JPH07501933A - 核酸配列の検出のための方法及び装置 - Google Patents

核酸配列の検出のための方法及び装置

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JPH07501933A JP5506805A JP50680593A JPH07501933A JP H07501933 A JPH07501933 A JP H07501933A JP 5506805 A JP5506805 A JP 5506805A JP 50680593 A JP50680593 A JP 50680593A JP H07501933 A JPH07501933 A JP H07501933A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列の検出のための方法及び装置 発明の分野 本発明はオリゴヌクレオチド及びヌクレオチドからの標的核酸配列を含む標的分 子の分離、並びにこの分子の濃縮及び検出のための装置及び方法に関する。
発明の背景 標的核酸配列を含む標的分子の検出のための手順における増幅手順の利用は当業 界に公知である。典型的には、この手順は標的核酸配列の酵素的増幅、及びゲル 電気泳動、それに続くサザンプロット手順による標的分子の検出が含まれる。
数多くの固相捕獲アッセイも、核酸配列を含む標的分子の検出のための手順を簡 素化するために開発されている。これらの手順においては、２種類のリガンドが 一般に増幅標的核酸配列の中に一体化される。第一リガントは、固相マトリック ス上に、増幅標的核酸配列を含む標的分子を捕獲するために使用され、そして第 二リガンドは、この第二リガンドへのシグナル生成試薬の結合によって標的分子 を検出するために使用されている。
ところで、固相アフィニティー捕獲アッセイは反応混合物中の高比率の標的分子 を捕獲するのに長い反応時間を必要とする（Ｓａｕｖａｉｇ。
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１９９０．　第１８巻９ 頁３１７５−３１８２）　。更に、捕獲が、固相アフィニティーリガンドを含む 増幅プライマーにより仲介されるとき、このアッセイの感度は自由プライマーと 標的核酸配列の中に一体化されたプライマーとの競合によって悪くなることがあ る。
選別及び濃縮手順としてのクロマトグラフィーの利用は当業界に公知である。Ｄ ＮＡ分子は濡れた紙の上ではクロマトグラフィー的に移動するが、乾いた紙に溶 液が付与されたときはそれらは泳動しないことが報告されている（Ｂｅｎｄｉｃ ｈら、Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、。
＋９６１．９４．４１７−４２３）。
発明の概要 本発明の第一の目的は、核酸配列を含む分子のキャピラリー（毛細管）輸送のた めの方法及び装置の提供にある。
本発明の別の目的は、液体サンプル中の標的核酸配列を含む標的分子の濃縮のた めの方法及び装置の提供にある。
本発明の更なる目的は、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドからの、標的核酸 配列を含む標的分子の分離のための方法及び装置の提供にある。
本発明の別の目的は、特異的な核酸配列を含む標的分子の検出のための方法の提 供にある。
本発明に従い、吸水性担体中で核酸配列を含む分子を輸送するための装置が提供 され、この担体は該分子を含む溶液と接触しているときに該分子の輸送を補助す るギヤピラリ−輸送経路を規定する乾燥吸水性担体を含んで成る。
本発明の好ましい態様に従い、液体サンプル中の標的分子の濃縮のための装置が 提供され、これは乾燥吸水性担体を含み、ここでその標的分子には標的核酸配列 が含まれ、そしてそれはこの吸水性担体内で、キャピラリー作用により、この乾 燥吸水性担体の一部がこの標的分子を含む液体サンプルど接触しているときに輸 送され、そして少なくとも一捕獲試藁が、この吸水性担体の接触部分の下流にあ る乾燥吸水担体上の少なくとも一捕獲ゾーンにおいて固定化されており、ここで この少なくとも一捕獲試薬はこの標的分子を捕獲することが可能である。
また、本発明に従い、標的分子、と非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド とを含む液体サンプル中の非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドから、標 的核酸配列を含む標的分子の分離のための装置を提供し、これは、この非標的オ リゴヌクレオチドに結合する化合物を含む槽と、キャピラリー作用によってこの 槽から標的分子を輸送するための器具とを含んで成る。
本発明の好ましい態様に従うと、この乾燥吸水性担体はニトロセルロース膜であ り、ここでその吸収部位は標的分子のキャピラリー輸送を助長するためにブロッ クされている。
本発明の別の好ましい態様に従うと、この乾燥吸水担体は硬質枠によって支持さ れている。
本発明の更に別の好ましい態様に従うと、この乾燥吸水性担体伝いの液体のキャ ピラリー輸送を助長するために、この吸水担体に、その少なくとも一捕獲ゾーン の下流に、吸収パッドが固定されている。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、このニトロセルロース膜の吸収部位 は巨大分子、清浄剤及びそれらの組合せより成る群から選ばれる化合物によって ブロックされている。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、その巨大分子にはタンパク質が含ま れる。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、この少なくとも一捕獲試薬にはこの標的 核酸配列の改質領域に対する抗体が含まれる。
本発明の別の好ましい態様に従うと、この少なくとも一捕獲試薬は、この標的核 酸配列の少なくとも一部に相補性な核酸プローブ配列を含む少なくとも一核酸捕 獲試薬を含んでいる。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、この核酸プローブ配列はＤＮＡ配列 を含む。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、この核酸プローブ配列はＲＮＡ配列 を含む。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、この標的分子は３０以上の塩基対を含ん で成る標的核酸配列を含む。
本発明の別の好ましい態様に従うと、この標的分子は、酵素増幅反応の核酸生成 物を含み、そして少なくとも一対のオリゴヌクレオチドブライマーを含む核酸配 列を一体化せしめる。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、この少なくとも一対のプライマーは ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマーを含む。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、この少なくとも一対のプライマーはりガ ーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のためのプライマーを含む。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、この少なくとも一対のプライマーのうち の少なくとも第ニプライマーは前記の少なくとも一捕獲試薬に結合するりガント を抱えるオリゴヌクレオチドを含んでおり、これにより、このリガントを抱える 少なくとも一プライマーを含む標的分子はこの少なくとも一捕獲試薬に結合しう る。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、このリガンドは抗原性エビｌ−−ブを含 む少なくとも一捕獲試薬に結合する。
本発明の別の好ましい態様に従うと、少なくとも一捕獲試薬に結合するリガンド は少なくとも−スルホン化シトシンを含む。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、この化合物はこの器具による輸送に とっては大きすぎるゲル濾過粒子を輸送のために含む。
本発明の更なる別の好ましい態様において、この非標的オリゴヌクレオチドは標 的核酸配列に一体化していないオリゴヌクレオチドブライマーを含む。
本発明の更なる好ましい態様において、この化合物は輸送手段によって輸送され ることのないマトリックスを含み、ここでその化合物は非標的オリゴヌクレオチ ドとハイブリダイズする。
本発明に従い、吸水性担体内で核酸配列を含む分子を輸送するための方法が提供 され、これは、核酸配列を含む分子の輸送を補助するキャピラリー輸送経路を規 定する乾燥吸水性担体を用意し、そしてこの乾燥吸水性担体を、核酸配列を含む 分子を含んでいる溶液と接触させる段階を含む。
更に、本発明に従うと、液体サンプル中の、核酸配列を含む分子の濃縮のための 方法が提供され、これは、乾燥吸水性担体を用意しくここで、その分子は標的核 酸配列を含む標的分子であり、そしてここでその分子は、この乾燥吸水性担体の 一部をこの分子と含む液体サンプルと接触させたときに、キャピラリー作用によ ってこの吸水性担体内で輸送される）、この乾燥吸水性担体の一部を、標的分子 を含む液体サンプルと接触させ（ここでこの乾燥吸水性担体は濡れているときに 、核酸配列を含む分子の輸送を補助する液輸送経路を規定する）、その液輸送経 路伝いにこの標的分子を輸送させ、そしてこの液体サンプルと接触している吸水 性担体の部分の下流にあるこの乾燥吸水担体上の少なくとも一捕獲ゾーンにおい て固定化されている少なくとも一捕獲試藁によってこの標的分子を捕獲する、段 階を含む。
本発明に従い、標的分子と、非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドとを含 む液体サンプル中の非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドから、標的核酸 配列を含む標的分子の分離のための方法が提供され、こねは、この非標的ヌク【 ／オチド浸びオリゴヌクレオチド配列に結合する化合物を含む槽を用意し、この 標的分子と、非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドとを含む液体ナンブル を加え、そしてこの標的分子をキャピラリー作用によって輸送する段階を含む。
