PT1364057E

PT1364057E - Método de detecção de ligandos

Info

Publication number: PT1364057E
Application number: PT01999671T
Authority: PT
Inventors: Frank Karlsen
Original assignee: Norchip As
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2009-07-06
Also published as: US20040076983A1; GB2375822A; ES2324462T3; JP4266634B2; GB2375822B; EP1364057B1; US7910294B2; WO2002046464A2; CA2437043C; CA2437043A1; GB0129143D0; AR031631A1; CY1109246T1; WO2002046464A3; GB0029617D0; AU2002220898A1; DK1364057T3; DE60138486D1; EP1364057A2; ATE429510T1

Description

ΕΡ 1 364 057/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Método de detecção de ligandos"

Campo do invento 0 invento refere-se a um método sensível para a detecção específica de ligandos.

Antecedentes do invento A detecção imunológica é actualmente o método de eleição para a detecção de ligandos no campo dos diagnósticos. Contudo, os métodos tradicionais de detecção imunológica, como o ensaio imunossorvente com enzima ligada (ELISA), sofrem de falta de sensibilidade e/ou especificidade quando se trata da detecção de ligandos presentes numa concentração muito baixa. 0 ensaio ELISA Standard possui uma sensibilidade máxima de aproximadamente 10 000 células ou cópias do alvo por unidade. Normalmente, a sensibilidade não se encontra acima de 100 000 células ou alvos. A concentração de proteínas por métodos imunomagnéticos poderá resultar num aumento da sensibilidade capaz de detectar até uma célula humana em estudos de investigação, mas isto deve-se largamente ao grande tamanho das células humanas. A sensibilidade máxima para a detecção de células bacterianas continua a ser da ordem das 1000 células, mesmo com a utilização de métodos imunomagnéticos com anticorpos. Assim, continua a existir a necessidade de dispor de métodos mais sensíveis de detecção imunológica. A patente US 5665539 descreve um método de "imunorreacção em cadeia pela polimerase" para detecção imunológica. Este método baseia-se na utilização de um anticorpo especifico conjugado com uma molécula de ADN de cadeia dupla. Os complexos formados pela ligação do conjugado do anticorpo a um antigénio são detectados, primeiro amplificando uma região do ADN de cadeia dupla com recurso à reacção de PCR e depois detectando os produtos de amplificação.

Os presentes inventores desenvolveram um método alternativo para a detecção sensível de antigénios (ligandos), 2 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ que se baseia na amplificação em tempo real de um marcador de ácido nucleico. Este método combina a especificidade das reacções imunológicas com a sensibilidade da amplificação de ácidos nucleicos e pode ser utilizado para uma medição quantitativa em tempo real.

Descrição do invento

Num primeiro aspecto, o invento proporciona um método de detecção de um ligando numa amostra, em que o método compreende as etapas de: (a) contacto da amostra com reagentes capazes de formar um complexo de reagentes, em que o complexo de reagentes compreende um receptor capaz de se ligar especificamente ao referido ligando e uma molécula de ácido nucleico; e (b) detecção de quaisquer complexos formados por ligação da porção de receptor do referido complexo de reagentes ao ligando presente na amostra através da detecção especifica da presença da molécula de ácido nucleico, mediante a amplificação de uma região do ácido nucleico e a detecção simultânea em tempo real dos produtos da reacção de amplificação. 0 invento baseia-se na combinação de uma reacção de ligação ligando/receptor especifica com uma etapa de detecção envolvendo a detecção de um marcador de ácido nucleico por meio de amplificação e de detecção em tempo real dos produtos da amplificação. A primeira parte do método do invento é, por conseguinte, análoga a um ensaio de ligação ligando/receptor Standard como seja, por exemplo, um imunoensaio. 0 receptor pode ser essencialmente qualquer molécula que apresente especificidade de ligação para o ligando em questão. Os anticorpos são particularmente preferidos, assim como os fragmentos de anticorpos que conservam a especificidade de ligação ao antigénio, por exemplo, os fragmentos F(ab')2· Outros receptores adequados incluem enzimas, receptores de hormonas, lectinas, etc. Esta lista não pretende ser exaustiva. A molécula de ácido nucleico é utilizada como marcador para permitir a detecção da ligação ligando/receptor 3 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ específica. Mais preferencialmente, o marcador de ácido nucleico é parcial ou totalmente de cadeia simples. A utilização de um marcador de ácido nucleico proporciona vantagens significativas relativamente aos marcadores mais convencionais, como sejam os marcadores enzimáticos ou fluorescentes, uma vez que o passo de detecção do ácido nucleico poderá envolver uma reacção de amplificação. A etapa de amplificação aumenta substancialmente a sensibilidade do método de detecção. 0 marcador de ácido nucleico é mais preferencialmente um ADN de cadeia simples, embora também se possam utilizar marcadores de ARN de cadeia simples. 0 invento também contempla a utilização de análogos sintéticos de ARN e de ADN, tal como, por exemplo, ácidos nucleicos que incorporam bases não naturais ou derivatizadas e ligações estruturais não naturais. É essencial que a molécula de ácido nucleico esteja ligada à molécula do receptor, de modo que a quantidade de ácido nucleico presente possa ser tomada como uma indicação da quantidade de receptores ligados ao ligando na amostra. O ácido nucleico de cadeia simples poderá estar directamente ligado ao receptor, embora mais usualmente esteja indirectamente ligado ao receptor via uma ou mais moléculas de ligação. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico de cadeia simples poderá estar ligada ao receptor via um receptor secundário que se liga especificamente ao receptor de ligação ao ligando. Além disso, o ácido nucleico de cadeia simples poderá estar ligado ao receptor de ligação ao ligando ou ao receptor secundário através de conjugação com os componentes de um par de ligação biológica, como seja a biotina/avidina ou a biotina/estreptavidina. 0 termo "ligação" engloba, assim, a ligação via interacções de união.

