TWI252869B - Enzymatic process for the enantiomeric resolution of amino acids - Google Patents

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1252869 A7 _ _B7 五、發明説明（1 ) 本專利申請案根據美國專利法第1 1 9 ( e ) 3 5條 ，主張於2 0 〇 1年1 1月2 0日所提出之美國臨時專利 申請案60/331， 613之優先權，其揭示內容淸楚 地倂爲本文之參考資料。本專利申請案亦根據美國專利法 第1 19 一 35條，主張於2001年9月4日提出之法 國專利申請案〇 1 / 1 1 4 3 1之優先權，其揭示內容淸 楚地倂爲本文之參考資料。 本發明關於用於外消旋混合物型式中之胺基酸的對映 異構解析的新穎酶催化方法。 胺基酸在所有工業中通常係做爲製藥、化學或農業用 化合物之製備方法中的活性化合物或做爲合成方法之中間 物。因此，顯然地，時常需要取得這些胺基酸之一或另一 種光學活性對映異構體。因此，現已發展出許多用於分離 前一手性之胺基酸對映異構體的路徑。尤其是，現已發現 :可令這些胺基酸進行對映異構解析的酶催化方法是種不 對稱合成方法的方便替代法。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 彳應方 冊反化 6 列催 第下酶 ，據的 稱根析 對} 解 不頁構 :ο 異 體 1 映 面 6 對 四 1 之 (I 酸 等 1 基 ，ο 胺 克 6 _ 諾 1 々 夏，於 羅 5 用 索 9 1 ，9 用 此 1 使 S ， } 表 ： 7 圖法 本纸張尺度適用中國國家標準（CNs ) A4規格（210X 297公釐） -4 - 1252869 A7 B7 五、發明説明（2

COOH 水/丙酮（1/1) 三乙胺 苯乙醯氯 -5°C:2小時

青黴素醯酶 22-25t,pH=7.5

、C00H

HN

COOH 〇 類似地，托吉，等（Bioorg，& Med Chem 1 999，第 7 冊，222 1_2229頁）根據下列反應圖表之一，詳細說明一種 用於解析爲對映異構純型之3 -胺基一 4 -戊炔酸乙酯的 (R )和（S )對映異構體的方法： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -5- 1252869 Α7 Β7 五、發明説明（3

R=TMS 或 Η 青黴素G醯胺水解酶 磷酸鹽緩衝液

+苯乙酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 起始之苯乙醯胺可經由將相對應之胺與苯乙酸，或其它物 質反應，以將胺醯化來取得， 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -6- 1252869 A7 B7 五 、發明説明（4 〇 〇

外消旋型之胺 青黴素G醯胺水解酶 苯乙酸 0 、0〆 \^Μθ3 + 0

⑸異構物 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (R)異構物 專利申請案W〇 9 8 / 5 0 5 7 5根據下列反應圖 表更詳細地說明手性Θ -胺基酸之製備方法，其包含根據 下列反應圖表，將該胺基酸之外消旋混合物與一醯基供給 者及青黴素G醯酶（或醯胺水解酶）在適合用來立體選擇 性地將該/3 -胺基酸之外消旋混合物的對映異構體之一酷 化成其相對應之N -醯化的衍生物之條件下進行接觸，所 得之相對的/3 -胺基酸對映異構體爲對映異構上增濃型： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） -7- 12528 69 A7 B7 五 發明説明（5 0

OR〇 醯基供給者 有機或水性溶劑 青黴素G醯酶 + 〇

來自糖類或類固醇類之所討論的”釀基供給者”爲下列通 式所示者： 〇

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其中R3係選自下列群體：苯基、苯氧基、胺基、不同的苯 基衍生物及吡啶«，且R 4係選自下列取代基：經基、院基 、烷氧基、烯基、快基、齒丨完基、芳基、芳丨完基°

專利申請案 W 〇 9 8 / 5 0 5 7 5 » T S JS 圖表說明另一 _替代之手性/5 -胺基酸的製備方法，其包 含將一外消旋型之醯胺，在適合選擇性地將該外消旋型釀 胺的對映異構體之一脫醯成其相對應之万—胺基酸的條件 下，與一醯基供給者和青黴素G醯酶（或醯胺水解酶）接 觸，所得之相對的Θ 一胺基酸對映異構體爲對映異構上增 濃型： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -8 - 1252869 Α7 Β7 五、發明説明（6 0 〇

