EA009322B1

EA009322B1 - Ферментативный способ расщепления энантиомеров аминокислот

Info

Publication number: EA009322B1
Application number: EA200400395A
Authority: EA
Inventors: Кристоф Саланья; Клод Гобер; Мари-Одиль Дюри
Original assignee: Авентис Фарма С.А.
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2007-12-28
Also published as: WO2003020943A3; PT1427840E; ES2272779T3; KR20040044542A; FR2829152B1; WO2003020943A2; EP1427840B1; HUP0401340A3; EA200400395A1; EP1427840A2; HUP0401340A2; DE60215206D1; CA2459246A1; JP4222939B2; PL367737A1; ATE341641T1; JP2005501561A; AR036410A1; YU16904A; MY127965A

Abstract

Настоящее изобретение относится к новому ферментативному способу, позволяющему осуществить энантиомерное расщепление аминокислот. В частности, указанный метод разделения энантиомеров аминокислот заключается в обработке рацемической смеси вышеуказанной аминокислоты глутаровым ангидридом и затем ферментом глутарил-7-АСА-ацилазой так, что выделяют один из энантиомеров вышеуказанной аминокислоты, в то время как другой энантиомер остается в форме производного соответствующего глутариламида.

Description

Настоящее изобретение относится к новому ферментативному способу, позволяющему осуществить расщепление энантиомеров аминокислот, которые присутствуют в виде рацемической смеси.

Аминокислоты широко используются во всех областях промышленности либо в качестве биологически активных соединений, либо в качестве промежуточных продуктов синтеза некоторых соединений, предназначенных, в частности, для применения в фармацевтической, химической или сельскохозяйственной промышленности. Однако вскоре оказалось, что часто возникает необходимость выделить тот или другой оптически активный энантиомер указанных аминокислот. Поэтому были разработаны различные способы выделения энантиомеров прохиральных аминокислот. В частности, перспективной альтернативой методам асимметрического синтеза оказались ферментативные способы, которые использу ются для расщепления энантиомеров.

Так, 8о1озЬопок е! а1. (ТейаЬебгоп: АззутеВу, Уо1. 6(7), 1995, рр. 1601-1610) использовали ферментативный способ для расщепления энантиомеров β-аминокислот, протекающий по следующей схеме:

По аналогии с этим способом Торщ е! а1. (ΒΐοοΓβ. & Меб. СЬет. 1999, Уо1. 7, рр. 2221-2229) разработали способ расщепления энантиомеров (В) и (8) этилового эфира 3-амино-4-пентановой кислоты в

при этом исходный фенилацетамид получен ацилированием соответствующего амина с помощью фенилуксусной кислоты, либо

О

амин в рацемической форме '3

Пенициллин-О-амидогидролаза фенилуксусная кислота

- 1 009322

В заявке на патент ЖО 98/50575 описывается в более общем виде способ получения хиральной βаминокислоты, который включает введение в контакт рацемической смеси вышеуказанной аминокислоты с донором ацильного радикала и с ферментом пенициллин-О-ацилазой (или амидогидролазой) в условиях, пригодных для стереоселективного ацилирования одного из энантиомеров рацемической смеси βаминокислоты до получения соответствующего Ν-ацилированного производного, при этом энантиомер, противоположный β-аминокислоте, получают в форме смеси, обогащенной энантиомером; способ протекает по следующей схеме:

при этом используемый донор ацильного радикала имеет общую формулу

где К₃ выбирают из фенила, феноксигруппы, аминогруппы, различных производных фенила и пиридила, а Кд выбирают из гидроксигруппы, алкоксигруппы, алкильных, алкенильных, алкинильных, галогеналкильных, анильных, анилалкильных заместителей, а также из остатков сахаров или стероидов.

В заявке на патент ЖО 98/50575 описывается также и другой, альтернативный, способ получения хиральной β-аминокислоты, который включает введение в контакт амида в рацемической форме с ферментом пенициллин-О-ацилазой в условиях, пригодных для селективного деацилирования одного из энантиомеров амида, находящегося в рацемической форме, до получения соответствующей βаминокислоты, при этом энантиомер, противоположный амиду, получают в форме смеси, обогащенной энантиомером; способ протекает по следующей схеме:

Рассматриваемые выше способы имеют, тем не менее, серьезный недостаток, заключающийся в том, что перед этапом ферментации или одновременно с этим этапом протекает реакция с образованием промежуточного амида, формула которого схематически может быть представлена следующим образом:

ароматическое ядро, предпочтительно фенильное

Этот амид нерастворим в водной среде из-за наличия ароматического ядра, что создает определенные недостатки. Например, известно, что некоторые ферменты растворимы в водной среде и часто чувствительны к присутствию органических растворителей. При этом, чтобы оптимизировать выход ферментативной реакции, важно, чтобы была хорошая растворимость субстрата по сравнению с ферментом для того, чтобы они могли тесно контактировать друг с другом.

