PT1427840E

PT1427840E - Processo enzimático para a resolução enantiomérica de aminoácidos

Info

Publication number: PT1427840E
Application number: PT02774892T
Authority: PT
Inventors: Christophe Salagnad; Claude Gobert; Marie-Odile Dury
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2007-01-31
Also published as: ZA200401226B; YU16904A; ATE341641T1; HUP0401340A3; TWI252869B; KR100924241B1; BR0212272A; FR2829152B1; EA009322B1; WO2003020943A3; EP1427840B1; KR20040044542A; EA200400395A1; HUP0401340A2; ES2272779T3; DE60215206T2; CA2459246A1; JP4222939B2; EP1427840A2; CY1105864T1

Description

DESCRIÇÃO

"PROCESSO ENZIMÁTICO PARA A RESOLUÇÃO ENANTIOMÉRICA DE AMINOÁCIDOS" A presente invenção refere-se a um novo processo enzimático que permite a resolução enantiomérica de aminoácidos sob a forma de mistura racémica.

Os aminoácidos são, frequentemente, utilizados em toda a espécie de indústrias, por exemplo, ou como compostos biologicamente activos ou como intermediários de síntese para a preparação de compostos para as áreas, nomeadamente, farmacêutica, química ou agrícola. Assim, revela-se rapidamente a frequente necessidade de se poder dispor de um ou de outro enantiómero opticamente activo desses aminoácidos. Por conseguinte, foram preparadas várias vias de separação dos enantiómeros de aminoácidos pró-quirais. Em particular, os processos enzimáticos que permitem a sua resolução enantiomérica revelaram ser uma alternativa interessante às abordagens de sínteses assimétricas.

Assim, Soloshonok et al. (Tetrahedron: Assymetry, Vol. 6(7), 1995, pp. 1601-1610) aplicaram um processo enzimático de resolução enantiomérica de aminoácidos β de acordo com o seguinte esquema reaccional: 1 R.

COOH água/acetona (1/1) trietilamina R.

HN NHL, cloreto de fenilacetilo -5 °C; 2 horas

COOH

Penicilina acilase 22-25 °C, pH = 7,5 "

Κνγ^ΟΟΟΗ nh2

De um modo análogo, Topgi et al. (Bioorg. & Med. Chem. 1999, Vol. 7, pp. 2221-2229) elaboraram um processo de resolução dos enantiómeros (R) e (S) do 3-amino-4-pentinoato de etilo, sob a forma enantiomericamente pura, de acordo com um dos seguintes esquemas reaccionais:

Penicilina G amido-hidrolase tampão fosfato

sendo a fenilacetamida de partida obtida por acilação da amina correspondente por acção do ácido fenilacético, ou então: 2 ο

HjN

amina sob a forma racémica SiMe.

Penicilina G amido-hidrolase ácido fenilacético

SiMe, SiMe. isómero (R) isómero (S) O pedido de patente WO 98/50575 descreve, de um modo mais geral, um método de preparação de um aminoácido β quiral que compreende o contacto de uma mistura racémica do referido aminoácido com um dador de acilo e a enzima Penicilina G acilase (ou amido-hidrolase), em condições apropriadas para acilar, de um modo estereosselectivo, um dos enantiómeros da mistura racémica do aminoácido β no seu derivado N-acilado correspondente, obtendo-se o enantiómero oposto do aminoácido β sob uma forma enantiomericamente enriquecida, de acordo com o seguinte esquema reaccional:

O O

O

+ sendo o "dador de acilo" em questão de fórmula geral: 3 ο r.

no qual R3 é seleccionado de entre fenilo, fenoxilo, amino, vários derivados do fenilo e piridilo e R4 é seleccionado de entre os substituintes hidroxilo, alcoxilo, alquilo, alcenilo, alcinilo, halogenoalquilo, anilo, anilalquilo, os açúcares ou os esteróides. O pedido de patente WO 98/50575 também descreve uma outra alternativa para a preparação de um aminoácido β quiral que compreende o contacto de uma amida, sob a forma racémica, com a enzima Penicilina G acilase em condições apropriadas para desacilar, de um modo selectivo, um dos enantiómeros da amida sob a forma racémica no seu aminoácido β correspondente, obtendo-se o enantiómero oposto da amida sob uma forma enantiomericamente enriquecida, de acordo com o seguinte esquema reaccional:

