HU228897B1 - Enzimes eljárás aminosavak enantiomer rezolválására - Google Patents

Description

ENZIMES ELJÁRÁS AMINOSAVAK ENANTIOMER REZOLVÁLÁSÁRA

A találmány tárgya új enzimes eljárás, amelynek segítségével 5 racém elegy formájában lévő ammosavakat enantiomerjelkre lehet rezolválnl.

Az aminosavekaf széleskörűen alkalmazzák különféle Iparágakban, példán! biológiai hatóanyagként vagy szintézis intermedierként különféle vegyületek, Igy gyógyszerészeti, kémiai vagy mezőgazda10 sági célra használható vegyületek előállításához. Hamar kiderült, hogy gyakran van szükség ezen amlnosavak egyik vagy másik optikailag aktív enantlomerjére. Számos eljárást kidolgoztak tehát a királis amlnosavak enantlomerjeinek elválasztására, Az enantiomerek elválasztását lehetővé tevő enzimes eljárások jelentik az egyik elo15 nyös lehetőséget aszimmetrikus szintézisek számára.

Például Soloshonok és munkatársai [lásd Teirahedron:

Assymetry, 6(7), 1801-1810 (1995)] kidolgoztak egy enzimes eljárást β amlnosavak enantlomerjeinek rezolválására. Áz eljárást az 1, reakcióvázlaton mutatjuk be.

Analóg módon Topgi és munkatársai [lásd Bloorg, & kled.

Chem., 7, 2221-2229 (1999>j eljárása szerint etí!~3-amino~4-pentinoát (R) és (S) enantiomerjét lehet elválasztani a 2. vagy 3. reakcióváziaton bemutatott eljárással. A 2. reakcióvázlat kiindulási vegyület©ként alkalmazott fenilaeetamldot a megfelelő amin fenilecetsavval történő acilezésével állítjuk elő.

A WO 93/50575 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben általános eljárást ismertetnek királis β aminosav előállítására, amely abból áll, hogy az adott aminosav racém elegyét egy acii donorra! és a penicillin G aoiláz (vagy amidohídroláz) enzimmel reagáltatják olyan megfelelő körülmények között, amelyek között a

1ööö95~3035C-8É/fa * X * V «

β aminosav racém elegyét alkotó egyik enantiomerí sztereoszelektfv módon acitálják a megfelelő N-acil-származékává, a β aminosav másik enantiomerjét pedig enantiomerben dús formában nyerik ki. Az eljárást a 4, reakciövázlaton szemléltetjük. Az említett aoil donor” a (VI) általános képlettel ábrázolható, a képletben R_s jelentése fenik, fenoxi-, aminocsoport, különböző fenilszármazékok vagy píridiicsoport, R4 jelentése bidroxil-, alkoxi-, aikll··, alkenil··, alkinil·, halogénalkil-, anil, anilalkii-csoport, cukrok vagy szteroidok.

A WO 98/50575 számon közzétett nemzetközi szabadalmi belő jelentésben egy másik alternatív eljárást is ismertetnek királls β aminosav előállítására, amely abból áll, hogy egy amidot racém formában a penicillin G aciláz enzimmel reagáltaínak olyan körülmények között, amelyek között a racém formában lévő amid egyik enantiömerje szelektíven dezaoileződík, a megfelelő β amínosawá alakot, az amid másik enantiomerjét pedig enantiomer dús formában nyerik ki. Az eljárást az 5. reakcióvázlaton szemléltetjük.

Az eddig ismertetett eljárások nagy hátránya azonban, hogy magával az enzimes lépéssel egyidejűleg vagy azt megelőzően egy intermedier amidőn keresztül megy az eljárás. Ezt az intermedier amidot a (VII) általános képlettel ábrázolhatjuk.

Az ilyen amid vizes közegben oldhatatlan az aromás gyűrű miatt, ez pedig különböző hátrányokkal jár. Ismert például, hogy bizonyos enzimek vizes közegben oldhatók, és gyakran érzékenyek szerves oldószerrel szemben. Ahhoz pedig, hogy az enzimes reakció op25 timális hozamú legyen, fontos, hogy a szubszlrátum az enzimhez képest jól oldódjon, abból a célból, hogy bensőségesen tudjanak egymással érintkezni.

Főként ezt a problémát kívánja a találmány megoldani. A találmány tárgya egyrészt új eljárás aminosav enantiomerjeinek elvá30 lasztására, amely abból áll, hogy az aminosav racém elegyét glutársav-anhidriddel, majd a glufaril 7-AGA aciláz enzimmel reagáifaljuk, így az aminosav egyik enantiomerjét kinyerjük, a másik enantiomer a megfelelő glutard-amid-származék formájában marad az eíegyben.

