfachsten durch maschinelle Bearbeitung durchgeführt, weil die
Reaktionsröhrchen-Vertiefungen zylindrisch symmetrisch sind.
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Einige kommerziell erhältliche thermische Kreisprozesseinrichtungen und publizierte
thermische Kreisprozesseinrichtungen vermeiden Metall-Probenblöcke und tauchen herkömmliche
PCR-Röhrchen in einen schnell beweglichen Strom von heißer oder kalter Luft, Wasser oder
anderer Hitzetransferflüssigkeiten. Solche Konstruktionen können leicht an Mikroskop-
Objektträger angepasst werden durch Austauschen der Röhrchenhalter gegen einen
Metalldraht oder ein Plastikgitter, das die Objektträger fest in dem Fluss der Hitzetransferflüssigkeit
hält. Vorzugsweise werden die Objektträger so angebracht, dass ihre kleinste Ausdehnung
(Dicke) dem Flüssigkeitsfluss gegenübersteht und der hauptsächliche Flüssigkeitsflussvektor
in einer Ebene mit den Parallelen der Ebene ihrer größeren Ausdehnungen (Breite und Länge)
liegt. Leichtes Schrägstellen der Mikroskop-Objektträger zum Haupt-Flüssigkeitsflussvektor
kann milde Turbulenzen herstellen, die dazu beitragen, einen gleichmäßigen Hitzetransfer zu
sichern.
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Wenn die thermische Kreisprozesseinrichtung direkt Mikroskop-Objektträger mit einer
beweglichen Hitzetransferflüssigkeit in Kontakt bringt, ist es notwendig, die Objektträger von
der Hitzetransferflüssigkeit durch eine dünne Barriere, die den Materialaustausch zwischen
der in situ-PCR-Präparation und der Hitzetransferflüssigkeit verhindert, zu isolieren.
Andernfalls kann die Präparation austrocknen oder eine Auswaschung der PCR-Reagenzien erfahren.
Bevorzugte Barrieren sind Hüllen aus einem dünnen, wasserundurchlässigen Plastik mit hoher
thermaler Leitfähigkeit wie ein Fluorkohlenstoff, ein Polyurethan, ein Polyolefin, ein
Polyimid oder ein Polyamid. Die Hüllen müssen so versiegelt sein, dass sie das Auslaufen von
Flüssigkeit oder Wasserdampf in oder aus ihnen heraus verhindern. Entweder ein
wasserresistentes Klebemittel oder ein enger Clip kann entsprechend dafür sorgen, die Hülle zu
versiegeln. Wenn die Hitzetransferflüssigkeit eine Flüssigkeit ist, kann ein Ende der Hülle über die
Flüssigkeit in den Dampfraum darüber ragen. Als eine Alternative zu einer Hülle kann die
Dampfbarriere ein dünnes Plastikblatt umfassen, das annähernd die Länge und Breite eines
Mikroskop-Objektträgers hat, und ein Heißwasser-resistentes Klebemittel zugefügt in einer
engen Reihe, um alle Enden einer Oberfläche trägt. Dieses Blatt wird eng auf die obere
Oberfläche des Mikroskop-Objektträgers gepresst, bevor der thermische Kreisprozess gestartet
wird und kann danach, abgezogen werden, um den Nachweis durchzuführen. Es kann sogar
das Deckgläschen ersetzen.
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Aus der vorstehenden Beschreibung und den folgenden Beispielen kann ein Fachmann die
vielen unterschiedlichen Aspekte der vorliegenden Erfindung, wie sie durch die folgenden
Ansprüche eingeschlossen sind, verstehen.
Beispiel 1
In situ-PCR und Hybridisierungsnachweis von HPV,
integriert in humane enomische DNA
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Zellen einer stabilen humanen Gebärmutterhals-Krebszelllinie, SiHa (ATCC HTB 35),
enthaltend eine integrierte Kopie des humanen Papillomavirus (HPV) Typ 16-Genoms pro
humanem Genom, werden bis zu einer Dichte von etwa 10&sup5; Zellen/ml in Eagle's minimal
essenziellem Medium mit nicht-essenziellen Aminosäuren, Natriumpyruvat und 15% fetalem
Rinderserum kultiviert, zweifach in Tris-gepufferter Saline gewaschen, eingestellt auf eine
ungefähre Dichte von 10&sup4; Zellen/ml und geschüttelt über Nacht bei Raumtemperatur in 10%
(Volumen/Volumen) Formaldehyd in Phosphatpuffer. Die Formaldehyd-fixierten Zellen
wurden bei 2000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert und das Pellet wurde in Paraffin eingebettet.