Numa concretização, o receptor e a molécula de ácido nucleico de cadeia simples poderão ser ligados numa etapa separada para fornecer um complexo de reagentes, antes de dar início ao procedimento de detecção. Numa concretização preferida, o ácido nucleico poderá ser ligado ao receptor de ligação ao ligando através da formação de um conjugado que compreende os receptores de ligação ao ligando, o ácido 4 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ nucleico e uma molécula transportadora. As moléculas transportadoras adequadas incluem polímeros solúveis em água, mais preferencialmente polissacáridos naturais ou sintéticos como, por exemplo, os dextranos. Os métodos adequados para efectuar a ligação de oligonucleótidos a moléculas transportadoras estão descritos em WO 98/22620 e em US-A-6,207,385.

Numa concretização adicional, a ligação entre o receptor e a molécula de ácido nucleico de cadeia simples poderá ser formada no decurso do procedimento de detecção, por formação de um "complexo de reagentes" contendo o receptor, o ácido nucleico de cadeia simples e quaisquer moléculas de ligação necessárias para unir o receptor ao ácido nucleico.

Os componentes que constituem o complexo de reagentes poderão ser adicionados simultânea ou sequencialmente durante o procedimento de detecção. No campo dos imunoensaios, é sabido que os reagentes podem ser adicionados sequencialmente com uma lavagem entre cada adição, ou simultaneamente com uma etapa de lavagem final para remover os reagentes não ligados antes da detecção da ligação específica. A adição "simultânea" de reagentes engloba não só a adição de reagentes ao mesmo tempo, como também a situação em que os reagentes são adicionados um após o outro, mas sem quaisquer etapas de lavagem intermédias. A adição sequencial de reagentes com uma lavagem entre cada adição poderá fornecer uma maior sensibilidade, mas a adição simultânea de reagentes requer menos manipulações e é, por conseguinte, mais receptiva à automação para aplicações de diagnóstico de elevado rendimento.

Numa concretização especifica do método do invento, os receptores específicos para o ligando visado são inicialmente adicionados à amostra em teste. Os receptores são conjugados com um primeiro componente de um par de ligação biológica. A amostra é incubada para permitir a ligação receptor/ligando e depois é lavada para remover os receptores não ligados. Moléculas de ácido nucleico conjugadas com o segundo componente do par de ligação biológica são depois adicionadas, a amostra é incubada para permitir que o ácido nucleico se ligue ao receptor através da ligação do primeiro e segundo 5 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ componentes do par de ligação biológica e depois é lavada para remover o ácido nucleico não ligado. A detecção do ácido nucleico de cadeia simples é seguidamente efectuada. Um exemplo de um par de ligação biológica é a biotina/avidina ou a biotina/estreptavidina. Mais preferencialmente, a molécula de ácido nucleico de cadeia simples estará conjugada com a biotina e o receptor com a avidina ou a estreptavidina. A etapa de lavagem entre a adição dos receptores e do ácido nucleico poderá ser omitida, ou os dois reagentes poderão ser adicionados ao mesmo tempo.

Noutra concretização especifica, os receptores específicos para o ligando visado são inicialmente adicionados à amostra em teste. A amostra é depois incubada para permitir a ligação receptor/ligando e, em seguida, é lavada para remover os receptores não ligados. Receptores secundários capazes de se ligar aos primeiros receptores são seguidamente adicionados à amostra, em que estes receptores secundários estão ligados a moléculas marcadoras de ácido nucleico de cadeia simples. A amostra é depois incubada para permitir a ligação dos receptores secundários aos primeiros receptores e lavada para remover os receptores secundários não ligados. A detecção do ácido nucleico é, em seguida, efectuada da forma descrita abaixo. Um exemplo específico desta concretização consiste na utilização de um anticorpo como primeiro receptor, isto é, o receptor que se liga especificamente ao ligando, e de um anticorpo anti-isotipo como receptor secundário. A etapa de lavagem entre a adição dos receptores e dos receptores secundários poderá ser omitida, ou os dois reagentes poderão ser adicionados ao mesmo tempo.

Numa variação desta concretização, as moléculas de ácido nucleico poderão ser ligadas aos receptores secundários utilizando a reacção entre um par de ligação biológica. Por exemplo, o receptor secundário poderá ser conjugado com a avidina ou a estreptavidina e a molécula de ácido nucleico com a biotina. A ligação dos receptores secundários às moléculas de ácido nucleico através da ligação biotina/avidina ou biotina/estreptavidina poderá depois ser realizada por adição dos receptores secundários e das moléculas de ácido nucleico à amostra de teste como reagentes separados, opcionalmente com uma etapa de lavagem entre a adição dos dois reagentes. Em 6 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ alternativa, os receptores secundários poderão ser ligados às moléculas de ácido nucleico numa etapa separada, sendo o reagente ligado depois adicionado à amostra de teste.