本発明に従うと、標的分子と、非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドどを 含む液体サンプル中のこの非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドからの、 標的核酸配列を含む標的分子の分離、この標的分子の濃縮、並びにこの濃縮標的 分子の検出のための装置も提供され、これは、この非標的オリゴヌク１７オ千ド に結合する化合物を含む第１領域の複数のウェルを含む複数のウェルを規定する 槽備品（ここで、この液体サンプルはこの第一領域の複数のウェルに加えられう る）、濡れているときに標的分子の輸送を補助する、この槽からの液輸送経路を 規定する乾燥吸水性担体（ここで、この標的分子は、この中成水性担体中で、キ ャピラリー作用により、この乾燥吸水性担体の一部が標的分子を含む液体サンプ ルと接触しているときに輸送される）、この標的分子を捕獲することのできる少 なくとも一捕獲試薬（ここで、この少なくとも一捕獲試薬は、この吸水性担体の 接触部分の下流にあるこの乾燥吸水性担体上の少なくとも一捕獲ゾーンにおいて 固定化されている）、及びこの捕獲標的分子を検出するための装置、を含む。
更に、本発明に従うと、液体サンプル中の、標的核酸配列の濃縮及び検出のため の方法が更に提供され、これは、乾燥吸水性担体を用意しくここで、この標的核 酸配列は、この乾燥吸水性担体の一部をこの標的核酸配列を含む液体サンプルと 接触させたときに、キャピラリー作用によってこの吸水性担体内で輸送される） 、この乾燥吸水性担体の一部を、標的核酸配列を含む液体サンプルと接触させ（ ここで、二の乾燥吸水性担体は濡ｔ１でいるときに、標的核酸配列の輸送を補助 する液輸送経路を規定する）、その液輸送経路伝い（こ１−の標的核酸配列を輸 送させ、ぞしてこの液体サンプルと接触している吸水性担体の部分の下流にある この乾燥吸水担体上の少なくとも一捕獲ゾーンにおいて固定化されている少なく とも一核酸捕獲試薬とのハイブリダイゼーシヨンによってこの標的核酸配列を捕 獲する、段階を含む。
本発明に従い、標的核酸配列の濃縮及び検出のための装置が更に提供され、これ は、複数のウェルを規定する槽備品、濡れているとき標的分子の輸送を補助する 、この槽からの液輸送経路を規定する乾燥吸水性担体（ここで、この標的核酸配 列は、この吸水性担体内で、ギヤピラリ−作用により、この乾燥吸水性担体の一 部がこの標的核酸配列を含む液体サンプルと接触しているどきに輸送される）、 ハイブリダイゼーシヨンによってこの標的核酸配列を捕獲するための核酸プロー ブ配列を含む少なくとも一核酸捕獲試薬（ここでこの少なくとも一核酸捕獲試薬 は、この吸水性担体の接触部分の下流にあるこの乾燥吸水性担体上の少なくとも 一捕獲ゾーンにおいて固定化されている）、及びこの捕ＴＡＮ的核酸配列を検出 するだめの装置、を含む。
本発明の好ましい態様に従うと、検出のための装置は、シグナル生成試薬に結合 するリガンドを抱える標的分子が固定化されている吸水性担体、及びこのリガン ドを抱える標的分子をこの標的分子の検出を指標する高感度シグナルを生成する シグナル生成試薬と接触させるための装置を含む。
本発明の更に好ましい態様に従うと、検出のための装置は、シグナル生成試薬に 結合するリガンドを抱える標的分子が固定化されている吸水性担体、及びこのリ ガンドを抱える標的分子を、この標的分子の検出を指標する高感度シグナルを生 成する発色剤と反応するシグナル生成試薬と接触させるだめの装置を含む。
本発明の別の好ましい態様に従うと、この標的核酸配列は酵素増幅反応の生成物 を含み、そして少なくとも一対のオリゴヌクレオチドブライマーを含む。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、この非標的オリゴヌクレオチドは、 この標的核酸配列に一体化されていないオリゴヌクレオチドブライマーを含む。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、その少なくとも２組のプライマーか ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＢ）のためのプライマーを含む。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、少なくとも一対のプライマーはりガーゼ 連鎖反応（ＬＣＲ）のためのプライマーを含む。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、この少なくとも一対のオリゴヌクレオチ ドブライマーのうちの少なくとも第ニプライマーは少なくとも一捕獲試薬に結合 するリガンドを含んでおり、これにより、このリガンドを含む標的分子はこの少 なくとも一捕獲試薬に結に結合するりガントは少なくとも−スルホン化シトシン を含む。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、この少なくとも一対のプライマーの うちの第一プライマーは、シグナル生成試薬に結合するりガントを含み、これに よりこのリガンドを含む標的分子は、シグナル生成試薬により生成されるシグナ ルの存在によって検出されつる。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、この少なくとも一対のプライマーのうち の第一プライマーは、シグナル生成試薬に結合するリガンドを含み、これにより このリガンドを含む標的分子は、シグナル発生剤と接触した後にこのシグナル生 成試薬により生成されるシグナルの存在により検出されうる。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、このシグナル生成試薬に結合するり ガントをビオチニル化ヌクＬ・オチド配列を含む。本発明の更なる好ましい態様 に従うと、このシグナル生成試薬は着色ラテックスビーズに結合しｔ：ストレプ トアビジンを含む。
本発明の別の好ましい態様に従うと、シグナル発生剤との接触後にこのシグナル 生成試薬により生成されたソゲナルはストレプトアビジン−゛ｒルカリホスホフ ァターゼコンジュゲートを含む。
本発明の別の好ましい態様に従うと、この第一領域のウェルはシグナル生成試薬 も含む。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、複数のウェルは更に、洗浄溶液を含む第 二領域のウェルを含む。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、複数のウェルはシグナル発生剤溶液 を含む第三領域のウェルを含む。
本発明の別の好ましい態様に従うと、この乾燥吸水性担体は少なくとも一本のス トリップを含む。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、複数のウェルは標的核酸配列について検 査すべきサンプルを含む第一領域のウェルを含む。
本発明の別の好ましい態様に従うと、複数のウェルは更にシグナル生成試薬を含 む第二領域のウェルを含む。
本発明の別の更なる好ましい態様に従うと、複数のウェルは更に洗浄溶液の第三 領域のウェルを含む。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、複数のウェルはシグナル発生剤を含 む第四領域のウェルを含む。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、第一領域のウェルのそれぞれは、標的分 子が、それらが捕獲される少なくとも一捕獲ゾーンに至るまで輸送されるよう、 各ストリップの接触部分を受容するようになっている。
本発明の更に好ましい態様に従うと、この第二領域のウェブそれぞれは、前記少 なくとも一捕獲ゾーンにおける標的分子の固定化後の非特異的捕獲化合物を除去 するのに前記ストリップを洗浄するため、各ストリップの接触部分を受容するよ うになっている。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、この第三領域のウェルはストリップ全体 を受容するようになっている。
本発明の別の好ましいＩｎに従うと、前記接触のための装置は、シグナル生成試 薬溶液を含む少なくとも一第三領域のウェル、及び前記少なくとも一捕獲ゾーン における標的核酸の固定化を経た少なくども一ストリップを含み、ここでこのス トリップ全体は、シグナル発生剤と少なくとも一捕獲ゾーンとの接触を可能とす るようにシグナル発生剤溶液と接触している。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、前記第一領域のウェルそれぞれは、 標的核酸配列が、それらが捕獲される少なくとも一捕獲ゾーンに至るまで輸送さ れるように、各ストリップの接触部分を受容するようになっている。
本発明の更なる別の好ましい態様に従うと、前記第二領域のウェルそれぞれは、 シグナル生成試薬が、それらが標的核酸配列上に抱えられたリガンドに結合する 箇所である少なくとも一捕獲ゾーンに至るまで輸送されるように、各ストリップ の接触部分を受容するようになっている。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、前記第三領域のウェルそれぞれは、少な くとも一捕獲ゾーンにおける標的核酸配列の固定化後に非特異的捕獲化合物を除 去するのにこのストリップを洗浄するため、各ストリップの接触部分を受容する ようになっている。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、前記接触のための装置は、シグナル発生 剤を含む少なくとも一第四領域のウェル、及び前記少なくとも一捕獲ゾーンにお ける標的核酸配列の固定化を経た少なくとも一ストリップを含み、ここでこのス トリップ全体は、シグナル発生剤と少なくとも一捕獲ゾーンとの接触を可能とす るようにシグナル発生剤溶液と接触している。
本発明の更なる好ましい態様に従うと、この第四領域のウェルそれぞれはストリ ップ全体を受容するようになっている。
本発明に従い、特異的な核酸配列の検出のための方法も提供され、この方法は、 オリジナルの核酸配列の少なくとも一部に特異的である核酸配列を含む標的分子 を生成するために、このオリジナルの核酸配列の少なくとも一部を酵素反応によ り増幅させ、この標的分子を非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドから分 離しくこの分離は、この非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドに結合する 基体を含む槽を用意し、標的分子と、この非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレ オチドとを含む液体サンプルを加え、次いでキャピラリー作用によってこの標的 分子を輸送する段階を含む）、この標的分子を濃縮しくこの濃縮は、乾燥吸水性 担体を用意しくここで、標的分子は、この吸水性担体内で、キャピラリー作用に より、この乾燥吸水性担体の一部が標的分子を含む液体サンプルと接触している ときに輸送される）、この乾燥吸水性担体の一部を、標的核酸配列を含む液体サ ンプルと接触させ（ここでこの乾燥吸水性担体は、濡れているとき、この標的分 子の輸送を補助する液輸送経路を規定する）、この標的分子をこの液輸送経路伝 いに輸送し、次いでこの標的分子を、液体サンプルと接触している吸水性担体の 部の下流にある乾燥吸水性担体上の少なくとも一捕獲ゾーンにおいて固定化され ている少なくとも一捕獲試薬によって捕獲する段階を含む）、次いで、シグナル 生成試薬と結合するものであって吸水性担体上に固定化されているリガンドを有 する標的分子を、シグナル生成試薬と接触させて検出可能なシグナルを生成する ことによりこの標的分子を検出する、段階を含む。
