KR100924241B1 - 아미노산의 에난티오머를 분할하기 위한 효소적 방법 - Google Patents

아미노산의 에난티오머를 분할하기 위한 효소적 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미노산의 에난티오머 분할에 사용되는 신규한 효소적 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 당해 아미노산의 에난티오머 분리방법은 아미노산의 라세미 혼합물을 글루타르산 무수물로 처리한 후, 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제로 처리하여 당해 아미노산의 에난티오머 중 1종을 회수하고 나머지 1종의 에난티오머는 상응하는 글루타릴아미드 유도체 형태로 잔류시킴을 포함한다.
아미노산의 에난티오머 분할, 글루타르산 무수물, 글루타릴-7-ACA 아실라제, 에난티오머 순도

Description

아미노산의 에난티오머를 분할하기 위한 효소적 방법{Enzymatic method for the enantiomeric resolution of amino acids}
본 발명은 라세미 혼합물 형태로 존재하는 아미노산의 에난티오머를 분할하기 위한 신규한 효소적 방법에 관한 것이다.
아미노산은 종종 모든 종류의 산업분야에서, 예를 들면, 생물학적 활성 화합물로서 또는 특히 약제학적, 화학적 또는 농업적 목적을 위한 화합물 제조용 합성 중간체로서 사용된다. 따라서, 이러한 아미노산의 1종 또는 다른 1종의 광학 활성 에난티오머를 수득하는 것이 필요함이 매우 급속도로 입증되었다. 따라서, 예비-키랄성 아미노산의 에난티오머를 분리하는 다수의 방법이 개발되었다. 특히, 이들의 에난티오머를 분할하기 위한 효소적 방법이 비대칭 합성 방법에 대한 유리한 대안인 것으로 밝혀졌다.
따라서, 솔로쇼녹(Soloshonok) 등[참조: Tetrahedron: Assymetry, Vol. 6(7), 1995, pp. 1601-1610]은 아래의 반응식에 따라 β-아미노산의 에난티오머를 분할하기 위한 효소적 방법을 사용하였다:
Figure 112004009110346-pct00001
유사하게 톱기(Topgi) 등[참조: Bioorg. & Med. Chem. 1999, Vol. 7, pp. 2221-2229]은 아래의 반응식 중 하나에 따라서 에틸 3-아미노-4-펜티노에이트의 (R) 및 (S) 에난티오머를 순수한 에난티오머 형태로 분할하는 방법을 개발하였다:
Figure 112004009110346-pct00002
(최초의 페닐아세트아미드는 상응하는 아민을 페닐아세트산과 반응시켜 아실 화함으로써 수득된다) 또는:
Figure 112007063411343-pct00016
국제 공개공보 WO 제98/50575호에는, 아래의 반응식에 따라서 키랄성 β-아미노산의 라세미 혼합물을, 이의 에난티오머 중 1종을 상응하는 이의 N-아실화 유도체로 입체선택적으로 아실화하기에 적합한 조건하에, 아실 공여체 및 효소 페니실린 G 아실라제(또는 아미도하이드롤라제)와 접촉시키고 β-아미노산의 에난티오머 중 나머지 1종을 에난티오머 함량이 높은 상태로 수득함을 포함하는, 키랄성 β-아미노산의 제조방법이 보다 일반적인 견지에서 기재되어 있으며, 여기서, 당해 "아실 공여체"는 화학식
Figure 112009055666977-pct00004
의 그룹(여기서, R3은 페닐, 페녹시, 아미노, 페닐의 각종 유도체 및 피리딜이고, R4는 당 또는 스테로이드로부터의 하이드록실, 알콕시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아닐 및 아닐알킬 치환체로부터 선택된다)이다:
Figure 112004009110346-pct00005
또한, 국제 공개공보 WO 제98/50575호에는, 아래의 반응식에 따라서 라세미 형태의 아미드를, 이의 에난티오머 중 1종을 상응하는 이의 β-아미노산으로 선택적으로 탈아실화하기에 적합한 조건하에, 효소 페니실린 G 아실라제와 접촉시키고 당해 아미드의 에난티오머 중 나머지 1종을 에난티오머 함량이 높은 상태로 수득함을 포함하는, 키랄성 β-아미노산의 또 다른 제조방법이 기재되어 있다:
Figure 112004009110346-pct00006
그러나, 위에 논의된 방법은 다음과 같이 간략하게 나타낼 수 있는 화학식의 중간체 아미드로 인해, 상기와 같은 효소적 단계 이전에 또는 그와 동시에 진행상 의 큰 단점을 갖고 있다:
Figure 112004009110346-pct00007
이러한 아미드는 방향족 핵이 존재하기 때문에 수성 매질에 불용성이라는 단점을 갖고 있다. 예를 들면, 특정 효소는 수성 매질에 가용성이고 종종 유기 용매의 존재에 민감하다고 알려져 있다. 그러나, 효소 반응의 수율을 최적화하기 위해서는 효소에 비해 기질의 가용성이 양호하여 이들이 밀접하게 접촉할 수 있게 하는 것이 중요하다.