Numa concretização especifica adicional, os receptores específicos para o ligando visado são inicialmente adicionados à amostra em teste. A amostra é incubada para permitir a ligação receptor/ligando e depois é lavada para remover os receptores não ligados. Receptores secundários capazes de se ligar aos primeiros receptores são seguidamente adicionados à amostra, em que os receptores secundários estão conjugados com a primeira metade de um par de ligação biológica. A amostra é seguidamente incubada para permitir a ligação dos receptores secundários aos primeiros receptores e é lavada para remover os receptores secundários não ligados. A amostra é depois colocada em contacto, primeiro, com moléculas de ácido nucleico que estão conjugadas com a primeira metade do par de ligação biológica numa primeira extremidade da cadeia de ácido nucleico e com a segunda metade do par de ligação biológica numa segunda extremidade da cadeia de ácido nucleico e, depois, com moléculas de ácido nucleico conjugadas apenas com a segunda metade do par de ligação biológica. Após uma etapa de lavagem final, o ácido nucleico é detectado da forma descrita abaixo.

Um exemplo especifico desta concretização utiliza receptores secundários conjugados com estreptavidina, um primeiro tipo de moléculas de ácido nucleico conjugadas com biotina numa extremidade da cadeia de ácido nucleico e com estreptavidina na outra extremidade da cadeia de ácido nucleico, e um segundo tipo de moléculas de ácido nucleico conjugadas apenas com biotina. É preferido adicionar os dois tipos de moléculas de ácido nucleico sequencialmente, com uma etapa de lavagem intermédia, mesmo que as restantes adições de reagentes sejam efectuadas simultaneamente, isto é, sem as etapas de lavagem intermédias. Nesta concretização, a utilização dos dois tipos de moléculas de ácido nucleico fornece um ciclo adicional de amplificação, tal como ilustrado nas Figuras anexas. Várias das concretizações específicas referidas acima utilizam um "par de ligação biológica" para ligar os 7 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ componentes do complexo de reagentes. Os pares de ligação biológica adequados incluem a biotina/avidina e a biotina/estreptavidina. As técnicas para a conjugação de proteínas e ácidos nucleicos com a biotina, a estreptavidina e a avidina são bem conhecidas na arte. Adicionalmente, estão disponíveis comercialmente alguns conjugados úteis.

Os componentes do complexo de reagentes também poderão ser ligados por meio de uma ligação específica, em que um exemplo desta ligação é a utilização de receptores secundários que se ligam directamente aos receptores de ligação ao ligando. Os componentes também poderão ser ligados mediante a utilização de moléculas de ligação biespecíficas. Um exemplo de uma molécula de ligação biespecífica é uma proteína quimérica proteína A/estreptavidina recombinante, descrita na patente U.S. 5328985. Esta molécula quimérica é capaz de se ligar tanto a um anticorpo, via o domínio de proteína A, como a uma molécula biotinilada, via o domínio de estreptavidina.

Uma vez terminada a parte do método correspondente à reacção de ligação, a presença de complexos ligando/receptor específicos é detectada por meio da detecção das moléculas marcadoras de ácido nucleico.

Numa concretização preferida, a detecção do ácido nucleico é efectuada por amplificação de uma sequência do ácido nucleico e detecção dos produtos de amplificação. Mais preferencialmente, a amplificação é realizada utilizando uma técnica de amplificação isotérmica. A técnica de amplificação mais preferida é a amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (abreviada como NAS BA de "Nucleic Acid Sequence-Based Amplification"), mas outras técnicas de amplificação isotérmica poderão ser utilizadas como, por exemplo, a amplificação mediada por transcrição, a tecnologia de amplificação mediada por sinal do ARN, a reacção de "split promoter amplification" e a amplificação isotérmica em fase de solução. A técnica de NASBA é bem conhecida na arte, tal como descrito por Compton, J. Nature. 350: 91-92 (1991) e Davey et al., patente U.S. N.° 5,409, 818. A técnica de NASBA é geralmente utilizada com um marcador de ARN de cadeia simples, e os produtos de amplificação são ARN de 8 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ cadeia simples. Contudo, no presente invento, o alvo é preferencialmente ADN de cadeia simples que fornece produtos de amplificação de ARN de cadeia simples. A técnica de NASBA é um procedimento eficaz para gerar grandes quantidades de ARN correspondente a uma sequência-alvo de ácido nucleico in vitro, permitindo a detecção de sequências-alvo que estão presentes em concentrações muito baixas na amostra de teste original. 0 método de NASBA baseia-se na utilização de um iniciador que é modificado com uma sequência promotora, por exemplo, um promotor de T7. Foi demonstrado que a sensibilidade e a especificidade da amplificação NASBA são equivalentes às da reacção de PCR e melhores que a maioria dos protocolos de RT-PCR.

Numa concretização especialmente preferida, a detecção do ácido nucleico é efectuada por amplificação de uma região do ácido nucleico e detecção em tempo real dos produtos de amplificação. Mais preferencialmente, a detecção do ácido nucleico será efectuada por NASBA em tempo real. A reacção de NASBA resulta na geração de produtos de amplificação, em que o produto de amplificação principal é ARN de cadeia simples anti-sentido correspondente a uma região do ácido nucleico alvo. A reacção de NASBA em tempo real envolve a detecção dos produtos de amplificação em simultâneo com a amplificação do alvo. Isto é possivel mediante a utilização da tecnologia de "faróis moleculares" em combinação com a amplificação NASBA Standard, tal como descrito por Leone et al., Nucleic Acids Research. 26: 2150-2155 (1998).

