DE60215206T2

DE60215206T2 - Enzymatisches verfahren zur enantiomeren trennung von aminosäuren

Info

Publication number: DE60215206T2
Application number: DE60215206T
Authority: DE
Inventors: Christophe Salagnad; Claude Gobert; Marie-Odile Dury
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2022-08-31
Also published as: KR20040044542A; HUP0401340A2; NZ530855A; ES2272779T3; DK1427840T3; AR036410A1; CN1551922A; MY127965A; CA2459246A1; CY1105864T1; ATE341641T1; PL367737A1; TWI252869B; BR0212272A; JP2005501561A; PT1427840E; FR2829152B1; EA200400395A1; WO2003020943A2; EP1427840A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues enzymatisches Verfahren, mit dem Aminosäuren in Form einer razemischen Mischung in Enantiomere aufgeteilt werden können.
Aminosäuren werden häufig in vielen Industriezweigen verwendet, zum Beispiel als biologisch aktive Verbindungen oder als Synthesezwischenprodukte für die Herstellung von Verbindungen für insbesondere pharmazeutische, chemische oder landwirtschaftliche Zwecke. Es hat sich schnell herausgestellt, daß es häufig erforderlich ist, über das eine oder andere optisch aktive Enantiomer dieser Aminosäuren zu verfügen. So würden zahlreiche Wege zur Trennung von pro-chiralen Aminosäureenantiomeren entwickelt. Insbesondere hat sich herausgestellt, daß enzymatische Verfahren, mit denen sie in Enantiomere getrennt werden können, eine interessante Alternative zu den Ansätzen der asymmetrischen Synthese darstellen.
So wurde von Soloshonok et al. (Tetrahedron: Assymetry, Bd. 6(7), 1995, S. 1601-1610) ein enzymatisches Verfahren für die Enantiomerentrennung von β-Aminosäuren entwickelt, bei dem man nach dem folgenden Reaktionsschema vorgeht:
Analog dazu wurde von Topgi et al. (Bioorg. & Med. Chem. 1999, Bd. 7, S. 2221-2229) ein Verfahren zur Trennung von Ethyl-3-amino-4-pentinoat in das (R)- und das (S)-Enantiomer in enantiomerenreiner Form entwickelt, bei dem man nach einem der folgenden Reaktionsschemata vorgeht:
Hier erhält man das als Ausgangsmaterial verwendete Phenylacetamid durch Acylierung des entsprechenden Amins durch Einwirkung der Phenylessigsäure. Alternativ dazu geht man folgendermaßen vor:
Die Patentanmeldung WO 98/50575 beschreibt in allgemeinerer Form ein Verfahren zur Herstellung einer chiralen β-Aminosäure, bei dem man eine razemische Mischung dieser Aminosäure mit einem Acyldonator und dem Enzym Penicillin-G-acylase (bzw. -amidohydrolase) unter Bedingungen in Kontakt bringt, die sich für die stereoselektive Acylierung von einem der Enantiomere der razemischen β-Aminosäuremischung zu seinem entsprechenden N-Acylderivat eignen, wobei das andere Enantiomer der β-Aminosäure in Enantiomeren angereicherter Form erhalten wird, und zwar nach dem folgenden Reaktionsschema:
Der entsprechende "Acyldonator" weist die folgende allgemeine Formel auf:
in der R₃ aus der Reihe Phenyl, Phenoxy, Amino, verschiedene Phenyl- und Pyridylderivate stammt, und R₄ aus der Reihe der Hydroxy-, Alkoxy-, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Halogenalkyl-, Aryl-, Arylalkylsubstituenten, der Zucker oder der Steroide stammt.