本発明に従って特異的な核酸配列の検出のための方法が更に提供され、この方法 は、オリジナルの核酸配列の少なくとも一部に特異的である標的核酸配列を生成 するためにオリジナルの核酸配列の少なくとも一部を酵素反応により増幅させ、 この標的核酸配列を含む液体サンプルを用意し、この標的核酸配列をキャピラリ ー作用により輸送し、この標的核酸配列を濃縮しくこの濃縮は、乾燥吸水性担体 を用意しくここで、この標的核酸配列はこの吸水性担体内で、キャピラリー作用 によって、この乾燥吸水性担体の一部がこの標的核酸配列を含む液体サンプルと 接触しているときに輸送される）、この乾燥吸水性担体の一部をこの標的核酸配 列を含む液体サンプルと接触させ（ここで、この乾燥吸水性担体は、濡れている とき、この標的核酸配列の輸送を補助する液輸送経路を規定する）、次いてこの 標的核酸配列をこの液輸送経路伝いに輸送する段階を含む）、この標的核酸配列 を、液体サンプルと接触している吸水性担体の部分の下流にあるこの乾燥吸水性 担体上の少なくとも一捕獲ゾーンにおいて固定化されている少なくとも一核酸捕 獲試薬によって捕獲し、次いてこの標的核酸配列を、シグナル生成試薬に結合す るものてあって吸水性担体上に固定化されているリガンドを有する標的核酸配列 をシグナル発生剤と接触させて検出可能なシグナルを生成することによって検出 する段階を含んて成る。
図面の簡単な説明 本発明は図面と関連付けた下記の詳細な説明からより完全に理解及び知得される ものであり、ここで； 図１は、液体サンプル中の非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドからの標 的核酸配列の分離、標的核酸配列の濃縮、並びに濃縮標的核酸配列の検出のため の、本発明に従って構築され、且つ使用される、使用前の装置の前面図であり； 図２は、使用中の図１の装置の前面図であり；図３は、使用前の図１の装置とは 別の態様の前面図であり；そして 図４は、使用中の図３の装置の前面図である。
好ましい態様の詳細な説明 図１〜４について参照されたいが、これは本発明の好ましい態様に従って構築さ れ、且つ使用される、液体サンプル中の非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオ チドからの標的核酸配列を含む標的分子の分離、標的分子の濃縮、並びに濃縮標 的分子の検出のための装置１０を示している。
装置ＩＯは、非孔性材料、例えばポリスチレンより組立てられ、且つ複数のウェ ル、例えばウェル１４．　＋６及び１８を含む槽備品１２を含む。
これらのウェル、例えばウェル１４．１６及び１８はおよそ、長さＩｃｍ、輻０ ．５　ｃｍ、そして深さＺ５ｃｍであり、そしてストリップ２０の接触部分２０ を受容するようなサイズである。
このストリップ２２は、はぼ長さ３．０　ｃｍ及び幅０．５　ｃｍであり、且つ ３〜５ミクロンの孔径を有するマイレレッド（ｍｙｌｅｒｅｄ）ニトロセルロー ス膜において典型的に具現化された吸水性担体２４を含み、これは補強枠２６に よって囲まれていてよい。この補強枠２６は非孔性材料、例えばポリスチレンよ り組立てられ、そして吸水性担体２４はこの枠２２に接着剤のような常用の手段 によって装着されていてよい。はぼ長さ２ｃ＋＋＋、輻０．５　ｃｍの、吸収材 料、例えばＷｈａｔｍａｎ　３ＭＭペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ、　Ｍａｉｄｓｔ ｏｎｅ、　Ｕ、　Ｋより入手可）より成る吸収パッド２７が、接着剤のような常 用の手段によって接触部分２０と対立するこのストリップの先端に取付けられて いる。このストリップ２２の先端には、接着剤のような常用の手段によってとっ 手２８も取付けられている。
このとっ手２８は非孔性材料、例えばポリスチレンより成る。少なくとも−スト リップ２２がとっ手２８に取付けられて、検査部材３０を構成している。
単独の捕獲試薬が一般に、吸水性担体２４の上にその吸水性担体の中心領域にお いて固定化されて、捕獲ゾーン３２を形成している。単独の捕獲試薬が一般に利 用されるが、単独の吸水性担体上に多重捕獲ゾーンを形成するように複数の捕獲 試薬が利用されてよい。
単独捕獲試薬、典型的には抗−スルホン化ＤＮＡ抗体、又は標的核酸配列の少な くとも一部に相補性である核酸は、ニトロセルロース脱上への吸収によって典型 的に固定化されている。
ウェル１４は典型的には酵素反応混合物を含む。更に、この捕獲試薬が抗−スル ホン化ＤＮＡ抗体のとき、ウェル１４は典型的にはゲル濾過粒子（図示せず）、 典型的には５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。
Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）ゲル濾過粒子を含む。このゲル濾過粒子は吸 水性担体２４の中でギヤピラリ−作用によって輸送されるには大きすぎるサイズ である。
装置ｌＯを利用して特異的な核酸配列を検出するために利用する手順は典型的に は、少なくとも一対のプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又 はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を利用した特異的核酸配列の酵素増幅を含む。こ れらの反応の少なくとも一対のプライマー−のうちの少なくとも第一プライマー は、アフィニティーリガンド、典型的にはシグナル生成試薬に結合するビオチン 、典型的にはストレブトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲ−１・を抱 える。更に、捕獲試薬が抗−スルホン化ＤＮＡ抗体であるとき、酵素増幅のため の少なくとも一対のプライマーのうちの少なくとも一第二プライマーは、アフィ ニティーリガンド、典型的にはスルホン化シトシンを抱えており、これは捕獲ゾ ーン２２の捕獲試薬に結合している。数回の増幅サイクル、典型的には１〜５０ サイクルを経て、反応混合物のアリコー１へを装置１０を利用してアッセイする 。
捕獲試薬が抗−スルホン化ＤＮＡ抗体であるとき、標的核酸配列、オリゴヌクレ オチドプライマー及びヌクレオチドを含む反応混合物のアリコート、典型的には １〜２０μｍをウェル１４に加える。シグナル生成試薬を含む溶液、典型的には ＴＰＧランニングバッファー（０，３％のツイーン２０及び１％のゼラチン；　 ＰＢＳ中）中のストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート約３ ０μｌもウェル１４に加え、次いでストリップ２２の接触部分２０を反応混合物 と接触させてウェル１４の中に入れた。核酸配列を含む標的分子を含んでいるこ の反応混合物をキャピラリー輸送によって吸水性担体２４伝いに、捕獲ゾーン３ ２を経て（ここで標的分子は捕獲試薬により捕獲される）吸収パッド２７へと搬 送させる。
約１０分後、ラベル化核酸配列を含む分子のほとんど（典型的にはラベル化分子 のうちの８０％以上）が捕獲ゾーンの中に捕獲された。
次にストリップ２２の接触部分２０をウェル１４から除去し、そしてウェル１６ の中に入れた。
ウェル１６は典型的には約５０μｌのＴＰバッファ　（ＰＢＳ中の０．３％のツ イーン）を含み、これは吸水性担体２４伝いに捕獲ゾーンへと搬送され、標的核 酸配列の検出を妨害しつる非特異的捕獲化合物を除去する。約１０分後、ストリ ップ２２をウェル１６から取出し、そしてウェル１８に浸した。
ウェル１８は約３００μｌのシグナル発生剤溶液、典型的には発色基質（ＢＣＩ Ｐ／ＮＢＴ、　Ｏｒｇｅｎｉｃｓ　Ｌｔｄ、、　Ｙａｖｎｅ　ｌ５ｒａｅｌより 市販）を含むＣｈｅｍｉｐｒｏｂｅ　（商標）溶液を含む。この溶液が捕獲ゾー ン３２を覆っている。シグナル生成試薬、即ちこの捕獲ゾーン３２中のラベル化 分子に付加しているアルカリホスファターゼは、この発色基質を、標的核酸配列 の検出を指凛する検出可能シグナルである沈殿性色素へと変換せしめる。
捕獲試薬が、標的核酸配列の少なくとも一部に相補性な核酸であるとき、この反 応混合物のアリコートを典型的には０．６ＭのＮａＣｌ。
２０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７，５、０，０２９６のフィコール４００　 （Ｓｉｇｍａ。
Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）　、　０．０２９６のゼラチン及び１％ 　ＰＶＰより成るハイブリダイゼーション溶液で希釈する。次にこのサンプルを 典型的には煮沸し、次いで急冷し、そして各溶液のアリコートを装置１２のウェ ル１４に移す。各ストリップ２２の接触部分２０を次にウェル１４中の溶液と典 型的には接触させる。
次に装置ＩＯを典型的には多湿インキュベーターの中に約２５公人れておき、そ して吸水性担体２４を形成しているニトロセルロースストリップ伝いにこの溶液 を泳動させる。核酸配列を含む標的分子を含む溶液を吸水性担体２４伝いに、キ ャピラリー輸送によって、吸収パッド２７へと搬送し、そして捕獲ゾーン３２を 通過させ、ここで標的分子はこの標的核酸配列に相補性の核酸によって捕獲され る。
ストリップ２２を次に典型的にはストレプトアビジンアルカリホスファターゼコ ンジュゲートを含むウェル１６に移す。次にストリップ２２を典型的にはＰＢＳ 中の０．３９６のツイーン２０１５０μｌを含む溶液を含んでいるウェル１８に 移し、そしてストリップ２２の接触部分２０をこの溶液に約１５分接触させてお いた。
最後に、ストリップ２２を図面には示していない一連のウェルの中の、発色反応 のための基質を供する。ＣｈｅｍｉＰｒｏｐｅ　（商標）　ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶 液の中に約２０分浸した。ストリップ２２の捕獲ゾーン３２における青色シグナ ルは標的分子の存在を示唆している。
図３及び４においてわかる通り、−より多くのストリップ２２をとっ手２８に取 付けて、複数のアッセイを同時に行うを可能とすることができる。
実施例を、本発明を例示する図１〜４と共に下記に説明する。