O

0¾ solventes orgânicos ou aquosos

O

penicilina G acilase

O

+ anteriormente discutidos de passar, antes ou em

No entanto, os processos apresentam o grande inconveniente 4 simultâneo ao passo enzimático como tal, por uma amida intermediária cuja fórmula se pode resumir do seguinte modo:

O Núcleo aromático, de um modo preferido fenilo

H

Uma tal amida é insolúvel em meio aquoso devido à presença do núcleo aromático, o que apresenta inconvenientes. Por exemplo, sabe-se que determinadas enzimas são solúveis em meio aquoso e são, frequentemente, sensíveis à presença de solventes orgânicos. Porém, para que o rendimento da reacção enzimática possa ser optimizado, é importante que exista uma boa solubilidade do substrato em relação à enzima, de modo a que possam estar em contacto íntimo. É principalmente este inconveniente que a presente invenção se propõe resolver. De facto, a presente invenção refere-se, de acordo com um primeiro aspecto, a um novo processo de separação dos enantiómeros de um aminoácido que consiste em tratar uma mistura racémica do referido aminoácido com anidrido glutárico e, então, com a enzima glutaril-7-ACA acilase de modo a recuperar-se um dos enantiómeros do referido aminoácido, sendo que o outro enantiómero permanece sob a forma de derivado da glutarilamida correspondente.

Este processo é particularmente vantajoso uma vez que a utilização de anidrido glutárico permite passar, de um modo intermediário, por um derivado da glutarilamida correspondente ao aminoácido de partida, a função glutarilo conferindo à 5 molécula a sua solubilidade em meio aquoso. Daí resulta que o processo, de acordo com a presente invenção, pode ser realizado em condições reaccionais suaves e em meio aquoso, ou seja, em particular, sem a utilização de um co-solvente orgânico. 0 processo, de acordo com a presente invenção, também tem a vantagem de se aplicar, de um modo geral, a todas as formas de aminoácidos (α, β, γ...). No sentido da presente invenção, agrupa-se, sob o termo genérico «aminoácido», tanto os aminoácidos como tal (a saber, os compostos que têm uma função amino e uma função ácido -COOH) como os derivados ésteres correspondentes (a saber, os compostos para os quais a função ácido está substituída por uma função éster COOR) . De um modo preferido, o processo de acordo com a invenção aplica-se, mais precisamente, aos aminoácidos de fórmula geral (I):

NEL R'

.COOR O) na qual n é um número inteiro seleccionado de entre 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, R representa um átomo de hidrogénio ou, então, um radical alquilo, alceno, alcino, cicloalquilo, arilo, um hidrocarboneto policíclico condensado ou um heterociclo, estando todos esses radicais eventualmente substituídos, e R' representa um radical alquilo, alceno, alcino, cicloalquilo, arilo, um hidrocarboneto policíclico 6 condensado, um heterociclo ou, então, um radical oxilo, tio, sulfóxido ou sulfonilo substituído com um grupo alquilo, arilo, cicloalquilo ou um heterociclo, estando todos esses radicais eventualmente substituídos.

Assim, no caso em que os aminoácidos são de fórmula geral (I), o processo de acordo com a presente invenção pode ser representado pelo esquema reaccional da figura 1. Esse esquema representa um primeiro passo de tratamento pelo anidrido glutárico e um segundo passo de tratamento pela enzima glutaril-7-ACA acilase. A configuração de cada um dos produtos obtidos, a saber, por um lado o aminoácido e por outro o derivado da glutarilamida, depende da natureza do radical R'.

No sentido da presente invenção, os radicais alquilo, alceno e alcino contêm, em geral, entre 1 e 30 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, sem que tal seja limitativo. Isto também se aplica nos casos em que esses radicais são substituintes de outros radicais. De um modo preferido, esses radicais contêm entre 1 e 20 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada e, de um modo ainda mais preferido, entre 1 e 10 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada. Os radicais alquilo podem ser seleccionados, por exemplo, de entre: metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo, n-undecilo, n-dodecilo, n-tridecilo, n-pentadecilo, n-hexadecilo, n-heptadecilo, n-octadecilo, isopropilo, isobutilo, isopentilo, iso-hexilo, 3-metilpentilo, neopentilo, neo-hexilo, 2,3,5-trimetil-hexilo, sec-butilo, terc-butilo, terc-pentilo. Dos radicais alquilo são preferidos, por exemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, n-hexilo e iso-hexilo. 7

Os radicais alceno podem ser seleccionados, por exemplo, de entre vinilo, 1-propenilo, alilo, butenilo, 2-metil-l-propenilo, 2-metil-2-propenilo ou 3-metil-2-butenilo. Os radicais alcino podem ser seleccionados, por exemplo, de entre etinilo, 1-propinilo ou propargilo.