Die Patentanmeldung WO 98/50575 beschreibt auch eine andere Alternative zur Herstellung einer chiralen β-Aminosäure, bei der man ein Amid in razemischer Form mit dem Enzym Penicillin-G-acylase unter Bedingungen in Kontakt bringt, die sich für die selektive Desacylierung von einem der Enantiomere des Amids in razemischer Form zu seiner entsprechenden β-Aminosäure eignen, wobei das andere Enantiomer des Amids in enantiomerenangereicherter Form erhalten wird, und zwar nach dem folgenden Reaktionschema:
Die oben genannten Verfahren weisen jedoch den wesentlichen Nachteil auf, daß vor dem eigentlichen enzymatischen Schritt bzw. gleichzeitig ein Amid-Zwischenprodukt auftritt, dessen Formel folgendermaßen beschrieben werden könnte:
Solch ein Amid ist aufgrund des Vorliegens des aromatischen Rings im Wäßrigen unlöslich, was Nachteile aufweist. So ist zum Beispiel bekannt, daß gewisse Enzyme im Wäßrigen löslich sind und häufig gegenüber vorhandenen organischen Lösungsmitteln empfindlich sind. Für eine optimale Ausbeute der enzymatischen Reaktion ist es wichtig, daß die Löslichkeit des Substrats für das Enzym gut ist, so daß diese in innigen Kontakt treten können.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in erster Linie darin, diesen Nachteil abzuschaffen. Die vorliegende Erfindung betrifft also in einem ersten Aspekt ein neues Verfahren zur Trennung von Enantiomeren einer Aminosäure oder eines Aminosäureesters, das darin besteht, daß man eine razemische Mischung dieser Aminosäure mit Glutarsäureanhydrid und anschließend mit Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase so behandelt, daß man das eine Enantiomer dieser Aminosäure gewinnt, während das andere Enantiomer in Form eines Derivats des entsprechenden Glutarylamids zurückbleibt.
Dieses Verfahren ist insbesondere vorteilhaft als es die Verwendung von Glutarsäureanhydrid ermöglicht, als Zwischenprodukt mit einem Glutarylamidderivat der als Ausgangsmaterial verwendeten Aminosäure vorzugehen, wobei die Glutarylfunktion dem Molekül eine Löslichkeit im Wäßrigen vermittelt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher unter milden Reaktionsbedingungen im Wäßrigen durchgeführt werden, also insbesondere ohne Verwendung eines organischen Hilfslösungsmittels.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist außerdem den Vorteil auf, daß es allgemein auf alle Aminosäureformen (α-, β-, γ-Form usw.) angewandt, werden kann. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung versteht man unter dem allgemeinen Begriff "Aminosäure" nicht nur die Aminosäuren als solche (nämlich diejenigen Verbindungen, die eine Aminofunktion und eine -COOH – Säurefunktion aufweisen) als auch die entsprechenden Aminosäureester (nämlich diejenigen Verbindungen, bei denen die Säurefunktion durch eine COOR – Esterfunktion ersetzt ist). Genauer gesagt wendet man das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise auf die Aminosäuren der allgemeinen Formel (I):
an, in der

– n eine ganze Zahl aus der Reihe 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet,
– R ein Wasserstoffatom oder einen Alkyl-, Alken-, Alkin-, Cycloalkyl-, Arylrest, einen kondensierten polycyclischen Kohlenwasserstoff oder einen Heterocyclus bedeutet, wobei alle diese Reste gegebenenfalls substituiert sind,
– und R' einen Alkyl-, Alken-, Alkin-, Cycloalkyl-, Arylrest, einen kondensierten polycyclischen Kohlenwasserstoff, einen Heterocyclus oder einen durch eine Alkyl-, Aryl-, Cycloalkylgruppe oder einen Heterocyclus substituierten Oxy-, Thio-, Sulfoxid- oder Sulfonylrest bedeutet, wobei alle diese Reste gegebenenfalls weiter substituiert sind.

Wenn die Aminosäuren die allgemeine Formel (I) aufweisen, kann das erfindungsgemäße Verfahren also entsprechend dem Reaktionsschema von 1 dargestellt werden. Dieses Schema stellt einen erste Schritt, in dem mit Glutarsäureanhydrid behandelt wird, sowie einen zweiten Schritt, in dem mit dem Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase behandelt wird, dar. Die Konfiguration von jedem der erhaltenen Produkte, nämlich entweder Aminosäure oder Glutarylamidderivat, hängt von der Art des Rests R' ab.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung enthalten die Alkyl-, Alken- und Alkinreste im allgemeinen zwischen 1 und 30 Kohlenstoffatome in einer geraden oder verzweigten Kette, was jedoch nicht als einschränkend zu verstehen ist. Dies trifft auch dann zu, wenn diese Reste Substituenten von anderen Resten sind. Vorzugsweise enthalten diese Reste zwischen 1 und 20 Kohlenstoffatome in einer geraden oder verzweigten Kette, stärker bevorzugt zwischen 1 und 10 Kohlenstoffatome in einer geraden oder verzweigten Kette. Die Alkylreste können zum Beispiel aus der folgenden Reihe stammen: Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, n-Pentyl, n-Hexyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Tridecyl, n-Pentadecyl, n-Hexadecyl, n-Heptadecyl, n-Octadecyl, Isopropyl, Isobutyl, Isopentyl, Isohexyl, 3-Methylpentyl, Neopentyl, Neohexyl, 2,3,5-Trimethylhexyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, tert.-Pentyl. Bevorzugte Alkylreste sind zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, n-Pentyl, Isopentyl, n-Hexyl und Isohexyl. Die Alkenreste können zum Beispiel aus der folgenden Reihe stammen: Vinyl, 1-Propenyl, Allyl, Butenyl, 2-Methyl-1-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl oder 3-Methyl-2-butenyl. Die Alkinreste können zum Beispiel aus der folgenden Reihe stammen: Ethinyl, 1-Propinyl oder Propargyl.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung enthalten die Cycloalkylreste im allgemeinen zwischen 3 und 12 Kohlenstoffatome. Vorzugsweise stammen sie aus der Reihe Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, Cyclononyl, Cyclodecyl, Cycloundecyl und Cyclododecyl. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Cycloalkyle polycyclisch sein. Vorzugsweise stammen die Reste aus der Reihe der Bicycloalkyle oder der Tricycloalkyle.
Erfindungsgemäß versteht man unter „Aryl"-Rest die einwertigen aromatischen Kohlenwasserstoffreste. Unter den Arylresten ist gegebenenfalls substituiertes Phenyl bevorzugt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung versteht man unter kondensiertem polycyclischem Kohlenwasserstoff Reste, die vorzugsweise aus der folgenden Reihe stammen: Pentalen, Inden, Naphthalen, Azulen, Heptalen, Biphenylen, as-Indacen, s-Indacen, Acenaphthylen, Fluoren, Phenalen, Phenanthren, Anthracen, Fluoranthen, Acephenanthrylen, Aceanthrylen, Triphenylen, Pyren, Chrysen, Naphthacen, Pleiaden, Picen, Perylen, Pentaphen, Pentacen, Tetraphenylen, Hexaphen, Hexacen, Rubicen, Coronen, Trinaphthylen, Heptaphen, Heptacen, Pyranthren oder Ovalen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "Heterocyclus" auf monocyclische oder polycyclische anellierte Verbindungen, die ein oder mehrere Heteroatome enthalten, wobei jeder Ring aus 3 bis 10 Ringgliedern gebildet wird. Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Heterocyclen zwischen 1 und 3 Heteroatome aus der Reihe Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff in einem Ring, der aus 3 bis 10 Ringgliedern gebildet wird. Die Heterocyclen der vorliegenden Erfindung stammen vorzugsweise aus der Reihe Thiophen, Benzo[b]thiophen, Naphtho[2,3-b]thio phen, Thianthren, Furan, 2H-Pyran, Isobenzofuran, 2H-Chromen, Xanthen, Phenoxathiin, 2H-Pyrrol, Pyrrol, Imidazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Pyridazin, Indolizin, Isoindol, 3H-Indol, Indol, 1H-Indazol, Purin, 4H-Chinolizin, Isochinolin, Chinolin, Phthalazin, 1,8-Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Pteridin, 4aH-Carbazol, Carbazol, β-Carbolin, Phenanthridin, Acridin, Perimidin, 1,7-Phenanthrolin, Phenazin, Phenarsazin, Isothiazol, Phenothiazin, Isoxazol, Furazan, Phenoxazin, Isochroman, Pyrrolidin, Δ2-Pyrrolin, Imidazolidin, Δ2-Imidazolin, Pyrazolidin, Δ3-Pyrazolin, Piperidin, Piperazin, Indolin, Isoindolin, Chinuclidin und Morpholin.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stammt bzw. stammen, wenn die verschiedenen oben definierten Reste substituiert sind, dieser bzw. diese Substituenten je nach der Art des Rests im allgemeinen aus der Reihe Halogenatome, Aryl-, Heterocyclus-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Thio-, Alkylthio-, Arylthio-, Alkylsulfoxid-, Arylsulfoxid-, Alkylsulfonyl-, Arylsulfonyl-, Cyano-, Nitro-, Sulfonamid-, Alkylsulfonamid- und Arylsulfonamidgruppen. Vorzugsweise sind die verschiedenen Reste, wie sie oben definiert wurden, einfach, zweifach oder dreifach substituiert. Gemäß einem bevorzugten Aspekt stammen die Halogenatome aus der Reihe Chlor, Fluor, Brom und Iod. Sind die Alkylreste durch Halogenatome substituiert, so handelt es sich vorzugsweise um Fluoratome. Vorzugsweise beträgt die Anzahl der Fluorsubstituenten 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7. So kann es sich zum Beispiel um eine Trifluormethylgruppe handeln.
Vorzugsweise stammen die erfindungsgemäßen Aminosäuren aus der Reihe der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in der n eine ganze Zahl aus der Reihe 0, 1, 2 oder 3 bedeutet, R ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl- oder Arylfunktion bedeutet und R' wie oben definiert ist.