旧Ｖ−１の遺伝子におけるプライマーを選び、そして下記の配列を５°ＴＧＧＧ ＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＡＡＴＡＣＣＡＣプライマー　３゛５°ＴＧＧＧＡ ＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＡＡＴＡこれらのプライマーをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｈａｙｗａｒｄ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）で合成し、モしてＯＰ Ｃ迅速精製カートリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　ＣＡ、　 ＵＳＡ）を用いて精製した。
プライマーのスルホン化 プライマー３′を５゛末端において、１３量体ポリシトシンテールによって合成 した。これらのプライマーを次にＣｈｅｍｉＰｒｏｂｅ　（商標）キット（Ｏｒ ｇｅｎｉｃｓ　Ｌｔｄ、より市販）に記載のプロトコールに従ってスルホン化し た。
１００　μ］のＣテールブライ７−　（０，５ｍｇ／ｍｌ）をＣｈｅｍｉＰｒｏ ｂｅ　（商標）キットの溶液Ａ　（４Ｍの亜硫酸水素ナトリウム）　５０μｌ及 びＣｈｅｍｉＰｒｏｂｅ　（商標）キットの溶液Ｂ（ＩＭ）のメトギシアミン） １２．５μｌと混ぜ、そして２０℃で一夜インキユベートした。次にスルホン化 オリゴヌクレオチドを２μｌのベッドの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラ ムを通じる遠心により脱塩した。
ブライマービオチニル化 プライマー４を５′末端において、４僧のシトシンヌクレオチドかＮ’　−ＬＣ Ａ　−５−メチルデオキシシチジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ。
１１ａｙｗａｒｄ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）により置き代ってＣｃｃＣｃｃＣｅｃＣ ｃｃ　（ここでＣは改質シトシンを表わす）となっている１２Ｍ体ポリシトシン によって合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、その教示内容を引用するこ とで本明細書に組入れるＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃ ｌｏｎｉｎｇ　：ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　＋９８９．　ｐ ６４６．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙB Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　Ｎ、　Ｙ、に記載の手順に従って アクリルアミドゲルにより精製した。
精製したオリゴヌクレオチドを下記の手順に従ってビオチニル化した： １０ｎｍｏｌｅのデシケートに付したプライマーを５０μｌの１００　ｍＭのホ ウ酸バッファーの中に溶かし、そして０．１ｍｇのビオチンＮヒドロキシスクシ ニミド（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１１．Ｌ、　ＵＳＡ）　Ｏ，Ｉ　 ｍｇを含む５０μｍのジメチルホルムアミド（ＤＩＪＦ）に加えた。この溶液を 次に２０°Ｃで一夜インキユベートし、次いでＮｅｎ５ｏｒｂ　２０カラム（Ｄ ｕ　Ｐｏｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ。
Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＨ，ＵＳＡ）を通じて、その供給者の仕様に従って 精製した。このプライマーを次にエバポレーションにより濃縮し、モしてもとの 温度となるように水に再懸濁した。
ｂ）旧■配列の増幅　陽性旧■サンプル由来の抽出ＤＮＡ　１ｎｇを含む１００ μｌの混合物（抽出手順は、その教示内容を引用することで本明細書に組入れる Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ。
１９８９、第４５巻１頁２００−２０３に従う）０１００　ｐｍｏｌｅづつのプ ライマーＰ３及びＰ４．０．２５ｍＭの４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ ｄＮＴＰ）、１０μＩのＩＯＸのＴａｑバッフｙ　−（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａ ｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ。
ＵＳＡ）並びに２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プログラ ム可能Ｇｒａｎｔ　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｕ、　Ｋ、）浴槽で下記の条件の もとで増幅した。
９４°Ｃて５分の第−ＤＮＡ変性段階に、９４°Ｃでの１分の変性、５２℃での １分のＤＮＡアニーリング及び７２°Ｃで１分のＤＮＡ伸長の３０サイクルを続 けた。増幅は７２°Ｃで７分間の伸長段階で終えた。
第二増幅は、第一増幅と同じ条件だが、前述のラベル化ビオチニル化及びスルホ ン化プライマーを利用して２０サイクルにわたって行なった。使用したＤＮＡ鋳 型は、１００　ｐｍｏｌｅづつの各ラベル化プライマー、０．２５ｍＭの４種の デオキシヌクレオチド三ミリ酸、ｌＯμｌの１０ＸのＴａｑバッフｙ　−（Ｐｒ ｏｍｅｇａ）及び２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む１０ ０μｌの混合物の中に希釈した第−ＰＣＲ混合物１μｌとした。プライマーをＰ ＣＲ生成物から、反応混合物ｌｏｏμｌを２．５ＭのＮａＣｌ溶液中のポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）　（Ｓｉｇｍａ。
Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ，ＵＳＡ）６０μｍと混合することにより排除した。
この混合物を次に４°Ｃで１時間インキュベートした。次に、４°Ｃで１０．０ ００Ｘｇでの１０分間の遠心の後、上清液を捨て、そしてそのべ１／ツトを１０ ０μｍの水に再懸濁した。
Ｃ）ニトロセルロース支持ストリップの製造１、ミレレッド　ニトロセルロース （孔径３　μ）　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅ１１．　Ｄｕｓｓｅｌ 、　Ｇｅｒｍａｎｙ）を０．５　Ｘ　３．　Ｏｃｍの長に切り、図１〜４の装置 の吸水性担体２４を行った。この吸水性担体２４はストリップ２２を構成する。
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１９６のスクロースの添加された、Ｏｒｇｅ旧 ＣＳ　Ｌｔｄ、　より市販の精製マウスモノクローナル抗−改質化ＤＮＡ　（カ タログｎｏ、　１０７９３０１０）　（２ｍｇ／ｍｌ）　１　ｕ　１を、ニトロ セルロースストリップの中央に水平線において包埋して捕獲ゾーン３２を形成し た。このストリップを次に３７℃で１時間風乾した。
次に自由な吸収部位を、ＰＢＳ中の１９６のゼラチン（ＮｏｒｌａｎｄＰｒｏｄ ｕｃｔｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｃａｎａｄａ）及び０． ０５％のツイーン２０（Ｓｉｇｍａ）の溶液の中に２時間このストリップをイン キュベートすることによってブロックした。このニトロセルロースストリップを 次に水の中で簡単に洗い、３７°Ｃのインキュベーターの中で１時間乾かし、そ してデシケートのもとで少なくとも４ケ月間保管した。吸収パット２７として働 くよう、０．５Ｘ２ｃｍの四角いＷｈａｔｍａｎ　３ＭＭペーパーをこのストリ ップの上面に取付けた。
２、プロツキング工程抜きで上記の通りにマイレレッド　ニトロセルロース片を 用意した。
ｄ）ＤＮＡの輸送及び濃縮 ＰＣＲ反応混合物をＴＧＰランニングバッファー（ＰＢＳ中の０．３０％のツイ ーン２０及び１％のゼラチン）又はＰＢＳのいづれかに１０倍に希釈した。次に ３０μｌづつの各溶液を、図１〜４に示す装置のウェルと似たウェルに移し、そ して各ストリップ２２の接触部分２０をこの溶液と接触させた。
この溶液を、吸水性担体２４を構成するニトロセルロースストリップ伝いに室温 で１０分泳動させた。次にこのストリップに、１：２．５００に希釈したストレ プトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲ−）　（Ｅｎｚｙｍａｔｉｘ、 　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｕ、　Ｋ、）の溶液を完全に覆った。室温で１０分の インキュベーションの後、このストリップを水で簡単に洗い、次いてＢＣＩＰ／ ＮＢＴ　ＣｈｅｍｉＰｒｏｐｅ（商標）溶液（Ｏｒｇｅｎｉｃｓ　Ｌｔｄ、）に より覆った。５分後、このストリップを水で簡単に洗い、そして目視にＨした。
色素はエタノールの中での簡単な洗浄及び室温での乾燥により安定にした。その 捕獲ゾーンに紫の線分が認められたらストリップ２２はＨＩＶについて陽性であ ると考えた。
バッファーとしてＰＢＳを用いてのニトロセルロースストリップの吸収部位をブ ロックしていないニトロセルロースストリップ上でのＰＣＲ増幅旧■生成物の泳 動は陽性反応を示すことがなかった。しかしながら、ニトロセルロースの自由吸 収部位がゼラチン溶液によってブロックされているストリップ２２は、ランニン グバッファーとしてＰＢＳを用いたときに可視シグナルを提供した。更に、ＰＣ Ｒ反応混合物溶液との接触に付する前に吸収部位をブロックしていないストリッ プ２２は、ＴＧＰランニングバッファーを使用したときに可視シグナルを提供し た。最も強いシグナルは、ブロックストリップ及びＴＧＰランニングバッファー の両方を使用したときに得られた。
これらの結果は、増幅核酸配列がキャピラリー移動により、ニトロセルロースの 吸収部位が核酸配列のキャピラリー輸送の前又は最中のいづれかにおいてブロッ クされているニトロセルロースストリップ伝いに泳動てきうることを示唆してい る。更に、これらの結果は、溶液中の増幅ＤＮＡが、ブロック化ニトロセルロー スストリップを接触点において増幅ＤＮＡを含む溶液と接触させ、次いでこの増 幅ＤＮＡをその接触点の下流にあるこのニトロセルロースストリップ上の適当な 捕獲部位において捕獲することにより濃縮されうることも示唆している。