Именно указанный недостаток и предлагается главным образом устранить в настоящем изобретении. Настоящее изобретение относится, в соответствии с первым объектом изобретения, к способу разделения энантиомеров аминокислоты, который заключается в обработке рацемической смеси вышеуказанной аминокислоты глутаровым ангидридом и затем ферментом глутарил-7-АСА-ацилазой, выделяют один из энантиомеров вышеуказанной аминокислоты, а другой энантиомер остается в форме соответст

- 2 009322 вующего производного глутариламида.

Указанный способ имеет то особое преимущество, что при использовании глутарового ангидрида образуется промежуточное производное глутарового амида, соответствующее исходной аминокислоте, в котором глутарильная функциональная группа придает молекуле растворимость в водной среде. Из этого следует, что способ согласно настоящему изобретению может быть использован в мягких реакционных условиях и в водной среде, то есть, в частности, без использования органического сорастворителя.

Способ в соответствии с настоящим изобретением обладает также тем преимуществом, что он может применяться ко всем формам аминокислот (α, β, γ ...). В настоящем изобретении под общим термином аминокислота понимают как собственно аминокислоты (а именно, соединения, имеющие аминогруппу и кислотную группу -СООН), так и соответствующие им сложные эфиры (а именно, соединения, в которых кислотная группа заменена на сложноэфирную группу СООК). Предпочтительно способ согласно изобретению применяют, в частности, к аминокислотам общей формулы (I)

где η является целым числом, которое выбирают из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6,

К означает атом водорода или алкильный, алкеновый, алкиновый, циклоалкильный, арильный радикал, полициклический углеводородный радикал с приконденсированными циклами или гетероцикл, при этом все указанные радикалы возможно являются замещенными,

К' означает алкильный, алкеновый, алкиновый, циклоалкильный, арильный радикал, полициклический углеводородный радикал с приконденсированными циклами, гетероцикл или гидроксигруппу, тиогруппу, сульфоксидный или сульфонильный радикал, замещенный алкильной, арильной, циклоалкильной или гетероциклической группой, при этом все указанные радикалы возможно являются замещенными.

Таким образом, если аминокислоты соответствуют общей формуле (I), то способ согласно настоящему изобретению может быть представлен схемой реакции, приведенной на фиг. 1. На указанной схеме показан первый этап - обработка глутаровым ангидридом и второй этап - обработка ферментом глутарил7-АСА-ацилазой. Конфигурация каждого из полученных продуктов, а именно, аминокислоты, с одной стороны, и производного глутарового амида, с другой стороны, зависит от типа радикала К'.

В рамках настоящего изобретения алкильные, алкеновые и алкиновые радикалы имеют прямую или разветвленную цепочку и обычно содержат от 1 до 30 атомов углерода, однако количество атомов не является ограничивающим. Это же замечание относится также и к тем случаям, когда указанные радикалы являются заместителями других радикалов. Предпочтительно указанные радикалы имеют от 1 до 20 атомов углерода в прямой или разветвленной цепи, еще более предпочтительно от 1 до 10 атомов углерода в прямой или разветвленной цепи. Алкильные радикалы могут быть выбраны, например, из метила, этила, н-пропила, н-бутила, н-пентила, н-гексила, н-гептила, н-октила, н-нонила, н-децила, н-ундецила, н-додецила, н-тридецила, н-пентадецила, н-гексадецила, н-гептадецила, н-октадецила, изопропила, изобутила, изопентила, изогексила, 3-метилпентила, неопентила, неогексила, 2,3,5-триметилгексила, вторбутила, трет-бутила, трет-пентила. Предпочтительными алкильными радикалами являются, например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, нгексил и изогексил. Алкеновые радикалы могут быть выбраны, например, из винила, 1-пропенила, аллила, бутенила, 2-метил-1-пропенила, 2-метил-2-пропенила или 3-метил-2-бутенила. Алкиновые радикалы могут быть выбраны, например, из этинила, 1-пропинила или пропаргила.