No sentido da presente invenção, os radicais cicloalquilo contêm, de um modo geral, entre 3 e 12 átomos de carbono. De um modo preferido, são seleccionados de entre ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo e ciclododecilo. De acordo com um outro aspecto da presente invenção, os cicloalquilos podem ser policiclicos. De um modo preferido, esses radicais são seleccionados de entre os bicicloalquilos ou tricicloalquilos.

De acordo com a presente invenção, entende-se, por radical "arilo", os radicais hidrocarbonados aromáticos univalentes. De entre os arilos, é preferido o fenilo eventualmente substituído.

No sentido da presente invenção, entende-se por hidrocarboneto policiclico condensado, os radicais seleccionados, de um modo preferido, de entre pentaleno, indeno, naftaleno, azuleno, heptaleno, bifenileno, as-indaceno, s-indaceno, acenaftileno, fluoreno, fenaleno, fenantreno, antraceno, fluoranteno, acefenantrileno, aceantrileno, trifenileno, pireno, criseno, naftaceno, pleiadeno, piceno, perileno, pentafeno, pentaceno, tetrafenileno, hexafeno, hexaceno, rubiceno, coroneno, trinaftileno, heptafeno, heptaceno, pirantreno ou ovaleno.

No sentido da presente invenção, o termo "heterociclo" significa compostos monociclicos ou policíclicos fundidos e contendo um ou vários heteroátomos, sendo cada ciclo formado por 3 a 10 membros. De um modo preferido, os heterociclos de acordo com a presente invenção contêm entre 1 e 3 heteroátomos seleccionados de entre oxigénio, enxofre e azoto num ciclo formado por 3 a 10 membros. Os heterociclos da presente invenção são seleccionados, de um modo preferido, de entre tiofeno, benzo[b]tiofeno, nafto[2,3-b]tiofeno, tiantreno, furano, 2 H-pirano, isobenzofurano, 2 Jí-cromeno, xanteno, fenoxatiina, 2 Jí-pirrole, pirrole, imidazole, pirazole, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, iso-indole, 3 H-indole, índole, 1 H-indazole, purina, 4 H-quinolizina, isoquinoleína, quinoleína, ftalazina, naftiridina-1,8, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, 4a íí-carbazole, carbazole, β-carbolina, fenantridina, acridina, perimidina, fenantrolina-1,7, fenazina, fenarsazina, isotiazole, fenotiazina, isoxazole, furazano, fenoxazina, isocromano, pirrolidina, A2-pirrolina, imidazolidina, A2-imidazolina, pirazolidina, A3-pirazolina, piperidina, piperazina, indolina, iso-indolina, quinuclidina e morfolina.

No sentido da presente invenção, quando os diferentes radicais, tais como definidos anteriormente, são substituídos, o referido ou os referidos substituintes são seleccionados, em geral, de entre os átomos de halogéneo, grupos arilo, heterociclo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, tiol, alquiltio, ariltio, alquilsulfóxido, arilsulfóxido, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, ciano, nitro, sulfonamida, alquilsulfonamida e arilsulfonamida, de acordo com a natureza do radical. De um modo preferido, os diferentes radicais, tais como definidos anteriormente, são substituídos 1, 2 ou 3 vezes. De acordo com 9 um aspecto preferido, os átomos de halogéneo são seleccionados de entre cloro, flúor, bromo e iodo. No caso em que os radicais alquilo são substituídos por átomos de halogéneo, trata-se, de um modo preferido, de átomos de flúor. De um modo preferido, o número de substituintes flúor é de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. Por exemplo, pode tratar-se de um grupo trifluorometilo.

De um modo preferido, os aminoácidos de acordo com a presente invenção são seleccionados de entre os compostos de fórmula geral (I), na qual n é um número inteiro seleccionado de entre 0, 1, 2 ou 3, R representa um átomo de hidrogénio ou, então, um radical alquilo ou arilo e R' é tal como definido anteriormente.