* * V »♦· «4

Ez az eljárás különösen előnyös, mível a glutársav-anhidrid alkalmazása lehetővé teszi, hogy a kiindulási aminosavnak megfelelő glutaril-emid-származékon keresztül végezzük a reakciót, ahol a gtutarllcsoport biztosítja a molekula vízoidhatóságát. Ennek az az eredménye, hogy a találmány szerinti eljárást enyhe reakciókörülmények között vizes közegben, vagyis szerves segédoldószer alkalmazása nélkül tudjuk elvégezni.

A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy általánosan alkalmazható valamennyi aminosav forma (α, β, y stb.) esetében). A találmány értelmében az aminosav általános kifejezésbe beleértjük magát az aminosavat, (vagyis azt a vegyüietet, amelynek van egy aminocsoportja és egy -COOH) savcsoportja), valamint a megfelelő észtereket is (vagyis az olyan vegyüieteket, amelyekben a savcsoportot egy észtercsoport COÖR helyettesít). Előnyösen a találmány szerinti eljárást olyan (I) általános képletű amlnosavakra alkalmazzuk, ahol

- n értéke egész szám, 0, 1, 2, 3, 4, 5 vagy 6,

- R jelentése hidrogénatom vagy alkil-, alkenii-, alkinil·, cikloalkll·. aril- vagy kondenzált polieiklusos szénhidrogén-csoport vagy heterociklusos csoport, ahol valamennyi említett csoport adott esetben szubsztiluálva van és

- R* jelentése alkil·, alkenii-, alkinil-, cikloalkll-, aril-, kondenzált polieiklusos szénhidrogén- vagy heterociklusos csoport vagy alkil-, aril·, cikloalkll· vagy heterociklusos csoporttal szubsztituáit oxi-, tio~, szulfoxid- vagy szuiíonli-csoport, ahol valamennyi szubsztituens csoport adott esetben még szubsztituálva is van.

Amikor tehát az aminosav az (1) általános képletnek felel meg, a találmány szerinti eljárást a 6. reakció-vázlaton szemléltetjük. A reakcióvázlaton az első lépésben a glutársav-anhidriddel végzett reakciót, a második lépésben pedig a glutaril 7-ACA acilázzal végzett reakciót mutatjuk be, A kapott terméket konfigurációja, vagyis egyrészt az aminosav, másrészt a glutanl-amid-származék konfigurációja az R’ csoport jelentésétől függ.

* 4 ΑΧ X ft *

A találmány értelmében az alkil·, aikenll- és aikinil-csoportok általában 1-30 szénatomosak, lehetnek egyenes vagy elágazó íáncúak, bár ez nem korlátozó jellegű. Ugyanez érvényes abban az esetben, amikor ezek a csoportok más csoportok szubsztifuenseL Elő5 nyösen ezek a csoportok 1-2Ö szénatomosak, egyenes vagy elágazó láncúak, különösen előnyösen 1-10 szénatomosak, egyenes vagy elágazó szénláncüak. Áz alkilosoportok közül példaként a kővetkezőket említhetjük: metll·, etil·, n-propll·, π-butil-, n-pentil·, n-hexll·, n-heptn~, η-oktll-, n-noníl·, n-decii-, η-undecd-, n-tíodecll··, n-trideo.il·, n10 -pentadecil·, η-hexadecil-, n-heptadecll·, n-okfadeeil·, izopropll-, izobutíl·, Izopenfil-, izohexsl-, 3-rnefHpentil-, neopentil-, neohexi!-,

2,3,5-trimethhexll·, szék-buti!-, terc-butíl-, terc-penlil-csoport Az előnyös alkilosoportok közül példaként a metil-, etil·, n-propl!-, Izopropíl·, n-butll··, ízobutil-, szek-hutil·, terc-butíl-. n-pentil-, izopentll-, n15 -hexll- és Izohexll-csoportot említjük. Az alkemlcsoportok közül példaként a következőket említjük: vlnil-, 1-propenll·, allll·, hűteni!-, 2-metil-1-propenll·, 2-meíH-2-pröpenil· és S-metil-S-buteni!-csoport. Az alkímtcsoportck közül megemlítjük az etlnll·, az 1-propmrl· és a prepa r g II - csoportot.

A találmány értelmében a cíkloalksl-csoportok általában 3-12 szénatomosak. Előnyösek az alábbiak; cíklopropil·, ciklobutil·, cíkíopentd-, cikiohexil·, cikloheptíl·, ciklooktil-, ciklonom!-, crkiodecil·, cíkloundecll· és ciklododecH-csoport. A találmány egy másik változata szerint a cikloalkilcsoportok lehetnek poiíeiklusosak is. Ezek közül előnyösek a biclkloalkil és a IricikioaBii-csoportok..

