ES2272779T3 - Procedimiento enzimatico para la resolucion enantiomerica de amoniacidos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de separación de los enantiómeros de un aminoácido o de un éster de aminoácido; que consiste en tratar una mezcla racémica de dicho aminoácido con anhídrido glutárico, después con la enzima glutaril 7-ACA acilasa de modo que se recupera uno de los enantiómeros de dicho aminoácido, permaneciendo el otro enantiómero en forma de derivado de la glutarilamida correspondiente.
Description
Procedimiento enzimático para la resolución
enantiomérica de aminoácidos.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento enzimático que permite la resolución enantomérica de
aminoácidos en forma de mezcla racémica.
Los aminoácidos se utilizan frecuentemente en
cualquier tipo de industria, por ejemplo bien como compuestos
biológicamente activos, o bien como intermediarios de síntesis para
la preparación de compuestos con fines especialmente
farmacéuticos, químicos o agrícolas. Tanto es así, que
frecuentemente resultaba necesario poder disponer rápidamente de
uno u otro de los enantiómeros ópticamente activos de estos
aminoácidos. Por lo tanto, se han puesto a punto numerosas vías de
separación de enantiómeros de aminoácidos
pro-quirales. En particular, los procedimientos
enzimáticos que permiten su resolución enantiomérica han resultado
ser una alternativa interesante a los métodos sintéticos
asimétricos.
Así, Soloshonok et al.
(Tetrahedron: Assymetry, vol. 6(7), 1995, págs.
1601-1610) han puesto a punto un procedimiento
enzimático de resolución enantiométrica de
\beta-aminoácidos según el esquema de reacción
siguiente:
De manera análoga, Topgi et al.
(Bioorg. & Med. Chem. 1999, vol., 7, págs.
2221-2229) han elaborado un procedimiento de
resolución de los enantiómeros (R) y (S) del 3-amino
4-pentinoato de etilo en forma enantioméricamente
pura según uno de los esquemas de reacción siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
obteniéndose la fenilacetamida de
partida por acilación de la amina correspondiente por acción del
ácido fenilacético, o
bien:
La solicitud de patente WO 98/50575 describe de
manera más general un método de preparación de un
\beta-aminoácido quiral que comprende la puesta
en contacto de una mezcla racémica de dicho aminoácido con un
donante de acilo y la enzima penicilina G acilasa (o
amidohidrolasa), en condiciones apropiadas para acilar
estereoselectívamente uno de los enantiómeros de la mezcla racémica
del \beta-aminoácido en su correspondiente
derivado N-acilado, obteniéndose el enantiómero
opuesto del \beta-aminoácido en forma
enantioméricamente enriquecida, según el esquema de reacción
siguiente:
siendo el "donante de acilo"
en cuestión de fórmula
general:
en la cual R_{3} se elige entre
fenilo, fenoxi, amino, diversos derivados del fenilo y del piridilo,
y R_{4} se elige entre los sustituyentes hidroxi, alcoxi,
alquilo, alquenilo, alquinilo, halógenoalquilo, arilo, arilalquilo,
los azúcares o los
esteroides.
La solicitud de patente WO 98/50575 describe
igualmente otra alternativa para la preparación de un
\beta-aminoácido quiral, que comprende la puesta
en contacto de una amida en forma racémica con la enzima penicilina
G acilasa en condiciones apropiadas para desacilar selectivamente
uno de los enantiómeros de la amida en forma racémica y su
correspondiente \beta-aminoácido, obteniéndose el
enantiómero opuesto de la amida en forma enantioméricamente
enriquecida, según el esquema de reacción siguiente:
Los procedimientos expuestos anteriormente
presentan sin embargo el gran inconveniente de pasar, previa o
simultáneamente, a la etapa enzimática como tal, por una amida
intermedia cuya fórmula se podría resumir de la forma
siguiente:
Una amida de este tipo es insoluble en medio
acuoso por el hecho de la presencia del núcleo aromático, lo que
presenta inconvenientes. Por ejemplo, es conocido que ciertas
enzimas son solubles en medio acuoso y son frecuentemente sensibles
a la presencia de disolventes orgánicos. Por lo tanto, para que el
rendimiento de la reacción enzimática se pueda optimizar, es
importante disponer de una buena solubilidad del sustrato con
relación a la enzima, de manera que puedan estar en íntimo
contacto.