青黴素G醯酶 0R2 有機或水性溶劑

〇

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ο 0

經濟部智慈財產局資工消費合作社印製 然而，上述所討論之經由中間體醯胺所進行之方法， 在進行酶催化步驟之前或進行酶催化之同時會顯示出重大 缺點，該醯胺所具之化學式可摘要如下ί 芳香核， 宜爲苯基 這類醯胺由於有芳香核存在，因此不溶於水性介質中 ，此種情況會具有些缺點。例如：已知某些酶可溶在水性 介質中，且通常對有機溶劑之存在很敏感。然而，爲了能 讓酶催化反應之產量最優化，受質具有相對於酶而言可稱 得上良好之溶解度是很重要的，如此才能使受質和酶能有 緊密的接觸。 本發明所要解決的問題主要爲此缺點。實際上，根據 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -9 * 1252869 Α7 Β7 五、發明説明（7 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 胃1點，本發明係關於用來分離胺基酸對映異構體的新穎 力法，其包含以戊二酸酐來處理該胺基酸，然後以戊二醯 基一7 - A C A醯酶處理之，以回收該胺基酸之其中一種 胃映異構體，而另一種對映異構體則維持在相對應之戊二 醯胺衍生物的型式。 本方法特別有利的爲：由於其使用戊二酸酐因而在進 行中間可經由相當於起始胺基酸之戊二醯胺衍生物來進行 ，該戊二醯官能基賦予該分子在水性介質中溶解的能力。 因此，本發明之方法可在溫和的反應條件下及水性介質中 進行；也就是，不需使用有機溶劑。 本發明之方法亦具有可大致應用至所有型式之胺基酸 (α， β , r，等）的優點。在本發明的內容中，”胺基 酸” 一詞不僅包含這類之胺基酸（也就是，具胺基官能和 酸官能一 C〇〇Η之化合物），亦包括相對應之酯衍生物 (也就是，該酸官能基被酯官能基C〇〇R所取代之化合 物）。較合適的爲，本發明方法特定應用在通式（1 )所 示之胺基酸：