Uma combinação de uma reacção de amplificação isotérmica com a detecção em tempo real dos produtos de amplificação proporciona uma sensibilidade enorme. Esta sensibilidade melhorada permite, por exemplo, a realização da detecção in situ de níveis muito baixos dos analitos visados, por exemplo, proteínas ou anticorpos. Adicionalmente, é possível efectuar directamente uma detecção quantitativa precisa, mesmo de quantidades muito baixas do analito visado.

Compreender-se-á que a natureza precisa da molécula marcadora de ácido nucleico, isto é, a sua sequência, não é material para o invento. Caso se pretenda utilizar a reacção 9 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ de NASBA para a detecção de um marcador de ARN de cadeia simples, é normalmente preferível evitar sequências de ARN que conduziriam à formação de uma extensa estrutura secundária passível de interferir com a eficiência da reacção de amplificação. 0 método do invento possui uma vantaqem importante relativamente à técnica de imuno-PCR previamente conhecida, na medida em que é possível efectuar uma amplificação substancialmente isotérmica de ácidos nucleicos de cadeia simples, por exemplo, utilizando a reacção de NASBA, e não é necessário aquecer a temperaturas elevadas de ~95°C durante a reacção de amplificação. As temperaturas elevadas necessárias para a desnaturação do ADN de cadeia dupla na etapa de desnaturação do ciclo de PCR são uma desvantagem quando se trata da detecção por imuno-PCR de antigénios imobilizados, dado que as temperaturas elevadas poderão conduzir à degradação do antigénio e/ou do anticorpo utilizado na detecção imunológica. Este problema é evitado através da detecção de um alvo de ácido nucleico de cadeia simples por meio de uma reacção de NASBA isotérmica. 0 método do invento encontra aplicação no campo da detecção imunológica, especialmente no campo dos diagnósticos. Em particular, o método pode ser adaptado para realizar um imunoensaio análogo a um teste ELISA de sanduíche Standard. Um teste ELISA de sanduíche geralmente requer dois anticorpos que são dirigidos contra um antigénio particular. Um anticorpo é adsorvido passivamente (revestido) sobre a superfície dos poços de uma placa de ensaio de microtitulação. Os poços são depois bloqueados com um agente de bloqueio não específico para reduzir a ligação não específica de fundo dos reagentes do ensaio. As amostras de teste suspeitas de conterem o antigénio desejado (ligando) são seguidamente adicionadas aos poços e incubadas durante um período de tempo suficiente para permitir que o antigénio se ligue ao anticorpo imobilizado na superfície da placa. Após lavagem para remover os reagentes não ligados, um segundo anticorpo (receptor) é adicionado aos poços. Este segundo anticorpo liga-se ao antigénio imobilizado, completando a sanduíche. A ligação do segundo anticorpo (o receptor) ao antigénio (o ligando) é depois efectuada utilizando o método do invento, isto é, por formação 10 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ de um complexo de reagentes que liga o segundo anticorpo (receptor) a um ácido nucleico que é subsequentemente detectado na etapa de detecção do ensaio.

Noutros tipos de ensaios ELISA, a amostra de teste poderá ser adicionada directamente aos poços da placa de microtitulação e incubada para permitir que o antigénio (ligando) presente na amostra fique ligado à superfície dos poços. Este tipo de ensaio é similar ao ensaio de sanduíche, mas não requer o primeiro anticorpo; em vez disso, o antigénio é revestido directamente sobre a superfície da placa de microtitulação. A "amostra de teste" que se pretende testar quanto à presença de um ligando particular poderá ser praticamente qualquer material que se deseje testar quanto à presença de um ligando. Ela poderá ser uma amostra líquida, como seja uma amostra clínica, um fluido ambiental, etc. Por exemplo, no campo dos diagnósticos, a amostra de teste poderá compreender fluidos corporais como sangue completo, soro, plasma, linfa, lágrimas, urina, etc. A amostra de teste também poderá ser uma amostra sólida como, por exemplo, uma secção de tecido, células fixas ou um esfregaço de células, tal como discutido abaixo. A natureza precisa da amostra de teste não é crucial para o invento. O método do invento também pode ser adaptado para utilizar em imuno-histoquímica, por exemplo, na detecção de um ligando in situ numa amostra de tecido fixo e seccionado, e a palavra "amostra", tal como utilizada nas reivindicações, deverá ser interpretada como incorporando secções e amostras de tecido, células fixas, esfregaços de células, etc. Quando o método do invento é utilizado para a detecção de ligandos in situ numa amostra de tecido, é preferido utilizar a amplificação NASBA para a detecção da molécula marcadora de ácido nucleico, mais preferencialmente um marcador de ARN de cadeia simples. Os objectivos principais da análise in situ consistem em determinar a localização do antigénio, proteger e não degradar o alvo e conservar a morfologia do tecido. A utilização da reacção de imuno-PCR para detectar antigénios in situ poderá resultar em degradação do antigénio ou do anticorpo utilizado no ensaio e em danos na morfologia 11 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ subjacente do tecido, devido à necessidade de incluir uma etapa de temperatura elevada no ciclo da reacção de PCR. A utilização da reacção de NASBA para detectar um marcador de arn de acordo com o método do invento evita estes problemas, uma vez que a reacção de NASBA é uma técnica de amplificação essencialmente isotérmica e pode ser realizada a uma temperatura constante de cerca de 42°C (Davey et al., patente US 5409818). Deste modo, não há necessidade de etapas de desnaturação a temperatura elevada.