A találmány értelmében arílcsoporf'-on egyértékü aromás szénhidrogén-csoportokat értünk. Az árucsoportok közül előnyös az adott esetben szubszfituált femicsoport.

A találmány értelmében kondenzált policíklusös szénhidrogén30 csoportok közül előnyösen az alábbiakat értjük: pentaiin, indén, naftalén, azulén, heptalén, bífenllén, asindacén, sindacén, acenaftilén, fluorén, fonalén, fenantrén, antraoén, fluorantén, acefenantrifén, aceantrilén, letrifenilén, pírén, krizén, naftacén, piaiadén, picén,

Φ * perilén, pentafén, pentacén, tetrafenilén, hexafén, hexacén, rubieén, koronán, trinaftilén, bepíafén, hepíacén, pirantrén és ovalén.

A találmány értelmében a heterociklusos vegyülef kifejezés monociklusos vagy kondenzált policiklusos vegyüietet jelent, amely egy vagy több heteroatomot tartalmaz, ahol az egyes gyűrű 3-10tagű. A találmány szerint a heterociklusos vegyületek az oxigén-, kén- és nitrogénatom közül 1-3 heteroatomot tartalmaznak egy 3-10tagú gyűrűben. A találmány szerinti heterociklusos vegyületeket előnyösen az alábbiak közül választjuk; tiofén, benzoíbjtiofén, naffö[2,3“t}liöfén, tiantrén, furán, 2H-pirán, izobenzofurán, 2H-kromén, xantén, fenoxatiln, 2H~pírrol, pírról, imldazol, pirazol, pirldin, pirazin, pirimidin, piridazin, indolizln, izoindol, 3H~indol, indöl, IH-indazoí, purin, 4H~kmolizln, izokinolein, kinolein, ftalazin, naftiridin-1,8, kinoxalin, kinazolin, oinnolin, pteridin, 4aH~karbazol, karbazoi, β-karbolin, fanantrldln, akridln, perimidin, t'enanfrohn-1,7, fenazln, fenarzazin, izotlazol, fenotiazin, izoxazol, furazán, fenoxazin, izokromán, pirrolidin, Á2~psrrOÍin, imidazolidin, A2~imidazolin, pirazolidin, A3-pirazolin. piperidin, piperazln, indolin, izolndolin, kinuklidln és morfelm.

A találmány szerint, amikor a fentebb említett különböző csoportok szubsztituálva vannak, akkor az egy vagy több szubsztltuenst általában az alábbiak közül választjuk: halogénatom, aril-, heterociklusos, hidroxll-, aikoxi-, ariloxi-, tio-, alkiltlo-, ariltto-, alkilszulfoxid-, arílszulfoxid-, atkOszuSfonil·, artlszulfoníl·, ciano-, nitro-, szuifonamid-, alkilszulfonamid- és arilszuifonamid-, a csoport jelentésétől függően. Előnyösen a fent definiált különböző csoportok egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan vannak szubsztituálva. A halogénatomot a klór-, fluor-, brőm- és lódatom közül választjuk. Abban az esetben, amikor az alklicsoportok halogénatommal vannak szubsztituálva, akkor a halogénatom előnyösen a flooratom. A fluor szuhsztítuensek száma előnyösen 1, 2, 3, 4, 5, 8 vagy 7. Előnyös például a Irifluormetil-osoport

A találmány szerint az aminosavat előnyösen az olyan (I) álfaJános képletü vegyületek közül választjuk, ahol n értéke egész szám, 0, 1, 2 vagy 3, R jelen tése hidrogénatom, alkií- vagy árucsoport és R' jelentése a fenti.

Különösen előnyösen a találmány szerint az aminosavai olyan (!) általános képletű vegyületek közül választjuk, ahol n értéke egész szám, ö, 1 vagy 2, R jelentése hidrogénatom vagy alkilcsoport és R' jelentése adott esetben szubsztltuált arií- vagy heterociklusos csoport, Ez utóbbi esetben az aril- és/vagy heterociklusos csoport előnyösen egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan van szubszfltuálva.