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其中 —η係選自〇， 1， 2， 3， 4， 5或6之整數， - R代表氫原子，或烷基、鏈烯基、炔基、環烷基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ 297公釐） -10- 1252869 A7 -----——--____ 五、發明説明（8 ) 、芳基、縮合之多環烴、或雜環，這些基全部可被任意取 代， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 且R 代表院基，鏈烯基，炔基，環烷基，芳基 ，縮合之多烴，雑環，或是經下列群體所取代之氧基、 硫基、亞砸或礦基、院基、芳基、環烷基或雜環基，還有 ，所有這些基可被任意地取代。 圖形之簡單說明 第1圖：圖表所表示的爲根據本發明，以戊二酸酐處 理通式（I )之胺基酸的第1步驟，以及以戊二醯基一 7 - A c A醯酶來處理的第二步驟。所得之各產物的構型， 也就是一方面爲胺基酸，另一方面爲戊二醯胺衍生物之構 型係根據R ’基之性質而定。 第2圖：圖表所表示的爲經由水解將手性戊二醯胺衍 生物轉化成其相對應之手性胺基酸的步驟。 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 當胺基酸爲通式（I )所示者時，本發明之方法可以 第1圖之反應圖表來表示。此圖表表示出以戊二酸酐處理 的第1步驟，及以戊二醯基-7 - A C A醯酶處理的第2 步驟。所得之各產物的構型。也就是一方面爲胺基酸，另 一方面爲戊二醯胺衍生物之構型係根據R ’基的性質而定 〇 在本發明的內容中，烷基，鏈烯基和炔基通常含有1 至3 0個碳原子，且爲直鏈型或側鏈型，但其並不受限於 此。此點亦適用於當這些基爲其它基之取代基的情況中。 本紙^^適^"中國國家標準（CNS ) A4規格（2「〇Χ 297公~~~ " -11 - 1252869 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（9 ) 較合適的爲，這些基含有直鏈型或側鏈型之1至2 0個碳 原子，更合適的爲含有直鏈型或側鏈型之1至1 0個碳原 子。該烷基可選自，如：甲基、乙基、正-丙基、正-丁 基、正一戊基、正-己基、正-庚基、正-辛基、正-壬 基、正-癸基、正-十一院基、正-十二焼基、正-十三 烷基、正-十五烷基、正-十六烷基、正-十七烷基、正 一十八烷基、2， 3， 5-三甲基己基，第二一己基，及 異己基。該烯基可選自，如：乙烯基，1 -丙烯基、烯丙 基、丁燒基、2 —甲基一 1—丙嫌基、2 —甲基一 2 —丙 烯基、或3-甲基一2-丁烯基。該炔基可選自，如：乙 炔基，1 -丙炔基或炔丙基。 本發明的內容中，該環烷基通常含有3至12個碳原 子。其宜選自如下群體：環丙基、環丁基、環戊基、環己 基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸基、環十一烷基、和 環十二烷基。根據本發明另一方面，該環烷基可爲多環型 。較佳的爲，這些基係選自雙環烷基或三環烷基類。 根據本發明，”芳基”一詞係指單價芳香烴基。在芳 基之中，較佳的爲經任意取代的苯基。 在本發明的內容中，縮合之多環烴宜指選自如下群體 之基：茂签、茚、萘、奠、黃各、伸聯苯基、茚革、s — 茚革、苊烯萘、苐、葩、菲、蒽、苐蒽、苊烯菲、苊烯蒽 、三亞苯、襄、窟、萘革、$、茜、笸、五芬、五革、四 亞苯、六芬、六革、荼、苛、聯三萘、七芬、八革、苒或 莪。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -12 ~ 1252869 A7 -—______B7 五、發明説明（1〇 ) & 在本發明的內容中，”雜環”一詞係指含有一或多個 木隹原子之單環或稠合之多環化合物，各環係由3至丨〇員 所組成。根據本發明之雜環宜在該由3至1 〇員所形成之 環中含有1至3個選自如下群體之雜原子：氧、硫及氮。 本發明之雜環宜選自下列群體：噻吩、苯幷〔b〕噻吩、 奈并〔2， 3 - b〕噻吩、噻嗯、呋喃、2 H _吡喃、異 苯并呋喃，2 Η —晛烯、v山、啡鳄噻、2 Η —吡咯、吡咯 、咪唑、吡唑、吡啶、吡畊、嘧啶、嗒啡、吲畊、異吲噪 、3 Η —吲D朵、D引[I朵、1 Η — D引哇、嘌Β令、4 Η — D奎哄、 異唑啉、喹啉、呔畊、1，8 -嘹啶、喹喏啉、鸣唑啉、 哮啉、蝶啶、4 a Η -肼甲醯 '肼甲醯、$ 一咔啉、啡啶 、吖啶、咕啶、1，7 —啡啉、啡哄、啡呻畊、異噻唑、 啡噻哄、異nf唑、呋咕、啡噚畊、異睨、吡咯啶、△ 2 一 吡咯啉、咪唑啶、△ 2 -咪唑啉、吡唑啶、△ 3 -吡唑啉 、N -六氫吡啶、六氫吡d井、吲哚啉、異吲哚、喂啶和嗎 福啉。 