본 발명이 해결하고자 하는 것은 주로 이러한 단점이다. 사실, 본 발명은 한 양태에 따라서, 아미노산의 라세미 혼합물을 글루타르산 무수물로 처리한 후, 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제로 처리하여 당해 아미노산의 에난티오머 중 1종을 회수하고 나머지 1종의 에난티오머는 상응하는 글루타릴아미드 유도체 형태로 잔류시킴을 포함하여, 아미노산의 에난티오머를 분리하는 신규한 방법을 제공한다.
당해 방법은, 글루타르산 무수물을 사용하여 중간에 최초의 아미노산에 상응하는 글루타릴아미드 유도체를 통해(글루타릴은 분자에 수성 매질에서의 가용성을 제공하는 작용을 한다) 최초의 아미노산으로 가공할 수 있기 때문에, 특히 유리하다. 결과적으로, 본 발명의 방법은 온화한 반응 조건하에 수성 매질 속(즉 특히 유기 공용매(cosolvent)를 사용하지 않음)에서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 모든 형태의 아미노산(α, β, γ 등)에 광범위하게 적용할 수 있다는 이점이 있다. 본원에서, 일반적인 용어 "아미노산"은 상기와 같은 아미노산(즉 아미노 관능기 및 산 관능기 -COOH를 포함하는 화합물) 뿐만 아니라, 상응하는 에스테르 유도체(즉 산 관능기가 에스테르 관능기 COOR에 의해 치환된 화합물)도 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 더욱 특히 화학식 I의 아미노산에 적용된다.
Figure 112004009110346-pct00008
위의 화학식 I에서,
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 정수이고,
R은 수소원자이거나, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 아릴 라디칼, 축합된 다환식 탄화수소 또는 헤테로사이클이고, 이들 라디칼 모두 임의로 치환되고,
R'은 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 아릴 라디칼, 축합된 다환식 탄화수소 또는 헤테로사이클이거나, 알킬, 아릴, 사이클로알킬 그룹 또는 헤테로사이클에 의해 치환된 옥시, 티오, 설폭사이드 또는 설포닐 라디칼이고, 이들 라디칼 모두 임의로 치환된다.
따라서, 아미노산이 화학식 I의 화합물인 경우, 본 발명의 방법은 도 1의 반응식으로 나타낼 수 있다. 당해 반응식은 글루타르산 무수물로 처리하는 제1 단계 및 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제로 처리하는 제2 단계를 제시한다. 수득된 생성물(즉, 한쪽은 아미노산, 다른 쪽은 글루타릴아미드 유도체) 각각의 배열은 라디칼 R'의 성질에 따라 달라진다.
본원에서 알킬, 알켄 및 알킨 라디칼은 일반적으로 탄소수 1 내지 30의 직쇄 또는 측쇄를 포함지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 이는 또한, 이들 라디칼이 다른 라디칼의 치환체인 경우에도 적용된다. 이들 라디칼은 바람직하게는 탄소수 1 내지 20의 직쇄 또는 측쇄, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 내지 10의 직쇄 또는 측쇄를 포함한다. 알킬 라디칼은, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, n-운데실, n-도데실, n-트리데실, n-펜타데실, n-헥사데실, n-헵타데실, n-옥타데실, 이소프로필, 이소부틸, 이소펜틸, 이소헥실, 3-메틸펜틸, 네오펜틸, 네오헥실, 2,3,5-트리메틸헥실, 2급-부틸, 3급-부틸 및 3급-펜틸로부터 선택될 수 있다. 바람직한 알킬 라디칼은, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, n-헥실 및 이소헥실이다. 알켄 라디칼은, 예를 들면, 비닐, 1-프로페닐, 알릴, 부테닐, 2-메틸-1-프로페닐, 2-메틸-2-프로페닐 및 3-메틸-2-부테닐로부터 선택될 수 있다. 알킨 라디칼은, 예를 들면, 에티닐, 1-프로피닐 또는 프로파닐로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사이클로알킬 라디칼은 일반적으로 3 내지 12개의 탄소원자를 함유할 수 있다. 이들은 바람직하게는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실, 사이클로운데실 및 사이클로도데실로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 사이클로알킬은 다환식 사이클로알킬일 수 있다. 바람직하게는, 이들 라디칼은 바이사이클로알킬 및 트리사이클로알킬로부터 선택된다.