Es principalmente este inconveniente el que se
propone resolver la presente invención. En efecto, la presente
invención se refiere según un primer aspecto a un nuevo
procedimiento de separación de los enantiómeros de un aminoácido,
el cual consiste en tratar una mezcla racémica de dicho aminoácido
con anhídrido glutárico, después con la enzima
glutaril-7-ACA acilasa, de manera
que se recupere uno de los enantiómeros de dicho aminoácido,
permaneciendo el otro enantiómero en forma de derivado de la
glutarilamida correspondiente.
Este procedimiento es particularmente ventajoso
puesto que el empleo de anhídrido glutárico permite pasar de forma
intermedia por un derivado de la glutarilamida correspondiente al
aminoácido de partida, confiriendo la función glutarilo a la
molécula su solubilidad en medio acuoso Por ello resulta que el
procedimiento según la presente invención se puede efectuar en
condiciones reactivas suaves y en medio acuoso, es decir en
particular sin la utilización de un co-solvente
orgánico.
El procedimiento según la presente invención
posee igualmente la ventaja de que se aplica globalmente a todas
las formas de aminoácidos (\alpha, \beta, \gamma...). En el
sentido de la presente invención, bajo el término genérico
"aminoácido" se agrupan tanto los aminoácidos como tales (a
saber los compuestos que tienen una función amino y una función
ácido -COOH) como los ésteres derivados correspondientes (a saber,
los compuestos en los cuales la función ácido se ha reemplazado por
una función éster COOR). De forma preferida, el procedimiento según
la invención se aplica más exactamente a los aminoácidos de fórmula
general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- -
- n es un número entero seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6,
- -
- R representa un átomo de hidrógeno o bien un radical alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, arilo, un hidrocarburo policíclico condensado, o un heterociclo, estando eventualmente sustituidos todos estos radicales,
- -
- y R' representa un radical alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, arilo, un hidrocarburo policíclico condensado, un heterociclo, o bien un radical oxi, tio, sulfóxido o sulfonilo substituido con un grupo alquilo, arilo, cicloalquilo o un heterociclo, estando además todos estos radicales eventualmente sustituidos.
Así, en el caso en que los aminoácidos sean de
la fórmula general (I), el procedimiento según la presente
invención se puede representar por el esquema de reacción de la
figura 1. Este esquema representa una primera etapa de tratamiento
con anhídrido glutárico y una segunda etapa de tratamiento con la
enzima glutaril 7-ACA acilasa. La configuración de
cada uno de los productos obtenidos, a saber el aminoácido por una
parte y el derivado de la glutarilamida por otra parte, depende de
la naturaleza del radical R'.
En el sentido de la presente invención, los
radicales alquilos, alquenos y alquinos contienen en general entre
1 y 30 átomos de carbono en cadena lineal o ramificada, sin que, por
otra parte, esto sea limitativo. Esto se aplica igualmente a los
casos en que estos radicales son sustituyentes de otros radicales.
De preferencia, estos radicales contienen entre 1 y 20 átomos de
carbono en cadena lineal o ramificada y, de forma todavía más
preferente, entre 1 y 10 átomos de carbono en cadena lineal o
ramificada. Los radicales alquilo se pueden seleccionar, por
ejemplo entre: metilo, etilo, n-propilo,
n-butilo, n-pentilo,
n-hexilo, n-heptilo,
n-octilo, n-nonilo,
n-decilo, n-undecilo,
n-dodecilo, n-tridecilo,
n-pentadecilo, n-hexadecilo,
n-heptadecilo, n-octadecilo,
isopropilo, isobutilo, isopentilo, isohexilo,
3-metilpentilo, neopentilo, neohexilo,
2,3,5-trimetilhexilo, sec-butilo,
terc-butilo, terc-pentilo. Los
radicales alquilo preferidos son, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, isopropilo, n-butilo,
isobutilo, sec-butilo, terc-butilo,
n-pentilo, isopentilo, n-hexilo e
isohexilo. Los radicales alqueno se pueden elegir, por ejemplo
entre el vinilo, 1-propenilo, alilo, butenilo,
2-metil-1-propenilo,
2-metil-2-propenilo
o
3-metil-2-butenilo.