在本發明的內容中，當如上述定義之不同基團被取代 時，該取代基通常係根據基團之性質而選自如下群體··鹵 素原子、方基、雑fe、經基、院氧基、芳氧基、硫赶、院 硫基、芳硫基、院基亞硕、芳基亞硕、院磺基、芳碌基、 氰基、硝基、磺醯脘、烷磺醯胺和芳磺醯胺基團。較合適 的爲，上述定義之不同基團被取代1，2或3次。根據較 佳的部分，該_素原子係選自氯、氟、溴和碘。當院基係 被鹵原子所取代代時，該所討論之原子宜爲氟原子。氟取 本i張尺度適用中國國家標率（ CNS ) A4規格（210x 297公釐） " 一 -13- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-'口 f 經濟部智慈財4局員工消費合作社印製 1252869 A7 B7 五、發明説明（11 ) 代基之數目宜爲1，2， 3，4， 5， 6或7。例如：所 討論之基團可爲三氟甲基。 本發明之胺基酸宜選自通式（I )所示之化合物，其 中η係選自0， 1， 2， 3之整數，R代表一氫原子或院 基或芳基，且R’如上述之定義。 更合適的爲，本發明之胺基酸宜選自通式（I )所示 之化合物，其中η係相等於〇， 1或2之整數，R代表氫 原子，或烷基官能基，且R ’係選自經任意取代之雜環或 芳基。在後項情況中，該芳基及/或雜環基宜經取代1， 2或3次。 戊二醯基—7 — A C Α醯酶已做爲許多工業方法中的 催化劑，尤其是用來水解/3 -內醯胺，如：N -戊二醯基 - 7 -胺醋酸基頭孢菌素酸。其可根據本領域中技術熟習 人士（酶的專家）所熟知之技術，從許多微生物中衍生出 來，如：從不動桿菌屬、節桿菌屬、桿菌屬、假單胞菌屬 、狹窄滋養單胞菌（Stenotrophomonas)或其它黃單胞桿菌 屬中衍生出來。該戊二醯基- 7 - A C A醯酶亦可從，如 :羅氏診斷公司（羅氏分子生化公司，慕尼黑史丹渥弗史 特斯1 1 6，D — 6 8 3 0 5 )購得，或另外從雷可達提 S . p . A.公司（S t a b i 1 i m e n t 〇 d i 〇 p e r a，V i a L a m b r 〇 3 8，I - 2 0 〇 9 〇 Opera (MI))購得。 戊二醯基-7- ACA醯酶可以不同型式來使用，而 不需改良其立體特異性及其立體選擇性。例如，戊二醯基 一 7 - A C A醯酶可以可溶的或固定的型式來使用。在第 本紙張尺度適用1¾家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐"1 ~~^ -14- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣 P. 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 1252869 Α7 ____ Β7 五、發明説明（12 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 二種情況中，該酶通常係根據本領域中技術熟習人士所熟 知之技術來固定。例如：該酶可包含在聚合體凝膠中，或 藉由共價鍵結、交叉連接、吸附或裝入膠囊中來附著至固 體支撐物上。常用之合適的支撐物爲，如：多孔玻璃、多 孔陶器、合成的聚合物（如：聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚乙 燃、聚醯胺或聚丙烯醯胺），或天然來源之聚合物（如： 纖維素）。 透過利用戊二醯基一7-ACA醯酶，可取得具高對 映異構體過量之各對映異構體，尤其是具高於或等於約 9 0%之e e，或甚至是具高於或等於約9 5%，且宜高 於或等於約9 9 %之e e 。在本發明的內容中，”對映異 構體過量”係指對映異構體的其中之一相對於該外消旋混 合物的％過量。更具體地說，對映異構體過量係依下式來 計算= ee(%)=100= 0/° ⑻ 一％(s) 經濟部智慧財產局a(工消費合作社印製 其中〔R〕和〔S〕分別代表（R )和（S )對映異構體 的濃度。 