본 발명에 따라서, 용어 "아릴" 라디칼은 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 아릴 중에서 임의로 치환된 페닐이 바람직하다.
본원에서 용어 "축합된 다환식 탄화수소"는 바람직하게는 펜탈렌, 인덴, 나프탈렌, 아줄렌, 헵탈렌, 비페닐렌, as-인다센, s-인다센, 아세나프틸렌, 플루오렌, 페날렌, 페난트렌, 안트라센, 플루오란텐, 아세펜안트릴렌, 아세안트릴렌, 트리페닐렌, 피렌, 크리센, 나프타센, 플레이아덴, 피센, 페릴렌, 펜타펜, 펜타센, 테트라페닐렌, 헥사펜, 헥사센, 루비센, 코로넨, 트리나프틸렌, 헵타펜, 헵타센, 피란트렌 또는 오발렌으로부터 선택된 라디칼을 의미한다.
본원에서 용어 "헤테로사이클"은 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 일환식 또는 융합된 다환식 화합물을 나타내며, 여기서 각각의 환은 3 내지 10원 환이다. 본 발명에 따르는 헤테로사이클은 바람직하게는 3 내지 10원 환 내에 산소, 황 및 질소로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다. 본 발명의 헤테로사이클은 바람직하게는 티오펜, 벤조[b]티오펜, 나프토[2,3-b]티오펜, 티안트렌, 푸란, 2H-피란, 이소벤조푸란, 2H-크로멘, 크산텐, 페녹사티인, 2H-피롤, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 3H-인돌, 인돌, 1H-인다졸, 푸린, 4H-퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 1,8-나프티리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 4a H-카바졸, 카바졸, β-카볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 페리미딘, 1,7-페난트롤린, 페나진, 페나르사진, 이소티아졸, 페노티아진, 이속사졸, 푸라잔, 페녹사진, 이소크로만, 피롤리딘, Δ2-피롤린, 이미다졸리딘, Δ2-이미다졸린, 피라졸리딘, Δ3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌린, 이소인돌린, 퀴누클리딘 및 모르폴린으로부터 선택된다.
본 발명의 범주에서, 본원에서 위에 정의한 바와 같은 각종 라디칼이 치환되는 경우, 일반적으로 당해 치환체(들)은 라디칼의 성질에 따라 할로겐 원자, 아릴, 헤테로사이클, 하이드록실, 알콕시, 아릴옥시, 티올, 알킬티오, 아릴티오, 알킬 설폭사이드, 아릴 설폭사이드, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 시아노, 니트로, 설폰아미드, 알킬설폰아미드 및 아릴설폰아미드 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 위에 정의한 바와 같은 각종 라디칼은 1, 2 또는 3회 치환된다. 바람직한 양태에 따라서, 할로겐 원자는 염소, 불소, 브롬 및 요오드로부터 선택된다. 알킬 라디칼이 할로겐 원자에 의해 치환되는 경우, 당해 원자는 바람직하게는 불소원자이다. 불소 치환체의 갯수는 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7이다. 예를 들면, 당해 그룹은 트리플루오로메틸 그룹일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 아미노산은 n이 0, 1, 2 및 3으로부터 선택된 정수이고, R이 수소원자, 알킬 또는 아릴 라디칼이고, R'이 위에 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 아미노산은 n이 0, 1 또는 2의 정수이고, R이 수소원자 또는 알킬 그룹이고, R'이 임의로 치환된 헤테로사이클 및 아릴로부터 선택되는 화학식 I의 화합물로부터 선택된다. 후자의 경우, 아릴 및/또는 헤테로사이클 라디칼은 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 치환된다.
효소 글루타릴-7-ACA 아실라제는 특히 N-글루타릴-7-아미노아세톡시세팔로스포린산과 같은 β-락탐의 가수분해를 위해서 다수의 산업공정에서 이미 촉매로서 사용되어 왔다. 이는 당해 분야의 숙련가, 효소 전문가에게 익히 공지되어 있는 기술에 따라, 예를 들면, 아시네토박터(Acinetobacter), 아트로박터(Arthrobacter), 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 또는 크산토모나스(Xanthomonas) 속의 다수의 미생물로부터 유도될 수 있다. 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제는 또한 로쉐 디아그노스틱 게엠베하(Roche Diagnostic GmbH)(독일 데-68305 만하임 스탄트호퍼 슈트라쎄 116 로쉐 몰리큘러 바이오케미칼스) 또는 레코르다티 에스.피.에이.(Recordati S.p.A.)(이탈리아 아이-20090 오페라(밀란) 비아 람브로 38 스타빌리멘토 디 오페라)로부터 구입할 수 있다.