Los radicales alquino se pueden elegir, por ejemplo, entre etinilo,
1-propinilo o el propargilo.
En el sentido de la presente invención, los
radicales cicloalquilo contienen en general entre 3 y 12 átomos de
carbono. Se eligen preferentemente entre el ciclopropilo,
ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo,
ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo y ciclododecilo. Según otro
aspecto de la presente invención, los cicloalquilos pueden ser
policíclicos. Estos radicales se eligen preferentemente entre los
bicicloalquilos o los tricicloalquilos.
Según la presente invención, se entiende por
radical "arilo" los radicales hidrocarbonados aromáticos
univalentes. Entre los arilos se prefiere el fenilo eventualmente
sustituido.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por hidrocarburo policíclico condensado los radicales
seleccionados preferentemente entre el pentaleno, indeno, naftaleno,
azuleno, heptaleno, bifenileno, as-indaceno,
s-indaceno, acenaftileno, fluoreno, fenaleno, fenantreno,
antraceno, fluoranteno, 'acefenantrileno, aceantrileno,
trifenileno, pireno, criseno, naftaceno, pleiadeno, piceno,
perileno, pentafeno, pentaceno, tetrafenileno, hexafeno, hexaceno,
rubiceno, coroneno, trinaftileno, heptafeno, heptaceno, pirantreno u
ovaleno.
En el sentido de la presente invención, el
término "heterociclo" designa los compuestos monocíclicos o
policíclicos fusionados y que contienen uno o varios heteroátomos,
estando formado cada ciclo por 3 a 10 eslabones. De preferencia,
los heterociclos según la presente invención contienen entre 1 y 3
heteroátomos seleccionados entre el oxígeno, el azufre y el
nitrógeno en un ciclo formado por 3 a 10 eslabones. Los heterociclos
de la presente invención se seleccionan preferentemente entre
tiofeno, benzo[b]tiofeno,
naftol[2,3-b]tiofeno, tiantreno,
furano, 2H-pirano, isobenzofurano,
2H-cromeno, xanteno, fenoxantiina, 2H-pirrol,
pirrol, imidazol, pirazol, piridina, pirazina, piyrimidina,
piridazina, indolizina, iso-indol, 3H-indol,
indol, 1H-indazol, purina, 4H-quinolizina,
isoquinoleina, quinoleina, ftalazina,
1,8-naftiridina, quinoxalina, quinazolina,
cinnolina, pteridina, 4aH-carbazol, carbazol,
\beta-carbolina, fenantridina, acridina,
perimidina, 1,7-fenantrolina, fenazina,
fenarsazina, isotiazol, fenotiazina, isoxazol, furazano, fenoxazina,
isocromano, pirrolidina, \Delta2-pirrolina,
imidazolidina, \Delta2-imidazolina, pirazolidina,
\Delta3-pirazolina, piperidina, piperazina,
indolina, iso-indolina, quinuclidina y
morfolina.
En el sentido de la presente invención, cuando
los diferentes radicales como los definidos anteriormente están
sustituidos, dicho o dichos sustituyentes se seleccionan en general
entre los átomos de halógeno, los grupos arilo, heterociclo,
hidroxi, alcoxi, ariloxi, tiol, alquiltio, ariltio, alquilsulfóxido,
arilsulfóxido, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, ciano, nitro,
sulfonamida, alquilsulfonamida y arilsulfonamida, según la
naturaleza del radical. De preferencia, los diferentes radicales
tales como los definidos anteriormente están sustituidos 1, 2 o 3
veces. Según un aspecto preferido, los átomos de halógeno se
seleccionan entre cloro, flúor, bromo y yodo. En el caso en que los
radicales alquilo estén sustituidos por átomos de halógeno, se trata
preferentemente de átomos de flúor. De preferencia, el número de
sustituyentes flúor es de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7. Por ejemplo, se
puede tratar de un grupo trifluorometilo.
De preferencia, los aminoácidos según la
presente invención se seleccionan entre los compuestos de la fórmula
general (I) en la cual n es un número entero seleccionado entre
0, 1, 2 o 3, R representa un átomo de hidrógeno o bien un radical
alquilo o arilo y R' es tal como se define anteriormente.