Um exemplo especifico da aplicação do método do invento à detecção de antigénios in situ é a detecção de diferentes niveis da proteína supressora de tumores p53 no carcinoma do ovário, como marcador de prognóstico. Ao utilizar um anticorpo monoclonal extremamente especifico contra o antigénio p53 localizado in situ numa secção de tecido do tumor, em combinação com um anticorpo secundário marcado com estreptavidina e ligado a um marcador de ácido nucleico marcado com biotina, como seja um marcador de ADN ou de ARN, poderá ser possível detectar alterações no nível de expressão de p53 abaixo de 10 proteínas. A detecção do marcador de ácido nucleico ligado ao anticorpo secundário (via a ligação biotina/estreptavidina) é preferencialmente efectuada mediante a realização de uma reacção de NASBA, utilizando um par ideal de iniciadores e uma sonda de tipo farol molecular ideal. O sinal fluorescente proveniente da sonda farol molecular ligada poderá ser detectado utilizando um microscópio fluorescente normal munido de uma câmara CCD e de software.

Concretizações do presente invento serão agora descritas, apenas como exemplo, em referência às figuras anexas, nas quais: A Figura 1 é uma representação esquemática dos conjugados utilizados em reacções de detecção de ligandos de acordo com o invento.

A Figura 2 é uma representação esquemática de exemplos de diferentes moléculas de ligação (avidina-biotina, estreptavidina-biotina, dextrano ou conjugação directa via ligações químicas) que poderão ser utilizadas como ponte entre o segundo receptor e o oligonucleótido de ácido nucleico. O 12 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ oligonucleótido de cadeia simples é depois amplificado por uma reacção de NASBA, utilizando iniciadores e faróis moleculares para detecção em tempo real, tal como descrito em maior detalhe nos exemplos que se seguem. A Figura 3 é uma representação esquemática de vários conjugados incluindo diferentes moléculas de ligação, que poderão ser utilizados em reacções de detecção de ligandos de acordo com o invento. A Figura 4 é uma ilustração genérico da reacção de detecção de ligandos utilizando a amplificação NASBA e a tecnologia de faróis moleculares de acordo com o invento.

Na reacção genérica de detecção de ligandos descrita e ilustrada nas Figuras, o ligando visado (antigénio) imobilizado sobre uma superfície sólida é ligado por um primeiro anticorpo que possui especificidade para o antigénio. Um segundo anticorpo possuindo especificidade para o primeiro anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-isotipo) é depois ligado ao primeiro anticorpo. 0 segundo anticorpo é conjugado com o oligonucleótido de ADN de cadeia simples através de uma de várias moléculas de ligação diferentes, como ilustrado nas Figuras 2 e 3. 0 oligonucleótido de ADN de cadeia simples é depois amplificado por NASBA, utilizando iniciadores e faróis moleculares para a detecção em tempo real, como apresentado na Figura 4 e descrito em maior detalhe nos exemplos que se seguem. 0 invento será melhor compreendido em referência aos seguintes exemplos experimentais:

Exemplo 1 - Imunoamplificação NASBA em tempo real

Materiais e reagentes

Microplacas: Greiner n.° 650161, 96 poços, fundo em U Microtubos: MCT-150-C 1,5 ml transparentes (Axygen Scientific n.° 311-08-051)

Pastilhas de solução salina tamponada com fosfato (PBS): 0,01 M; pH 7,4 (Sigma P-4417) 13 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ

Solução salina tamponada com fosfato contendo Tween 20 (PBST): 0,01 M; pH 7,4 (Sigma P-3563)

Tampão de bloqueio: albumina sérica de bovino (BSA) em pbs 0,25 mg/ml (Sigma B-6917)

Tampão de diluição do anticorpo: PBS 0,01 M

Anticorpo primário (1) : Anticorpo de cabra anti-Salmonella (Europa Bioproducts Ltd., CR7100GAP)

10 μg/ml em PBS

Cultura de bactérias (antigénio):

Salmonella cholerasuis subs. Cholerasuis Diluída 1:100; 1:100 e 1:10 000 em PBS DSM n.° 4883 (DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)

Anticorpo primário (2): Anticorpo de coelho anti-Salmonella (Europa Bioproducts Ltd., CR7100RP)

1 μρ/ιηΐ em PBS

Anticorpo secundário (ELISA): Anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Zymed Laboratories Inc., 81-6122)

1:2 000 em PBS PNPP (100X) - Substrato para fosfatase alcalina (Zymed Laboratories Inc., 00-2201)

Diluído 1:100 em tampão de substrato (10X) para PNPP

Tampão de substrato (10X) para PNPP: (Zymed Laboratories Inc., 00-2208)

Diluído 1:10 com água destilada

Con jugado IMRAMP:

Esqueleto de dextrano com anticorpo de cabra anti-lgG de coelho e oligonucleótido sintético (ver abaixo para obter a especificação da sequência). Utilizaram-se dois oligonucleótidos diferentes no protocolo (Immb5 e Imkort) 14 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ

Tampão de diluição para conjugado IMRAMP: Tris/HCl 0,1 M; pH 7,2

Reagentes para isolamento automatizado:

Nuclisens Nasba Diagnostics n.° 84044 (Organon Teknika) Partículas de sílica Tampão de lise (pH normal)

Sequências dos oligonucleótidos sintéticos (MWG Biotech AG): (Immbõ): 5' Amino-modificador C12 5,C12-gattaatcggccggcttcgcctaggcagacatttcagcatacgcatactatatcc tttgcatgctactatatggcagcgtcgtcagatagcacagtagcagcgattaa-3' (Imkort): 5' Amino-modificador C12 5'C12-gattaatcgggcagacatttcagcatacgcatactatcctttgcatgctactata tgtcagatagcacagtagcagcgattaa-3'

Sequência dos faróis moleculares (MWG Biotech AG): (Pmb2): 5' FAM-GCGGC ATC CTT TGC ATG CTA CTA TA GCCGC-dabsil-3'

Sequências dos iniciadores de NASBA 1 e 2 (MWG Biotech AG): (Pnasbal) : 5'- AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AAG G GCT GCT ACT GTG CTA TCT GA-3' (Pnasba2) : 5'-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG GAC ATT TCA GCA TAC GCA TA-3'

Kit básico (reacções de amplificação) :

Nuclisens Nasba Diagnostics n.° 84121 (Organon Teknika)

Protocolos

Revestimento das placas 1. Revestir os poços de uma placa de microtitulação de 96 poços com 100 μΐ de anticorpo primário (1) 10 μρ/ιηΐ.

Incubar durante a noite a 41°C. 2. Eliminar o anticorpo primário (1) que não revestiu os poços; lavar os poços revestidos pelo menos três vezes com PBST e uma vez com PBS. 15 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ 3. Bloquear os restantes locais activos através de incubação da placa com 200 μΐ de BSA 0,25 mg/ml durante duas horas a 20°C. 4. Eliminar a BSA que não bloqueou os locais activos; lavar os poços revestidos pelo menos três vezes com PBST e uma vez com PBS. A microplaca está agora pronta para ser utilizada em aplicações de ELISA ou de IMRAMP, como descrito abaixo.

Ensaio ELISA de sanduíche (ensaio imunossorvente com enzima ligada) (funciona como controlo na etapa 1-8 em IMRAMP) 5. Adicionar 70 μΐ da concentração apropriada de uma cultura fresca de Salmonella aos poços. Incubar durante 1 hora a 20°C com agitação (40 rpm). 6. Eliminar as bactérias não ligadas; lavar os poços revestidos pelo menos três vezes com PBST e uma vez com PBS. 7. Preparar uma diluição apropriada do anticorpo primário (2) em PBS. Adicionar 70 μΐ aos poços e incubar durante 1 hora a 20°C com agitação (40 rpm). 8. Eliminar o anticorpo primário (2) não ligado; lavar os poços revestidos pelo menos três vezes com PBST e uma vez com PBS. 9. Preparar a diluição apropriada do conjugado do anticorpo secundário com fosfatase alcalina (AP). Adicionar 70 μΐ aos poços e incube durante 1 hora a 20°C com agitação (40 rpm). 10. Eliminar o anticorpo secundário não ligado; lavar os poços revestidos pelo menos três vezes com PBST e uma vez com PBS. 11. Preparar o substrato da fosfatase alcalina (PA) fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) em tampão de substrato pnpp (10X). 16 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ 12. Verifica-se um desenvolvimento de cor amarela nas amostras positivas. As amostras negativas surgem transparentes/não apresentam desenvolvimento de cor.

Imunoamplificagão em tempo real (IMRAMP) 5. Adicionar 70 μΐ da concentração apropriada de uma cultura fresca de Salmonella aos poços. Incubar durante 1 hora a 20°C com agitação. 6. Eliminar as bactérias não ligadas; lavar os poços revestidos pelo menos três vezes com PBST e uma vez com PBS. 7. Preparar a diluição apropriada do anticorpo primário (2) em PBS. Adicionar 70 μΐ aos poços e incubar durante 1 hora a 20°C com agitação (40 rpm). 8. Eliminar o anticorpo primário (2) não ligado; lavar os poços revestidos pelo menos três vezes com PBST e uma vez com PBS. 9. Preparar a diluição apropriada do conjugado IMRAMP em Tris/HCl (descrição do conjugado fornecida acima). Adicionar 70 μΐ aos poços e incubar durante 1 hora a 20°C com agitação (40 rpm). 10. Eliminar o conjugado IMRAMP não ligado; lavar os poços revestidos pelo menos três vezes com PBST e uma vez com PBS. A microplaca está agora pronta para ser utilizada na aplicação (A) ou (B) como descrito abaixo. (A) IMRAMP com amplificação NASBA e detecção via faróis moleculares (Figura 4) 1. Preparar a mistura principal. Seguir as instruções do kit de amplificação Nuclisens. Adicionar as seguintes soluções à mistura principal: 2,5 μΐ de um farol molecular 20 μΜ (Pmb2) para o oligonucleótido sintético 17 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ 5 μΐ de iniciador de Nasba 1 10 μΜ para o oligonucleótido sintético 5 μΐ de iniciador de Nasba 2 10 μΜ para o oligonucleótido sintético 60 μΐ de solução de enzima (ARN-polimerase; ARNaseH; transcritase inversa) 2. Adicionar 20 μΐ de PBS aos poços. 3. Adicionar 15 μι da mistura principal aos poços (ver acima). 4. Adicionar RNasin ao poço numa concentração final de lU/microlitro. 5. A amplificação e a detecção decorrem a 41°C num leitor de placas de fluorescência BIO-TEK FL600 durante 2 horas.