효소 글루타릴-7-ACA 아실라제는 이의 입체특이성 및 입체선택성을 개질시키지 않고서 각종 형태로 사용할 수 있다. 예를 들면, 글루타릴-7-ACA 아실라제는 가용성 형태 또는 고정화 형태로 사용할 수 있다. 고정화 형태의 경우, 일반적으로 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있는 기술에 따라서 효소를 고정화시킨다. 예를 들면, 효소를 중합체성 겔 속에 함유시키거나 공유결합, 가교결합, 흡착 또는 봉입(encapsulation)에 의해 고체 지지체에 부착시킬 수 있다. 통상적으로 사용되는 적합한 지지체는, 예를 들면, 다공성 유리, 다공성 세라믹, 합성 중합체(예를 들면, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌, 폴리아미드 또는 폴리아크릴아미드) 또는 천연 기원의 중합체(예를 들면, 셀룰로스)이다.
효소 글루타릴-7-ACA 아실라제를 사용함으로써, 각각의 에난티오머에 대해 높은 에난티오머 순도(enantiomeric excess)("ee"), 특히 90% 이상, 심지어는 95% 이상, 바람직하게는 99% 이상의 에난티오머 순도를 수득할 수 있다. 본원에서 "에난티오머 순도"는 라세미 혼합물에 대한 1종의 에난티오머의 초과량(%)을 의미한다. 보다 구체적으로는, 에난티오머 순도는 아래와 같이 계산한다:
Figure 112004009110346-pct00009
(여기서, [R] 및 [S]는 각각 (R) 및 (S) 에난티오머의 농도를 나타낸다)
일반적으로, 최초의 아미노산(기질)의 총량에 대한 효소의 사용량은 기질 1mmol당 1 내지 100단위(U), 바람직하게는 10 내지 40단위이다. 효소 1단위는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 표준 pH 및 온도 조건하에 1분당 N-글루타릴-7-아미노아세톡시세팔로스포린산 1μmol을 가수분해하는 데 필요한 효소의 양에 상응한다.
본 발명에 따라서, 반응은 임의로 완충된 수성 매질 속에서 수행한다. 이 경우, 수성 완충액은 농도가 10 내지 200mM이고 pH 5 내지 6.5에서 사용할 수 있는 아세테이트 완충액, pH 6.5 내지 8에서 사용할 수 있는 인산염 완충액 및 pH 8 내지 9에서 사용할 수 있는 피로인산염 완충액으로부터 선택할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 pH가 모니터링되고 6 내지 9로 조정되는 매질 속에서 수행한다. 바람직하게는, 반응 매질의 pH는 모니터링되고 특히 7.5 내지 8.5, 더욱 바람직하게는 8 내지 8.5로 조정된다. pH는 산, 예를 들면, 염산, 황산 또는 황산 및 염기, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수성 암모니아를 가함으로써 pH-스타트(pH-stat)를 사용하여 모니터링할 수 있다.
본 발명에 따라 아미노산을 글루타르산 무수물로 처리하는 단계는 20 내지 40℃, 바람직하게는 25 내지 35℃에서 수행한다. 또한, 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제를 사용하는 제2 단계는 10 내지 50℃, 바람직하게는 25 내지 35℃에서 수행한다.
마지막으로, 반응 시간은 광범위하게 1 내지 100시간일 수 있고, 특히 관련된 아미노산 및 효소 농도에 따라 달라진다. 일반적으로, 반응은 목적하는 에난티오머를 만족스러운 에난티오머 순도로 수득하는 데 필요한 만큼 장시간 동안 진행시킨다. 수득된 키랄성 아미노산의 양 및 에난티오머 순도 값은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 통상적인 기술을 사용하여 모니터링한다. 유리하게는, 모니터링은 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)를 사용하여 수행한다.
본 발명에 따라서, 위에 기재된 방법으로 수득한 (R) 및 (S) 에난티오머를 용이하게 분리할 수 있는데, 이는 이중 1종은 수성 매질에 가용성인 아민 형태로 존재하고 나머지 1종은 고체 아미드 형태로 존재하기 때문이다. 결과적으로, 본 발명의 추가의 양태는 후속적인 단계로서 (R) 및 (S) 에난티오머의 분리 단계를 포함하는 위에 기재된 방법에 관한 것이다.