De forma todavía más preferente, los aminoácidos
según la presente invención se seleccionan entre los compuestos de
la fórmula general (I) en la cual n es un número entero igual a 0,
1 o 2, R representa un átomo de hidrógeno o bien una función
alquilo y R' se elige entre los arilos o los heterociclos
eventualmente sustituidos. En este último caso, los radicales arilo
y/o heterocíclo están sustituidos preferentemente 1, 2 o 3
veces.
La enzima glutaril 7-ACA acilasa
ya fue utilizada como catalizador en numerosos procedimientos
industriales, especialmente para la hidrólisis de
\beta-lactamas tales como el ácido
N-glutaril-7-aminoacetoxicefalosporínico.
Esta enzima se puede derivar de numeroso microorganismos, por
ejemplo del género Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus,
Pseudomonas, Stenotrophomonas o también Xanthomonas,
según técnicas bien conocidas por el experto en la materia,
especialista en enzimas. La enzima
glutaril-7-ACA acilasa se puede
obtener igualmente de forma comercial, por ejemplo de Roche
Diagnostic GmbH (Roche Molecular Biochemicals, Standhofer Strasse
116, D-68305 Mannheim) o también de Recordati S.p.A.
(Stabilimento di opera, Via Lambro 38, I-20090 Opera
(MI)).
La enzima
glutaril-7-ACA acilasa se puede
utilizar en diferentes formas sin que ello modifique su
estereoespecificidad y su estereoselectividad. Por ejemplo, la
glutaril 7-ACA acilasa se puede utilizar en forma
soluble o bien en forma inmovilizada. En este segundo caso, la
enzima se inmoviliza generalmente según técnicas bien conocidas por
el experto en la materia. Por ejemplo, la enzima puede estar
contenida en geles poliméricos o bien se puede fijar a soportes
sólidos por unión covalente, reticulación, adsorción o
encapsulación. Soportes adaptados y utilizados corrientemente son,
por ejemplo, vidrio poroso, cerámicas porosas, polímeros sintéticos
(por ejemplo poliestireno, polivinilalcoholes, polietileno,
poliamidas o poliacrilamidas), o los polímeros de origen natural
(por ejemplo celulosa).
Por el empleo de la enzima glutaril
7-ACA acilasa, es posible obtener un exceso
enantiomérico ("ee") elevado para cada enantiómero, en
partículas superior o igual a 90%, a veces incluso superior o igual
a 95%, y preferentemente superior o igual a 99%. En el sentido de
la presente invención, se entiende por "exceso enantiomérico"
el exceso en % de uno de los enantiómeros con relación a la mezcla
racémica. Más exactamente, el exceso enantiomérico se calcula de la
forma siguiente:
ee (%) =
\frac{[R] - [S]}{[R] - [S]} * 100 = % \ (R) - % \
(S)
[R] y [S] representan respectivamente la
concentración del enantiómero (R) y (S).
Generalmente, la cantidad de enzima empleada en
relación con la cantidad total de aminoácido de partida (sustrato)
está comprendida entre 1 y 100 unidades (U) por mmol de sustrato y,
preferentemente, entre 10 y 40 unidades por mmol de sustrato. 1
unidad de enzima corresponde a la cantidad de enzima necesaria para
hidrolizar 1 µmol de ácido
N-glutaril-7-aminoacetoxicefaloesporínico
por minuto en las condiciones estándar de pH y temperatura
conocidas por el experto en la materia.
Según la invención, la reacción se efectúa en
medio acuoso eventualmente tamponado. En este caso, el tampón
acuoso con una concentración comprendida entre 10 mM y 200 mM se
puede seleccionar entre los tampones acetato utilizables a pH
comprendido entre 5 y 6,5 o los tampones fosfato utilizables a pH
comprendido entre 6,5 y 8, o también los tampones pirofosfato
utilizables a pH comprendido entre 8 y 9.
De este modo, el procedimiento según la
invención se emplea en un medio en el cual el pH se controla y
ajusta entre 6 y 9. De preferencia, el pH del medio de reacción se
controla y ajusta exactamente entre 7,5 y 8,5 y, de manera aún más
preferida, entre 8 y 8,5. El pH se puede controlar con ayuda de una
pH-stat por adición de un ácido tal como, por
ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, y de
una base tal como, por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de
potasio o amoníaco.