一般而言，所使用之酶量相對於起始胺基酸（受質） 的全部量係介於1和1 0 0單位/莫耳受質間，且宜介於 約1 0和4 〇單位/莫耳受質間。丨單位酶相當於在本領 域之技術熟習人士所熟知的標準P Η値和溫度下，每分鐘 司水解1毫莫耳之Ν 一戊二醯基一 7 一胺醋酸基頭孢 本紙張尺度適用巾® H家標準（CNS) A4規格（21QX 297公麓） -15 - 1252869 A7 __ 五、發明説明（13 ) 酸的酶量。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據本發明，該反應係在一經任意緩衝的水性介質中 進行。在此情況中，該濃度爲介於約1 0 m Μ和2 0 0 m Μ之間的水性緩衝液可選自如下群體：可在介於約5和 6 . 5之間之ρ Η値下使用之醋酸鹽緩衝液，或可在介於 約6 · 5和8間之ρ Η値下使用的磷酸鹽緩衝液，或可在 介於約8和9間之ρ Η値下使用的焦磷酸鹽緩衝液。 因此，本發明之方法可在其中該ρ Η受到偵察並調整 爲介於約6和9之間的介質中進行。在一種體系中，該反 應介質受到偵察並特定調整爲介於約7 · 5和8 . 5之間 ，而在另一種體系中，其ρ Η値約介於8和8 · 5之間。 該Ρ Η値可藉由ρ Η測量器之輔助來偵察，其可藉由加入 酸，如：氫氯酸、硫酸或磷酸，及鹼，如：氫氧化鈉、氫 氧化鉀或水性氨來進行。 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 根據本發明，以戊二酸酐來處理胺基酸之步驟可在介 於2 0 °C和4 0 °C間之溫度下進行，一般係在介於約2 5 °C和3 5 °C之間。再者，使用戊二醯基一 7 - A C A醯酶 之弟一^步驟可在介於約1 0 °C和5 0 C間進行，一*般係在 約2 5 °C和3 5 t間進行。 最後，反應時間大約是在介於約1和1 〇 〇小時變化 ，其主要係根據相關之胺基酸和酶濃度而定。一般而言， 只要有需要，此反應可繼續進行以取得具令人滿意之對映 異構II過量的所需對映異構體。所得之手性胺基酸的量及 對映異構體過量値係利用本領域之技術熟習人士所熟知的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -16- 1252869 A7 B7 五、發明説明（14 ) 傳統技術來偵察。較有利的爲，利用Η p l C (高效能液 態色層分析法）來進行偵察。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據本發明，經由上述方法所得之（R )和（S )對 映異構體可以很容易地將其分開，這是由於其中一種係以 可溶於水性介質中之胺的型式存在，而另一種係以固態胺 的形式存在。因此，本發明的另一方面係關於上述所列之 包含後續之分離（R )和（S )對映異構體步驟的方法。 該（R )和（S )對映異構體之分離步驟可以很容易 地經由本領域中之技術熟習人士所已知的傳統技術來進行 。也就是藉由如··過濾、萃取、色層分析或結晶化作用來 完成。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 當欲將另一對映異構體以胺基酸型式分離出，而非以 戊一醯妝衍生物型式分離出時，該已根據上述方法分離出 之戊二醯胺衍生物的對映異構體需再進行水解，以將相對 應之胺基酸以對映異構型來回收。需注意的是，由於水解 可保持所使用之化合物的立體化學，且不會導致手性戊二 醯胺衍生物的外消旋作用，因此本方法爲一種方便的方法 。其中該胺基酸爲通式（I )所示者，此額外步驟可藉由 根據第2圖之反應圖表來表示。 該水解作用係根據本領域之技術熟習人士所已知之傳 統技術來進行。所討論之水解作用特指酸性或鹼性水解作 用。在後者之情況中，其可在如：氫氧化鈉之類的鹼之存 在下，於介於約5 0 °C和9 0 °C間之溫度和大氣壓力下進 丫丁。然而，任何其匕可適用，且本領域之技術熟習人士所 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -17- 1252869 A7 B7 五、發明说明（15 ) 已知的操作條件亦可使用。 由於本發明可讓胺基酸以外消旋型來解析，因而其可 用來取得該胺基酸之一或另一種對映異構體，尤其是，該 對映異構體可構成合成作用中間體。 舉例說明，本發明可取得（S ) - 3 —胺s _ 3 —苯 丙酸，其構成下列通式所示之化合物的合成方法中的中間 體： 〇 Η 0