Configuração do leitor de placas:

Sensibilidade: 75 Excitação: 485/40 Emissão: 530/25 (B) IMRAMP com extracção: amplificação NASBA e detecção via faróis moleculares 1. Adicionar 100 μΐ de tampão de lise aos poços e incubar durante 20 min a 37°C. 2. Transferir todo o material dos poços para tubos separados contendo 0,9 ml de tampão de lise. Incubar durante 10 min a 37°C. 3. Adicionar 50 μΐ de partículas de sílica a cada tubo e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. Misturar os tubos de 2 em 2 minutos. 4. Eliminar todo o material do tubo num cartucho separado para utilização no extractor Nuclisens. 5. Seguir o manual para o método: "Extracção de 1 ml de plasma". 18 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ 6. Serão utilizados 5 μΐ de extracto no método de amplificação NASBA (descrito em A).

Nota: 0 tampão de lise é adicionado aos poços após a incubação com o conjugado IMRAMP e antes do método de extracção habitual (Nuclisens). 0 tampão de lise provavelmente destrói o esqueleto de dextrano e, deste modo, reduz possíveis obstáculos estereoquímicos para a ARN-polimerase.

Exemplo 2 - Amplificação de oligonucleótidos em conjugados contendo um esqueleto de dextrano com ADN de cadeia simples e anticorpo, utilizando diferentes tamanhos de dextrano

Prepararam-se os seguintes conjugados:

Conjugado Oligo Tamanho de dextrano (peso molecular) 641101 Immkort 20 000 641101 Immkort 196 000 641101 Immkort 500 000 641101 Pnasbal 500 000 Amplificação

Mistura principal: 2x esferas reagentes 160 μΐ diluente

27 água NASBA 28 KC1 120 enzima dividida em 2 e adicionada 1) 2,5 Pnasba2 (iniciador NASBA 2) 10 μΜ 2,5 Immkort 0,1 μΜ (usado como iniciador NASBA 1) 1,25 Pmb2ny (farol molecular) 20 μΜ 2) 15 μΐ da mistura de iniciadores Pnasba 1 + Pnasba 2, 10μΜ

Introduziram-se 15 μΐ da mistura principal em cada poço. As amostras e os conjugados foram adicionados, e os produtos 19 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ foram detectados num leitor de placas de fluorescência BIO-TEK FL 6000.

Os resultados (não apresentados) indicam que os dextranos de menor peso molecular são mais adequados para a detecção por NASBA.

Exemplo 3 - Extracção e amplificação de conjugados Extracção das amostras:

Adicionaram-se 100 μι de conjuqado a 900 μΐ de tampão de lise (NucliSens, pH normal).

Incubou-se num banho de água durante 10 minutos a 37°C. O conjugado no tampão de lise foi adicionado a 50 μΐ de silica e incubado durante 10 minutos, invertendo-se os tubos de 2 em 2 minutos.

As amostras foram carregadas no extractor Nuclisens, e o ARN/ADN foi extraido utilizando métodos Standard.

Resultados da amplificação NASBA:

Conjugado Contendo Aditivos Result. NASBA F470301-2 Immb3, dx, Ac TrisHCl,NaCl,bronidox Negativo F650301-2 Imm5, dx Tris HC1, NaCl Negativo F320401(B) Imm5, dx, Ac Tris HC1, NaCl Negativo F230701-1 Imkort, dx, Ac EDTA, RNasin, DMSO Amplificado F230701-2 Imkort, dx, Ac EDTA, RNasin, DMSO Amplificado F230701-1* Imkort, dx, Ac EDTA, RNasin Amplificado F230701-1** Imkort, dx, Ac RNasin, DMSO Amplificado F230701-1*** Imkort, dx, Ac EDTA, DMSO Negativo

Immb3 oligonucleótido dx dextrano

Ac anticorpo

Bronidox conservante

Os resultados da amplificação (não apresentados) indicam que é possivel obter uma amplificação bem sucedida utilizando os conjugados de dextrano extraídos. Os conjugados contendo EDTA, RNasin e DMSO são os mais adequados para a amplificação NASBA em IMRAMP. 20 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ

Exemplo 4 - Amplificação com/sem RNasin

Amplificação de oligonucleótido Psek2 e conjugado F320401. F320401 consiste em Immb3 (oligonucleótido), dextrano e GAR (anticorpo).

Mistura principal: 1 esfera reagente 80 μΐ diluente de esferas reagentes 13.5 μΐ água NASBA 14 μΐ KC1 5 μΐ iniciador Pnasba 1 5 μΐ iniciador Pnasba 2 2.5 μΐ Pmb2 (farol molecular) 60 μΐ enzima

Dividir a mistura principal em duas metades. A uma metade adicionou-se RNasin com uma concentração final de 1 U/ml.

Introduziram-se 15 μι da mistura principal em cada poço e adicionou-se 5 μΐ.