El tratamiento de los aminoácidos según la
invención con anhídrido glutárico se realiza a una temperatura
comprendida entre 20ºC y 40ºC y, preferentemente entre 25ºC y 35ºC.
Además, la segunda etapa que emplea la enzima
glutaril-7-ACA acilasa se efectúa a
una temperatura comprendida entre 10ºC y 50ºC y, de preferencia,
entre 25ºC y 35ºC.
Por último, el tiempo de reacción varía
globalmente entre 1 hora y 100 horas y depende especialmente del
aminoácido en cuestión y de la concentración de enzimas.
Generalmente, se deja que la reacción transcurra el tiempo necesario
para obtener el enantiómero deseado en un exceso enantiomérico
suficiente. Utilizando las técnicas clásicas conocidas por el
experto en la materia, se controla la cantidad de aminoácido quiral
obtenido y el valor del exceso enantiomérico. El control se efectúa
ventajosamente por CLHP (cromatografía líquida de alta
resolución).
Según la presente invención, los enatiómeros (R)
y (S) obtenidos por el procedimiento descrito anteriormente se
pueden separar fácilmente por el hecho de que se presentan, uno en
forma de amina soluble en medio acuoso y el otro en forma de amida
sólida. Por lo tanto, otro objeto de la presente invención se
refiere al procedimiento como el expuesto anteriormente, el cual
comprende como etapa subsiguiente la separación de los enantiómeros
(R) y (S).
La separación de dichos enantiómeros (R) y (S)
se puede efectuar fácilmente gracias a las técnicas clásicas
conocidas por el experto en la materia. Se trabaja, por ejemplo, por
filtración, extracción, cromatografía o cristalización.
\newpage
En el caso en que se desee aislar el otro
enantiómero en forma de aminoácido y no en forma de derivado de la
glutarilamida, dicho enantiómero del derivado de la glutarilamida,
el cual se aisló según el procedimiento descrito anteriormente, se
hidroliza a continuación de manera que se recupera el aminoácido
correspondiente en forma de enantiómero. Hay que resaltar que este
procedimiento es ventajoso puesto que la hidrólisis permite
conservar la estereoquímica del compuesto empleado y no conduce a
una racemización del derivado de la glutarilamida quiral. En el
caso en que los aminoácidos sean de la fórmula general (I), esta
etapa suplementaria se puede representar por el esquema de reacción
según la figura 2.
La hidrólisis se efectúa conforme a las técnicas
clásicas conocidas por el experto en la materia. Especialmente, se
puede tratar de una hidrólisis ácida o básica. En este último caso,
se trabaja por ejemplo en presencia de una base tal como sosa, a
temperatura comprendida entre 50ºC y 90ºC y bajo la presión
atmosférica. No obstante, se pueden utilizar otras técnicas
cualesquiera, igualmente convenientes y conocidas por el experto en
la materia.
La presente invención es útil en el sentido en
que permite resolver los aminoácidos en forma racémica, lo que
permite disponer de uno o del otro enantiómero de dicho aminoácido,
constituyendo especialmente estos enantiómeros productos
intermedios de síntesis.
A modo ilustrativo, la presente invención
permite disponer, por ejemplo, del ácido (S)
3-amino-3-fenilpropanoico
que constituye un producto intermedio en la síntesis del compuesto
de fórmula general:
el cual es un antagonista del
receptor VLA4 implicado especialmente en las enfermedades
asmáticas.
Además de las disposiciones precedentes, la
presente invención comprende igualmente las características y
ventajas que surgirán de los ejemplos siguientes, y que se deben
considerar como ilustrativas de la invención sin limitar su
alcance.
Figura 1: Representación esquemática de la 1ª
etapa de tratamiento de un aminoácido de fórmula general (I) según
la presente invención con anhídrido glutárico y de la 2ª etapa de
tratamiento con la enzima glutaril 7-ACA acilasa.
La configuración de cada uno de los productos obtenidos, a saber el
aminoácido por una parte y el derivado de la glutarilamida por otra
parte, depende de la naturaleza del radical R'.
Figura 2: Representación esquemática de la etapa
de transformación, por hidrólisis, del derivado de la glutarilamida
quiral en su aminoácido quiral correspondiente.