A glutarll 7-ACA aciláz enzimet katalizátorként már alkalmazták számos Ipari eljárásban, például β-laktámok, például N-glutaril-7~ -amlnoacetoxicefalosporin-sav hidrolízisére. Az enzim számos mikroorganizmusból származhat, ilyenek például a kővetkezők: Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Stenotrophonas vagy Xanthomonas nemhez tartozók, az előállításukra vonatkozó eljárások az enzimek területén jártas szakemberek számára jól ismertek. A glutarll 7-ACA aciláz enzim kereskedelmi forgalomban is kapható, például az alábbi gyártók termékeként: Roche Diagnostic GmbH (Roche Molecular Biocbemicals, Standhofer Stasse 118, 0-88305 Mannheim) vagy Recordati S.p.A. (Stabilsmento di opera, Via Lambro 38. I-20Ö9Q Opera (Mí)>.

A glutarll 7-ACA aciláz enzimet különböző formákban alkalmazhatjuk anélkül, hogy ez befolyásolná az enzim szfereospecifikus és sztereoszeiektiv tulajdonságait, Például a glutarll 7-ACA acüázt alkalmazhatjuk oldható alakban vagy immobilizált formában. Ez utóbbi esetben az enzim általában a szakember számára ismert eljárásokkal van ímmobrhzálva. Például tartalmazhatják az enzimet polimer gélek vagy kapcsolódhat az enzim kovalens kötéssel, térhálősltással, adszorpcióval vagy kapszulázássai különböző szilárd hordozókhoz. A megfelelő és általánosan alkalmazott hordozók közül példaként a következőket említjük: porózus üveg, porózus kerámia, szintetikus polimer (például polisztorol, polivmilaikoholok, polietilén, poliamidok * · · χ* vagy políakrilamidok) vagy természetes eredetű polimer (például cél·· luiéz},

A gíutarif 7-ACA aoííáz enzim alkalmazásával minden enantiomerre magas enantíomer felesleget (“ee”) érhetünk el, például 90 %5 ot vagy ennél magasabb értéket, sőt 95 %-ot vagy ennél magasabb értéket, előnyösen 99 %-ot vagy ennél magasabb értéket, A találmány értelmében enantíomer felesleg”-en az egyik enantíomer százalékban kifejezett feleslegét értjük a récém elegyhez viszonyítva. Pontosabban az enantíomer felesleget az alábbiak szerint számítjuk:

io Rj - m ee (%} =------------* 100 = % (R) - % (S) [Rj - [Sj (Rí és [S] jelentése az (R) és (3) enantíomer koncentrációja.

Általában a kiindulási aminosav (szubsztrátum) teljes mennyi15 ségéhez viszonyítva 1-100 egység (0) per mmól szubsztrátum enzimet, előnyösen 10-40 egység per mmél szubsztrátum enzimet alkalmazunk. 1 enzim egység annak az enzim mennyiségnek felel meg, amely percenként a szakember által ismert standard pH és hőmérséklet körülmények között 1 pmrnől H-glutaril-7-aminoacefox'ícefalo20 sporin-sav hidrolíziséhez szükséges.

A találmány szerint a reakciót adott esetben pufferoít vizes közegben végezzük. Amennyiben puffért alkalmazunk, a 10 mmól és 200 mmól közötti koncentrációjú vizes puffért az 5 és 6,5 közötti pHnál alkalmazható acetát pufferok, a 6,5 és 8 közötti pH-nái alkalmaz25 ható foszfát pufferok és a 8 és 9 közötti pH-nái alkalmazható plrofoszfát pufferok közül választhatjuk,

A találmány szerinti eljárást tehát olyan közegben végezzük, ahol a pH szabályozott és 6 és 9 közötti értékre van beállítva. Előnyösen a reakcióközeg pH-ja szabályozott és pontosan 7,5 és 8,5 kö30 zőfti értékre van beállítva, még előnyösebben 8 és 8,5 közötti pHértékre van beállítva. A pH-t “pH-síatttal szabályozhatjuk sav, például sósav, kénsav vagy foszforsav hozzáadásával, és bázis, például nátrium-hídroxid, kálíum-hídroxid vagy ammónia hozzáadásával.

A találmány szerint az aminosav és a glutársav-anhídrid reakcióját 20 ás 40 °C közötti, előnyösen 25 és 35 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A második lépést, ahol a glutaril 7-ACA acílázt alkalmazzuk, 10 és 50 °C, előnyösen 25 és 35 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

Végül a reakció időtartama összesen 1 óra és 1Ö0 óra között változik, függ az adott aminosavtól és az enzim koncentrációjától. Általában a reakciót annyi ideig hagyjuk végbemenni, amennyi idő ahhoz szükséges, hogy kielégítő enantiomer feleslegben kapjuk meg lö a kívánt enaniiomerl. A kapott királis aminosav mennyiségét és az enantiomer felesleget a szakember által ismert hagyományos eljárások alkalmazásával ellenőrizzük. Előnyősén ezt az ellenőrzést HPLC (nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárás) eljárással végezzük.