Mikrotom-Schnitte (4 um Dicke) des Paraffinblocks wurden auf
Glas-Mikroskop-Objektträger gebracht, die in 2% 3-Aminopropyltriethoxysilan (Aldrich Chemicals Co.) in Aceton
durch Schwimmenlassen der Schnitte in ein Wasserbad eingetaucht. Nach Anheftung wurden
die Schnitte deparaffinisiert und proteolytisch verdaut mit Reagenzien aus dem Viratype® in
situ-Gewebe-Hybridisierungskit (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) unter Befolgung
der Herstelleranweisungen. (Die gleichen Reagenzien und Verfahren des Onncor S6800-Kits,
Oncor, Inc., Gaithersburg, MD, hätten genauso anstelle dessen verwendet werden können.)
Die Objektträger wurden in handgemachten Aluminiumfolien-Booten mit ungefähren
Ausmaßen von 8 · 3 · 1 mm platziert; und jedes Set von vier Schnitten (pro Objektträger) wurde mit
5 bis 10 ul PCR-Lösung (siehe unten) überschichtet. Dann wurde ein Plastikdeckgläschen
über jede der vier in situ-PCR-Schnitte gelegt. Bei herkömmlicher in situ-PCR wurde das
Deckgläschen auf dem Objektträger mit einem Tropfen Nagellack verankert, der Objektträger
wurde mit etwa 1 ml Mineralöl bedeckt, das Folienboot wurde auf die Oberfläche des
Aluminium-Probenblocks einer thermischen PCR-Kreisprozesseinrichtung gelegt und der
thermische Kreisprozess wurde begonnen. Bei manueller HotStartTM-in situ-PCR wurde das Boot,
das einen Objektträger (mit Deckgläschen) enthielt, bis 82ºC erhitzt und bei dieser
thermischen Kreisprozesstemperatur gehalten, während das Deckgläschen abgehoben wurde, 2 ul
des fehlenden PCR-Reagenz (siehe unten) wurden über die Oberfläche der Präparation
verteilt, das Deckgläschen wurde zurückgelegt und auf den Objektträger mit einem Tropfen
Nagellack geheftet und etwa 1 ml Mineralöl vorgeheizt auf 82ºC wurde über den Objektträger
und das Deckgläschen in dem Boot gelegt. Dann wurde das normale Wärmeprogramm wieder
aufgenommen.
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Die PCR-Lösung von einem pH 8,3 enthielt 10 mM TrisCl, 50 mM KCl, 4,5 mM MgCl&sub2;, 20
mM von jedem dNTP, 0,2 Einheiten/ul von AmpliTaq®-DNA-Polymerase und 6 uM von
jedem Primer. Bei "Einzel-Primerpaar"-Experimenten diktierten die Primer PV1 und PV2 ein
449 Basenpaarprodukt aus dem HPV Typ 16-Genom. Bei "multiplen Primerpaar"-Experimenten
wurden die Primer PV1 und PV7 verwendet, die eine Serie von überlappenden, etwa
450 Basenpaar-PCR-Produkten, die eine Gesamt-Sequenzlänge von 1247 Basenpaaren
bedeckten, diktieren. Alle Primersequenzen sind in der Tabelle unten angegeben.
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Bei herkömmlicher in situ-PCR waren alle vorstehend aufgelisteten Komponenten in der
PCR-Lösung, die anfangs auf die histochemischen Schnitte gegeben wurde, anwesend. Bei
manueller HotStartTM-in situ-PCR fehlten der Lösung, die anfangs auf die Schnitte gegeben
wurde, Primer und Taq-Polymerase. Diese Reagenzien wurden getrennt in 2 ul von 10 mM
TrisCl, 50 mM KCl, pH 8,3, zugegeben, nachdem der Objektträger auf 82ºC gehalten wurde.