당해 (R) 및 (S) 에난티오머의 분리는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 통상적인 기술을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다. 이는, 예를 들면, 여과, 추출, 크로마토그래피 또는 결정화 방법으로 수행한다.
나머지 1종의 에난티오머를 글루타릴아미드 유도체 형태가 아니라 아미노산 형태로 분리하고자 하는 경우, 이어서, 위에 기재된 방법에 따라서 분리된 글루타릴아미드 유도체의 당해 에난티오머를 가수분해하여 상응하는 아미노산을 에난티오머 형태로 회수한다. 당해 방법은, 가수분해에 의해, 사용된 화합물의 입체화학이 유지되고 키랄성 글루타릴아미드 유도체의 라세미화는 유도되지 않기 때문에 유리하다는 사실에 주목해야 한다. 아미노산이 화학식 I의 화합물인 경우, 당해 추가의 단계는 도 2에 따르는 반응식으로 나타낼 수 있다.
가수분해는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 통상적인 기술에 따라서 수행한다. 당해 가수분해는 특히 산성 또는 염기성 가수분해일 수 있다. 후자의 경우, 예를 들면, 염기, 예를 들면, 수산화나트륨의 존재하에 50 내지 90℃의 온도에서 대기압하에 수행한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 적합한 다른 임의의 공정 조건도 사용할 수 있다.
본 발명은 라세미 형태의 아미노산을 분할함으로써 당해 아미노산의 에난티오머 중 1종 또는 나머지 1종을 수득할 수 있다는 점에서 유용하다(당해 에난티오머는 특히 합성 중간체를 구성한다).
예를 들면, 본 발명에 의해, 특히 천식 질환과 관련된 VLA4 수용체 길항제인 화학식
Figure 112004009110346-pct00010
의 화합물의 합성시 중간체를 구성하는 (S)-3-아미노-3-페닐프로판산을 수득할 수 있다.
본 발명은 앞의 기재사항 뿐만 아니라, 아래의 실시예로부터 실현되는 특징 및 이점을 포함하며, 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 본 발명을 설명하기 위한 것으로 간주해야 한다.
도면
도 1: 본 발명에 따르는 화학식 I의 아미노산을 글루타르산 무수물로 처리하는 제1 처리 단계 및 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제로 처리하는 제2 단계를 나타낸다. 수득된 생성물(즉, 한쪽은 아미노산, 다른 쪽은 글루타릴아미드 유도체) 각각의 배위는 라디칼 R'의 성질에 따라 달라진다.
도 2: 키랄성 글루타릴아미드 유도체를 가수분해시켜 이의 상응하는 키랄성 아미노산으로 전환시키는 단계를 나타낸다.
실시예
실시예 1: 라세미 혼합물 형태의 3-아미노-3-(4'-니트로페닐)-프로판산의 분할
(a) 라세미 3-아미노-3-(4'-니트로페닐)-프로판산의 아실화
라세미 3-아미노-3-(4'-니트로페닐)-프로판산 40.6g을 증류수 200ml 및 트리에틸아민 55ml에 용해시킨다. 글루타르산 무수물 29.4g을 소량의 분획으로 나누어 가하고 반응 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 이어서, 반응 혼합물을 95%(w/v) 황산 8.2ml로 산성화시킨다. 이렇게 하여 수득한 침전물을 여과제거하고 증류수 15ml로 3회 세척한 후, 진공하에 55℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다. 이로써 라세미 3-(글루타릴아미드)-3-(4'-니트로페닐)프로판산 52.84g을 수득한다. 수득된 생성물의 특성은 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 측정한다.
(b) 현탁액 중의 결정성 글루타릴-7-ACA 아실라제를 사용하는 효소적 탈아실화(100ml 반응기)
앞 단계에서 수득한 산 20g을 증류수 75ml에 용해시킨다. 현탁액의 pH를 30%(w/v) 수산화나트륨 11.2ml를 가하여 8.2로 조정한다. 결정성 글루타릴-7-ACA 아실라제 현탁액 826mg(626단위)을 당해 용액에 가한다. 반응 혼합물을 35℃에서 51시간 동안, 모니터링되고 7.9 내지 8.1로 조정되는 pH에서 교반한다. 반응 종결시 반응 혼합물을 20 ℃로 냉각시키고, 5N 염산을 가하여 pH를 7.0으로 조정한다. 이어서, 에탄올 20ml를 가한다. 수득된 (R)-3-아미노-3-(4'-니트로페닐)프로판산 침전물을 여과제거하고, 에탄올 30ml로 3회 세척한 후, 진공하에 45℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다. 이로써, 에난티오머 순도가 99%를 초과하는 (R)-3-아미노-3-(4'-니트로페닐)프로판산 5.65g을 수득한다.