De um modo ainda mais preferido, os aminoácidos de acordo com a presente invenção são seleccionados de entre os compostos de fórmula geral (I), na qual n é um número inteiro igual a 0, 1 ou 2, R representa um átomo de hidrogénio ou, então, uma função alquilo, e R' é seleccionado de entre os arilos ou heterociclos eventualmente substituídos. Neste último caso, os radicais arilo e/ou heterociclo são, de um modo preferido, substituídos 1, 2 ou 3 vezes. A enzima glutaril-7-ACA acilase já foi utilizada como catalisador em vários processos industriais, nomeadamente, para a hidrólise de β-lactamas, tais como ácido N-glutaril-7-aminoacetoxicefalosporinico. Pode ser derivada de vários microrganismos, por exemplo, do género Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Stenotrophomonas ou, ainda, Xanthomonas, de acordo com as técnicas bem conhecidas pelo perito na técnica, especialista em enzimas. A enzima Glutaril-7-ACA acilase também se pode obter comercialmente, por exemplo, 10 junto da Roche Diagnostic GmbH (Roche Molecular Biochemicals, Standhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim) ou, ainda, junto da

Recordati S.p.A. (Stabilimento di opera, Via Lambro 38, 1-20090

Opera (MI)). A enzima glutaril-7-ACA acilase também pode ser utilizada sob diferentes formas sem que isso altere a sua estereoespecificidade e a sua estereosselectividade. Por exemplo, a glutaril-7-ACA acilase também pode ser utilizada sob a forma solúvel ou, então, imobilizada. Neste segundo caso, a enzima é, em geral imobilizada de acordo com técnicas bem conhecidas pelo perito na matéria. Por exemplo, a enzima pode estar contida em géis poliméricos ou, então, ligada a suportes sólidos por ligação covalente, reticulação, adsorção ou encapsulação. Suportes adaptados e que são frequentemente utilizados são, por exemplo, vidro poroso, cerâmicas porosas, polímeros sintéticos (por exemplo, poliestireno, polivinilálcoois, polietileno, poliamidas ou poliacrilamidas), ou polímeros de origem natural (por exemplo, celulose).

Pela utilização da enzima glutaril-7-ACA acilase, é possível obter um excesso enantiomérico ("ee") elevado para cada enantiómero, em particular, superior ou igual a 90%, inclusivamente superior ou igual a 95% e, de um modo preferido, superior ou igual a 99%. No sentido da presente invenção, entende-se por "excesso enantiomérico" o excesso em % de um dos enantiómeros relativamente à mistura racémica. Mais precisamente, o excesso enantiomérico calcula-se do seguinte modo: 11 ee(%) = [r]+[s] [R] e [S] representam a concentração em enantiómero (R) e (S) , respectivamente.

De um modo geral, a quantidade de enzimas utilizadas relativamente à quantidade total de aminoácido de partida (substrato) está compreendida entre 1 e 100 unidades (U) por mmol de substrato e, de um modo preferido, entre 10 e 40 unidades por mmol de substrato. 1 unidade de enzima corresponde à quantidade de enzima necessária para a hidrólise de 1 μιηοΐ de ácido N-glutaril-7-aminoacetoxicefalosporínico, por minuto, em condições padrão de pH e temperatura conhecidas pelo perito na técnica.

De acordo com a invenção, realiza-se a reacção em meio aquoso, eventualmente tamponado. Neste caso, o tampão aquoso de uma concentração compreendida entre 10 mM e 200 mM pode ser seleccionado de entre os tampões acetato, utilizáveis a pH compreendido entre 5 e 6,5 ou os tampões fosfato, utilizáveis a pH compreendido entre 6,5 e 8 ou, ainda, os tampões pirofosfato, utilizáveis a pH compreendido entre 8 e 9.

Assim, o processo, de acordo com a invenção, é realizado num meio em que o pH é controlado e ajustado entre 6 e 9. De um modo preferido, o pH do meio reaccional é controlado e ajustado precisamente entre 7,5 e 8,5 e, de um modo ainda mais preferido, entre 8 e 8,5. O pH pode ser controlado com o auxilio de um pH-stat, por adição de um ácido, tal como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico, e de uma base, 12 tal como, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amoniaco. 0 tratamento dos aminoácidos, de acordo com a invenção, com anidrido glutárico é realizado a uma temperatura compreendida entre 20 °C e 40 °C e, de um modo preferido, entre 25 °C e 35 °C. Além disso, o segundo passo que utiliza a enzima glutaril-7-ACA acilase é realizado a uma temperatura compreendida entre 10 °C e 50 °C e, de um modo preferido, entre 25 °C e 35 °C.