40,6 g de ácido
3-amino-3-(4'-nitrofenil)propanoico
racémico se disuelven en 200 ml de agua destilada y 55 ml de
trietilamina. Se añaden 29,4 g de anhídrido glutárico en pequeñas
porciones y la mezcla de reacción se agita durante 1 hora. Después,
la mezcla de reacción se acidifica con 8,2 ml de ácido sulfúrico al
95% (peso/volumen). El precipitado así obtenido se filtra, se lava
3 veces con 15 ml de agua destilada, y se seca hasta peso constante
a 55ºC a vacío. Se obtienen así 52,84 g de ácido
3-(glutarilamida)-3-(4'-nitrofenil)
propanoico racémico.
La naturaleza del producto obtenido se determina
por HPLC (cromatografía líquida de alta resolución).
20 g del éster obtenido en la etapa anterior se
disuelven en 75 ml de agua destilada. El pH de la suspensión se
ajusta a 8,2 añadiendo 11,2 ml de sosa al 30% (peso/volumen). A
esta solución se añaden 826 mg (626 unidades) de una suspensión de
glutaril-7-ACA acilasa cristalizada.
La mezcla de reacción se agita durante 51 horas a 35ºC y a pH
controlado y ajustado entre 7,9 y 8,1. Al final de la reacción, la
mezcla de reacción se enfría a 20ºC y el pH se ajusta a 7,0 por
adición de ácido clorhídrico 5N. Se añaden entonces 20 ml de etanol.
El precipitado de ácido (R)
3-amino-3-(4'-nitrofenil)propanoico
así obtenido se filtra, se lava 3 veces con 30 ml de etanol y se
seca hasta peso constante a 45ºC bajo vacío. Se obtienen así 5,65 g
de ácido (R)
3-amino-3-(4'-nitrofenil)propanoico
en un exceso enantiomérico superior a 99%.
Las aguas madre se acidifican con 17,5 ml de
ácido clorhídrico 5N. El precipitado que se forma se filtra y se
lava 2 veces con 10 ml de agua destilada. La torta obtenida se seca
a vacío hasta peso constante a 45ºC. Se obtienen así 8,25 g de
ácido (S)
3-(glutarilamida)-3-(4'-nitrofenil)propanoico
y ácido (R)
3-(glutarilamida)-3-(4'-nitrofenil)propanoico
en una relación 91:9. La naturaleza de los productos obtenidos se
determina por HPLC.
20,5 g del ácido obtenido en la etapa a) se
disuelven en 75 ml de agua destilada. El pH de la suspensión se
ajusta a 8,2 añadiendo 11,9 ml de hidróxido de sodio al 30%
(peso/volumen). A esta solución se añaden 6,2 g (632,4 unidades) de
glutaril-7-ACA acilasa inmovilizada
húmeda (Roche Diagnostic GmbH). La mezcla de reacción se agita
durante 18 horas a 35ºC y a pH controlado y ajustado entre 7,9 y
8,1. Al final de la reacción, el pH de la mezcla de reacción se
ajusta a 9,5 por adición de hidróxido de sodio al 30% (peso/volumen)
y el volumen de la mezcla de reacción se ajusta a 200 ml de modo a
disolver el ácido (R)
3-amino-3-(4'-nitrofenil)
propanoico producido. La enzima inmovilizada se separa por
filtración y el pH de las aguas madre se ajusta a 7,0 por adición
de ácido clorhídrico 5N. Se añaden entonces a la mezcla de reacción
50 ml de etanol. El ácido (R)
3-amino-3-(4'-nitrofenil)
propanoico precipitado se filtra, se lava con 10 ml de etanol y se
seca hasta peso constante a 45ºC bajo vacío. Se obtienen así 5,375
g de ácido (R)
3-amino-3-(4'-nitrofenil)
propanoico con un exceso enantiomérico superior a 98%.
Las aguas madre se acidifican con 20 ml de ácido
clorhídrico 5N. El precipitado que se forma se filtra y se lava 2
veces con 15 ml de agua destilada. La torta se seca hasta peso
constante a 45ºC a vacío. Se obtienen así 6 g de ácido (S)
3-(glutarilamida)-3-(4'-nitrofenil)propanoico
con una relación 94:6.
La naturaleza de los productos obtenidos se
determina por HPLC.