모액을 5N 염산 17.5ml로 산성화한다. 형성된 침전물을 여과제거하고 증류수 10ml로 2회 세척한다. 수득된 여과 케이크를 진공하에 45℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다. 이로써 91:9 비율의 (S)-3-(글루타릴아미드)-3-(4'-니트로페닐)프로판산 및 (R)-3-(글루타릴아미드)-3-(4'-니트로페닐)프로판산 8.25g을 수득한다. 수득된 생성물의 특성을 HPLC로 측정한다.
(c) 로쉐 디아그노스틱 게엠베하에서 시판중인 고정화 글루타릴-7-ACA 아실라제를 사용하는 효소적 탈아실화(100ml 반응기)
단계(a)에서 수득된 산 20.5g을 증류수 75ml에 용해시킨다. 현탁액의 pH를 30%(w/v) 수산화나트륨 11.9ml를 가하여 8.2로 조정한다. 습윤성 고정화 글루타릴-7-ACA 아실라제(로쉐 디아그노스틱 게엠베하) 6.2g(632.4단위)을 당해 용액에 가한다. 반응 혼합물을 35℃에서 18시간 동안, 모니터링되고 7.9 내지 8.1로 조정되는 pH에서 교반한다. 반응 종결시 30%(w/v) 수산화나트륨을 가하여 pH를 9.5로 조정하고, 반응 혼합물의 용적을 200ml로 조정하여 생성된 (R)-3-아미노-3-(4'-니트로페닐)프로판산을 용해시킨다. 고정화 효소를 여과제거하고 모액의 pH를 5N 염산을 가하여 7.0으로 조정한다. 이어서, 반응 혼합물에 에탄올 50ml를 가한다. 침전된 (R)-3-아미노-3-(4'-니트로페닐)프로판산을 여과제거하고 에탄올 10ml로 세척한 후, 진공하에 45℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다. 이로써, 에난티오머 순도가 98%인 (R)-3-아미노-3-(4'-니트로페닐)프로판산 5.375g을 수득한다.
모액을 5N 염산 20ml로 산성화한다. 형성된 침전물을 여과제거하고 증류수 15ml로 2회 세척한다. 여과 케이크를 진공하에 45℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다. 이로써, 94:6 비율의 (S)-3-(글루타릴아미드)-3-(4'-니트로페닐)프로판산 6g을 수득한다.
수득된 생성물의 특성을 HPLC로 측정한다.
(d) 현탁액 중의 결정성 글루타릴-7-ACA 아실라제를 사용하는 효소적 탈아실화(500ml 반응기)
단계(a)에서 수득된 라세미 3-(글루타릴아미드)-3-(4'-니트로페닐)프로판산 100g을 증류수 400ml에 용해시킨다. 현탁액의 pH를 30%(w/v) 수산화나트륨 60ml를 가하여 8.2로 조정한다. 결정성 글루타릴-7-ACA 아실라제 현탁액 6.4mg(4653단위)을 당해 용액에 가한다. 반응 혼합물을 35℃에서 30시간 동안, 모니터링되고 7.9 내지 8.1로 조정되는 pH에서 교반한다. 반응 종결시 반응 혼합물을 20℃로 냉각시키고, 30%(w/v) 수산화나트륨 25ml를 가하여 pH를 13으로 조정하여, 형성된 (R)-3-아미노-3-(4'-니트로페닐)프로판산을 용해시킨다. 불용성 입자를 여과하고 모액의 pH를 36% 염산 27ml를 가하여 7.0으로 조정한다. 이어서, 반응 혼합물에 에탄올 100ml를 가한다. 수득된 (R)-3-아미노-3-(4'-니트로페닐)프로판산 침전물을 여과제거하고 에탄올 100ml로 2회 세척한 후, 진공하에 45℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다. 이로써, 에난티오머 순도가 97%인 (R)-3-아미노-3-(4'-니트로페닐)프로판산 28.87g을 수득한다.
수득된 생성물의 특성을 HPLC로 측정한다.