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其尤其爲牽涉到氣喘疾病的V L A 4受體拮抗齊j。. 除了前述各項外，本發明亦包含下列竇例中所顯現之 特性及益處，這些實例僅說明本發明，而非限制其範圍。 實施例 實施例1 :外消旋混合物型之3 -胺基一 3 -（ 4，—硝 苯基）苯酸的解析 a )外消性3 -胺基一 3 -（ 4 ’ 一硝苯基）丙酸的醯 化 將4 0 . 6克外消旋性3 -胺基一 3 4 ’ —硝苯 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210x 297公f) -18- 1252869 A7 B7 五、發明説明（16) 基）丙酸溶於2 0 0毫升蒸餾水和5 5毫升三乙胺中。將 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 9 . 4克戊二酸酐一小部分，一小部分的加入其中，並 將反應混合物攬拌1小時。然後，以8 _ 2毫升之9 5 % (重量/體積）硫酸來酸化反應混合物。將由此所得之沈 澱物濾出，以1 5毫升蒸餾水淸洗三次，再於5 5 °C，真 空下將其乾燥至固定重量。如此可得5 2 · 8 4克之外消 旋性3 —(戊—^醯胺）一 3 — ( 4 ’ —硝苯基）丙酸。藉 Η P L C (高效能液體色層分析法）來測定產物的性質。 b )利用在懸浮液中之結晶型戊二醯基一 7 - A C Α醯酶 進行之酶催化的脫醯作用（1 0 0毫升反應劑） 將在前述步驟中所得之2 0克酸溶於7 5毫升蒸餾水 中。藉由加入1 1 · 2毫升30% (重量/體積）氫氧化 鈉來將懸浮液之P Η値調整爲8 . 2。將8 2 6毫克（ 6 2 6單位）結晶型戊二醯基一 7 - A C Α醯酶懸浮液加 入溶液中。在3 5 °C，及介於7 · 9和8 . 1間之p Η下 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，將反應混合物攪拌5 1小時。反應終止時，將反應混合 物冷卻至2 0 °C，並藉由加入5 Ν氫氯酸來將ρ Η値調整 爲7 · 0。然後，加入2 0毫升乙醇。將所產生之（R ) 一 3 -胺基一 3 ( 4 ’ 一硝苯基）丙酸沈澱物濾出，以 3 0毫升乙醇淸洗3次，並在4 5 °C，真空下將其乾燥至 固定重量。如此，可產生5 · 6 5克（R ) - 3 -胺基一 3 -（ 4 ’ 一硝苯基）丙酸，其對映異構體過量超過9 9 % 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19- 1252869 Α7 Β7 五、發明説明（17) 以1 7 · 5毫升氫氯酸來酸化母液。將所形成之沈澱 物濾出，並以1 0毫升蒸餾水淸洗二次。將所得之濾物餅 在4 5 °C，真空下乾燥至固定重量。如此，可產生 8 .25 克之（S)— 3 —(戊二醯胺）—3 — (4，— 硝苯基）丙酸及（R) - 3 -（戊二醯胺）一 3 -（4’ 一硝苯基）丙酸，其比例爲9 1 : 9。以Η P L C來測定 所得產物之性質。 c )利用從羅氏診斷公司取得之固定的戊二醯基- 7 — A C Α醯酶進行的酶催化之脫醯作用（1 0 0毫升反應劑 ) 將在步驟a )中所取得之2 0 . 5克酸溶於7 5毫升 蒸餾水中。藉由加入1 1 . 9毫升之3 0% (重量/體積 )氫氧化鈉來將懸浮液之P Η値調整爲8 · 2。將6 · 2 克（6 3 2 · 4單位）之經固定的濕戊二醯基—7 -ACA醯酶（羅氏診斷公司）加入此溶液中。在3 5 °C下 ，將反應混合物攪拌1 8小時，且其p Η値係受到監控並 經調整在介於7 . 9和8 · 1之間。在反應終止時，藉由 加入3 0 % (重量/體積）氫氧化鈉來將反應混合物之 Ρ Η値調爲9 · 5，且將反應混合物之體積調爲2 0 0毫 升，以溶解所產生之（r ) — 3 —胺基一 3 -（ 4 ’ 一硝 苯基）丙酸。藉由過濾來移除固定的酶，並藉由加入5 Ν 氫氯酸來將母液之ρ Η調爲7 · 0。然後，將5 0毫升之 乙醇加入反應混合物中。將沈澱的（R ) - 3 -胺基一 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) τ Ρ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -20- 1252869 Α7 Β7 五、發明説明（18) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 （4 ’ 一硝苯基）丙酸濾出，以1 0毫升乙醇淸洗之， 並在4 5 °C，真空下乾燥至固定的重量。如此，可產生 5 .375 克（R)— 3 —胺基一 3 — (4’ 一硝苯基） -丙酸，其對映異構體過量等於98%。 以2 0毫升5 N氫氯酸將母液酸化。將所形成之沈澱 物濾出並以1 5毫升蒸餾水淸洗二次。在4 5 °C，真空下 ，將濾物餅乾燥至固定重量。如此可產生6克之（S ) - 3 -（戊二醯胺）一 3 — ( 4 ’ —硝苯基）丙酸和（R ) 一 3 -（戊二醯胺）—3 -（ 4 ’ 一硝苯基）丙酸，比例 爲 9 4 : 6 〇 藉Η P L C來測定所得產物之性質。 d )利用在懸浮液中之結晶型戊二醯基—7 - A C Α醯酶 進行的酶催化之脫醯作用（5 0 0毫升反應劑） 將1 0 0克在步驟a )中所取得之外消旋性3 -（戊 二醯胺）一 3 -（ 4 ’ 一硝苯基）丙酸溶於4 0 0毫升蒸 餾水中。