ヒト胎盤ＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ）、　Ｃａ５Ｋｉ細胞ＤＮＡ及びブルースクリプ ト　プラスミドＤＮＡを用意し、そしてＮｕｒら（Ａｎｎ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｌ １ｎ、１９８９゜４７、６０１−６０６）に記載の通りにスルホン化し、ここで Ｃａ５Ｋｉ細胞ＤＮＡ又はヒト胎盤ＤＮＡの各分子は約ＩｏｌＳ塩基対を有して いる。ＨＩＶ特異的ＰＣＲ生成物を増幅し、ここで一方のプライマーはスルポン 化し、他方のプライマーはビオチニル化し、これによって実施例１に記載の通り ＰＣＲ生成物を二重ラベルに付した。ブロック吸収部位を存するニトロセルロー スストリップ２２も実施例１に記載の通りに用意した。
３種類のＤＮＡのそれぞれの２０℃ｇ／ｎ＋１の溶液（スルホン化又は未スルホ ン化）１μｍを２０μｌのＴＧＰランニングバッファーに加えた。
このＤＮＡ溶液をウェルに入れ、そしてこのストリップ２２の接触部分をこの溶 液と接触させた。１０分後、このストリップをＤＮＡ溶液から取出し、そして別 のウェルに移し、ここでそのストリップ２２の接触部分２０を、二重ラベルＰＣ Ｒ生成物（実施例１のＨＩＶ　ＰＣＲ反応混合溶液から１＝２０に希釈）及びＴ ＧＰランニングバッファーに１：２．５００に希釈したストレプトアビジンアル カリホスファターゼコンジュゲート（Ｅｎｚｙｍａｔｉｘ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇ ｅ、　Ｕ、　Ｋ、）と接触させた。二重ラベルＤＮＡ生成物との１０分の接触の 後、ストリップ２２を１０分間、このストリップ２２の接触部分をＴＣＰバッフ ァーの洗浄溶液と接触させることにより洗った。最後に、このストリップ２２を ＣｈｅｍｉＰｒｏｂｅ　（商標）ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（Ｏｒｇｅｎｉｃ　Ｌｔ ｄ、より市販）の中に、実施例１に記載の通り５分のインキュベーション時同慶 しておいた。
３種類のＤＮＡ　、即ち、胎盤ＤＮＡ、　Ｃａ５Ｋｉ細胞ＤＮＡ及びブルースク リプトプラスミドＤＮＡの全てが、完全にスルホン化されているとき、捕獲ゾー ン３２中の可視シグナルの発生を防ぐことか見い出された。
これらの結果と対照的に、同一のＤＮＡを含むが、そのＤＮＡがスルホン化され ていない溶液はシグナルを阻止することができなかった。
これらの結果は、ゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡの両者が、液体のギヤピラ リ−移動によってニトロセルロース担体伝いに輸送されうること、並びにこのＤ ＮＡがニトロセルロースストリップ上の適当な捕獲部位にて濃縮されうろことを 示唆している。
Ｅ記の結果は、サンプル中の標的ＤＮＡの存在が、標的ＤＮＡがスルホン化され 、且つ前述の通り二重ラベルＤＮＡを捕獲する前に捕獲ゾーンに結合されている とき、二重ラベルＰＣＲ生成物により生成されるシグナルの低下によって検出さ れうることも示唆している。
ＨＰＶのＥ６遺伝子におけるプライマーを選び、これはその教示内容を引用する ことで本明細書に組入れるイスラエル特許出願第０９７２２６号に記載のＩ（Ｐ Ｖ１６．１ＩＰＶＩ８及び１ＩＰＶ３３の共通プライマーである。それらのプラ イマーは下記の配列を有するニプライマー　ｈ１５’　ＡＡＧＧＧＡＧＴＡＡＣ ＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴプライマー　ｈ２５’　ＡＴＡＡＴＧＴＣＴＡＴＡＴＴＣ ＡＣＴＡＡＴＴプライマー合成及びラベル手順は実施例Ｉに記載の通りである。
これらの手順に従ってプライマー旧はスルホン化し、そしてプライマーｈ２はビ オチニル化した。
ＨＰＶ　ＤＮＡ配列の増幅及びラベリング１００　ｐｍｏｌｅのラベル化又は未 ラベルプライマー、ＨｙｂｒｉＣｏｍｂ　（商標）　ＩＩＰキット（Ｏｒｇｅｎ ｉｃ　Ｌｔｄ、より市販）の仕様書に従って頚部生検から抽出したｌμｇのＤＮ Ａ、　０．２５ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、　ｌＯｕ　 １のＩＯＸのＴａｑバッフｙ　−（Ｐｒｏｍｅｇａより市販）及び２５単位のＴ ａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａより市販）を含む１００　ｕ　１の反応混合 物。この混合物のサーモサイクリングをＧｒａｎ　ｔプログラム可能浴槽で実施 した。
未ラベルプライマーを用いて第−ＰＣＲ段階を実施した。各増幅サイクルは：９ ４°Ｃで１分のＤＮＡ変性、５５°Ｃで１分のアニーユング段階、及び７２°Ｃ で１分のＤＮＡ伸長段階より成る。増幅反応は２ｏサイクルを経て、７２℃での ５分間の伸長に終結させた。ラベル化プライマーを利用する第二ＰＣＲ段階を下 記の手順に従って実施した。ｌμｌの第一反応混合物を、第−ＰＣＲ反応のそれ と同一の反応混合物（ただし、非ラベルプライマーではなく、ラベル化されたも の）　１００　ｕ　１の含む６レブリケートそれぞれに加えた。各レプリケート を０．１０．２０゜２５又は３０サイクルにわたって増幅し、次いで４℃で保存 した。
ＰＣＲ生成物の検出 １、臭化エチジウム−ＥｔｄＢｒ−による検出。
増幅後、１０８ｍのＰＣＲ混合物を８９６の未変性（ＴＥＡ）　）リスー酢酸バ ッファーポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そして５０ｍＡで１時間電気 泳動にかけた。ゲルをＩＯμｇ／Ｉの臭化エチジウム（ＥｔｄＢｒ）の中に１５ 分浸し、そしてＤＮＡをＵｖ光により目視した。
２、サザンプロットによる検出。
電気泳動による分離後、泳動したＰＣＲフラグメントを、トランスプロットセル （Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｊｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）の中で１．５　Ａ ｍｐにて３時間にわたり、トランスファーバッファーとしてＴＡＥバッファーを 利用して、ｌ１ｙｂｏｎｄ　−Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｂｕｃｋｓ、　Ｕ、 　Ｋ、より市販）上にエレクトロプロットした。この膜を風乾し、次いて８０° Ｃで２時間焼いた。
ビオチニル化ラベルの目視は下記の通りに実施した：膜を、ｌ−１１−１ｉ　（ Ｔｒｏｐｉｘ、　ＭＡ、　ＵＳＡ）及び０．１９６のツイーン２０の添加された ＰＢＳによりブロックした。このナイロン膜を、Ｉ：２．５００に希釈したスト レプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートの添加された同一のブロ ッカ−の中で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳの中の０．１％のツイーン ２０を含む溶液により洗った。最後に、この膜をＣｈｅｍｉＰｒｏｂｅ　（商標 ）ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色溶液の中に３０分浸し、そして過剰の発色物を水ですす いだ。
３、固相支持体捕獲（ディツプスティック）アッセイによる検出。
ディツプスティック捕獲アッセイのための固相支持体として非吸水性インパクト ポリスチレン（Ｏｒｇｅｎｉｃ　Ｌｔｄ、より市販）を使用した。
ディツプスティックの製造。ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌの精製マウスモノクローナ ル抗−改質化ＤＮＡの溶液！μｌをディツプスティックの下部に適用し、次いで ３７℃で１時間乾かした。その未結合の部位も、このディツプスティックを１９ ６のゼラチン及び０．０５％のツイーン２ｏの溶液の中に１時間浸すことによっ てブロックした。このディツプスティックを次に水の中で２〜５秒間洗い、そし て３７℃で１時間乾かした。
アッセイ： 第二ＰＣＲサイクルグループそれぞれに由来する５μｍの反応混合溶液を、スト レプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートを含む４５μＩのＴＧＰ ランニングバッファーに加えた（１：２００）。
この溶液をウェルに入れ、次いてこのディツプスティックをこの溶液の中に浸し た。３０分のインキュベーション後、このディツプスティックをＰＢＳの中で洗 い、そしてＢＣ［Ｐ／ＮＢＴ溶液の中に２０分浸した。
反応はこのディツプスティックを水で洗うことにより停止させた。
４、キャピラリーＤＮＡ濃縮アッセイ（ＣＤＣＡ）による検出。
第二ＰＣＲサイクルグループそれぞれに由来する各反応混合溶液３μｍを、ＴＧ Ｐランニングバッファーの中に１：２，５００に希釈されたストレプトアビジン アルカリホスファターゼコンジュゲートを含む溶液３０μｌを含んでいるウェル に加えた。実施例１の通りにニトロセルロースストリップを調製した。ストリッ プ２２の接触部分２ｏをこのウェルの中の溶液と１０分間接触させた。このスト リップ２０の接触部分を次に５０μｍの洗浄溶液（ＴＰバッファー）を含むウェ ルに１０分間接触させておいた。最後に、このストリップ２２を、発色反応のた めの基質を供するＣｈｅｍｉＰｒｏｂｅ　（商Ｉｓ’）　ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液 の中に５分間完全に浸］７ておいた。
上記の手順の結果を表Ｉに示し、これらは、萌述のアッセイ−ＥｔｄＢｒ、サザ ンプロット、固相支持体捕獲アッセイ及びＣＤＣＡ−についてのＰＣＲサイクル 数に関する検出限界を示す。
表　ｌ いくつかの系の検出限界 ＰＣＲサイクル数 ＣＤＣＡ　−＋＋＋＋＋ ±；域値レベル ｍ＝絶対陰性 十＝絶対陽性 表１かられかる通り、ディツプスティック検査の感度はＥｔｄＢｒ蛍光検査のそ れと似ており、両者ともサザンプロット技術より感度が低かった。ＣＤＣＡはサ ザンプロット技術と少なくとも同程度の感度であることが認められた。
実施例４ ＣＤＣＡ手順の感度に及はす増幅後のプライマー排除の効果特異的な１（ＩＶ配 列を陽性１１１■サンプルから、１００μｌの反応混合物中での実施例１に記載 の未ラベルプライマー３及びプライマーｔｏｏ　ｐｍｏｌｅを用いる２０ＰＣＲ サイクルにより増幅させた。第二増幅は第−増幅と同じ条件で実施したが、ただ しラベル化プライマーを用いて、そして２．　４．　６．　８．１０及び２０サ イクルに付しｔ：。第二ＰＣＲ増幅のための鋳型は、１００　ｐｍｏｌｅの各ラ ベル化プライマー、０．２５ｍＭの４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、１ ０μｍのｌＯｘのＴａｑバッフｙ　−（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び２．５ＵのＴａｑ ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む反応混合物１００μｍに希釈した第−Ｐ ＣＲ混合物ｌμｌとした。各ＰＣＲ増幅サイクル数に関して、４アリコートの１ ００μｍのＰＣＲ反応混合物を各アッセイについて検査した。