실시예 2: 라세미 혼합물 형태의 3-아미노-3-페닐프로판산의 분할
(a) 라세미 3-아미노-3-페닐프로판산의 아실화
라세미 3-아미노-3-페닐프로판산 488g을, 펠렛 형태의 수산화나트륨 236g을 함유하는 증류수 2l에 용해시킨다. 글루타르산 무수물 437.5g을 소량의 분획으로 나누어 1시간에 걸쳐서 20℃에서 반응 혼합물에 가하면서 교반한다. 1시간 후, 반응 혼합물을 95%(w/v) 황산 236ml로 산성화하고 10℃로 냉각시킨다. 이렇게 하여 형성된 침전물을 여과한 후, 증류수 600ml로 3회 세척한다. 이렇게 하여 수득된 습윤 여과 케이크 1610g은 라세미 3-글루타릴아미드-3-페닐프로판산 602g을 함유한다. 수득된 생성물의 특성을 HPLC로 측정한다.
(b) 현탁액 중의 결정성 글루타릴-7-ACA 아실라제를 사용하는 효소적 탈아실화(5l 반응기)
라세미 3-글루타릴아미드-3-페닐프로판산 589g을 함유하는 위에서 수득한 습윤 여과 케이크 1575g을 증류수 1610ml에 용해시킨다. 현탁액의 pH를 30%(w/v) 수산화나트륨 440ml를 가하여 8.0로 조정한다. 결정성 글루타릴-7-ACA 아실라제 현탁액 52.6g(32,000단위)을 당해 용액에 가한다. 반응 혼합물을 35℃에서 41시간 동안, 모니터링되고 7.9 내지 8.1로 조정되는 pH에서 교반한다. 반응 종결시 반응 혼합물을 20℃로 냉각시키고, 30%(w/v) 수산화나트륨 25ml를 가하여 pH를 13으로 조정하여, 형성된 (R)-3-아미노-3-(4'-니트로페닐)프로판산을 용해시킨다. 불용성 입자를 여과하고 모액의 pH를 36% 염산 27ml를 가하여 7.0으로 조정한다.
수득된 (R)-3-아미노-3-페닐프로판산 침전물을 여과제거하고 증류수 150ml로 세척한 후, 진공하에 45℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다. 이로써, 에난티오머 순도가 98%인 (R)-3-아미노-3-페닐프로판산 96.9g을 수득한다.
모액을 95%(w/v) 황산 180ml로 산성화한다. 이렇게 하여 형성된 침전물을 여과제거하고 냉각 증류수 400ml로 2회 세척한다. 여과 케이크를 진공하에 45℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다. 이로써, 90:10 비율의 (S)-3-(글루타릴아미드)-3-페닐프로판산 및 (R)-3-(글루타릴아미드)-3-페닐프로판산 314.6g을 수득한다.
수득된 생성물의 특성을 HPLC로 측정한다.
(c) 염기성 가수분해에 의한 (S)-3-글루타릴아미드-3-페닐프로판산의 탈아실화
단계(b)에서 수득한 90:10 비율의 (S)-3-글루타릴아미드-3-페닐프로판산과 (R)-3-글루타릴아미드-3-페닐프로판산의 혼합물 557.2g을 증류수 3.91l 및 30%(w/v) 수산화나트륨 1.65l에 용해시킨다. 반응 혼합물을 70℃에서 4일 동안 교반한다.
이어서, 반응 혼합물을 15℃로 냉각시킨다. 수득된 생성물을, 37%(중량/용적) 염산 3.21l를 가하여 pH를 6.9으로 조정하여 침전시키고 여과제거한 후, 진공하에 45℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조시킨다. 이로써, 에난티오머 순도가 98%를 초과하는 (S)-3-아미노-3-페닐프로판산 및 (R)-3-아미노-3-페닐프로판산 202.4g을 수득한다.
수득된 생성물의 특성을 HPLC로 측정한다.

Claims (17)

  1. 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 라세미 혼합물을 글루타르산 무수물로 처리한 후, 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제로 처리하여 당해 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 에난티오머 중 1종을 회수하고 나머지 1종의 에난티오머는 상응하는 글루타릴아미드 유도체 형태로 잔류시킴을 포함하여, 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 에난티오머를 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 에스테르가 화학식 I의 화합물임을 특징으로 하는 방법.