100 g de ácido
3-amino-3-(4'-nitrofenil)
propanoico racémico obtenido como en la etapa a) se disuelven en
400 ml de agua destilada. El pH de la suspensión se ajusta a 8,2
añadiendo 60 ml de sosa al 30% (peso/volumen). A esta solución se
añaden 6,4 mg (4653 unidades) de una suspensión de
glutaril-7-ACA acilasa cristalizada.
La mezcla de reacción se agita durante 30 horas a 35ºC y a pH
controlado y ajustado entre 7,9 y 8,1. Al final de la reacción, la
mezcla de reacción se enfría a 20ºC y el pH se ajusta a 13 por
adición de 25 ml de sosa al 30% (peso/volumen) de modo a que se
disuelva el ácido (R)
3-amino-3-(4'-nitrofenil)propanoico
formado. Las partículas insolubles se filtran y el pH de las aguas
madre se ajusta a 7,0 por adición de 27 ml de ácido clorhídrico al
36%. Se añaden entonces a la mezcla de reacción 100 ml de etanol. El
precipitado de ácido (R)
3-amino-3-(4'-nitrofenil)propanoico
obtenido se filtra, se lava 2 veces con 100 ml de etanol y se seca
hasta peso constante a 45ºC bajo vacío. Se obtienen así 28,87 g de
ácido (R)
3-amino-3-(4'-nitrofenil)
propanoico en un exceso enantiomérico igual a 97%.
La naturaleza del producto obtenido se determina
por HPLC.
488 g de ácido
3-amino-3-fenilpropanoico
racémico se disuelven en 2 litros de agua destilada que contiene
236 g de sosa en forma de pastillas. A la mezcla de reacción se
añaden en pequeñas porciones, durante 1 hora, 437,5 g de anhídrido
glutárico, bajo agitación y a 20ºC. Después de 1 hora, la mezcla de
reacción se acidifica con 236 ml de ácido sulfúrico al 95%
(peso/volumen) y enfriado a 10ºC. El precipitado así formado se
filtra, después se lava 3 veces con 600 ml de agua destilada. La
torta húmeda de 1610 g, así obtenida, contiene 602 g de ácido
3-glutarilamida-3-fenilpropanoico
racémico. La naturaleza de los productos obtenidos se determina por
HPLC.
1575 g de la torta húmeda obtenida
anteriormente, que contiene 589 g de ácido
3-glutarilamida-3-fenilpropanoico
racémico, se disuelven en 1610 ml de agua destilada. El pH de la
suspensión se ajusta a 8,0 añadiendo 440 ml de sosa al 30%
(peso/volumen). A esta solución se añaden 52,6 mg (32000 unidades)
de una suspensión de glutaril-7-ACA
acilasa cristalizada. La mezcla de reacción se agita durante 41
horas a 35ºC y a pH controlado y ajustado entre 7,9 y 8,1. Al final
de la reacción, la mezcla de reacción se enfría a 20ºC y el pH se
ajusta a 13 por adición de 25 ml de hidróxido de sodio al 30%
(peso/volumen) de modo a disolver el ácido (R)
3-amino-3-(4'-nitrofenil)propanoico
producido. Las partículas insolubles se filtran y el pH de las
aguas madre se ajusta a 7,0 por adición de 27 ml de ácido
clorhídrico al 36%.
El precipitado de ácido (R)
3-amino-3-fenilpropanoico
así obtenido se filtra, se lava con 150 ml de agua destilada y se
seca hasta peso constante a 45ºC bajo vacío. Se obtienen así 96,9 g
de ácido (R)
3-amino-3-fenilpropanoico
con un exceso enantiomérico igual a 98%.
Las aguas madre se acidifican con 180 ml de
ácido sulfúrico al 95% (peso/volumen). El precipitado así formado
se filtra y se lava 2 veces con 400 ml de agua destilada
refrigerada. La torta se seca hasta peso constante a 45ºC a vacío.
Se obtienen así 314,6 g de ácido (S)
3-(glutarilamida)-3-fenilpropanoico
y ácido (R)
3-(glutarilamida)-3-fenilpropanoico
en una relación 90:10.
La naturaleza de los productos obtenidos se
determina por HPLC.