アッセイ−１０ 第一アッセイは実施例３に記載のＣＤＣＡ系とした。各ＰＣＲ増幅サイクル数の グループからの３μＩの反応混合物を、ＴＧＰランニンユンッファー中の３０μ ｍのストレプトアビジンアルカリホスファターゼを含むウェルに加え、モしてＣ ＤＣＡを実施例３に記載の通りに実施した。
アッセイ−２゜ 第三アッセイにおいて、ＰＣＲ反応混合物をＰＥＧで処理してＣＤＣＡを実施す る前にプライマーを除去した。各ＰＣＲ増幅サイクル数のグループのプライマー は実施例１に記載の通りにＰＥＧ溶液を利用して排除した。３μｌのＰＥＧ処理 ＰＣＲ増幅混合物を３０μｍのＴＧＰランニングバッファーに加え、次いでアッ セイを実施例３の通りに実施した。
アッセイ−３゜ 第三アッセイにおいては、ＰＣＲ反応混合物中のプライマーはＣＤＣＡの前に５ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００により排除した。各ＰＣＲ増幅サイクル数のグルー プのプライマーを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００により下記の通りに排除した。
５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中の０．５　ｕ　１のト リスＥＤＴバッファー（ＴＥ）をウェルに移し、過剰のＴＥを濾紙で吸収した。
１５μｌの各ＰＣＲ反応混合物をＴＧＰランニングバッファーでｌ：１に希釈し 、そしてこの混合物をウェルの底に直接載せた。
実施例１に記載の通りに用意した。吸収部位がブロックされているニトロセルロ ースストリップを含むストリップ２２の接触部分２０を、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ −１００の上側と２５分接触させた。このストリップ２２の接触部分を次にウェ ル中のＴＧＰランニングバッファーの中に１：２．５００に希釈したストレプト アビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートと１０分接触させ、次いて洗い 、そして実施例１に記載の通りに目視した。
アッセイ−４゜ 第四アッセイにおいは、プライマーをＰＣＲ反応混合物から、化合物に結合した 相補性オリゴヌクレオチド配列に対するこのプライマーのハイブリダイゼーショ ンによってＣＤＣＡの前に除去した。各ＰＣＲ増幅サイクル数のグループのプラ イマーを、捕捉すべきプライマーの配列に相補性の配列を有するオリゴヌクレオ チドでコートされたビーズと接触させることによって捕捉した。
ａ）捕捉系の用意。ストレプトアビジンをＷｏｏｄｗｏｒｄ、　Ｒ，Ｂ、及びＥ ｌｏｆｓｏｎ、　Ｒ，Ａ、　（１９６］）　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ ｏｃ、　８３．１００７−１０１０の原理に従い、イスラエル特許出願０９８４ ５２号に記載の条件のもとて（その開示内容は引用することで本明細書に組入れ る）スチレン／ビニルカルボン酸ビーズ（直径５　μｍ、　Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎ。
Ｃａｒｍｅｌ、　ＩＮ、　ＬＩＳＡより市販）に結合させた。相補性オリゴヌク レオチド配列　５’　ＴＡＴＴＣＣＴＡＡＴＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡを合成し、そ して実施例Ｉに記載の通りにビオチニル化した。
オリゴヌクレオチドを下記の手順によりビーズに結合させた。
１００μｌの１％のコート化ビーズを１ｍｇ／ｍｌのビオチニル化すリボヌクレ オチドの溶液と１：！で混合した。この溶液を３０”Ｃで３時間インキュベート した。未結合のオリゴヌクレオチドをＰＢＳの中で洗い、そしてＰＢＳ中の１％ のゼラチン溶液の中で保存した。
ｂ）アッセイ手順。３μｍの各ＰＣＲ増幅サイクル数グループを、０．５０％の 相補性オリゴヌクレオチドコート化ビーズ及びＴＣＰバッファー中のストレプト アビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート（１：５００に希釈）を含む溶 液３０μＩを含んでいるウェルに加え、そして１０分間インキュベートした。
実施例１の通りに用意した、吸収部位がブロックされているニトロセルロースス トリップを含むストリップ２２の接触部分２ｏを次に、洗い、そして実施例３の 通りにシグナルを発生させた。
表２はＣＣＤＡの感度に及ぼす増幅後のプライマーの排除の効果を示す。
表２ アッセイｌ−４の検出限界 ＰＣＲサイクル数 ＋　＝ｌＩＩＶ　ＤＮＡ配列（Ｄ検出。
表２かられかる通り、未処理ＰＣＲ溶液は８サイクルの増幅の後でさえもＣＤＣ Ａアッセイにおいて可視シグナルを提供しなかった。１０すイクルぐらい経た後 のみに、陽性応答が認められた。分離段階又は検査中による増幅後のプライマー の排除は２〜６　ＰＣＲサイクルのみの後に標的核酸配列の検出を可能にした。
各技術によるプライマーの排除はゲル電気泳動及びＥｔｄＢｒによる識別化によ って確認した（データーは示していない）。
プローブの用意。−重鎖ＨＰＶ配列を、実施例３に記載のＨＰＶプライマーｈｉ を利用する非対称性ＰＣＲ増幅によって調製した。増幅のために下記の条件を利 用した。実施例３に記載の通りに調製したＩＯｎｇの非ラベルＨＰＶ　ＰＣＲ生 成物を鋳型として用い、そしてただ一つのプライマーｈ１を増幅のために用いた 。実施例３に記載の通りにして５０ＰＣＲサイクルを実施した。
次にその一本鎖生成物を３０゛Ｃで１時間スルホン化し、次いでＣｈｅｍｉＰｒ ｏｂｅ　（商標）キット（Ｏｒｇａｎｉｃｓ、　Ｌｔｄ、）の使用のための仕様 書に記載の通りに５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０を用いることによって脱塩した。
＋１ＰＶ配列の増幅 ＋１ＰＶ配列を２通りの方法によって臨床サンプルから増幅させた：Ａ）ビオチ ニル化ｈ２プライマー及び非ラベルｈｌプライマーを使用、並びにＢ）ビオチニ ル化ｈ２プライマー及びスルホン比重プライマーを使用。両方の方法に関し、Ｐ ＣＲは実施例３に記載の通りにして、３５サイクル行った。
ハイブリダイゼーション 方法ＡのＰＣＲ反応混合溶液５μｍ　（３５ザイクル後）を、０．６６ＭのＮａ Ｃ１，６５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．３ＭのＥＤＴＡ、Ｏ，Ｉ　Ｍのリン 酸バッファーｐｔ＋６．６　、０．０２％のフィコール（商標）、０．２％のポ リビニルピロリドン、０．５％のポリエチレングリコール、０．１２％の牛血清 アルブミン及び１００　ｎｇの上記のスルホン化プローブを含むハイブリダイゼ ーション溶液９５μｍに加えた。この溶液を９５°Ｃで５分熱し、次いで急冷し た。ハイブリダイゼーションを６５℃で４５分間行った。
ＣＤＣＡによる捕獲 ハイブリダイゼーション完了後の３μｌのハイブリダイゼーション混合物又は方 法Ｂ由来の０．３μｍのＰＣＲ反応混合溶液を、ＴＧＰランニンユンッファー中 のストレプトアビジンアルカリホスファターゼ３０μｌを含むウェルに加えた。
実施例１に記載の通りに用意したニトロセルロースストリップを含むストリップ ２２の接触部分２０をこのウェル中の溶液と１０分接触させ、バイブリドを捕獲 し、そして実施例３の通りに目視した。
結果 １２サンプルを評価した。試験した両方の方法に関して、同一の５つのサンプル は陽性であり、そして同一の７つのサンプルは陰性で　。
ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）を０．２μｍのスチレン／ビニルカルボン酸 着色化ビーズ（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｃａｒｍ ｅｌ、　ＩＮ、　ＵＳＡ）に共有結合させた。この結合は実施例４に記載の通り Ｗｏｏｄｗａｒｄらの方法によって達成せしめた。
ＨＰＶ配列を含むと予測される臨床サンプル由来のＰＣＲ生成物を、実施例３に 記載の通りにｈ−１スルポン化及びｈ−２ビオチニル化プライマーを用いて第二 ＰＣＲ増幅工程によって増幅させた。実施例１に記載の通りにＰＥＧ溶液を利用 してＰＣＲ反応混合溶液からプライマーを排除した。この溶液３μｍを１．０％ のゼラチン、０．３％のツイーン２０及び０．２５ＭのＮａＣｌ中の０．０５％ のストレプトアビジン結合化ビーズを含むウェルに加えた。実施例３に記載の通 りに調製したストリップ２２の接触部分２０をウェルの中に、このウェル中の溶 液を接触するようにして入れた。数分後、青色のシグナルがストリップ２２の捕 獲ゾーン３２において識別された。
ａ）プライマーの選択 １（ＰＶ／＋６のＥ６遺伝子におけるプライマーを選び、そして下記の配列５° ＡＡＧＧＧＣＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴプライマー２ ５’　ＧＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＣｂ）オリゴヌクレオチドプロー ブ捕獲試薬捕獲試薬として働くオリゴヌクレオチドプローブを、ＰＣＲ反応にお けるプライマー２の伸長により生成されるビオチニル化繊の配列と相補性となる ように選んだ。下記の配列を選んだ。
ＣＡＡ　ＣＡＡＣＡＡ　ＣＡＡＧＴＴＴ　ＣＡＧＧＡ　ＣＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡ Ｇ　ＣＧＡ　ＣＣＣＣ）ニトロセルロース支持ストリップの用意孔径５ミクロン のマイレレッドニトロセルロース（ＭｉｃｒｏｎＳｅｐｅｒａｔｉｏｎ　Ｉｎｃ 、、　Ｗｅｓｔｂｏｒｏ、　ＭＡ、　ＵＳＡ）を０．５　Ｘ　３．　Ｏｃｍのス トリップに切った。ＩＯＸのＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣ１及び０．０ １５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐｌ（７，０より成る）中の５ｎｇのオリゴヌク レオチドプローブ捕獲試薬より成る溶液ｌμｌを、各ニトロセルロースストップ の中央にスポットを形成するように適用した。次にこれらのストリップを３７° Ｃて１５分間乾かし、次いてオリゴヌクレオチドプローブを、これらのストリッ プを５分間のＵｖ照射に暴露することによってニトロセルロースストリップに固 定させた。
ｄ）ＨＰＶ配列の増幅 ＰＣＲ増幅は、ｌμｇ（７）正常ヒト胎盤ＤＮＡ　（７）存在下テ１，０００． １００゜１０、　１又はＯｆ）ｇのＣａ５Ｋｔ細胞ＤＮＡのいづれかを含む１０ ０　μｍのアリコートの反応混合物の中で実施した。各ＰＣＲ反応混合物は更に ＋００ｐｍｏｌｅの各プライマー（ＰＩ及びＰ２）　、　０．２５ｍＭの４種類 のデオキシヌクレオチド三リン酸、１０μｌのＩＯＸのＴａｑバッファー及び２ ．５ＵのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。
９４°Ｃで５分の第−ＤＮＡ変性段階に続き、９４°Ｃて１分の変性、４７°Ｃ で１．５分のアニーリング及び７２°Ｃで１．５分の伸長、３０サイクルを行っ た。増幅は７２℃で７分の伸長で終えた。
ｅ）ＤＮＡの輸送及び濃縮 標的核酸配列の濃縮及び捕獲は下記のクロマトグラフィーハイブリダイゼーショ ン手順により達成せしめた：上記の段階ｄにおいて獲得した５０μｍづつのＰＣ Ｒ生成物を、０．６ＭのＮａＣ１，２０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７，５、 ０，０２％のフィコール４００　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ ，ＵＳＡ）、　０．０２％のゼラチン及び１％のＰＶＰより成る４５０μｌのハ イブリダイゼーション溶液の中に１：ｌＯに希釈した。これらのサンプルを１０ 分間煮沸し、そして氷上で急冷した。２００μｌづつの溶液を次に図１〜４に示 す装置１２のウェル１４に移し、そして各ストリップ２２の接触部分２０をウェ ル１４中の溶液と接触させた。
装置Ｉ２を３７°Ｃの多湿インキュベーター（相対湿度９０％）の中に２５分間 入れ、次いてその溶液を、吸水性担体２４を構成している二トロセルローススト リップ伝いに泳動させた。これらのストリップを次に、ＰＲＳの中でＩ：２，５ ００に希釈された１００μｌのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコン ジュゲート及び０．３％のツイーン２０を含むウェルＩ６の中に２０分間入れて おいた。これらのストリップを次に１５０μｌのＰＢＳ及び０．３９６のツイー ン２０を含む溶液を含んでいるウェルに移した。ストリップ２２の接触部分２０ をこの溶液に３７°Ｃで１５分接触させておいた。最後にこれらのストリップを 、発色反応のための基質を供するＣｈｅｍｉＰｒｏｂｅ　（商標）　［１ＣＩＰ ／ＮＢＴ溶液の中に３７°Ｃで２０分浸しておいた。ストリップ２２の補獲ゾー ン３２における青色のシグナルはＨＰＶ　ＤＮＡの存在を示す。
ｌｐｇのＣａ５Ｋｉ　ＤＮＡはどの低い量で存在しているＨＰＶ配列がこのクロ マトグラフィーハイブリダイゼーション手順によって検出できることが見い出さ れた。
本発明は本明細書において特定に示した及び記載したものに限定されないことが 当業者にとって明らかであろう。本発明の範囲は下記の請求の範囲によってのみ 限定される。
補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年４月４日

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. １．吸水性担体内で核酸配列を含む分子を輸送するための装置であって、該分子 を含む溶液と接触しているときに、該分子の輸送を補助するキャピラリー輸送経 路を規定する乾燥吸水性担体を含んで成る装置。
  2. ２．液体サンプル中の標的分子の濃縮のための装置であって：乾燥吸水性担体（ ここで、この標的分子は標的核酸配列を含み、そして前記吸水性担体内で、キャ ピラリー作用により、この乾燥吸水性担体がこの標的分子を含む液体サンプルと 接触しているときに輸送される）；及び 前記吸水性担体の接触部分の下流にあるこの乾燥吸水性担体上の少なくとも一捕 獲ゾーンにおいて固定化されている少なくとも一捕獲試薬（ここで、この少なく とも一捕獲試薬は標的分子を捕獲することができる）； を含んで成る請求項１に記載の装置。
  3. ３．標的核酸配列を含む標的分子の、この標的分子と、非標的ヌクレオチド及び オリゴヌクレオチドとを含む液体サンプル中の非標的ヌクレオチド及びオリゴヌ クレオチドからの分離のための装置であって： 前記非標的オリゴヌクレオチドに結合する化合物を含む槽；及びキャピラリー作 用により前記槽から前記標的分子を輸送するための手段； を含んで成る装置。
  4. ４．前記吸水性担体がニトロセルロース膜であり、ここでその吸収部位が前記標 的分子のキャピラリー輸送を助長するためにブロックされている、請求項２に記 載の装置。
  5. ５．前記吸水性担体が硬質枠により支持されている、請求項４に記載の装置。
  6. ６．前記乾燥吸収性担体伝いの液体のキャピラリー輸送を助長するために、この 吸収性担体に、前記少なくとも一捕獲ゾーンの下流にて吸収パッドが固定されて いる、請求項２に記載の装置。
  7. ７．ニトロセルロース膜の前記吸収部位が、巨大分子、清浄剤及びそれらの組合 せを含んで成る群から選ばれる化合物によりブロックされている、請求項４に記 載の装置。
  8. ８．前記巨大分子がタンパク質を含む、請求項７に記載の装置。
  9. ９．前記少なくとも一捕獲試薬が、前記標的核酸配列の改質部分に対する抗体を 含んで成る、請求項２に記載の装置。
  10. １０．前記少なくとも一捕獲試薬が、前記標的核酸配列の少なくとも一部に相補 性な核酸プローブ配列を含む少なくとも−核酸捕獲試薬を含んで成る、請求項２ に記載の装置。
  11. １１．前記核酸プローブ配列がＤＮＡ配列を含む、請求項１０に記載の装置。
  12. １２．前記核酸プローブ配列がＲＮＡ配列を含む、請求項１０に記載の装置。
  13. １３．前記標的分子が３０塩基対以上を含んで成る標的核酸配列を含む、請求項 １に記載の装置。
  14. １４．核酸配列を含む前記標的分子が、酵素増幅反応の核酸生成物を含んで成り 、そして少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを一体化せしめている 、請求項２に記載の装置。
  15. １５．前記少なくとも一対のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のた めのプライマーを含んで成る、請求項１４に記載の装置。
  16. １６．前記少なくとも一対のプライマーがリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のための プライマーを含んで成る、請求項１４に記載の装置。
  17. １７．前記少なくとも一対のプライマーのうちの少なくとも第二プライマーが、 少なくとも一捕獲試薬に結合するリガンドを抱えるオリゴヌクレオチドを含み、 これにより、前記リガンドを抱える前記少なくとも−プライマーを含む前記標的 分子が前記少なくとも一捕獲試薬に結合しうる、請求項１４に記載の装置。
  18. １８．前記リガンドが抗原性エピトープを含んで成る、請求項１７に記載の装置 。
  19. １９．前記リガンドが少なくとも−スルホン化シトシンを含んで成る、請求項１ ８に記載の装置。
  20. ２０．前記非標的オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸配列に一体化されていな いオリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る、請求項３に記載の装置。
  21. ２１．前記化合物が、輸送のための前記手段によって輸送されるのには大きすぎ るゲル濾過粒子を含んで成る、請求項３に記載の装置。
  22. ２２．前記化合物が、輸送のための前記手段によって輸送されないマトリックス を占めており、そしてここで前記化合物が前記非標的オリゴヌクレオチドとハイ ブリダイズする、請求項３に記載の装置。
  23. ２３．吸水性担体内での核酸配列を含む分子の輸送のための方法であって： 核酸配列を含む分子の輸送を補助するキャピラリー経路を規定する乾燥吸水性担 体を用意し；そして この乾燥吸水性担体を核酸配列を含む分子を含んでいる溶液と接触させること； の段階を含んで成る方法。
  24. ２４．液体サンプル中の、核酸配列を含む分子の濃縮のための方法であって： 乾燥吸水性担体を用意し（ここで、前記分子は、標的核酸配列を含む標的分子で あり、そしてここで、前記分子は、この吸水性担体内で、キャピラリー作用によ り、この乾燥吸水性担体の一部がこの分子を含む液体サンプルと接触していると きに輸送される）；前記乾燥吸水性担体の一部を、前記標的分子を含む液体サン プルと接触させ（ここでこの乾燥吸水性担体は、濡れているとき、核酸配列を含 む分子の輸送を補助する液輸送経路を規定する）；前記液輸送経路伝いに前記標 的分子を輸送し；そして前記分子を、前記吸水性担体の前記液体と接触している 部分の下流にあるこの乾燥吸水性担体上の少なくとも−捕獲ゾーンにおいて固定 化されている少なくとも−捕獲試薬により捕獲すること；の段階を含んで成る方 法。
  25. ２５．標的核酸配列を含む標的分子の、この標的分子と、非標的ヌクレオチド及 びオリゴヌクレオチドとを含む液体サンプル中の非標的ヌクレオチド及びオリゴ ヌクレオチドからの分離のための方法であって： 前記非標的オリゴヌクレオチドに結合する化合物を含む槽を用意し； 前記標的分子と、前記非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドとを含む液体 サンプルを加え；そして前記分子をキャピラリー作用により輸送すること；の段 階を含んで成る方法。
  26. ２６．標的核酸配列を含む標的分子の、この標的分子と、非標的ヌクレオチド及 びオリゴヌクレオチドとを含む液体サンプル中の非標的ヌクレオチド及びオリゴ ヌクレオチドからの分離、この標的分子の濃縮、並びに濃縮標的分子の検出のた めの装置であって：前記非標的オリゴヌクレオチドに結合する化合物を含む複数 ウェルの第一領域を含む複数のウェルを規定する槽備品（ここで前記液体サンプ ルをこの複数のウェルの第一領域に加えることができる）；濡れているときに前 記標的分子の輸送を補助する、前記槽からの液輸送経路を規定する乾燥吸水性担 体（ここで前記標的分子はこの吸水性担体内で、キャピラリー作用により、この 乾燥吸水性担体の接触部分がこの標的分子を含む液体サンプルと接触していると きに輸送される）； 前記標的分子を捕獲できる少なくとも−捕獲試薬（ここでこの少なくとも−捕獲 試薬は、この吸水性担体の接触部分の下流にあるこの乾燥吸水性担体上の少なく とも−捕獲ゾーンにおいて固定化されている）；及び この捕獲標的分子を検出するための手段；を含んで成る装置。
  27. ２７．液体サンプル中の標的核酸配列の濃縮及び検出のための方法であって： 乾燥吸水性担体を用意し（ここで、この標的核酸配列はこの乾燥担体内で、キャ ピラリー作用により、この乾燥吸水性担体の一部がこの標的核酸配列を含む液体 サンプルと接触しているときに輸送される）； 前記乾燥吸水性担体の一部を、前記標的核酸配列を含む液体サンプルと接触させ （ここで、この吸水性担体は、濡れているとき、この標的核酸配列の輸送を補助 する液輸送経路を規定する）；前記標的核酸配列を前記液輸送経路伝いに輸送し ；前記標的核酸配列を、前記液体サンプルと接触しているこの吸水性担体の部分 の下流にあるこの乾燥吸水性担体上の少なくとも−捕獲ゾーンにおいて固定化さ れている少なくとも一核酸捕獲試薬とのハイブリダイゼーションにより捕獲する こと；の段階を含んで成る方法。
  28. ２８．標的核酸配列の濃縮及び検出のための装置であって：複数のウェルを規定 する槽備品； 濡れているときに前記標的核酸配列の輸送を補助する、前記槽からの液輸送経路 を規定する乾燥吸水性担体（ここでこの標的核酸配列はこの吸水性担体内で、キ ャピラリー作用により、この乾燥吸水性担体の接触部分がこの標的核酸配列を含 む液体サンプルと接触しているときに輸送される）； ハイブリダイゼーションによって前記標的核酸配列を捕獲するための核酸プロー ブ配列を含む少なくとも−核酸捕獲試薬（ここで、この少なくとも−核酸捕獲試 薬はこの吸水性担体の接触部分の下流にあるこの乾燥吸水性担体上の捕獲ゾーン において固定化されている）；及び 前記の捕獲された標的核酸配列を検出するための手段；を含んで成る装置。
  29. ２９．検出のための前記手段が： シグナル生成試薬に結合するリガンドを抱える、核酸配列を含む標的分子がその 上に固定化されている吸水性担体；及びこの核酸配列を含む標的分子の検出を指 標する検出可能シグナルを生成するために、前記リガンドを抱える核酸配列を含 む標的分子を前記シグナル生成試薬と接触させるための手段；を含んで成る、請 求項２６に記載の装置。
  30. ３０．前記標的核酸配列が酵素増幅反応の生成物であり、そして少なくとも一対 のオリゴヌクレオチドプライマーを一体化せしめている、請求項２９に記載の装 置。
  31. ３１．前記非標的オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸配列に一体化されていな いオリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る、請求項２６に記載の装置。
  32. ３２．前記少なくとも 一対のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の ためのプライマーを含んで成る、請求項３０に記載の装置。
  33. ３３．前記一対のプライマーが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のためのプライマ ーを含んで成る、請求項３０に記載の装置。
  34. ３４．前記少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの第二プライ マーが、前記少なくとも一捕獲試薬に結合するリガンドを含み、これにより、こ のリガンドを含む前記標的分子がこの少なくとも一捕獲試薬に結合しうる、請求 項３０に記載の装置。
  35. ３５．前記リガンドが抗原性エピトープを含んで成る、請求項３４に記載の装置 。
  36. ３６．前記リガンドが少なくとも−スルホン化シトシンを含んで成る、請求項３ ５に記載の装置。
  37. ３７．前記少なくとも一対のプライマーのうちの第一プライマーがシグナル生成 試薬に結合するリガンドを含み、これにより、このリガンドを含む前記標的分子 が、このシグナル生成試薬により生成されるシグナルの存在により検出されうる 、請求項３０に記載の装置。
  38. ３８．前記少なくとも一対のプライマーのうちの第一プライマーがシグナル生成 試薬に結合するリガンドを含み、これにより、このリガンドを含む前記標的分子 が、シグナル発生剤との接触後にこのシグナル生成試薬により生成されるシグナ ルの存在により検出されうる、請求項３７に記載の装置。
  39. ３９．前記リガンドがビオチニル化ヌクレオチドを含んで成る、請求項３７に記 載の装置。
  40. ４０．前記シグナル生成試薬が着色ラテックスビーズに結合したストレプトアビ ジンを含んで成る、請求項３７に記載の装置。
  41. ４１．前記シグナル発生剤との接触後に前記シグナル生成試薬により生成される シグナルがストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを含む 、請求項３８に記載の装置。
  42. ４２．前記した第一領域ウェルがシグナル生成試薬も含む、請求項２６に記載の 装置。
  43. ４３．前記複数のウェルが、洗浄溶液を含む第二領域ウェルを更に含む、請求項 ２６に記載の装置。
  44. ４４．前記複数のウェルが、シグナル発生剤溶液を含む第三領域ウェルも含む、 請求項２６ら記載の装置。
  45. ４５．前記複数のウェルが、標的核酸配列について検査すべきサンプルを含む第 一領域ウェルを含んで成る、請求項２８に記載の装置。
  46. ４６．前記複数のウェルが、シグナル生成試薬を含む第二領域ウェルを更に含ん で成る、請求項２８に記載の装置。
  47. ４７．前記複数のウェルが、洗浄溶液を含む第三領域ウェルを更に含んで成る、 請求項２８に記載の装置。
  48. ４８．前記複数のウェルが、シグナル発生剤を含む第四領域ウェルを更に含んで 成る、請求項２８に記載の装置。
  49. ４９．前記乾燥吸水性担体が少なくとも一本のストリップを含んで成る、請求項 ２６に記載の装置。
  50. ５０．前記第一領域ウェルのそれぞれが、前記標的分子をそれらが捕獲される前 記少なくとも一捕獲ゾーンに至るまで輸送するために、各ストリップの接触部分 を受け入れるようになっている、請求項４９に記載の装置。
  51. ５１．前記第二領域ウェルそれぞれが、前記ストリップ一捕獲ゾーンにおける前 記標的分子の固定化の後の非特異的に捕獲された化合物の除去のために、前記ス トリップを洗浄するために各ストリップの接触部分を受容するようになっている 、請求項４３に記載の装置。
  52. ５２．前記第三領域ウェルのそれぞれが、ストリップ全体を受容するようになっ ている、請求項４４に記載の装置。
  53. ５３．接触のための前記手段が： シグナル生成試薬溶液を含む少なくとも−第三領域ウェル；前記少なくとも一捕 獲ゾーンにおける前記標的分子の固定化を経た少なくとも−ストリップ（ここで このストリップ全体がシグナル発生剤溶液と、このシグナル発生剤とこの少なく とも一捕獲ゾーンとの接触を可能とするように接触している）；を含んで成る請 求項５２に記載の装置。
  54. ５４．前記第一領域ウェルそれぞれが、前記核酸配列を、それらが捕獲される少 なくとも一捕獲ゾーンに至るまで輸送するよう各ストリップの接触部分を受容す るようになっている、請求項２８に記載の装置。
  55. ５５．前記第三領域ウェルそれぞれが、前記シグナル生成試薬を、それが前記標 的核酸配列に抱えられたリガンドに結合する前記少なくとも一捕獲ゾーンに至る まで輸送するよう、各ストリップの接触部分を受容するようになっている、請求 項４６に記載の装置。
  56. ５６．前記第三領域ウェルそれぞれが、前記ストリップ一捕獲ゾーンにおける前 記標的核酸配列の固定化の後の非特異的に捕獲された化合物の除去のために、前 記ストリップを洗浄するために各ストリップの接触部分を受容するようになって いる、請求項４７に記載の装置。
  57. ５７．接触のための前記手段が： シグナル生成試薬溶液を含む少なくとも−第四領域ウェル；前記少なくとも一捕 獲ゾーンにおける前記標的核酸配列の固定化を経た少なくとも−ストリップ（こ こでこのストリップ全体がシグナル発生剤溶液と、このシグナル発生剤とこの少 なくとも一捕獲ゾーンとの接触を可能とするように接触している）；を含んで成 る請求項４８に記載の装置。
  58. ５８．前記第四領域ウェルがストリップ全体を受容するようになっている、請求 項５７に記載の装置。
  59. ５９．特異的な核酸配列の検出のための方法であって：オリジナルの核酸配列の 少なくとも一部に特異的である核酸配列を含む標的分子を生成するために、この オリジナル核酸配列の少なくとも一部を酵素反応によって増幅し；この標的分子 を、非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドから分離し〔ここで、この分離 は： 非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドに結合する基体を含む槽を用意し； 前記標的分子と、非標的ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドとを含む液体サン プルを加え；そして この標的分子をキャピラリー作用によって輸送する；段階を含む〕；この標的分 子に濃縮し〔ここで、この濃縮は：乾燥吸水性担体を用意する（ここで、この標 的分子はこの吸水性担体内で、キャピラリー作用により、この乾燥吸水性担体の 一部がこの標的分子を含む液体サンプルと接触しているときに輸送される）；こ の乾燥吸水性担体の一部を、この標的核酸配列を含む液体サンプルと接触させる （ここで、この乾燥吸水性担体は、濡れているとき、この標的分子の輸送を補助 する液輸送経路を規定する）；この標的分子をこの液輸送経路伝いに輸送し；そ してこの標的分子を、この液体サンプルと接触している吸水性担体の部分の下流 にあるこの乾燥吸水性担体上の捕獲ゾーンにおいて固定化去れている少なくとも 一捕獲試薬により捕獲する；段階を含む〕；次いで この標的分子を、シグナル生成試薬を含み、且つ吸水性担体上に固定化されてい るリガンドを有する標的分子を、シグナル発生剤と接触させて検出可能シグナル を生成することによって検出する；段階を含んで成る方法。
  60. ６０．特異的な核酸配列の検出のための方法であって：オリジナルの核酸配列の 少なくとも一部に特異的である核酸配列を生成するために、このオリジナル核酸 配列の少なくとも一部を酵素反応によって増幅し； この標的核酸配列を含む液体サンプルを用意し；この標的核酸配列をキャピラリ ー作用によって輸送し；この標的核酸配列に濃縮し〔ここで、この農縮は：乾燥 吸水性担体を用意し（ここで、この標的核酸配列はこの吸水性担体内で、キャピ ラリー作用により、この乾燥吸水性担体の一部がこの標的核酸配列を含む液体サ ンプルと接触しているときに輸送される）； この乾燥吸水性担体の一部を、この標的核酸配列を含む液体サンプルと接触させ （ここで、この乾燥吸水性担体は、濡れているとき、この標的核酸配列の輸送を 補助する液輸送経路を規定する）；この標的核酸配列をこの液輸送経路伝いに輸 送し；そしてこの標的核酸配列を、この液体サンプルと接触している吸水性担体 の部分の下流にあるこの乾燥吸水性担体上の捕獲ゾーンにおいて固定化去れてい る少なくとも一捕獲試薬により捕獲する；段階を含む〕；次いで この標的核酸配列を、シグナル生成試薬を含み、且つ吸水性担体上に固定化され ているリガンドを有する標的核酸配列を、シグナル発生剤と接触させて検出可能 シグナルを生成することによって検出する； 段階を含んで成る方法。
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