В рамках настоящего изобретения циклоалкильные радикалы обычно содержат от 3 до 12 атомов углерода. Предпочтительно их выбирают из циклопропила, циклобутила, циклопентила, циклогексила, циклогептила, циклооктила, циклононила, циклодецила, циклоундецила и циклододецила. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения циклоалкилы могут быть полициклическими. Предпочтительно, указанные радикалы выбирают из бициклоалкилов или трициклоалкилов.

В соответствии с настоящим изобретением под арильными радикалами понимают ароматические одновалентные радикалы. Среди арилов предпочтительным является фенил, который может быть замещенным.

В рамках настоящего изобретения под конденсированным полициклическим углеводородным радикалом понимают радикалы, выбираемые предпочтительно из пенталена, индена, нафталина, азулена, гепталена, бифенилена, аз-индацена, з-индацена, аценафтилина, флуорена, феналена, фенантрена, антрацена, флуорантена, ацефенантрилена, ацеантрилена, трифенилена, пирена, хризена, нафтацена, плеадена, пицена, перилена, пентафена, пентацена, тетрафенилена, гексафена, гексацена, рубицена, коронена, тринафтилина, гептафена, гептацена, пирантрена или овалена.

В рамках настоящего изобретения термин гетероцикл обозначает моноциклические соединения или конденсированные полициклические соединения, содержащие один или несколько гетероатомов, при этом каждый цикл содержит от 3 до 10 звеньев. Предпочтительно гетероциклы в соответствии с настоящим изобретением содержат в цикле, имеющем от 3 до 10 звеньев, от 1 до 3 гетероатомов, которые выбирают из кислорода, серы и азота. Гетероциклы по настоящему изобретению выбирают предпочти

- 3 009322 тельно из тиофена, бензо [Ь]тиофена, нафто[2,3-Ь]тиофена, тиантрена, фурана, 2Н-пирана, изобензофурана, 2Н-хромена, ксантена, феноксатиина, 2Н-пиррола, пиррола, имидазола, пиразола, пиридина, пиразина, пиримидина, пиридазина, индолизина, изоиндола, ЗН-индола, индола, 1Н-индазола, пурина, 4Нхинолизина, изохинолина, хинолина, фталазина, нафтиридина-1,8, хиноксалина, хиназолина, циннолина, птеридина, 4аН-карбазола, карбазола, β-карболина, фенантридина, акридина, перимидина, фенантролина-1,7, феназина, фенарсазина, изотиазола, фенотиазина, изоксазола, фуразана, феноксазина, изохромана, пирролидина, А2-пирролина, имидазолидина, А2-имидазолина, пиразолидина, А3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индолина, изоиндолина, хинуклидина и морфолина.

В рамках настоящего изобретения в том случае, когда определенные выше различные радикалы являются замещенными, то вышеуказанный или вышеуказанные заместители обычно выбирают из атомов галогена, арильной, гетероциклической, гидрокси-, алкокси-, арилокси-, тиол-, алкилтио-, арилтиогруппы, алкилсульфоксидной, арилсульфоксидной, алкилсульфонильной, арилсульфонильной, цианогруппы, нитрогруппы, сульфонамидной, алкилсульфонамидной и арилсульфонамидной группы в зависимости от типа радикала. Предпочтительно определенные выше различные радикалы имеют 1, 2 или 3 заместителя. В соответствии с предпочтительным вариантом изобретения атомы галогена выбирают из хлора, фтора, брома и йода. В том случае, когда алкильные радикалы замещены атомами галогена, речь идет предпочтительно об атомах фтора. Предпочтительно число заместителей, которым является фтор, равно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7. Например, речь может идти о трифторметильной группе.

Предпочтительно аминокислоты в соответствии с настоящим изобретением выбирают из соединений общей формулы (I), где η является целым числом, выбранным из ряда 0, 1, 2 или 3, К означает атом водорода или алкильный или арильный радикал, а значение К' определено выше.

Еще более предпочтительно аминокислоты в соответствии с настоящим изобретением выбирают из соединений общей формулы (I), где η является целым числом, равным 0, 1 или 2, К означает атом водорода или алкильную группу, а К' выбирают из арилов или гетероциклов, возможно замещенных. В последнем случае арильные радикалы и/или гетероциклы предпочтительно имеют 1, 2 или 3 заместителя.