557,2 g de una mezcla de ácido (S)
3-glutarilamida-3-fenilpropanoico
y ácido (R)
3-glutarilamida-3-fenilpropanoico
en una relación 90:10 obtenidos en la etapa b) precedente se
disuelven en 3,91 litros de agua destilada y 1,65 litros de sosa al
30% (peso/volumen). La mezcla de reacción se agita a durante 4 días
a 70ºC.
Después, la mezcla de reacción se enfría a 15ºC.
El producto obtenido se precipita ajustando el pH a 6,9 por adición
de 3,21 litros de ácido clorhídrico al 37% (peso/volumen), se filtra
y se seca hasta peso constante a 45ºC bajo vacío. Se obtienen así
202,4 g de ácido (S)
3-amino-3-fenilpropanoico
y ácido (R)
3-amino-3-fenilpropanoico
con un exceso enantiomérico superior a 98%.
La naturaleza de los productos obtenidos se
determina por HPLC.
Claims (15)
1. Procedimiento de separación de los
enantiómeros de un aminoácido o de un éster de aminoácido; que
consiste en tratar una mezcla racémica de dicho aminoácido con
anhídrido glutárico, después con la enzima glutaril
7-ACA acilasa de modo que se recupera uno de los
enantiómeros de dicho aminoácido, permaneciendo el otro enantiómero
en forma de derivado de la glutarilamida correspondiente.
2. Procedimiento según la reivindicación
1, caracterizado porque dicho aminoácido o éster de
aminoácido tiene por fórmula general:
en la
que:
- -
- n es un número entero seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6,
- -
- R representa un átomo de hidrógeno o bien un radical alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, arilo, un hidrocarburo policíclico condensado, o un heterociclo, estando eventualmente sustituidos todos estos radicales,
- -
- y R' representa un radical alquilo, alqueno, alquino, cicloalquilo, arilo, un hidrocarburo policíclico condensado, un heterociclo, o bien un radical oxi, tio, sulfóxido o sulfonilo substituido con un grupo alquilo, arilo, cicloalquilo o un heterociclo, estando además todos estos radicales eventualmente sustituidos.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque dicho aminoácido o éster de aminoácido
se selecciona entre los compuestos de fórmula general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual n es un número entero
elegido entre 0, 1, 2 o 3, R representa un átomo de hidrógeno o bien
un radical alquilo o arilo y R' es tal como se define en la
reivindicación
2.
4. Procedimiento según la reivindicación
2 o 3, caracterizado porque dicho aminoácido o éster de
aminoácido se selecciona entre los compuestos de fórmula general
(I):
en la cual n es un número entero
igual a 0, 1 o 2, R representa un átomo de hidrógeno o bien una
función alquilo y R' se selecciona entre los arilos o los
heterociclos eventualmente
sustituidos.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la enzima
glutaril-7-ACA acilasa se utiliza
en forma soluble o inmovilizada.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
cantidad de enzimas empleada con relación a la cantidad total de
aminoácido o de éster de aminoácido de partida (sustrato) está
comprendida entre 1 y 100 unidades por mmoles de sustrato.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
reacción se efectúa en medio acuoso tamponado.
8. Procedimiento según la reivindicación
7, caracterizado porque dicho tampón acuoso tiene una
concentración comprendida entre 10 mM y 200 mM y se selecciona
entre los tampones acetato utilizables a pH comprendido entre 5 y
6,5, o los tampones fosfato utilizables a pH comprendido entre 6,5 y
8, o los tampones pirofosfato utilizables a pH comprendido entre 8
y 9.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el pH esta
controlado y ajustado entre 6 y 9.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
tratamiento del aminoácido o del éster de aminoácido con anhídrido
glutárico se realiza a una temperatura comprendida entre 20ºC y
40ºC.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
tratamiento con la enzima glutaril 7-ACA acilasa
se efectúa a una temperatura comprendida entre 10ºC y 50ºC.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tiempo
de reacción varía entre 1 y 100 horas.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque, además,
se separan los enantiómeros (R) y (S).
14. Procedimiento según la reivindicación
13, caracterizado porque dicha separación de los enantiómeros
(R) y (S) se efectúa por filtración, extracción, cromatografía o
cristalización.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 13 o 14, caracterizado porque el enantiómero
derivado de la glutarilamida que ha sido separado, se hidroliza
además, de modo que se recupera el aminoácido correspondiente en
forma de enantiómero.
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