Finalmente, o tempo de reacção varia, globalmente, entre 1 hora e 100 horas e depende, nomeadamente, do aminoácido envolvido e da concentração em enzimas. De um modo geral, deixa-se prosseguir a reacção o tempo necessário para se obter o enantiómero desejado com um excesso enantiomérico satisfatório. Controla-se a quantidade de aminoácido quiral obtida e o valor do excesso enantiomérico utilizando as técnicas clássicas conhecidas pelo perito na técnica. De um modo vantajoso, o controlo é realizado por HPLC (Cromatografia Liquida de Alta Performance).

De acordo com a presente invenção, os enantiómeros (R) e (S) obtidos pelo processo descrito anteriormente podem ser facilmente separados uma vez que se apresentam, um sob a forma de amina solúvel em meio aquoso e o outro sob a forma de amida sólida. Assim, um outro objecto da presente invenção refere-se ao processo, tal como exposto anteriormente, que compreende como passo subsequente a separação dos enantiómeros (R) e (S). A separação dos referidos enantiómeros (R) e (S) pode ser facilmente realizada devido às técnicas clássicas conhecidas 13 pelo perito na matéria. Procede-se, por exemplo, por filtração, extracção, cromatografia ou cristalização.

No caso em que se pretende isolar o outro enantiómero sob a forma de aminoácido, e não sob a forma de derivado da glutarilamida, o referido enantiómero do derivado da glutarilamida que foi isolado de acordo com o processo descrito anteriormente é, em seguida, submetido a hidrólise de modo a recuperar o aminoácido correspondente sob a forma de enantiómero. Deve notar-se que esse processo é vantajoso uma vez que a hidrólise permite conservar a estereoquimica do composto utilizado e não conduz a uma racemização do derivado da glutarilamida quiral. No caso em que os aminoácidos são de fórmula geral (I), este passo suplementar pode ser representado pelo esquema reaccional de acordo com a figura 2. A hidrólise é realizada de acordo com as técnicas clássicas conhecidas pelo perito na matéria. Pode tratar-se, nomeadamente, de uma hidrólise ácida ou básica. Neste último caso, procede-se, por exemplo, na presença de uma base, tal como o hidróxido de sódio, à temperatura compreendida entre 50 °C e 90 °C e sob pressão atmosférica. No entanto, podem ser utilizadas quaisquer outras condições de processo igualmente adequadas e conhecidas pelo perito na técnica. A presente invenção é útil no sentido em que permite resolver aminoácidos sob a forma racémica, o que permite dispor de um ou de outro enantiómero do referido aminoácido, sendo que os referidos enantiómeros constituem, nomeadamente, intermediários de sintese. 14 A título ilustrativo, a presente invenção permite, por exemplo, dispor do ácido (S)-3-amino-3-fenilpropanóico que constitui um intermediário na síntese do composto de fórmula geral:

que é um antagonista do receptor VLA4 envolvido, nomeadamente, nas doenças da asma.

Além das disposições anteriores, a presente invenção também compreende características e vantagens que se evidenciam dos exemplos a seguir, e que devem ser considerados como ilustrativos da invenção sem limitar, no entanto, o seu âmbito.

FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática do Io passo de tratamento de um aminoácido de fórmula geral (I), de acordo com a presente invenção, pelo anidrido glutárico e do 2o passo de tratamento pela enzima glutaril-7-ACA acilase. A configuração de cada um dos produtos obtidos, a saber, por um lado o aminoácido e por outro o derivado da glutarilamida, depende da natureza do radical R'. 15

Figura 2: Representação esquemática do passo de transformação do derivado da glutarilamida quiral no seu aminoácido quiral correspondente por hidrólise.

EXEMPLOS

Exemplo 1:_Resolução_do_ácido_3-amino-3- (4' - nitrofenilo)propanóico sob a forma de mistura racémica a) Acilação do ácido 3-amino-3-(4'-nitrofenilo)propanóico racémico São dissolvidos, em 200 mL de água destilada e 55 mL de trietilamina, 40,6 g de ácido 3-amino-3-(4'-nitrofenilo)propanóico racémico. São adicionados, em pequenas porções, 29,4 g de anidrido glutárico e a mistura reaccional é agitada durante 1 hora. Então, a mistura reaccional é acidificada com 8,2 mL de ácido sulfúrico a 95% (peso/volume). O precipitado assim obtido é filtrado, lavado 3 vezes com 15 mL de água destilada e seco até peso constante, a 55 °C, sob vácuo. Obtém-se, assim, 52,84 g de ácido 3-(glutarilamida)-3-(4'-nitrofenilo)propanóico racémico. A natureza do produto obtido foi determinada por HPLC (Cromatografia Liquida de Alta Eficácia). 16 b) Desacilagão enzimática pela glutaril-7-ACA acilase cristalizada, em suspensão (reactor de 100 mL) São dissolvidos, em 75 mL de água destilada, 20 g do ácido obtido no passo anterior. O pH da suspensão é ajustado a 8,2 por adição de 11,2 mL de hidróxido de sódio a 30% (peso/volume) . Adiciona-se, a esta solução, 826 mg (626 unidades) de uma suspensão de glutaril-7-ACA acilase cristalizada. A mistura reaccional é agitada durante 51 horas a 35 °C e a pH controlado e ajustado entre 7,9 e 8,1. No fim da reacção, a mistura reaccional é arrefecida a 20 °C e o pH é ajustado a 7,0 por adição de ácido clorídrico a 5 N. Adiciona-se então 20 mL de etanol. O precipitado de ácido (R)-3-amino-3-(4'-nitrofenilo)propanóico assim obtido é filtrado, lavado 3 vezes com 30 mL de etanol e seco até peso constante, a 45 °C, sob vácuo. Obtém-se, assim, 5,65 g de ácido (R)-3-amino-3-(4'-nitrofenilo)propanóico com um excesso enantiomérico superior a 99%. A água mãe é acidificada com 17,5 mL de ácido clorídrico a 5 N. O precipitado que se forma é filtrado e lavado 2 vezes com 10 mL de água destilada. O bolo obtido é seco até peso constante, a 45 °C, sob vácuo. Obtém-se, assim, 8,25 g de ácido (S)-3-(glutarilamida)-3-(4'-nitrofenilo)propanóico e de ácido (R)-3-(glutarilamida)-3-(4'-nitrofenilo)propanóico numa razão de 91:9. A natureza dos produtos obtidos foi determinada por HPLC. 17 c) Desacilagão enzimática pela glutaril-7-ACA acilase imobilizada obtida da Roche Diagnostic GmbH (reactor de 100 mL) São dissolvidos, em 75 mL de água destilada, 20,5 g do ácido obtido no passo a). O pH da suspensão é ajustado a 8,2 por adição de 11,9 mL de hidróxido de sódio a 30% (peso/volume) . Adiciona-se, a esta solução, 6,2 g (632,4 unidades) de glutaril-7-ACA acilase imobilizada húmida (Roche Diagnostic GmbH). A mistura reaccional é agitada durante 18 horas, a 35 °C, e a pH controlado e ajustado entre 7,9 e 8,1. No fim da reacção, o pH da mistura reaccional é ajustado a 9,5 por adição de hidróxido de sódio a 30% (peso/volume) e o volume da mistura reaccional é ajustado a 200 mL de modo a dissolver o ácido (R)-3-amino-3-(4'-nitrofenilo)propanóico produzido. A enzima imobilizada é retirada por filtração e o pH da água mãe é ajustado a 7,0 por adição de ácido clorídrico a 5 N. Adiciona-se então 50 mL de etanol à mistura reaccional. O ácido (R)-3-amino-3-(4'-nitrofenilo)propanóico precipitado é filtrado, lavado com 10 mL de etanol e seco até peso constante, a 45 °C, sob vácuo. Obtém-se, assim, 5,375 g de ácido (R)-3-amino-3-(4' -nitrofenilo)propanóico com um excesso enantiomérico igual a 98%. A água mãe é acidificada com 20 mL de ácido clorídrico a 5 N. O precipitado que se forma é filtrado e lavado 2 vezes com 15 mL de água destilada. O bolo é seco até peso constante, a 45 °C, sob vácuo. Obtém-se, assim, 6 g de ácido (S)-3-(glutarilamida)-3-(4'-nitrofenilo)propanóico numa razão de 94:6. A natureza dos produtos obtidos foi determinada por HPLC. 18 d) Desacilagão enzimática pela glutaril-7-ACA acilase cristalizada em suspensão (reactor de 500 mL) São dissolvidos, em 400 mL de água destilada, 100 g de ácido 3-(glutarilamida)-3-(4'-nitrofenilo)propanóico racémico obtidos como no passo a). O pH da suspensão é ajustado a 8,2 por adição de 60 mL de hidróxido de sódio a 30% (peso/volume). Adiciona-se r a esta solução, 6,4 g (4653 unidades) de uma suspensão de glutaril-7-ACA acilase cristalizada. A mistura reaccional é agitada durante 30 horas, a 35 °C, e a pH controlado e ajustado entre 7, 9 e 8,1. No fim da reacção, a mistura reaccional é arrefecida a 20 °C e o pH é ajustado a 13 por adição de 25 mL de hidróxido de sódio a 30% (peso/volume) de modo a dissolver o ácido (R)-3-amino-3-(4'- nitrofenilo)propanóico formado. As partículas insolúveis são filtradas e o pH da água mãe é ajustado a 7,0 por adição de 27 mL de ácido clorídrico a 36%. Adiciona-se então 100 mL de etanol à mistura reaccional. O precipitado de ácido (R)-3-amino-3-(4'-nitrofenilo)propanóico obtido é filtrado, lavado 2 vezes com 100 mL de etanol e seco até peso constante, a 45 °C, sob vácuo.

Obtém-se, assim, 28,87 g de ácido (R)-3-amino-3-(4'-nitrofenilo)propanóico com um excesso enantiomérico igual a 97%. A natureza do produto obtido foi determinada por HPLC. 19

Exemplo 2: Resolução do ácido 3-amino-3-fenilpropanóico sob a forma de mistura racémlca a) Acilação do ácido 3-amino-3-fenilpropanóico racémico São dissolvidos 488 g de ácido 3-amino-3-fenilpropanóico racémico em 2 litros de água destilada contendo 236 g de hidróxido de sódio, sob a forma de pastilhas. Adiciona-se, à mistura reaccional, em pequenas porções, em 1 hora, 437,5 g de anidrido glutárico, sob agitação e a 20 °C. Após 1 hora, a mistura reaccional é acidificada com 236 mL de ácido sulfúrico a 95% (peso/volume) e arrefecida a 10 °C. O precipitado assim formado é filtrado e, então, lavado 3 vezes com 600 mL de água destilada. O bolo húmido de 1610 g assim obtido contém 602 g de ácido 3-glutarilamida-3-fenilpropanóico racémico. A natureza dos produtos obtidos foi determinada por HPLC. b) Desacilação enzimática pela glutaril-7-ACA acilase cristalizada em suspensão (reactor de 5 litros) São dissolvidos, em 1610 mL de água destilada, 1575 g do bolo húmido obtido anteriormente, contendo 589 g de ácido 3-glutarilamida-3-fenilpropanóico racémico. O pH da suspensão é ajustado a 8,0 por adição de 440 mL de hidróxido de sódio a 30% (peso/volume). Adiciona-se, a esta solução, 52,6 g (32000 unidades) de uma suspensão de glutaril-7-ACA acilase cristalizada. A mistura reaccional é agitada durante 41 horas a 35 °C e a pH controlado e ajustado entre 7,9 e 8,1. No fim da reacção, a mistura reaccional é arrefecida a 20 °C e o pH é ajustado a 13 por adição de 25 mL de hidróxido de sódio a 30% (pes o/volume) de modo a dissolver o ácido (R)-3-amino-3-(4'- 20 nitrofenilo)propanóico produzido. As partículas insolúveis são filtradas e o pH da água mãe é ajustado a 7,0 por adição de 27 mL de ácido clorídrico a 36%. O precipitado de ácido (R)-3-amino-3-fenilpropanóico assim obtido é filtrado, lavado com 150 mL de água destilada e seco até peso constante, a 45 °C, sob vácuo. Obtém-se, assim, 96,9 g de ácido (R)-3-amino-3-fenilpropanóico com um excesso enantiomérico igual a 98%. A água mãe é acidificada com 180 mL de ácido sulfúrico a 95% (peso/volume). O precipitado assim formado é filtrado e lavado 2 vezes com 400 mL de água destilada arrefecida. O bolo é seco até peso constante, a 45 °C, sob vácuo. Obtém-se, assim, 314,6 g de ácido (S)-3-(glutarilamida)-3-fenilpropanóico e de ácido (R)-3-(glutarilamida)-3-fenilpropanóico numa razão de 90:10. A natureza dos produtos obtidos foi determinada por HPLC. c)_Desacilação_do_ácido_(S) -3-glutarilamida-3- fenilpropanóico por hidrólise básica São dissolvidos, em 3,91 litros de água destilada e 1,65 litros de hidróxido de sódio a 30% (peso/volume), 557,2 g de uma mistura de ácido (S)-3-glutarilamida-3-fenilpropanóico e de ácido (R)-3-glutarilamida-3-fenilpropanóico numa razão de 90:10 obtidos no passo b) anterior. A mistura reaccional é agitada durante 4 dias a 70 °C. 21

Em seguida, a mistura reaccional é arrefecida a 15 °C. 0 produto obtido é precipitado por ajuste do pH a 6, 9, por adição de 3,21 litros de ácido clorídrico a 37% (peso/volume), filtrado e seco até peso constante, a 45 °C, sob vácuo. Obtém-se, assim, 202,4 g de ácido (S)-3-amino-3-fenilpropanóico e de ácido (R)-3-amino-3-fenilpropanóico com um excesso enantiomérico superior a 98%. A natureza dos produtos obtidos foi determinada por HPLC.

Lisboa, 28 de Novembro de 2006 22

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo de separação dos enantiómeros de um aminoácido ou éster de aminoácido; que consiste em tratar uma mistura racémica do referido aminoácido com anidrido glutárico, depois, com a enzima glutaril-7-ACA acilase de modo a recuperar-se um dos enantiómeros do referido aminoácido, sendo que o outro enantiómero permanece sob a forma de derivado da glutarilamida correspondente.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido aminoácido ou éster de aminoácido ter a fórmula geral: NH2

(I) na qual -n é um número inteiro seleccionado de entre 1, 2, 3, 4, 5 ou β, -R representa um átomo de hidrogénio ou, então, um radical alquilo, alceno, alcino, cicloalquilo, arilo, um hidrocarboneto policiclico condensado ou um heterociclo, estando todos esses radicais eventualmente substituídos, -e R' representa um radical alquilo, alceno, alcino, cicloalquilo, arilo, um hidrocarboneto policiclico condensado, um heterociclo ou, então, um radical oxilo, 1 tio, sulfóxido ou sulfonilo substituído com um grupo alquilo, arilo, cicloalquilo ou um heterociclo, estando, além disso, todos esses radicais eventualmente substituídos.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido aminoácido ou éster de aminoácido ser seleccionado de entre os compostos de fórmula geral (I): NH,

(I) na qual n é um número inteiro seleccionado de entre 0, 1, 2 ou 3, R representa um átomo de hidrogénio ou, então, um radical alquilo ou arilo e R' é tal como definido na reivindicação 2.
4. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por o referido aminoácido ou éster de aminoácido ser seleccionado de entre os compostos de fórmula geral (I): NH,

O) na qual n é um número inteiro igual a 0, 1 ou 2, R representa um átomo de hidrogénio ou, então, uma função alquilo e R' é seleccionado de entre os arilos ou heterociclos eventualmente substituídos. 2
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a enzima glutaril-7-ACA acilase ser utilizada sob a forma solúvel ou imobilizada.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a quantidade de enzimas utilizadas relativamente à quantidade total de aminoácido ou éster de aminoácido de partida (substrato) estar compreendida entre 1 e 100 unidades por mmol de substrato.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a reacção ser realizada em meio aquoso tamponado.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido tampão aquoso ter uma concentração compreendida entre 10 mM e 200 mM e ser seleccionado de entre os tampões acetato utilizáveis a pH compreendido entre 5 e 6,5 ou tampões fosfato utilizáveis a pH compreendido entre 6,5 e 8 ou tampões pirofosfato utilizáveis a pH compreendido entre 8 e 9.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o PH ser controlado e ajustado entre 6 e 9.
10 . Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o tratamento do aminoácido ou éster de aminoácido, com anidrido glutárico, ser realizado a uma temperatura compreendida entre 20 °C e 40 °C. 3
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o tratamento com a enzima glutaril-7-ACA acilase ser realizado a uma temperatura compreendida entre 10 °C e O o o LO
12 . Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o tempo de reacção variar entre 1 hora e 100 horas.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se separar, além disso, os enantiómeros (R) e (S).
14 . Processo de acordo com a reivindicação 13 , caracterizado por a referida separação dos enantiómeros (R) e (S) ser realizada por filtração, extracção, cromatografia ou cristalização.
15. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 ou 14, caracterizado por o enantiómero derivado da glutarilamida que foi separado ser, além disso, submetido a hidrólise de modo a recuperar-se o aminoácido correspondente sob a forma de enantiómero. Lisboa, 28 de Novembro de 2006 4