    화학식 I
    Figure 112009055666977-pct00011
    위의 화학식 I에서,
    n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 정수이고,
    R은 수소원자이거나, 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 아릴 라디칼, 축합된 다환식 탄화수소 또는 헤테로사이클이고, 이들 라디칼 모두는 치환되지 않거나 할로겐 원자, 아릴, 헤테로사이클, 하이드록실, 알콕시, 티올, 알킬티오, 아릴티오, 알킬 설폭사이드, 아릴 설폭사이드, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 시아노, 니트로, 설폰아미드, 알킬설폰아미드 및 아릴설폰아미드 그룹으로부터 선택된 치환체(들)에 의해 치환되고,
    R'은 알킬, 알켄, 알킨, 사이클로알킬, 아릴 라디칼, 축합된 다환식 탄화수소 또는 헤테로사이클이거나, 알킬, 아릴, 사이클로알킬 그룹 또는 헤테로사이클에 의해 치환된 옥시, 티오, 설폭사이드 또는 설포닐 라디칼이고, 이들 라디칼 모두는 치환되지 않거나 할로겐 원자, 아릴, 헤테로사이클, 하이드록실, 알콕시, 티올, 알킬티오, 아릴티오, 알킬 설폭사이드, 아릴 설폭사이드, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 시아노, 니트로, 설폰아미드, 알킬설폰아미드 및 아릴설폰아미드 그룹으로부터 선택된 치환체(들)에 의해 치환된다.
  3. 제2항에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 에스테르가, n이 0, 1, 2 및 3으로부터 선택된 정수이고, R이 수소원자, 알킬 또는 아릴 라디칼이고, R'이 제2항에서 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
    화학식 I
    Figure 112009055666977-pct00012
  4. 제2항 또는 제3항 있어서, 아미노산 또는 아미노산 에스테르가, n이 0, 1 또는 2의 정수이고, R이 수소원자 또는 알킬 그룹이고, R'이 치환되지 않거나 할로겐 원자, 아릴, 헤테로사이클, 하이드록실, 알콕시, 티올, 알킬티오, 아릴티오, 알킬 설폭사이드, 아릴 설폭사이드, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 시아노, 니트로, 설폰아미드, 알킬설폰아미드 및 아릴설폰아미드 그룹으로부터 선택된 치환체(들)에 의해 치환된 헤테로사이클 및 아릴로부터 선택되는 화학식 I의 화합물로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
    화학식 I
    Figure 112009055666977-pct00013
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제가 가용성 형태 또는 고정화 형태로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 기질로서의 최초의 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 총량에 대한 효소의 사용량이 기질 1mmol당 1 내지 100단위임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응이 완충된 수성 매질 속에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 수성 완충액이, 농도가 10 내지 200mM이고, pH 5 내지 6.5에서 사용할 수 있는 아세테이트 완충액, pH 6.5 내지 8에서 사용할 수 있는 인산염 완충액 및 pH 8 내지 9에서 사용할 수 있는 피로인산염 완충액으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, pH가 모니터링되고 6 내지 9로 조정됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 아미노산 또는 아미노산 에스테르를 글루타르산 무수물로 처리하는 단계가, 20 내지 40℃의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제로 처리하는 단계가, 10 내지 50℃의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응 시간이 1 내지 100시간임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, (R) 에난티오머 및 (S) 에난티오머를 분리함을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, (R) 에난티오머 및 (S) 에난티오머의 분리가 여과, 추출, 크로마토그래피 또는 결정화에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 분리된 글루타릴아미드로부터 유도된 에난티오머를 가수분해하여 상응하는 아미노산 또는 아미노산 에스테르를 에난티오머 형태로 회수함을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  16. (a) 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 라세미 혼합물을 글루타르산 무수물로 처리한 후, 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제로 처리하여 당해 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 에난티오머 중 1종을 회수하고 나머지 1종의 에난티오머는 상응하는 글루타릴아미드 유도체 형태로 잔류시키는 단계 및
    (b) 이렇게 하여 수득된 2종의 에난티오머를 분리하는 단계
    를 포함하여, 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 에난티오머를 분리하는 방법.
  17. (a) 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 라세미 혼합물을 글루타르산 무수물로 처리한 후, 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제로 처리하여 당해 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 에난티오머 중 1종을 회수하고 나머지 1종의 에난티오머는 상응하는 글루타릴아미드 유도체 형태로 잔류시키는 단계,
    (b) 이렇게 하여 수득된 2종의 에난티오머를 분리하는 단계 및
    (c) 글루타릴아미드로부터 유도된 에난티오머를 가수분해하여 상응하는 아미노산 또는 아미노산 에스테르를 에난티오머 형태로 회수하는 단계
    를 포함하여, 아미노산 또는 아미노산 에스테르의 에난티오머를 분리하는 방법.
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