Фермент глутарил-7-АСА-ацилаза использовался ранее в качестве катализатора в многочисленных промышленных способах, в частности, для гидролиза β-лактамов, таких как Х-глутарил-7-аминоацетоксицефалоспориновая кислота. Его можно выделить из многочисленных микроорганизмов, например, из рода Ас1пе1оЬас1ег, А1йгоЬас1ег, ВасШиз, Рзеиботопаз, 81епо1горЪотопаз, а также ХапФотопаз в соответствии с методами, хорошо известными специалисту данной области, в частности, специалисту по ферментам. Фермент глутарил-7-АСА-ацилаза может также быть получен от фирмы КосЪе 1)1адпоз11с ОтЬН (КосЪе Мо1еси1аг ВюсЪет1са1з, 81апбЪо£ег 81газзе 116, Ό-68305 Маппйет), а также от фирмы Кесогбай 8.р.А. (81аЬИ1теп1о 61 орега, У1а ЬатЬго 38, 1-20090 Орега (М1)).

Фермент глутарил-7-АСА-ацилаза может быть использован в различных формах, при этом не изменяется его стереоспецифичность и его стереоселективность. Например, фермент глутарил-7-АСАацилаза может быть использован в растворимой или иммобилизованной форме. Во втором случае фермент обычно иммобилизуют в соответствии с методами, хорошо известными специалистам. Например, фермент может содержаться в полимерных гелях или может быть связан с твердыми носителями посредством ковалентной связи, или путем образования сетчатой структуры, или путем адсорбции или инкапсулирования. Подходящими носителями, которые наиболее часто используются, являются, например, пористое стекло, пористая керамика, синтетические полимеры (например, полистирол, поливиниловые спирты, полиэтилен, полиамиды или полиакриламиды) или полимеры природного происхождения (например, целлюлоза).

С помощью фермента глутарил-7-АСА-ацилазы можно получить энантиомер в избытке (ЭИ) для каждого энантиомера, в частности, в количестве, превышающем или равном 90%, даже превышающем или равном 95%, предпочтительно превышающем или равном 99%. В рамках настоящего изобретения под энантиомером в избытке понимают %-ный избыток одного из энантиомеров по отношению к рацемической смеси. В частности, энантиомерный избыток измеряется следующим образом:

эи (%; = Г; ~ г; х юо = % (к) - % <з) [к] + [3] при этом [К] и [8] означают концентрацию энантиомера (К) и (8) соответственно.

Обычно количество ферментов, используемых по отношению к общему количеству исходной аминокислоты (субстрата), составляет от 1 до 100 единиц (ϋ) на ммоль субстрата, предпочтительно от 10 до 40 единиц на ммоль субстрата. 1 единица фермента соответствует количеству фермента, необходимому для гидролиза 1 мкмоль Х-глутарил-7-аминоацетоксицефалоспориновой кислоты в минуту в стандартных условиях уровня рН и при температуре, известной специалистам.

В соответствии с изобретением реакцию осуществляют в водной среде, возможно с добавлением буферного раствора. В этом случае водный буферный раствор с концентрацией в интервале от 10 до 200 мМ может быть выбран из ацетатных буферов, используемых с уровнем рН в интервале от 5 до 6,5, или из фосфатных буферов, используемых с уровнем рН в интервале от 6,5 до 8, а также из пирофосфатных буферов, используемых с уровнем рН в интервале от 8 до 9.

- 4 009322

Таким образом, способ по изобретению применяют в среде, где уровень рН контролируют и поддерживают в интервале от 6 до 9. Предпочтительно уровень рН реакционной среды контролируют и поддерживают более точно в интервале от 7,5 до 8,5 и еще более предпочтительно в интервале от 8 до 8,5. Уровень рН контролируют с помощью устройства для поддержания рН путем приливания кислоты, такой как, например, соляная, серная или фосфорная кислота, и основания, такого как, например, гидроксид натрия, гидроксид калия или гидроксид аммония.

Обработка аминокислот согласно изобретению глутаровым ангидридом осуществляется при температуре от 20 до 40°С и предпочтительно от 25 до 35°С. Кроме того, второй этап, на котором используется фермент глутарил-7-АСА-ацилаза, осуществляют при температуре от 10 до 50°С и предпочтительно от 25 до 35°С.