Noch stärker bevorzugt stammen die erfindungsgemäßen Aminosäuren aus der Reihe der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in der n eine ganze Zahl 0, 1 oder 2 bedeutet, R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylfunktion bedeutet und R' aus der Reihe der gegebenenfalls substituierten Aryle oder Heterocyclen stammt. Im letztgenannten Fall sind die Aryl- und/oder Heterocyclusreste vorzugsweise einfach, zweifach oder dreifach substituiert.
Das Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase ist bereits in zahlreichen industriellen Verfahren als Katalysator verwendet worden, insbesondere für die Hydrolyse von β-Lactamen wie N-Glutaryl-7-aminoacetoxycephalosporinsäure. Es kann von zahlreichen Mikroorganismen erhalten werden, zum Beispiel Mikroorganismen der Gattung Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Stenotrophomonas oder Xanthomonas, und zwar mit Hilfe von Techniken, mit denen der Fachmann auf dem Gebiet der Enzyme gut vertraut ist. Das Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase kann auch im Fachhandel bezogen werden, zum Beispiel von Roche Diagnostic GmbH (Roche Molecular Biochemicals, Standhofer Straße 116, D-68305 Mannheim) oder von Recordati S.p.A. (Stabilimento di opera, Via Lambro 38, I-20090 Opera (MI)).
Das Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase kann in verschiedenen Formen verwendet werden, ohne daß dadurch seine Stereospezifität und Stereoselektivität modifiziert wird. So kann die Glutaryl-7-ACA-acylase zum Beispiel in löslicher oder immobilisierter Form verwendet werden. Im letzteren Fall wird das Enzym im allgemeinen mit Hilfe von Techniken, mit denen der Fachmann gut vertraut ist, immobilisiert. So kann das Enzym zum Beispiel in polymeren Gelen enthalten sein oder durch kovalente Bindung, Vernetzung, Adsorption oder Verkapselung an feste Träger gebunden sein. Geeignete Träger, die derzeit verwendet werden, sind zum Beispiel poröses Glas, poröse Keramiken, synthetische Polymere (zum Beispiel Polystyrol, die Polyvinylalkohole, Polyethylen, die Polyamide oder die Polyacrylamide), oder Polymere natürlichen Ursprungs (zum Beispiel Cellulose).
Mit dem Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase kann man für jedes Enantiomer einen hohen Enantiomerenüberschuß ("ee"), insbesondere 90% oder mehr, ja sogar 95% oder mehr, vorzugsweise 99% oder mehr, erhalten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung versteht man unter "Enantiomerenüberschuß" den Überschuß von einem der Enantiomeren im Vergleich zur razemischen Mischung, ausgedrückt in %. Genauer gesagt wird der Enantiomerenüberschuß folgendermaßen berechnet:
wobei [R] und [S] die jeweilige Konzentration an (R)- und (S)-Enantiomer bedeuten.
Im allgemeinen beträgt die verwendete Enzymmenge im Vergleich zur Gesamtmenge an als Ausgangsmaterial verwendeter Aminosäure (Substrat) zwischen 1 und 100 Einheiten (E) pro mmol Substrat, vorzugsweise zwischen 10 und 40 Einheiten pro mmol Substrat. 1 Enzymeinheit entspricht derjenigen Enzymmenge, die erforderlich ist, um 1 μmol N-Glutaryl-7-aminoacetoxycephalosporinsäure pro Minute unter dem fachbekannten pH- und Temperatur-Standardbedingungen zu hydrolysieren.
Erfindungsgemäß wird die Reaktion in einem gegebenenfalls gepufferten wäßrigen Medium durchgeführt. In diesem Fall kann der wäßrige Puffer in einer Konzentration von zwischen 10 mM und 200 mM aus der Reihe der bei zwischen pH 5 und 6,5 verwendbaren Acetatpuffer oder der bei pH 6,5 bis 8 verwendbaren Phosphatpuffer oder auch der bei pH 8 bis 9 verwendbaren Pyrophosphatpuffer stammen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird also in einem Medium durchgeführt, dessen pH-Wert zwischen 6 und 9 eingestellt und geregelt wird. Vorzugsweise wird der pH-Wert des Reaktionsmediums genau zwischen 7,5 und 8,5 eingestellt und geregelt, noch stärker bevorzugt zwischen 8 und 8,5. Die Regelung des pH-Werts kann mit Hilfe von pH-Staten erfolgen, und zwar dadurch, daß man mit einer Säure wie zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, und einer Base wie zum Beispiel Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid versetzt.
Die erfindungsgemäße Behandlung der Aminosäuren mit Glutarsäureanhydrid erfolgt bei einer Temperatur zwischen 20°C und 40°C, vorzugsweise zwischen 25°C und 35°C. Ein zweiter Schritt, bei dem das Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase verwendet wird, erfolgt außerdem bei einer Temperatur zwischen 10°C und 50°C, vorzugsweise zwischen 25°C und 35°C.
Schließlich schwankt die Reaktionsdauer allgemein zwischen 1 Stunde und 100 Stunden und hängt insbesondere von der betreffenden Aminosäure und der Enzymkonzentration ab. Im allgemeinen läßt man so lange reagieren, wie dies erforderlich ist, um zu dem gewünschten Enantiomer mit einem zufriedenstellenden Enantiomerenüberschuß zu gelangen. Die Menge der erhaltenen chiralen Aminosäure und der Wert des Enantiomerenüberstands werden mit traditionellen Techniken, mit denen der Fachmann vertraut ist, überprüft. Vorteilhafterweise erfolgt diese Überprüfung mittels HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie).
Erfindungsgemäß können das nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene (R)- und das (S)-Enantiomer leicht aufgrund der Tatsache getrennt werden, daß das eine Enantiomer in Form eines löslichen Amins in wäßrigem Medium vorliegt und das andere in Form des festen Amids. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft das oben beschriebene Verfahren, das als Folgeschritt die Trennung von (R)- und (S)-Enantiomer beinhaltet.
Die Trennung des (R)- und (S)-Enantiomers kann leicht mit Hilfe von traditionellen Techniken, mit denen der Fachmann vertraut ist, erfolgen. Man verwendet zum Beispiel die Filtration, Extraktion, Chromatographie oder Kristallisation.
Will man das eine Enantiomer in Form der Aminosäure und nicht in Form des Glutarylamidderivats isolieren, so wird das Enantiomer des Glutarylamidderivats, das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren isoliert wurde, anschließend so hydrolisiert, daß man die entsprechende Aminosäure in Form des Enantiomers erhält. Es ist festzustellen, daß dieses Verfahren insofern vorteilhaft ist, als die Hydrolyse die Stereochemie der verwendeten Verbindung nicht verändert und nicht zu einer Razemisierung des chiralen Glutarylamidderivats führt. Entsprechen die Aminosäuren der allgemeinen Formel (I), so kann dieser zusätzliche Schritt gemäß dem Reaktionsschema in 2 dargestellt werden.
Die Hydrolyse erfolgt mit traditionellen Techniken, mit denen der Fachmann vertraut ist. Insbesondere kann es sich um eine saure oder basische Hydrolyse handeln. In letzterem Fall geht man zum Beispiel in Gegenwart einer Base wie Natriumhydroxid bei einer Temperatur zwischen 50°C und 90°C und unter Atmosphärendruck vor. Es können jedoch auch alle anderen Arbeitsbedingungen, die zweckmäßig sind und mit denen der Fachmann vertraut ist, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist insofern nützlich, als man mit ihr Aminosäuren in razemischer Form trennen kann, wodurch man über das eine oder andere Enantiomer dieser Aminosäure verfügen kann, wobei diese Enantiomere insbesondere Synthesezwischenprodukte darstellen.
Beispielsweise kann man mit der vorliegenden Erfindung über die (S)-3-Amino-3-phenylpropansäure verfügen, die ein Zwischenprodukt bei der Synthese der Verbindung der folgenden allgemeinen Formel ist:
bei der es sich um einen VLA4-Rezeptor-Antagonisten, der insbesondere bei asthmatischen Erkrankungen eine Rolle spielt, handelt.
Außer dem zuvor Gesagten weist die vorliegende Erfindung auch Eigenschaften und Vorteile auf, die aus den folgenden Beispielen hervorgehen werden, wobei diese Beispiele, nur der Veranschaulichung der Erfindung, jedoch nicht der Einschränkung des Erfindungsumfangs, dienen.
ABBILDUNGEN
1: Schematische Darstellung des ersten Schritts der Behandlung einer erfindungsgemäßen Aminosäure der allgemeinen Formel (I) mit Glutarsäureanhydrid und des zweiten Schritts der Behandlung mit dem Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase. Die Konfiguration jedes der erhaltenen Produkte, nämlich der Aminosäure bzw. des Glutarylamidderivats, hängt von der Art des Rests R' ab.
2: Schematische Darstellung des Schritts der hydrolytischen Umwandlung des chiralen Glutarylamidderviats in seine entsprechende chirale Aminosäure.
BEISPIELE
Beispiel 1: Trennung der 3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure in Form einer razemischen Mischung
a) Acylierung der razemischen 3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure
40,6 g razemische 3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure werden in 200 ml destilliertem Wasser und 55 ml Triethylamin gelöst. Man versetzt mit 29,4 g Glutarsäureanhydrid in kleinen Portionen und rührt den Ansatz 1 Stunde lang. Anschließend wird der Ansatz mit 8,2 ml 95%iger (w/v) Schwefelsäure sauer gestellt. Der so erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, 3 mal mit 15 ml destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum bei 55°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Auf diese Weise erhält man 52,84 g razemische 3-(Glutarylamid)-3-(4'-nitrophenyl)propansäure.
Die Zusammensetzung des erhaltenen Produkts wird mittels HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) bestimmt.
b) Enzymatische Desacylierung mit kristallisierter Glutaryl-7-ACA-acylase in Suspension (100 ml Kolben)
20 g der im obigen Schritt erhaltenen Säure werden in 75 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-wert der Suspension wird durch Versetzen mit 11,2 ml 30%iger Natronlauge (w/v) auf 8,2 eingestellt. Diese Lösung wird mit 826 mg (626 Einheiten) einer Suspension von kristallisierter Glutaryl-7-RCA-acylase versetzt. Der Ansatz wird 51 Stunden lang bei 35°C gerührt, wobei der pH-Wert zwischen 7,9 und 8,1 eingestellt und geregelt wird. Am Ende der Reaktion wird der Ansatz auf 20°C abgekühlt und der pH-Wert wird durch Versetzen mit 5N Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Nun wird mit 20 ml Ethanol versetzt. Der so erhaltene Niederschlag der (R)-3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure wird abfiltriert, 3 mal mit 30 ml Ethanol gewaschen und im Vakuum bei 45°C bis zu Gewichtskonstanz getrocknet. Auf diese Weise erhält man 5,65g (R)-3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure mit einem Enantiomerenüberschuß von über 99%.
Die Mutterlauge wird mit 17,5 ml 5N Salzsäure angesäuert. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert und zweimal mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der erhaltene Filterkuchen wird im Vakuum bei 45°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Auf diese Weise erhält man 8,25 g (S)-3-(Glutarylamid)-3-(4'-nitrophenyl)propansäure und (R)-3-(Glutarylamid)-3-(4'-nitrophenyl)propansäure im Verhältnis 91:9.
Die Zusammensetzung der erhaltenen Produkte wurde mittels HPLC bestimmt.
c) Enzymatische Desacylierung mittels immobilisierter Glutaryl-7-ACA-acylase von Roche Diagnostic GmbH (100-ml-Kolben)
20,5 g der im Schritt a) erhaltenen Aminosäure werden in 75 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Suspension wird durch Versetzen mit 11,9 ml 30%iger Natronlauge (w/v) auf 8,2 eingestellt. Diese Lösung wird mit 6,2 g (632,4 Einheiten) feuchter immobilisierter Glutaryl-7-ACA-acylase (Roche Diagnostic GmbH) versetzt. Der Ansatz wird 18 Stunden lang bei 35°C gerührt, und zwar bei einem pH-Wert, der zwischen 7,9 und 8,1 eingestellt und geregelt wurde. Am Ende der Reaktion wird der pH-Wert des Ansatzes durch Versetzen mit 30%iger Natronlauge (w/v) auf 9,5 eingestellt, und das Ansatzvolumen wird auf 200 ml eingestellt, um die erzeugte (R)-3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure zu lösen. Das immobilisierte Enzym wird abfiltriert, und der pH-Wert der Mutterlauge wird durch Versetzen mit 5N Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Nun wird mit 50 ml Ethanol in Reaktionsmischung versetzt. Die ausgefallene (R)-3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure wird abfiltriert, mit 10 ml Ethanol gewaschen und im Vakuum bei 45°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Auf diese Weise erhält man 5,375 g (R)-3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure mit einem Enantiomerenüberschuß von 98%.
Die Mutterlauge wird mit 20 ml 5N Salzsäure sauer gestellt. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert und zweimal mit 15 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der Filterkuchen wird im Vakuum auf 45°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Auf diese Weise erhält man 6 g (S)-3-(Glutarylamid)-3-(4'-nitrophenyl)propansäure im Verhältnis 94:6.
Die Zusammensetzung der erhaltenen Produkte wurde mittels HPLC bestimmt.
d) Enzymatische Desacylierung mittels kristallisierter Glutaryl-7-ACA-acylase in Suspension (500 ml Kolben)
100 g razemische 3-(Glutarylamid)-3-(4'-nitrophenyl)propansäure, die wie in Schritt a) erhalten wurde, wurden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Suspension wird durch Versetzen mit 60 ml 30%iger Natronlauge (w/v) auf 8,2 eingestellt. Diese Lösung wird mit 6,4 g (4653 Einheiten) einer Suspension von kristallisierter Glutaryl-7-ACA-acylase versetzt. Der Ansatz wird 30 Stunden lang bei 35°C gerührt, und zwar bei einem pH-Wert, der auf zwischen 7,9 und 8,1 eingestellt und geregelt wurde. Am Ende der Reaktion wird der Ansatz auf 20°C abgekühlt und der pH-Wert wird durch Versetzen mit 25 ml 30%iger Natronlauge (w/v) auf 13 eingestellt, um die gebildete (R)-3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure zu lösen. Es wird vom Unlöslichen abfiltriert, und der pH-Wert der Mutterlauge wird durch Versetzen mit 27 ml 36%iger Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Nun wird mit 100 ml Ethanol versetzt. Der Niederschlag der erhaltenen (R)-3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure wird abfiltriert, zweimal mit 100 ml Ethanol gewaschen und im Vakuum bei 45°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Auf diese Weise erhält man 28,87 g (R)-3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure mit einem Enantiomerenüberschuß von 97%.
Die Zusammensetzung der erhaltenen Produkte wurde mittels HPLC bestimmt.
Beispiel 2: Trennung der 3-Amino-3-phenylpropansäure in Form einer razemischen Mischung
a) Acylierung der razemischen 3-Amino-3-phenylpropansäure
488 g razemischer 3-Amino-3-phenylpropansäure werden in 2 Litern destilliertem Wasser, das 236 g Natronlaufe in Form von Plättchen enthält, gelöst. Man versetzt im Lauf von einer Stunde unter Rühren und bei 20°C mit 437,5 g Glutarsäureanhydrid in kleinen Portionen. Nach einer Stunde wird der Ansatz mit 236 ml 95%iger Schwefelsäure (w/v) sauer gestellt und auf 10°C abgekühlt. Der so gebildete Niederschlag wird abfiltriert und anschließend 3 mal mit 600 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der so erhaltene feuchte Filterkuchen mit einem Gewicht von 1610 g enthält razemische 602 g 3-Glutarylamid-3-phenylpropansäure. Die Zusammensetzung der erhaltenen Produkte wurde mittels HPLC bestimmt.
b) Enzymatische Desacylierung mit kristallisierter Glutaryl-7-ACA-acylase in Suspension (5-Liter-Kolben)
1575 g des zuvor erhaltenen feuchten Filterkuchens, der 589 g razemische 3-Glutarylamid-3-phenylpropansäure enthält, werden in 1610 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Suspension wird durch Versetzen mit 440 ml 30%iger Natronlauge (w/v) auf 8,0 eingestellt. Diese Lösung wird mit 52,6 g (32 000 Einheiten) einer Suspension von kristallisierter Glutaryl-7-ACA-acylase versetzt. Der Ansatz wird 41 Stunden lang bei 35°C gerührt, und zwar bei einem pH-Wert, der zwischen 7,9 und 8,1 eingestellt und reguliert wird. Am Ende der Reaktion wird der Ansatz auf 20°C abgekühlt und der pH-Wert wird durch Versetzen mit 25 ml 30%igem Natriumhydroxid (w/v) auf 13 eingestellt, um die entstandene (R)-3-Amino-3-(4'-nitrophenyl)propansäure zu lösen. Es wird vom Unlöslichen abfiltriert, und der pH-Wert der Mutterlauge wird durch Versetzen mit 27 ml 36%iger Salzsäure auf 7,0 eingestellt.
Der so erhaltene Niederschlag von (R)-3-Amino-3-phenylpropansäure wird abfiltriert, mit 150 ml destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum bei 45°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Auf diese Weise erhält man 96,9 g (R)-3-Amino-3-phenylpropansäure mit einem Enantiomerenüberschuß von 98%.
Die Mutterlauge wird mit 180 ml 95%iger Schwefelsäure (w/v) sauer gestellt. Der so gebildete Niederschlag wird abfiltriert und zweimal mit 400 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen. Der Filterkuchen wird im Vakuum bei 45°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Auf diese Weise erhält man 314,6 g (S)-3-(Glutarylamid)-3-phenylpropansäure und (R)-3-(Glutarylamid)-3-phenylpropansäure im Verhältnis 90:10.
Die Zusammensetzung der erhaltenen Produkte wurde mittels HPLC bestimmt.
c) Desacylierung der (5)-3-Glutarylamid-3-phenylpropansäure mittels basischer Hydrolyse
557,2 g einer Mischung aus (S)-3-Glutarylamid-3-phenylpropansäure und (R)-3-Glutarylamid-3-phenylpropansäure im Verhältnis 90:10 aus Schritt b) oben werden in 3,91 Litern destilliertem Wasser und 1,65 Litern 30%iger Natronlauge (w/v) gelöst. Der Ansatz wird 4 Tage bei 70°C gerührt.
Anschließend wird der Ansatz auf 15°C abgekühlt. Das erhaltene Produkt wird dadurch ausgefällt, daß man den pH-Wert durch Versetzen mit 3,21 Litern 37%iger Salzsäure (w/v) auf 6,9 einstellt, und dann abfiltriert und im Vakuum bei 45°C bis zur Gewichtskonstanz trocknet. Auf diese Weise erhält man 202,4 g (S)-3-Amino-3-phenylpropansäure und (R)-3-Amino-3-phenylpropansäure mit einem Enantiomerenüberschuß von über 98%.
Die Zusammensetzung der erhaltenen Verbindungen wurde mittels HPLC bestimmt.

Claims

Verfahren zur Trennung von Enantiomeren einer Aminosäure oder eines Aminosäureesters, das darin besteht, daß man eine razemische Mischung dieser Aminosäure mit Glutarsäureanhydrid und anschließend mit Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase so behandelt, daß man das eine Enantiomer dieser Aminosäure gewinnt, während das andere Enantiomer in Form eines Derivats des entsprechenden Glutarylamids zurückbleibt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure oder der Aminosäureester der allgemeinen Formel
entspricht, in der – n eine ganze Zahl aus der Reihe 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet, – R ein Wasserstoffatom oder einen Alkyl-, Alken-, Alkin-, Cycloalkyl-, Arylrest, einen kondensierten polycyclischen Kohlenwasserstoff oder einen Heterocyclus bedeutet, wobei alle diese Reste gegebenenfalls substituiert sind, – und R' einen Alkyl-, Alken-, Alkin-, Cycloalkyl-, Arylrest, einen kondensierten polycyclischen Kohlenwasserstoff, einen Heterocyclus oder einen durch eine Alkyl-, Aryl-, Cycloalkylgruppe oder einen Heterocyclus substituierten Oxy-, Thio-, Sulfoxid- oder Sulfonylrest bedeutet, wobei alle diese Reste gegebenenfalls weiter substituiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure oder der Aminosäureester der allgemeinen Formel (I)
entspricht, in der n eine ganze Zahl aus der Reihe 0, 1, 2 oder 3 bedeutet, R ein Wasserstoffatom oder einen Alkyl- oder Arylrest bedeutet und R' wie in Anspruch 2 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure oder der Aminosäureester der allgemeinen Formel (I)
entspricht, in der n eine ganze Zahl aus der Reihe 0, 1 oder 2 bedeutet, R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylfunktion bedeutet und R' aus der Reihe der gegebenenfalls substituierten Aryle oder Heterocyclen stammt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase in löslicher oder immobilisierter Form verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Enzymmenge im Vergleich zu der Gesamtausgangsmenge der Aminosäure oder des Aminosäureesters (Substrat) zwischen 1 und 100 Einheiten pro mmol Substrat beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem gepufferten wäßrigen Medium durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der wäßrige Puffer eine Konzentration zwischen 10 mM und 200 mM aufweist und aus der Reihe der Acetatpuffer, die zwischen pH 5 und pH 6,5 verwendet werden können, oder der Phosphatpuffer, die zwischen pH 6,5 und pH 8 verwendet werden können, oder der Pyrophosphatpuffer, die zwischen pH 8 und pH 9 verwendet werden können, stammt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert kontrolliert und zwischen 6 und 9 eingestellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung der Aminosäure oder des Aminosäureesters mit dem Glutarsäureanhydrid bei einer Temperatur zwischen 20°C und 40°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit dem Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase bei einer Temperatur zwischen 10°C und 50°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszeit zwischen 1 Stunde und 100 Stunden schwankt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man weiterhin die (R)- und die (S)-Enantiomere trennt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung der (R)- und der (S)- Enantiomere mittels Filtration, Extraktion, Chromatographie oder Kristallisation durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das abgetrennte, von Glutarylamid abgeleitete Enantiomer weiterhin so hydrolysiert wird, daß man die entsprechende Aminosäure in Form ihres Enantiomers erhält.