Im ersten thermischen Kreisprozess wurde die Denaturierung für 3 Minuten bei 94ºC
durchgeführt und die Anlagerung/Verlängerung wurde für 2 Minuten bei 55ºC durchgeführt; die
verbleibenden 39 Kreisprozesse bestanden aus 1 Minute Denaturierung bei 94ºC und 2
Minuten Anlagerung/Verlängerung.
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Nach der DNA-Amplifizierung wurde das Mineralöl durch Tauchen in Xylen entfernt, das
Deckgläschen wurde entfernt und die aufgebrachten Schnitte wurden in 100% Ethanol
getrocknet. Jeder Objektträger wurde mit 10 ul einer 500 ng/ml-Lösung biotinylierter HPV
Typ 16-spezifischer Polynukleotidsonde (Viratype Kit, Life Technologies, Inc.) in 0,03 M
Natriumcitrat, 0,30 M NaCl, pH 7,5, 5% Dextransulfat, 50% Formamid bei 100ºC für 5
Minuten und bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert; dann wurde der Objektträger mit einem
alkalische Phosphatase-Streptavidin-Konjugat und den Phosphatase-Substraten 5-Bromo-4-chloro-
3-indolylphosphat (BCIP) und Nitroblau-tetrazolium (NBT) behandelt, gemäß den Anweisungen
des Herstellers des S6800-Färbekits (Oncor, Gaithersburg, MD). Nach enzymatischem
Nachweis der biotinylierten Sonde, die auf den Schnitten gehalten wurde, wurden die Schnitte
mit "nuclear fast red" für 5 Minuten gegengefärbt. Die folgenden Resultate wurden in diesem
experimentellen System erhalten, wenn die gefärbten Objektträger durch
Transmissionsmikroskopie bei 40-400-facher Vergrößerung untersucht wurden. In der herkömmlichen in situ-
PCR waren Einzelkopie-HPV-Ziele in SiHa-Zellen mit einem Einzel-Primerpaar nicht
nachweisbar, aber sie zeigten sich deutlich in den meisten Kernen mit multiplen Primerpaaren. In
der manuellen HotStartTM-in situ-PCR färbte ein Einzel-Primerpaar etwa 80% der Zellkerne
stärker als multiple Primerpaare es in herkömmlichen Verfahren taten. Die anderen 20%
können während des Schneidens beschädigt worden sein. Die vorher publizierten
Schlussfolgerungen, dass in situ-PCR multiple Primerpaare erfordert, die überlappende Ziele definieren, ist
somit ungültig. Die praktische und tatsächlich verbesserte Leistung eines Einzel-Primerpaars
vergrößert deutlich die Nützlichkeit der in situ-PCR.
Beispiel 2
In situ-PCR-Hybridisierungsnachweis von HIV-1,
integriert in humane genomische DNA
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Die humane T-Lymphozyten-Zelllinie, H9 (ATCC CRL 8543) wurde bis auf eine Dichte von
etwa 10&sup6; Zellen/ml in komplett RPMI-Medium kultiviert, mit HIV-1 wie in Basic Virological
Techniques, Seiten 66-69, beschrieben infiziert und für 4 Tage bei Raumtemperatur inkubiert.
Etwa 10&sup4; Zellen dieser Inkubation wurden Formaldehyd-fixiert, Paraffin eingebettet,
geschnitten (4 um Dicke), auf Glasobjektträger geheftet und proteolytisch permeabilisiert wie
in Beispiel 1. Herkömmliche und manuelle HotStartTM-in situ-PCR wurde wie in Beispiel 1
beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein Einzel-Primerpaar, SK38 und SK39
(Perkin-Elmer, Cetus Instruments, Norwalk, CT) verwendet wurde, das ein 115 Basenpaar-
Ziel in der HIV-1 gag-Region spezifizierte. Die Nach-PCR-Behandlung entsprach der aus
Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass die Sonde, SK19 (Perkin-Elmer Cetus Instruments) mit
Digoxigenin 11-dUTP markiert wurde unter Verwendung von Zufalls-Primern, unter
Verwendung der Reagenzien und Befolgung der Anweisung von Boehringer Mannheim
(Indianapolis, IN), Hersteller der markierten dNTP und des GeniusTM-Markierungskits. Die Färbung
der behandelten Mikroskop-Objektträger wurde mit einem alkalische Phosphatase-anti-Digoxigenin-Konjugat
und BCIP/NBT-Chromogenen durchgeführt, ebenso wie von Boehringer
Mannheim angewiesen.
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Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger zeigte, dass etwa 90% der Zellkerne mit
BCIP/NBT nach manueller HotStartTM-in situ-PCR angefärbt wurden; herkömmliche in situ-
PCR ergab keine gefärbten Kerne. Sogar ein 115 bp-Produkt schien nicht isotopisch durch
(und nur durch) die manuelle HotStartTM-methodische Verbesserung nachweisbar zu sein.
Beispiel 3
In situ-PCR-Spezifitätsverbesserung, die aus dem
HotStart-Verfahren resultiert
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Mikroskop-Objektträger, die histochemische Schnitte von eingebetteten, fixierten SiHa-Zellen
trugen, wurden wie in Beispiel 1 präpariert. Die Schnitte wurden mit etwa 50 ul humanen
peripheren Leukozyten (etwa 5000 Zellen/ml) aus einem HPV-negativen Donor angereichert,
hergestellt aus "buffy coat" und aufgebracht auf dem Objektträger durch Cytospin. Die
zugefügten Zellen wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur in 10% Formaldehyd in
Phosphatpuffer fixiert. Die Objektträger wurden herkömmlicher oder manueller HotStartTM-in situ-
PCR, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen, mit der Ausnahme, dass die dNTPs mit 5
mM Digoxigenin 11-dUTP (Boehringer Mannheim) angereichert wurden. HPV-Primerpaare
PV1 und PV2 wurden verwendet.
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Nach DNA-Amplifikation wurde alle Digoxigenin-markierte DNA, die nicht während des
Waschens und Dehydrierens entfernt wurde, mit einem alkalische
Phosphatase-anti-Digoxigenin-Konjugat und Phosphatase-Substraten BCIP und NBT gefärbt, wie von Boehringer
Mannheim, dem Hersteller der Färbereagenzien, empfohlen, mit der Ausnahme, dass die
Reagenzvolumina auf etwa 95% reduziert wurden, um histochemischen Schnitten mehr entgegen
zu kommen als Southern-Blot-Membranen. Nach Färbung der amplifizierten DNA wurden die
Leukozyten immunohistochemisch gefärbt durch ein Paar Maus-monoklonale primäre
Antikörper gegen Leukozyten übliche Antigene (DAKO-LCA, beinhaltend Antikörper pD7/26 und
2BN; DAKO-PATTS) und einen "Histostain-SP-Kit" für den Nachweis von Maus-primären
Antikörpern (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA). Dieser Kit verwendet einen
biotinylierten anti-Maus-sekundären Antikörper, Meerrettichperoxidase-Streptavidin, und das
chromogenische Peroxidase-Substrat Aminoethylcarbazol. Sowohl die primären Antikörper
als auch der Färbungskit wurden entsprechend den Herstelleranweisungen verwendet.
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Die mikroskopische Untersuchung zeigte, dass manuelle HotStartTM-in situ-PCR etwa 80%
der SiHa-Zellkerne färbte und keine Leukozytenkerne, was die Spezifität und Empfindlichkeit
des HotStartTM-Verfahrens zeigte, sogar mit einem Einzel-Primerpaar. Im Gegensatz dazu war
herkömmliche in situ-PCR so unspezifisch, dass alle Zellen, sowohl SiHa- als auch
Leukozytenzellen gefärbt wurden, was zeigte, dass erhebliche nicht-zielgerichtete Amplifikation
auftritt, wenn das HotStartTM-Verfahren nicht verwendet wird. Obwohl zielspezifische Sonden
spezifisch und unspezifisch amplifizierte DNA nach in situ-Hybridisierung (siehe Beispiel 1)
unterscheiden kann, zeigte das vorliegende Beispiel, dass das HotStartTM-Verfahren das
Hybridisieren unnötig machen kann, was den Nachweis erheblich vereinfacht und dabei sogar
noch die Durchführbarkeit von in situ-PCR steigert.