Наконец, время реакции может составлять от 1 до 100 ч и зависит, в частности, от используемой аминокислоты и концентрации ферментов. Обычно реакцию проводят в течение времени, необходимого для получения требуемого энантиомера с удовлетворительным энантиомерным избытком. Контролируют количество полученной хиральной аминокислоты и значение энантиомерного избытка, используя традиционные способы, известные специалисту. Предпочтительно контроль осуществляют при помощи ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии).

В соответствии с настоящим изобретением энантиомеры (К) и (8), полученные по способу, описанному выше, могут быть легко отделены друг от друга, так как один из них находится в форме амина, растворимого в водной среде, а другой находится в форме твердого амида. Таким образом, изобретение относится к способу, изложенному выше, который включает в качестве последующего этапа разделение энантиомеров (К) и (8).

Разделение вышеуказанных энантиомеров (К) и (8) можно легко осуществить с помощью традиционных способов, известных специалисту. Его проводят, например, фильтрацией, экстракцией, хроматографией или кристаллизацией.

В том случае, когда хотят выделить другой энантиомер в форме аминокислоты, а не в форме производного глутариламида, то вышеуказанный энантиомер производного глутариламида, который был выделен в соответствии со способом, описанным выше, затем гидролизуют таким образом, чтобы выделить соответствующую аминокислоту в форме энантиомера. Следует отметить, что указанный способ является предпочтительным, так как гидролиз сохраняет стереохимию исходного соединения и не приводит к рацемизации производного хирального глутариламида. В том случае, когда аминокислоты соответствуют общей формуле (I), указанный дополнительный этап может быть представлен схемой реакции, приведенной на фиг. 2.

Гидролиз осуществляют в соответствии с традиционными способами, известными специалисту. Речь может идти, в частности, о кислотном или щелочном гидролизе. В последнем случае гидролиз проводят, например, в присутствии основания, такого как гидроксид натрия при температуре от 50 до 90°С и при атмосферном давлении. Тем не менее, могут быть использованы все другие подходящие рабочие условия, также известные специалисту.

В этом смысле настоящее изобретение имеет практическое значение, так как оно позволяет расщеплять аминокислоты в рацемической форме и получить один или другой энантиомер вышеуказанной аминокислоты, при этом энантиомеры используются, в частности, в качестве промежуточных соединений в синтезе.

В качестве иллюстрации, настоящее изобретение позволяет, например, получить (8)3-амино-3фенилпропановую кислоту, которая используется в качестве промежуточного соединения в синтезе продукта общей формулы

N СООН который является антагонистом рецептора VIА4, который задействован, в частности, в заболеваниях астмой.

Помимо вышеуказанного, настоящее изобретение также имеет характеристики и вытекающие из них преимущества, иллюстрируемые примерами, которые должны рассматриваться как поясняющие изобретение, но не ограничивающие его.

- 5 009322

Фигуры

Фиг. 1 - схематическое изображение первого этапа способа согласно изобретению - обработка аминокислоты общей формулы (I) глутаровым ангидридом, и второго этапа - обработка ферментом глутарил-7-АСА-ацилазой. Конфигурация каждого из полученных продуктов, а именно аминокислоты, с одной стороны, и производного глутариламида, с другой стороны, зависит от природы радикала В'.

Фиг. 2 - схематическое изображение этапа превращения производного хирального глутариламида в соответствующую ему хиральную аминокислоту путем гидролиза.

Примеры

Пример 1. Расщепление 3-амино-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты, находящейся в форме рацемической смеси.

а) Ацилирование рацемической 3-амино-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты.

40,6 г рацемической 3-амино-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты растворяют в смеси 200 мл дистиллированной воды и 55 мл триэтиламина. Добавляют маленькими порциями 29,4 г глутарового ангидрида и перемешивают реакционную смесь в течение 1 ч. Затем реакционную смесь подкисляют с помощью 8,2 мл 95%-ной серной кислоты (мас./об.). Полученный осадок отфильтровывают, промывают 3 раза по 15 мл дистиллированной водой и сушат до постоянного веса при температуре 55°С в вакууме. Таким образом получают 52,84 г рацемической 3-(глутариламид)-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты.

Природу полученного продукта определяют с помощью ВЭЖХ.

б) Ферментативное деацилирование с помощью суспензии кристаллической глутарил-7-АСАацилазы (реактор емкостью 100 мл).