藉由加入6 0毫升3 0 % (重量/體積）氫氧化 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 鈉來將懸浮液之p Η値調整爲8 · 2。將6 . 4毫克（ 4 6 5 3單位）結晶型戊二醯基一 7 - A C Α醯酶之懸浮 液加入此溶液中。將反應混合物在3 5 °C，及受監控且調 整爲介於7 . 9和8 . 1間之P Η値下攪拌3 0小時。在 反應終止時，將反應混合物冷卻至2 0 °C，且藉由加入 2 5毫升3 0 % (重量/體積）氫氧化鈉來將ρ η調整爲 1 3，以溶解所形成之（R ) — 3 —胺基—3 — ( 4 ’ — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -21 - 1252869 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（19 ) 硝苯基）丙酸。將不溶之顆粒濾出，並藉由加入2 7毫升 之3 6 %氫氯酸來將母液之P Η値調整爲7 · 0。然後， 將1 0 0毫升乙醇加入反應混合物中。將所取得之（R ) 一 3 —胺基一 3 -（ 4 ’ 一硝苯基）丙酸的沈澱物濾出， 以1 0 0毫升乙醇淸洗二次，並在4 5 °C，真空下，乾燥 至固定重量。如此可產生28·87克（R)-3-胺基 一 3 -（ 4 ’ 一硝苯基）丙酸，其對映異構體過量等於 9 7%。 藉Η P L C來測定所得產物之性質。 實施例2 :外消旋混合物型式之3 -胺基-3 -苯丙酸的 解析 a )外消旋性3 -胺基一 3 -苯丙酸的醯化 將4 8 8克之外消旋性3 -胺基一 3 -苯丙酸溶於2 升之蒸餾水中，其中含有2 3 6克小九型式之氫氧化鈉。 在2 5 °C下，於1小時的期間內，將4 3 7 · 5克之戊二 酸酐一小部分、一小部分地加入反應混合物中，並一邊攪 拌之。1小時後，以2 3 6毫升9 5 % (重量/體積）硫 酸來酸化該反應混合物，並將其冷卻至1 0 t。將由此形 成之沈澱物濾出，並以6 0 0毫升之蒸餾水淸洗3次。由 此取得之濕濾物餅重爲1 6 1 0克，其內含有6 0 2克外 消旋性3 -戊二醯胺一 3 -苯丙酸。藉Η P L C來測定所 得之產物的性質。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -22- 1252869 Α7 Β7 五、發明説明（2〇 ) b )利用懸浮液中之結晶型戊二醯基- 7 — A C A醯酶進 行的酶催化之脫醯作用（5升反應劑） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將先前取得之含5 8 9克外消旋性3 -戊二醯胺- 3 一苯丙酸的1 5 7 5克，濕濾物餅溶於1 6 1 0毫升蒸倉留 水中。藉由加入4 4 0毫升3 0% (重量/體積）氫氧化 鈉來將懸浮液之P Η値調爲8 · 0。將5 2 · 6克（ 3 2 0 0 0單位）結晶型戊二醯一 7 - A C Α醯酶之懸浮 液加入此溶液中。在3 5 °C下，將反應混合物攪拌4 1小 時，且監測其P Η値，並將其調整爲介於7 . 9和8 · 1 間。在反應終止時，將反應混合物冷卻至2 0 °C，並藉由 加入2 5毫升3 0 % (重量/體積）氫氧化鈉來將p Η値 調爲1 3，以溶解所產生之（R ) - 3 -胺基一 3 —( 4 ’ 一硝苯基）丙酸。濾出不溶的顆粒，並藉由加入2 7 毫升3 6%氫氯酸來將母液之pH値調整爲7 . 0。 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 將所產生之（R ) - 3 -胺基- 3 -苯丙酸的沈澱物 濾出，以1 5 0毫升蒸餾水淸洗，並在4 5 °C，真空下將 其乾燥至固定重量。如此可產生9 6 · 9克（R) - 3 -胺基一3-苯丙酸，其對映異構體過量相等於98%。 以1 8 0毫升9 5 % (重量/體積）硫酸來酸化母液 。將所形成之沈澱物濾出，並以4 0 〇毫升冷卻之蒸|留水 淸洗二次。在4 5 °C、真空下，將濾物餅乾燥至固定重量 。如此可產生3 14 · 6克（S) — 3 -（戊二釀胺）— 3 -苯丙酸和（R) - 3 -（戊二醯胺）一 3 -苯丙酸， 其比例爲9 0 : 1 0。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )~ϋ格（210X 297公釐） -23- 1252869 A7 _____ B7_____ 五、發明説明（21 ) 藉Η P L C來測定所得產物之性質。 c )藉鹼性水解進行之（S ) - 3 -戊二醯胺一 3 一苯丙 酸的脫醯作用 將在前述步驟中所得之557 · 2克含（S) — 3 -戊二醯胺一 3 -苯丙酸和（R) — 3 -戊二醯胺一 3 一苯 丙酸（比例爲9 0 : 1 0 )的混合物在3 , 9 1升蒸餾水 和1 . 6 5升3 0% (重量/體積）氫氧化鈉中蒸餾。將 反應混合物在7 0 °C下攪拌4天。 然後，將反應混合物冷卻至1 5 °C。藉由加入 3 · 2 1升3 7% (重量/體積）氫氯酸來將PH値調整 爲6 · 9以沈澱所得產物，過濾之，並將其在4 5 °C，真 空下乾燥至固定重量。如此，可產生2 0 2 · 4克（3) 一 3—胺基一 3 —苯丙酸和（R) — 3 -胺基一 3 —苯丙 酸，其對映異構體過量大於9 8 %。 藉Η P L C來測定所得產物之性質。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -24-