Amostras: 1) Psek2 (1:100) 2) Psek2 (1:10 000) mistura principal sem RNasin 3) F320401 4) Psek2 (1:100) 5) Psek2 (1:10 000) mistura principal com RNasin 6) F320401

Os resultados (não apresentados) indicam que a RNasin promove a amplificação.

Exemplo 5 - Amplificação com/sem aquecimento

Amplificação de oligonucleótido artificial Psek2 e conjugados F620301 e F650301-2. F620301 consiste em Immb5 (oligo) em dextrano. F650301-2 consiste em Immb5, dextrano e GAR (anticorpo).

Os conjugados são dissolvidos em Tris/HCl e NaCl. 21 ΕΡ 1 364 057/ΡΤ

Mistura principal: 2 esferas reagentes 160 μΐ diluente de esferas reagentes

27 μΐ água NASBA 28 μΐ KC1 10 μΐ iniciador de nasba 1: Pnasbal 10 μΐ iniciador de nasba 2: Pnasba2 5 μΐ faróis moleculares: Pmb2

Introduziram-se 10 μι da mistura principal em cada um de 20 poços e adicionaram-se 5 μΐ de amostra: oligonucleótido ou conjugado em dois grupos. No grupo 1, a enzima foi adicionada directamente (sem pré-aquecimento). No grupo 2, a mistura principal foi pré-aquecida a 65°C durante 4 minutos e arrefecida até 41°C antes da adição da enzima. Ambos os grupos de amostras foram amplificados e detectados a 41°C durante 2 horas.

Os resultados (não apresentados) confirmam que a amplificação NASBA do oligonucleótido artificial é mais bem efectuada sem pré-aquecimento da mistura principal.

Lisboa, 2009-06-30

Claims

ΕΡ 1 364 057/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método de detecção de um ligando numa amostra, em que o método compreende as etapas de: (a) contacto da amostra com reagentes capazes de formar um complexo de reagentes, em que o complexo de reagentes compreende um receptor capaz de se ligar especificamente ao referido ligando e uma molécula de ácido nucleico total ou parcialmente de cadeia simples; e (b) detecção de quaisquer complexos formados por ligação da porção de receptor do referido complexo de reagentes ao ligando presente na amostra através da detecção específica da presença da molécula de ácido nucleico, mediante a amplificação de uma região do ácido nucleico utilizando uma técnica de amplificação isotérmica e a detecção simultânea em tempo real dos produtos da reacção de amplificação.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa (b) compreende a amplificação de uma região do ácido nucleico utilizando uma reacção de amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (NASBA).
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a etapa (a) compreende o contacto da amostra com receptores capazes de se ligar ao referido ligando, em que os referidos receptores estão ligados a moléculas de ácido nucleico.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a etapa (a) compreende as etapas sequenciais ou simultâneas de: (i) contacto da amostra com receptores capazes de se ligar ao referido ligando, em que os referidos receptores estão conjugados com um primeiro componente de um par de ligação biológica; e (ii) contacto da amostra com moléculas de ácido nucleico conjugadas com um segundo componente de um par de ligação biológica. ΕΡ 1 364 057/ΡΤ 2/3
5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a etapa (a) compreende as etapas sequenciais ou simultâneas de: (i) contacto da amostra com receptores capazes de se ligar ao referido ligando; e (ii) contacto da amostra com receptores secundários capazes de se ligar aos receptores da parte (i), em que os referidos receptores secundários estão ligados a moléculas de ácido nucleico.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a etapa (a) compreende as etapas sequenciais ou simultâneas de: (i) contacto da amostra com receptores capazes de se ligar ao referido ligando; (ii) contacto da amostra com receptores secundários capazes de se ligar aos receptores da parte (i), em que os referidos receptores secundários estão conjugados com um primeiro membro de um par de ligação biológica; e (iii) contacto da amostra com moléculas de ácido nucleico de cadeia simples conjugadas com um segundo membro de um par de ligação biológica.
7. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a etapa (a) compreende as etapas sequenciais ou simultâneas de: (i) contacto da amostra com receptores capazes de se ligar ao referido ligando; (ii) contacto da amostra com receptores secundários capazes de se ligar aos receptores da parte (i), em que os referidos receptores secundários estão conjugados com um primeiro membro de um par de ligação biológica; e (iii) contacto da amostra com moléculas de ácido nucleico conjugadas com um primeiro membro de um par de ligação biológica numa extremidade e um segundo membro de um par de ligação biológica na outra extremidade da cadeia de ácido nucleico; e (iv) contacto da amostra com moléculas de ácido nucleico conjugadas apenas com um segundo membro do par de ligação biológica. ΕΡ 1 364 057/ΡΤ 3/3
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 5, 6 ou 7, em que o primeiro e o segundo componentes do par de ligação biológica são a estreptavidina ou a avidina e a biotina, ou vice versa.
9. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o referido receptor secundário está ligado às referidas moléculas de ácido nucleico por meio de uma ligação química directa.
10. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a etapa (a) compreende a adição de um complexo de reagentes que é um conjugado compreendendo receptores capazes de se ligar ao ligando, moléculas de ácido nucleico e uma macromolécula transportadora.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a macromolécula transportadora é um dextrano.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que os receptores capazes de se ligar ao referido ligando são anticorpos ou fragmentos de anticorpos.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o ácido nucleico é parcial ou totalmente de cadeia simples.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o ácido nucleico é um ADN ou ARN de cadeia simples. Lisboa, 2009-06-30