г полученной на предыдущем этапе кислоты растворяют в 75 мл дистиллированной воды. Уровень рН суспензии доводят до 8,2, добавляя 11,2 мл 30%-ного гидроксида натрия (мас./об.). К полученному раствору добавляют 826 мг (626 единиц) суспензии кристаллической глутарил-7-АСА-ацилазы. Реакционную смесь перемешивают в течение 51 ч при температуре 35°С, и уровень рН контролируют и поддерживают в интервале от 7,9 до 8,1. По окончании реакции реакционную смесь охлаждают до 20°С, и уровень рН доводят до 7,0 добавлением 5Ν соляной кислоты. Затем добавляют 20 мл этанола. Полученный таким образом осадок (В)3-амино-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты отфильтровывают, промывают 3 раза по 30 мл этанолом и сушат до постоянного веса при температуре 45°С в вакууме. Таким образом получают 5,65 г (В)3-амино-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты с энантиомерным избытком, превышающим 99%.

Маточный раствор подкисляют с помощью 17,5 мл 5Ν соляной кислоты. Образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают 2 раза по 10 мл дистиллированной водой. Полученный на фильтре осадок сушат до постоянного веса при температуре 45°С в вакууме. Таким образом получают 8,25 г (8)3(глутариламид)-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты и (В)3-(глутариламид)-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты в соотношении 91:9.

Природу полученных продуктов определяют путем ВЭЖХ.

в) Ферментативное деацилирование с помощью иммобилизованной глутарил-7-АСА-ацилазы, полученной от фирмы Восйе Ωίαβηοδίίο ОшЬН (реактор емкостью 100 мл).

20,5 г кислоты, полученной на этапе а), растворяют в 75 мл дистиллированной воды. Уровень рН суспензии доводят до 8,2, добавляя 11,9 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия (мас./об.). К полученному раствору добавляют 6,2 г (632,4 единицы) иммобилизованной влажной глутарил-7-АСА-ацилазы (Восйе Ωίαβηοδίίο ОшЬН). Реакционную смесь перемешивают в течение 18 ч при температуре 35°С, и уровень рН контролируют и поддерживают в интервале от 7,9 до 8,1. По окончании реакции уровень рН реакционной смеси доводят до 9,5 добавлением 30%-ного раствора гидроксида натрия (мас./об.), и объем реакционной смеси доводят до 200 мл таким образом, чтобы растворить полученную (В)3-амино-3-(4'нитрофенил)пропановую кислоту.

Иммобилизованный фермент удаляют фильтрацией и доводят уровень рН маточного раствора до 7,0 добавлением 5Ν соляной кислоты. Затем в реакционную смесь добавляют 50 мл этанола. Выпавшую в осадок (В)3-амино-3-(4'-нитрофенил)пропановую кислоту отфильтровывают, промывают 10 мл этанола и сушат до постоянного веса при температуре 45°С в вакууме. Таким образом получают 5,375 г (В)3амино-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты с энантиомерным избытком, равным 98%.

Маточный раствор подкисляют с помощью 20 мл 5Ν соляной кислоты. Образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают 2 раза по 15 мл дистиллированной водой. Полученный осадок на фильтре сушат до постоянного веса при температуре 45°С в вакууме. Таким образом получают 6 г (8)3(глутариламид)-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты в соотношении 94:6.

г) Ферментативное деацилирование с помощью суспензии кристаллической глутарил-7-АСАацилазы (реактор емкостью 500 мл).

100 г рацемической 3-(глутариламид)-3-(4'-нитрофенил)пропановой кислоты, полученной как описано на стадии а), растворяют в 400 мл дистиллированной воды. Уровень рН суспензии доводят до 8,2, добавляя 60 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия (мас./об.). К полученному раствору добавляют

- 6 009322

6,4 г (4653 единиц) суспензии кристаллической глутарил-7-АСА-ацилазы. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 ч при температуре 35°С, и уровень рН контролируют и поддерживают в интервале от 7,9 до 8,1. По окончании реакции реакционную смесь охлаждают до 20°С, и уровень рН доводят до 13 добавлением 25 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия (мас./об.) так, чтобы растворить образовавшуюся (К)3-амино-3-(4'-нитрофенил)пропановую кислоту. Нерастворившиеся частицы отфильтровывают, и уровень рН маточного раствора доводят до 7,0 добавлением 27 мл 36%-ной соляной кислоты. Затем в реакционную смесь добавляют 100 мл этанола. Полученный осадок (К)3-амино-3-(4'нитрофенил)пропановой кислоты отфильтровывают, промывают 2 раза по 100 мл этанола и сушат до постоянного веса при температуре 45°С в вакууме. Таким образом получают 28,87 г (К)3-амино-3-(4'нитрофенил)пропановой кислоты с энантиомерным избытком, равным 97%.

Природу полученного продукта определяют путем ВЭЖХ.

Пример 2. Расщепление 3-амино-3-фенилпропановой кислоты в форме рацемической смеси.

а) Ацилирование рацемической 3-амино-3-фенилпропановой кислоты.

488 г рацемической 3-амино-3-фенилпропановой кислоты растворяют в 2 л дистиллированной воды, где предварительно растворяют 236 г гидроксида натрия в форме таблеток. В реакционную смесь в течение часа добавляют небольшими порциями 437,5 г глутарового ангидрида и перемешивают при температуре 20°С. По прошествии 1 ч реакционную смесь подкисляют с помощью 236 мл 95%-ной серной кислоты (мас./об.) и охлаждают до 10°С. Полученный осадок отфильтровывают, затем промывают 3 раза по 600 мл дистиллированной водой. Полученный влажный осадок на фильтре массой 1610 г содержит 602 г рацемической 3-глутариламид-3-фенилпропановой кислоты. Природу полученных продуктов определяют с помощью ВЭЖХ.

б) Ферментативное деацилирование с помощью кристаллической глутарил-7-АСА-ацилазы в суспензии (реактор емкостью 5 л).

1575 г полученного выше влажного осадка на фильтре, содержащего 589 г рацемической 3глутариламид-3-фенилпропановой кислоты растворяют в 1610 мл дистиллированной воды. Уровень рН суспензии доводят до 8,0, добавляя 440 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия (мас./об.). К полученному раствору добавляют 52,6 г (32000 единиц) суспензии кристаллической глутарил-7-АСА-ацилазы. Реакционную смесь перемешивают в течение 41 ч при температуре 35°С, и уровень рН контролируют и поддерживают в интервале от 7,9 до 8,1. По окончании реакции реакционную смесь охлаждают до 20°С, и уровень рН доводят до 13 добавлением 25 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия (мас./об.) с тем, чтобы растворить полученную (В)3-амино-3-(4'-нитрофенил)пропановую кислоту. Нерастворимые частицы отфильтровывают, и уровень рН маточного раствора доводят до 7,0 добавлением 27 мл 36%-ной соляной кислоты.

Полученный таким образом осадок (В)3-амино-3-фенилпропановой кислоты отфильтровывают, промывают 150 мл дистиллированной воды и сушат до постоянного веса при температуре 45°С в вакууме. Таким образом получают 96,9 г (В)3-амино-3-фенилпропановой кислоты с энантиомерным избытком, равным 98%.

Маточный раствор подкисляют с помощью 180 мл 95%-ной серной кислоты (мас./об.). Образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают 2 раза по 400 мл охлажденной дистиллированной водой. Полученный осадок на фильтре сушат до постоянного веса при температуре 45°С в вакууме. Таким образом получают 314,6 г (8)3-(глутариламид)-3-фенилпропановой кислоты и (В)3-(глутариламид)-3фенилпропановой кислоты в соотношении 90:10.

в) Деацилирование (8)3-(глутариламид)-3-фенилпропановой кислоты щелочным гидролизом.

557,2 г смеси (8)3-(глутариламид)-3-фенилпропановой кислоты и (К)3-(глутариламид)-3фенилпропановой кислоты в соотношении 90:10, полученной выше на стадии б), растворяют в 3,91 л дистиллированной воды и 1,65 л 30%-ного раствора гидроксида натрия (мас./об.). Реакционную смесь перемешивают в течение 4 дней при температуре 70°С.

Затем реакционную смесь охлаждают до 15°С. Полученный продукт осаждают, доводят уровень рН до 6,9 добавлением 3,21 л 37%-ной соляной кислоты (мас./об.), отфильтровывают и сушат до постоянного веса при температуре 45°С в вакууме. Таким образом получают 202,4 г (8)3-амино-3фенилпропановой кислоты и (В)3-амино-3-фенилпропановой кислоты с энантиомерным избытком, превышающим 98%.

Claims

1. Способ разделения энантиомеров аминокислоты или ее эфиров, который заключается в обработке рацемической смеси вышеуказанной аминокислоты или ее эфира глутаровым ангидридом и затем ферментом глутарил-7-АСА-ацилазой, рекуперируют один из энантиомеров вышеуказанной аминокислоты или ее эфира, а другой энантиомер остается в форме соответствующего производного глутарила мида.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вышеуказанная аминокислота или ее эфир имеет общую формулу (I) где η является целым числом, которое выбирают из 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6,

В означает атом водорода или радикал С1-С₃₀-алкил, С₂-С₃₀-алкен, С₂-С₃₀-алкин, С₃-С1₂-циклоалкил, возможно замещенный фенил, конденсированный полициклический углеводород, содержащий от 8 до 32 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 10 звеньев, при этом все указанные радикалы возможно являются замещенными, а В' означает радикал С₁-С₃₀-алкил, С₂-С₃₀-алкен, С₂-С₃₀-алкин, С₃-С₁₂-циклоалкил, возможно замещенный фенил, конденсированный полициклический углеводород, содержащий от 8 до 32 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 10 звеньев, или гидроксигруппу, тиогруппу, сульфоксидный или сульфонильный радикал, замещенный С₁-С₃₀-алкильной, возможно замещенной фенильной, С₃-С₁₂циклоалкильной группой или гетероциклической группой, содержащей от 3 до 10 звеньев, при этом все указанные радикалы возможно являются замещенными.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что вышеуказанную аминокислоту или ее эфир выбирают из соединений общей формулы (I) соов (I) где η является целым числом, которое выбирают из 0, 1, 2 или 3, В означает атом водорода или С1С30-алкильный или возможно замещенный фенильный радикал и значение В' определено в п.2.

4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что вышеуказанную аминокислоту или ее эфир выбирают из соединений общей формулы (I) где η является целым числом, равным 0, 1 или 2, В означает атом водорода или С₁-С₃₀-алкильную группу и В' выбирают из возможно замещенных фенилов или возможно замещенных гетероциклов, содержащих от 3 до 10 звеньев.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что используют фермент глутарил-7-АСАацилазу в растворимой или иммобилизованной форме.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что содержание используемых ферментов по отношению к общему количеству исходной аминокислоты (субстрата) или ее эфира составляет от 1 до 100 единиц на ммоль субстрата.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что реакцию осуществляют в водной среде с добавлением буферного раствора.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что вышеуказанный водный буферный раствор имеет концентрацию в интервале от 10 до 200 мМ и его выбирают из ацетатных буферных растворов, используемых с уровнем рН в интервале от 5 до 6,5, или из фосфатных буферных растворов, используемых с уровнем рН в интервале от 6,5 до 8, а также из пирофосфатных буферных растворов, используемых с уровнем рН в интервале от 8 до 9.

9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что уровень рН контролируют и поддерживают в интервале от 6 до 9.

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что обработка аминокислоты или ее эфира глутаровым ангидридом осуществляется при температуре от 20 до 40°С.

11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что обработку ферментом глутарил-7-АСАацилазой осуществляют при температуре от 10 до 50°С.

12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что время реакции составляет от 1 до 100 ч.

13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что разделяют, кроме того, (В)- и (8)энантиомеры.

- 8 009322

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что разделение вышеуказанных (К)- и (8)-энантиомеров осуществляют методом фильтрации, экстракции, хроматографии или кристаллизации.

15. Способ по любому из пп.13 или 14, отличающийся тем, что выделенный энантиомер производного глутариламида, кроме того, подвергают гидролизу с тем, чтобы выделить соответствующую аминокислоту в форме энантиомера.

16. Способ разделения энантиомеров аминокислоты, который заключается в:

а) обработке рацемической смеси вышеуказанной аминокислоты глутаровым ангидридом и затем ферментом глутарил-7-АСА-ацилазой, рекуперируют один из энантиомеров вышеуказанной аминокислоты, а другой энантиомер остается в форме соответствующего производного глутариламида,

б) последующем разделении полученных таким образом двух энантиомеров.

17. Способ разделения энантиомеров аминокислоты, который заключается в:

б) последующем разделении полученных таким образом двух энантиомеров, и

в) гидролизе энантиомера производного глутариламида с последующим выделением соответствующей аминокислоты в форме энантиомера.