1.5 A találmány szerint a fentiekben ismertetett eljárással kapott (R) és (S) enantiomert könnyen el lehet választani, mivel az egyik a vizes közegben oldható amin formában, a másik szilárd amid formában van. A találmány további tárgya tehát a fentiekben ismertetett eljárás, amely tartalmazza az (R) és (S) enantiomerek elválasztási lépését is.

Az (R) és (S) enantiomerek elválasztását könnyen elvégezhetjük a szakember által ismert hagyományos eljárásokkal. Az elválasztást végezhetjük például szűréssel, extrahálással, kromatográfiás eljárással vagy kristályosítással.

Abban az esetben, ha a másik enantiomert aminosav formában, nem pedig glutaril-amid-származék formájában kívánjuk izolálni, akkor a találmány szerinti eljárással izolált glutaril-amíd enantiomert hidrolizáljuk, igy enantiomer formában nyerjük ki a megfelelő amínosavat Meg kell jegyezni, hogy ez az eljárás előnyös, mivel a hídrólí30 zisset megőrizzük a szőbanforgö vegyület sztereokémiáját, a hidrolízis során a királis glutaril-armd-származék nem racemízáiődik. Abban az esetben, ha az ammosavak az (I) általános képíetö vegyületek közé tartoznak, ezt a további lépést a 7. reakcióvázlaton mutatjuk be.

φ « * ♦« >

A hidrolízist a szakember által Ismert hagyományos eljárásokkal végezzük. A hidrolízis lehet savas vagy lúgos hidrolízis. Ez utóbbi esetben például bázis, így nátrlum-hldrixid jelenlétében végezzük a reakciót 50 és 90 C közötti hőmérsékleten, atmoszférikus nyomáson.

Ettől eltérő, a szakember által ismert műveleti körülmények is alkalmazhatók azonban.

A találmány hasznos, mivel segítségével a racém elegy formájában (evő aminosavak elválaszthatók, ami lehetővé teszi, hogy az említett aminosav egyik vagy másik enantíomerjét előállítsuk, amely enantiomerek például szintézis intermedierek.

Például a találmány szerinti eljárással megkaphatjuk az (S) 3~amlnö-3~fenil-propánsavat, amely hasznos intermedier a (Vili) képletü vegyüiet előállításánál. A (Vili) képietű vegyüiet a VLAA receptor aníagonísíája, és mint ilyen asztma kezelésénél használható,

A találmányt a következőkben példákkal Illusztráljuk, ezek azonban nem használhatók a találmány oltalmi körének korlátozására. A példákból a találmány további jellemzői és előnyei is kitűnnek.

A találmány szerinti eljárást bemutató reakcióvázlafok rövid ismertetése

3. reakcióvázlat; Egy (I) általános képlefű aminosav találmány szerinti eljárással történő kezelésének ábrázolása. Az 1. lépésben a vegyületet gluíársav-anhidriddel reagálhatjuk, a 2. lépésben a glutaríl 7-ACA aclláz enzimmel reagáltatjuk. Az előállított termékek konfigurációja, vagyis egyrészt az aminosav, másrészt a glutaril-amid25 .származék konfigurációja az R’ csoport jelentésétől függ.

A 7. reakcíóvázíaíon a királís glutaíl-amid-származéknak a megfelelő kiráíis aminosavvá hidrolízis útján történő átalakítását szemléltetjük,

1. példa

Racém elegy formáiéban lévő S-amino-S-CA^futrofenih-propánsav rezolváiása

a) Racém S-amino-Ó-fA'-nítrofeniD-propánsav aoilezése

40,8 g racém 3-amíno-3~(4'-nitrofeníl)-propánsavat feloldunk

- ΙΟ200 mi desztiuált víz és 55 ml tnetil-amin eiegyében. Kis részietekben hozzáadunk 29,4 g gíutársav-anhidridet és a reakcióelegyet 1 órán keresztül keverjük. A reakcióelegyet ezután 8,2 mi 95 tömeg/térf.%-os kénsavval savanyítjuk. A kapott csapadékot leszűrjük, 3 x 15 mi desztillált vízzel mossuk és 55 ^öC-on vákuumban állandó tömeg eléréséig szárítjuk. 52,84 g racém 3-(giutaniamld)~3~(4‘-nitro-p r op á nsa va1ka pún k.

A kapott termék minőségét HPLC eljárással határozzuk meg.

Enzimes dezaoilezés kristályos glutani 7-ACA aciiázzal .0 szuszoenzi

7-S reaktorban) g előző lépés szerint előállított savat feloldunk 75 ml desztillált vízben. A szuszpenzió pH-ját 8,2-re állítjuk be 11,2 ml 30 tömeg/térf.%-os nátrium-hidroxid hozzáadásával. A kapott oldathoz hozzáadunk 826 mg (628 egység) kristályos glutarll 7-ACA aclláz szuszpenziót. A reakcióelegyet 51 érán keresztül 35 ^öC~on 7,9 és 8,1 közé beállított mért pH-náí végezzük. A reakció végén a reakcióelegyet 20 °C-ra hűfjük, és a pH-t 5 N sósav hozzáadásával 7,0 értékre állítjuk be. Ezután 20 ml eianolt adagolunk. A kapott (R) 3-amino-3-(4^!~nifrofenB}-propánsav csapadékot leszűrjük, 3 x 30 ml etanollal mossuk és vákuumban 45 °C-on állandó tömeg eléréséig szárítjuk. 5,85 g (R) 3-am':no-3-(4‘-nifrofenH)-propánsavat kapunk, enantiomer feleslege nagyobb, mint 99 %.

Az anyalúgot 17,5 ml 5 N sósavval savanyítjuk, A képződött csapadékot leszűrjük, 2 x 10 ml desztillált vízzel mossuk. A szörőlepényt 45 °C-on vákuumban állandó tömeg eléréséig szárítjuk, 8,25 g (S) 3-(glutariiamid)-3-(4'-nitrofenll)-propánsavat és (R) 3~{glutarii~ amldj-S-Cé'-mtroíenilj-propánsavat kapunk 91:9 arányban.

A kapott termékek minőségét HPLC eljárással határoztuk meg.

rmes mellőzés Ímmobilizált glutarll 7-ACA aciiázzal, szerzünk be (100 ml-es reakforban végezzük a sea^cio

20,5 g a) lépés szerint előállított savat feloldunk 75 mi desztillált vízben. A szuszpeoziő pH~ját 11,9 ml 30 tömeg/térf.%~os nátrium- 11 * ♦» » Φ « A «

Φ Φ *'Φ * Φ < ♦

hidroxid hozzáadásával 8,2-re állítjuk be. Az oldathoz hozzáadunk 8,2 g (832,4 egység) nedves immobiiizált glutaril 7-ACA acilázt (Roche Diagnostíc GmbH). A reakcióelegyet 18 órán keresztül 35 ^ÖCon keverjük, pH~ját ellenőrizzük és 7,3 .s 8,1 közötti értéken tartjuk.

A reakció végén a reakoiőelegy pH-ját 30 tömeg/térf.%~os nátrlumhldroxid hozzáadásával 9,5-re állítjuk be, és a reakciőelegy térfogatát 200 ml-re egészítjük ki. igy feloldjuk az előállított (R) S-amino-S-lé’-nítrofenil)-propánsavat. Az immobiiizált enzimet szűréssel eltávolítjuk, az anyalúg pH-ját 5 N sósav hozzáadásával 7,0 értékre állítjuk be. Ezután a reakciőelegyhez 50 ml etanolt adunk, A csapadék formájában kiváló (R) 3-amino-3-(4' nítrofenílj-propánsavat leszűrjük, 10 ml etanollal mossuk és 45 °C-on vákuumban állandó tömeg eléréséig szárítjuk, 5,375 g (R) 3-amino-3-(4’-nítrofeníl)-propánsavat kapunk, amelynek enantiomer feleslege 98 %.

Az anyalűgot 20 ml 5 N sósavval savanyítjuk. A képződő csapadékot leszűrjük, 2 x 15 ml desztillált vízzel mossuk. A szűrölepényt 45 °C~on vákuumban állandó tömeg eléréséig szárítjuk, 6 g (S) 3-giuíaniamid}~3-{4’-mlrofeni!)-pFöpánsavat kapunk 94:6 arányban,

A kapott termékek minőségét HPLC eljárással határozzuk meg.

d) Enzimes dezacílezés kristályos glutaril 7-ACA acilázzal szuszpenzióban (500 ml-es reaktorban)

100 g a) lépés szerint előállftott racém 3-(giutariÍamid)-3~(4^í-nít~ rofeniij-propánsavat feloldunk 400 ml desztillált vízben. A szuszpenzió pH-ját 3,2-re állítjuk be 80 ml 30 tömeg/térf.%-os nátríum-hidroxid hozzáadáséval. A kapott oldathoz hozzáadunk 6,4 g (4653 egység) kristályos glutaril 7-ACA aciláz szuszpenziót. A reakolőelegyet 30 órán keresztül 35 °C-on keverjük, pH-ját ellenőrizzük és 7,9 és 8,1 közötti értéken tartjuk. A reakció végén a reakcióé legyet 20 ^öC-ra hűtjük, pH-ját 25 ml 30 tömeg/férf.%-es nátrium-hídroxíd hozzáadá30 sóval 13-ra állítjuk be, így a képződött (R) 3~ammo-3-(4’-nitrofenil)-propánsav feloldódik. Az oldhatatlan részeket leszűrjük, az anyalúg pH-ját 27 mi 38 %-os sósav hozzáadásával 7,0-ra állítjuk be. Ezután a reakciőelegyhez 100 mi etanolt adunk, a kapott (R) 3-amino-3-(4^:Λ * ί : ’·: .· :.:.

*·* * *'·*·* <·* φφ** φ

-nitrofenii)-propánsav csapadékot leszűrjük, 2 χ 100 ml etanollaí mossuk, majd 46 *C-on vákuumban állandó tömeg eléréséig szárítjuk. 28,87 g (R) 3-am!nö-3-(4^í-nífrofenll)-propánsavat kapunk, enantíomer feles logo 97 %.

A kapott termék minőségét HPLC eljárással határozzuk meg.

2. példa

Racém elegy formájában lévő 3-amino-3-fenií-propánsav rezeivé lása

a) Racém 3-amlno -3-fenil-nrocánsav acllezése

488 g racém 3-amlno-3~fenll-propánsavat feloldunk 2 I desztillált vízben, amely 238 g nátrium-hídroxíd pasztillát tartalmaz. Kis részletekben 1 óra alatt a reakcfóelegyhez keverés közben 20 ^c’C-on hozzáadunk 437,5 g gtutársav-anhídrideí. 1 óra elteltével a reakoíőelegyef 236 ml 95 főmeg/térf.%-os kénsavval savanyítjuk és 10 °C-ra hűtjük. A képződött csapadékot leszűrjük. 3 x 600 mi desztillált vízzel mossuk. A kapott 1810 g nedves szűröíepény 802 g racém 3-giutarílamid-3-fenil-propánsavat tartalmaz. A kapott termékek minőségét HPLC eljárással határozzuk meg.

b) Enzimes dezaoilezés kristályos plutaríí 7--AGA acllázzal

1875 g előzőek szerint előállított nedves szürölepényt, amely 589 g racém 3-gíuíarliamíd--3~fenü~pí'opánsayat tartalmaz, feloldunk 1610 mi desztillált vízben. A szuszpenzió pH-ját 8,0-ra állítjuk be 440 ml 30 tomeg/'férf.%~os nálrium-hidroxid hozzáadásával. A kapott oldathoz hozzáadunk 52,6 g (32 000 egység) kristályos glutaril 7-ACA acrláz szuszpenziót. A reakcióelegyet 41 órán keresztül 35 °C-on keverjük, pH-ját ellenőrizzük és 7,9 és 8.1 közötti értéken tartjuk. A reakció végén a reakcióelegyet 20 ⁰C-ra hütjük, a pH-ját 25 mi 30 tömeg/férf,%-os nátrium-hldrcxíd hozzáadásával 13-ra állítjuk be, Így 30 feloldódik a képződött (R>-3-amlno-3-(4’-nitrofenH)~propánsav. Az oldhatatlan részeket leszűrjük, az anyalúg pH-ját 27 ml 38 %-os sósav hozzáadásával 7,0 értékre állítjuk be.

Az így kapott (R) 3-amino-3-feníl-propánsav csapadékot ie-13»* * ♦ φ 0

-» * V * * * ** *«» 4 szűrjük, 150 ml desztillált vízzel mossuk és 45 °C-on vákuumban állandó tömeg eléréséig szárítjuk. 96,9 g (R) S-aminö-S-femí-propánsavat kapunk 98 %-os enantiomer felesleggel.

Az anyalűgot 180 mi SS iömeg/férf.%-os kénsavval savanyítjuk. Az így kapott csapadékot leszűrjük, 2 x 4ÖÖ ml hideg desztillált vízzel mossuk. A szűröiepényf vákuumban 45 ^cC-on állandó tömeg eléréséig szárítjuk 314,8 g (S) 3~{giufariíamid)-3~fenil-propánsavat és (R) 3~(giuíarliamíd}-3-fenil~propánsavaí kapunk 90:10 arányban.

A kapott termékek minőségét HPLC eljárással határozzuk meg.

roiizissei

557,2 g (S) 3-giutarilamld-3-fenií-propánsav és (R) 3-glutarllamid-3-fenii-propánsav fej lépés szerint előállított 90:10 arányú elegyét felelőjük 3,91 1 desztillált víz és 1,85 I 30 tömeg/íérf.%-os nátri15 um-hidroxld elegyében. A reakcióelegyet 4 napig 70 °C-on keverjük, majd 15 °C-ra hütjök.

A kapott termék csapadék formában kiválik, amikor a pH~f 3,21 I 37 tömegZtérf.%~os sósav hozzáadásával 8,9-re állítjuk be. A csapadékot leszűrjük és vákuumban 45 ®C-on állandó tömeg eléréséig szá28 Htjuk. 202,4 g (S) 3-amino-3-fenü-propánsavat és <R) 3~amino~3-fe~ níí-propánsavai kapunk, enantiomer felesleg 98 %.

A kapott termékek minőségét HPLC eljárással határozzuk meg.

í$

3V

Claims (14)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás aminosav vagy aminosev-észter enantiomerjeínek elválasztására, azzal j e I le m ezv e, hogy az aminosav racém ©legyét gíufársav-anhldrlddei, majd a glutsrH 7-ACA aciláz enzimmel reagáitatjuk, így az amlnosav egyik enantiomerjét kinyerjük, míg a másik enantiomer a megfelelő glutanl-amid-származék formájában marad,
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosav vagy amlnosav-észfer az (I) általános képlettel ábrázolható, ahol

   - n értéke egész szám, 0, 1, 2, 3, 4, 5 vagy 6,

   - R jelentése hidrogénatom vagy alkil·, alkenil-, aíkinil-, cikioaíkil-, aril- vagy kondenzált poJioiklusos szénhidrogén-csoport vagy heterociklusos csoport, ahol valamennyi említett csoport adott esetben szubsztltuáiva van és

   - R^! jelentése alkil-, alkenil·, aíkinil-, cikíoalkil-, aril-, kondenzált poiiclklusos szénhidrogén- vagy heterociklusos csoport vagy alkil-, aril·, cikíoalkil- vagy heterociklusos csoporttal szübsztitüált oxl·, tio-, szulfoxid- vagy szulfonü-csoport, ahol valamennyi szubsztituens csoport adott esetben még szubsztltuáiva is van.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amínosavat vagy aminosav-észtert olyan (I) általános képletű vegyületek közül választjuk, ahol n értéke egész szám, 0,1,2 vagy 3, R jelentése hidrogénatom, alkil- vagy ariiosoport és R^s jelentése a 2. igénypont szerinti.
4. 4. A 2. vagy 3. Igénypont szerinti eljárás, azzal jelleme zv e, hogy az amínosavat vagy aminosav-észtert olyan (I) általános képletű vegyületek közöl választjuk, ahol n értéke egész szám, 0, 1 vagy 2, R jelentése hidrogénatom vagy aikilcsoport és R' jelentése adott esetben szubszfituált aril- vagy heterociklusos csoport.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j e 11 em e z v e, hogy a giutaril 7-ÁCA aciláz enzimet oldható formában vagy immobilizált formában alkalmazzuk.

   -15
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal J e ll em e z v e, hogy a kiindulási amínosav vagy aminosav-észter (szubsztrátum) teljes mennyiségére vonatkoztatott felhasznált enzim mennyiség 1 mmöl szubsztrátumra vonatkoztatva 1 és 100 egység közötti.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j e II em e z v e, hogy a reakciót pufféról! vizes közegben végezzük,

   S. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal j β 11 e m ez v e, hogy a vizes puffer koncentrációja 10 mmól és 200 mmól közötti, és azt az 5 és 6,5 közötti pH-nál alkalmazható acélát puffanok, a 6,5 és
8. 8 közötti pH-nál alkalmazható foszfát pufferok és a 8 és 9 közötti pH-nál alkalmazható pirofoszfát pufferok közül választjuk,
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j e ll em © z v e, hogy a pH-t ellenőrizzük és δ és 9 közötti értékre állítjuk be.

   16. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j e ΙΙο m e z v e_s hogy az amínosav vagy aminosav-észter és a glufársavanhidrid reakcióját 20 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten végezzük.
10. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal J e II © m e z v e, hogy a glutaril 7-AGA aciláz enzimmel történő kezelést 10 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten végezzük,
11. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j e 1I e m e z v e, hogy a reakció időtartama 1 éra és 100 óra között változik.
12. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j e I» I © m © z v e, hogy tartalmazza az (R) és (S) enantiomer elválasztására szolgáló lépést is.
13. 14. A 13. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (R) és (S> enantiomer elválasztását szűréssel, extrahálással, kromatográfiás eljárással vagy kristályosítással végezzük.
14. 15. A 13, vagy 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztott glutaril-amid-származék enantiomert hidrolizáljuk is, így a megfelelő aminosavat enantiomer formában nyerjük ki.