Claims (1)

125 A ]pt A8 B8 C8 D8 申請專利範圍1 種用於分離胺基酸之對映異構體的方法，其包 含： 以戊二酸酐處理胺基酸之外消旋混合物，以形成該對 映異構體之戊二醯胺化合物；及 以i： 醯基- 7 - A C A醯酶處理該對映異構體之戊 二醯胺化合物，以回收一種該胺基酸之對映異構體，而另 一種對映異構體則維持爲戊二醯胺化合物的型式。 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該胺基酸具 式（I ) nh2 .COOR (I) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) FT 、(CH2)n〆 其中 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 —η係選自0，1， 2， 3， 4， 5和6之整數， - R代表氫原子或選自下列群體之經任意取代之基 :烷基、鏈烯、炔、環烷基、芳基、縮合之多環烴、及雜 XiES. 土拉， - 而R ’代表選自下列群體之經任意取代的基·院 基、鏈烯、炔、環烷基、芳基、縮合之多環烴、及雜環’ 或被選自下列群體之經任意取代之基所取代的氧基、硫基 、亞硕或磺基：院基、芳基、環院基和雜環基。 3 .如申請專利範圍第2項之方法，其中n係選自0 ，1，2和3之整數，且R代表氫原子、烷基或方基。 4 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中n係相等於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X29^^7 -25- 1252869 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍2 0， 1或2之整數，11代表氫原子或烷基，且R，係選自 經任意取代之雜環和芳基。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該戊二_ _ 7-ACA醯酶爲可溶型式。 6 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該戊二釀_ 7-ACA醯酶爲固定型式。 7 .如申請專利範圍第1項之方法，其中所使用之酶 量相對於起始胺基酸受質之全部量爲每毫莫耳起^ 2 s 酸受質使用介於約1和1 0 0單位間之酶。 8 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中所彳吏_ 量相對於起始胺基酸受質之全部量爲每毫莫耳@ 2 K s 酸受質使用介於約1和1 0 0單位間之酶。 9 .如申請專利範圍第1項之方法，其中§亥_ if {系# 一經緩衝之水性介質中進行。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 〇 ·如申請專利範圍第9項之方法，其φ胃 之水性介質包含一濃度爲介於約1 0 m Μ和2 ^ ^ m Μ胃 之水性緩衝液，且係選自如下群體：在介於_ 5 _ 6 _ 5 間之Ρ Η値下使用的醋酸鹽緩衝液，在介於，約6 5和8 間之Ρ Η値下使用的磷酸鹽緩衝液，及在介& ,約8和9間 之p Η値下使用的焦磷酸鹽緩衝液。 1 1 .如申請專利範圍第1項之方法，外消旋 混合物之Ρ Η受偵察，且經調整爲介於約6和9 ;^胃。 ；[2 ·如申請專利範圍第1項之方法，_ ψ » $二_ 酐對胺基酸進行之處理係在介於約2 0 °C和4 〇間之溫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- 1252869 A8 B8 C8 D8 TT、申凊專利範圍3 度下進行。 1 3 .如申請專利範圍第1項之方法，其中以戊二醯 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 7 — A C Α醯酶進行之處理係在介於約1 〇 °C和5 0 °C 間之溫度下進行。 1 4 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該處理持 續約1至；L 〇 〇小時。 1 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，還包含分離（ R )和（S )對映異構體。 1 6 ·如申請專利範圍第1 5項之方法，其中C R ) 和（S )對映異構體之分離係藉由過濾、萃取、色層分析 或結晶化作用來進行。 1 7 .如申請專利範圍第1 5項之方法，其中將該維 持在戊二醯胺化合物之型式中的分離出之對映異構體加以 水解，以回收爲對映異構體型式之相對應的胺基酸。 1 8 .如申請專利範圍第1 6項之方法，其中將該維 持在戊二醯胺化合物之型式中的分離出之對映異構體加以 水解，以回收爲對映異構體型式之相對應的胺基酸。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 9 · 一種用來分離胺基酸之對映異構體的方法，其 包含： 以戊二酸酐處理胺基酸之外消旋混合物，以形成該對 映異構體之戊二醯胺化合物； 以戊二醯基- 7 - A C A醯酶處理該對映異構體之戊 二醯胺化合物，以回收一種該胺基酸之對映異構體，而另 一種對映異構體則維持爲戊二醯胺化合物的型式；並 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27- 1252869 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍4 然後，將該二種對映異構體分開。 2 0 . —種用來分離胺基酸之對映異構體的方法，其 包含： 以戊二酸酐處理胺基酸之外消旋混合物，以形成該對 映異構體之戊二醯胺化合物； 以戊二醯基- 7 - A C A醯酶處理該對映異構體之戊 二醯胺化合物，以回收一種該胺基酸之對映異構體，而另 一種對映異構體則維持爲戊二醯胺化合物的型式； 然後，將該二種對映異構體分開；並 將維持在戊二醯胺型式中之對映異構體水解以回收爲 對映異構型式之相對應的胺基酸。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐）