DE60120986T2

DE60120986T2 - Nicht-peptidische ccr1 rezeptor-antagonisten in kombination mit cyclosporin a zur behandlung von herztransplantatabstossung

Info

Publication number: DE60120986T2
Application number: DE60120986T
Authority: DE
Inventors: Richard Lafayette HORUK
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2000-07-31
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2021-08-01
Also published as: LV13033B; WO2002009762A2; EP1305047B1; WO2002009762A3; DE60120986D1; KR20030048000A; CA2417636A1; DK1305047T3; PT1305047E; AU2001278073B2; HUP0300686A2; IL153933A0; NO20030475D0; BR0113140A; NO20030475L; AU7807301A; BG107502A; HRP20030121A2; JP2004530630A; HUP0300686A3

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die geeignet sind bei der Behandlung von Herztransplantatabstoßung in Säugern, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträger, eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Formel (I) und eine subnephrotoxische Menge Cyclosporin A. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Herztransplantatabstoßung in Säugern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine wichtige Komponente des Entzündungsprozesses umfasst die Migration und Aktivierung ausgewählter Leukozytenpopulationen aus dem Kreislauf und ihre Akkumulation in dem angegriffenen Gewebe. Wenngleich die Idee der Leukozytenwanderung nicht neu ist, erlebte sie jüngst eine Renaissance nachfolgend auf die Entdeckung und Charakterisierung der Selektin- und Integrin-Familien von Adhäsionsmolekülen und der großen Familie selektiver chemotaktischer Cytokine, die als Chemokine bekannt sind. Chemokinrezeptoren werden exprimiert auf Leukozyten und prozessieren die Signale nachfolgend auf die Bindung des Chemokins, wobei solche Signale schließlich umgewandelt werden in Migration oder Aktivierung der Leukozyten in Richtung der Quelle des Chemokins. Daher spielen durch Regulation der Migration und Aktivierung von Leukozyten von dem periphären Blut zu extravaskulären Stellen in Organen, Haut, Articulationen oder Bindegewebe, Cytokine eine kritische Rolle bei der Erhaltung der Wirtsabwehr als auch bei der Entwicklung der Immunantwort.
Ursprünglich wurde die Chemokinfamilie von Molekülen in zwei Gruppen unterteilt: die „C-X-C"-Subfamilie und die „C-C"-Subfamilie. Das charakteristische Merkmal dieser beiden Subfamilien ist das Vorliegen von vier Cysteinresten in hochkonservierten Positionen in den Molekülen. In der „C-C"-Chemokinsubfamilie sind die ersten beiden Reste zueinander benachbart, während in der „C-X-C"-Subfamilie ein einzelner Aminosäurerest die Cysteinreste trennt. Eine jüngere Beschreibung eines „-C-" Chemokins scheint eine neue Familie von Chemokinen darzustellen, in welcher dem „-C"-Chemolin zwei der vier Cysteinreste fehlen, die in der „C-C"-Subfamilie oder der „C-X-C"-Subfamilie vorliegen.
Ein Mitglied der „C-C"-Subfamilie von Chemokinen ist Makrophagenentzündungsprotein-1α („MIP-1α"). Es wird exprimiert durch Zellen, wie etwa Makrophagen, T- und B-Lymphozyten, Neutrophile und Fibroblasten. Eine jüngere Studie (siehe Karpus, W. J. et al., J. Immunol. (1995), Band 155, S. 5003-5010) liefert eine starke in vivo-Konzept-Validierung für eine Rolle von MIP-1α in einem experimentellen Maus-Autoimmunenzephalomyelitis („EAE")-Modell von multipler Sklerose. Multiple Sklerose ist eine Autoimmunerkrankung, die durch T- und B-Lymphozyten und Makrophagen vermittelt wird, was zu übermäßiger Entzündung und Demyelisierung von weißem Material in dem zentralen Nervensystem führt. Die Studie zeigte, dass Antikörper gegen MIP-1α die Entwicklung von sowohl Anfangserkrankung als auch Krankheitsrückfall verhinderten, als auch die Verhinderung der Infiltration von mononukleären Zellen in das zentrale Nervensystem. Die Behandlung mit den Antikörpern war ebenfalls in der Lage zum Verbessern der Schwere fortschreitender klinischer Erkrankung. Diese Ergebnisse führten die Forscher zu dem Schluss, dass MIP-1α eine wichtige Rolle in der Etiologie von multipler Sklerose spielt. Eine andere Untersuchung (siehe Godiska, R. et al., J. Neuroimmunol. (1995), Band 58, S. 167-176) zeigte das Hinaufregulieren von mRNA für eine Anzahl von Chemokinen, einschließlich MIP-1α in den Läsionen und dem Rückmark von SJL-Mäusen (ein Stamm von Mäusen, die suszeptibel für Th₁-Krankheiten sind, wie etwa EAE), während des Verlaufs von akuter EAE.
RANTES ist ein anderes Mitglied der C-C-Chemokin-Subfamilie (der Name RANTES ist ein Acronym, das abgeleitet ist von einigen der ursprünglich beobachteten und vorhergesagten Charakteristika des Proteins und seines Gens: Regulated upon Activation Normal T cell Expressed presumed Secreted (Reguliert nach Aktivierung, normale T-Zelle, exprimiert, vermutlich sezerniert)). Es wurde gefunden, dass eine große Vielzahl von Geweben RANTES in einem ähnlichen Muster wie MIP-1α exprimiert. Es gibt Hinweise aus einer Vielzahl von Studien, die abnormale Produktion von RANTES in das Fortschreiten von Rheumatoidarthritis zu implizieren (siehe Rathanaswami, P. et al., J. Biol. Chem. (1993), Band 268, S. 5834-5839 und Snowden, N. et al., Lancet (1994), Band 343, S. 547-548). Rheumatoidarthritis ist eine chronische Entzündungskrankheit, die zum Teil gekennzeichnet ist durch eine Memory-T-Lymphozyten- und Monocyt-Infiltration, wovon angenommen wird, dass sie vermittelt wird durch chemotaktische Faktoren, die freigesetzt werden durch entzündete Gewebe. Es gibt einen starken Hinweis aus anderen Untersuchungen, die RANTES in die Pathophysiologie von Rheumatoidarthritis einbeziehen (siehe Barnes, D.A. et al., J. Clin. Invest. (1998), Band 101, S. 2910-2919 und Plater-Zyberk, C.A. et al., Immunol. Lett. (1997), Band 57, S. 117-120). Zum Beispiel verringerten in einem Ratten-Hilfsstoff-induzierten Arthritis („AIA")-Modell Antikörper gegen RANTES die Entwicklung der Krankheit stark.
Diese und andere Untersuchungen liefern einen starken Hinweis, dass MIP-1α-Gehalte erhöht werden in EAE-Modellen multipler Sklerose und dass RANTES-Gehalte erhöht werden bei Rheumatoidarthritis (siehe z.B. Glabinski, A.R. et al., Am. J. Pathol. (1997), Band 150, S. 617-630; Glabinski, A.R. et al., Methods Enzymol. (1997), Band 288, S. 182-190; und Miyagishi, R.S. et al., J. Neuroimmunol. (1997), Band 77, S. 17-26). Zusätzlich, wie oben beschrieben, sind diese Chemokine Chemoattraktionsmittel für T-Zellen und Monozyten, welche die Hauptzelltypen sind, die an der Pathophysiologie dieser Krankheiten beteiligt sind. Daher würde jedes Molekül, das die Aktivität von jedem dieser Cytokine inhibiert, vorteilhaft sein bei der Behandlung dieser Krankheiten und würde daher geeignet sein als ein Antientzündungsmittel.
Es besteht ebenfalls ein starker Hinweis der Verbindung von RANTES mit Organtransplantatabstoßung. Die Infiltration von mononukleären Zellen in das Interstitium von Organtransplantaten ist das Kennzeichen akuter zellulärer Abstoßung. Dieses zelluläre Infiltrat besteht primär aus T-Zellen, Makrophagen und Eosinophilen. In einer Untersuchung von RANTES-Expression während akuter Renalallotranstransplantat-Abstoßung wurde RANTES-mRNA-Expression gefunden in infiltrierenden mononukleären Zellen und Nierentubulusepithelzellen und es wurde gefunden, dass RANTES an sich gebunden ist an die endotheliale Oberfläche der Mikrovaskulatur innerhalb des abgestoßenen Transplantats (siehe Pattison, J. et al., Lancet (1994), Band 343, S. 209-211 und Wiedermann, C.J. et al., Curr. Biol. (1993), Band 3, S. 735-739). Eine jüngere Studie (siehe Pattison, J.M. et al., J. Heart Lung Transplant. (1996), Band 15, S. 1194-1199) legt nahe, dass RANTES eine Rolle bei Transplantatatheriosklerose spielen kann. Erhöhte Gehalte von RANTES, sowohl mRNA als auch Protein, wurden in mononukleären Zellen, Myofibroblasten und Endothelzellen von Arterien, die beschleunigte Atherios Sklerose im Vergleich mit normalen Koronararterien eingehen, nachgewiesen.
Da RANTES ein Ligand für die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR5 ist, können dann diese Rezeptoren, lokalisiert auf im Kreislauf befindlichen mononukleären Zellen, geeignete therapeutische Targets in der Transplantationsbiologie sein. Die Wichtigkeit des CCR1-Rezeptors wurde in Herztransplantationsmodellen bei Mäusen untersucht, die eine Targetdeletion in dem CCR1-Gen trugen (Gao, W. et al., J. Clin. Invest. (2000), Band 105, S. 35-44). In dieser Untersuchung zeigten vier getrennte Modelle von Allotransplantat-Überleben wesentliche Verlängerung durch CCR1 (–/–)-Rezipienten. In einem Modell führten Gehalte von Cyclosporin A, die marginale Wirkungen in CCR1(+/+)-Mäusen hatten, zur permanenten Allotransplantat-Akzeptanz in CCR1(–/–)-Rezipienten.
Kürzlich wurde von bestimmten kleinen Molekülen gezeigt, dass sie Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten sind, durch Inhibieren der Aktivität von RANTES und MIP-1α, und daher geeignet sind als Antientzündungsmittel. Siehe die veröffentlichte PCT-Patentanmeldung WO 98/56771, U.S. Patentanmeldung, Seriennr. 09/094,397, eingereicht am 09. Juni 1998, nun U.S. Patent 6,207,665, veröffentlicht am 27. März 2001, Hesselgesser, J. et al., J. Biol. Chem. (1998), Band 273, S. 15687-15692, Ng, H.P. et al., J. Med. Chem. (1999), Band 42, S. 4680-4694, Liang, M. et al., Eur. J. Pharmacol. (2000a), Band 389, S. 41-49 und Liang, M. et al., J. Biol.. Chem. (2000b), Band 275, S. 19000-19008.
Cyclosporine sind eine Familie neutraler lipophiler cyclischer Oligopeptide (11-mere), produziert von dem Pilz Tolypocladium inflatum Gams als auch anderen Fungi-imperfecti. Die Hauptkomponente ist Cyclosporin A, ein allgemein bekanntes kommerziell erhältliches immunsuppressives Arzneimittel, das selektiv adaptive Immunantworten inhibiert durch Blockieren von T-Zell-Aktivierung (siehe Kahan, B.D., New Engl. J. Med. (1989), Band 321, S. 1725-1738 und Valantine, H., Transplant. Proc. (2000), Band 32, S. 275-445). Wenngleich Cyclosporin A ein kritischer Faktor im Erfolg der Organtransplantation gewesen ist, bleiben wesentliche Langzeitsicherheitsprobleme bestehen, die direkt verbunden sind mit auf Cyclosporin A basierender Immunsuppression, einschließlich Nephrotoxizität, Hypertension, Diabetes Mellitis und lymphoproliferativer post-Transplantat-Krankheit. Es wäre daher wünschenswert in der Lage zu sein, eine subnephrotoxische Dosis von Cyclosporin A zu verabreichen, wobei seine ungewünschten Nebenwirkungen verringert werden, während die immunsuppressive Aktivität beibehalten wird, die erforderlich ist zum Vermeiden chronischer Abstoßung, die im Falle von Herztransplantation als chronische Allotransplantat-Vasculopathie bekannt ist, prinzipiell manifestiert als beschleunigte Arteriosklerose.
Verwandte Veröffentlichungen
In einer kürzlichen Renaltransplantatuntersuchung verringerte der Peptid-Chemokinrezeptorantagonist Met-RANTES bei Verabreichung mit geringen Dosen Cyclosporin A wesentlich renales Trauma, bzw. Nierentrauma, einschließlich Interstitialentzündung, hauptsächlich durch Verringern der Anzahl infiltrierender Monozyten (Gröne, H.J. et al., FASEB J. (1999), Band 13, S. 1371-1383). Diese Untersuchung stützt die Theorie, dass RANTES durch Aktivierung spezifischer Chemokinrezeptoren auf mononukleären Zellen eine wichtige Rolle bei der Allotransplantatabstoßung spielt.
Die veröffentlichte europäische Patentanmeldung 1 000 626 und/oder WO 00/16796 (Applied Research Systems) offenbaren die Verwendung eines Peptid-Chemokinrezeptorantagonisten, Met-RANTES, zusammen mit einem Cyclosporin zur Behandlung oder Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen, Geweben oder Zellen.
WO 99/40061 betrifft Dihydroxyhexansäurederivate, Verfahren zur Verwendung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten. Im Besonderen wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Nicht-Peptid-CCR1-Antagonisten umfasst zur Behandlung von Transplantatgewebeabstoßung und/oder Arteriosklerose und die Kombination mit Immunsuppressionsmitteln, wie etwa Cyclosporin A, offenbart.
WO 99/37619 und/oder WO 99/37617 sind auf die Verwendung einer Verbindung, dargestellt durch die Formel
gerichtet, zur Behandlung einer Krankheit, die mit der Rekrutierung von aberrierenden Leukozyten und/oder Aktivierung davon verbunden ist, worin Z, Y, X, N, M und n die Bedeutungen haben, die in WO 99/37619 und/oder WO 99/37617 definiert sind.
WO 99/37651 offenbart, dass Verbindungen der Formel (I)
verwendet werden zur Behandlung einer Krankheit, die verbunden ist mit der Rekrutierung von aberrierenden Leukozyten und/oder deren Aktivierung, worin Z, N, M und n die in WO 99/37651 definierte Bedeutung haben.
WO 98/38167 richtet sich auf Heteroarylhexansäureamidderivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung als selektive Inhibitoren von MIP-1-alpha-Bindung an seinen CCR1-Rezeptor.
WO 00/44365 betrifft die Verwendung eines Antagonisten der CCR1-Funktion zum Inhibieren von Transplantatabstoßung, worin ebenfalls die Co-Verabreichung eines oder mehrerer zusätzlicher therapeutischer Mittel, z.B. immunsuppressive Mittel und Zelladhäsioninhibitoren, offenbart wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung richtet sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die geeignet ist zur Behandlung der Herztransplantatabstoßung bei Säugern, wobei die Zusammensetzung ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Arzneimittelträger, eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonisten und eine subnephrotoxische Menge von Cyclosporin A enthält, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist eine Verbindung ist, ausgewählt aus der Formel (I):
worin:
R^1a ein oder mehrere Substituenten ist, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl oder Hydroxyalkyl;
R² Fluor an der 4-Position ist;
R³ Phenyl ist, substituiert an der 4-Position mit Chlor und an der 2-Position durch Aminocarbonyl, Ureido oder Glycinamido;
R⁴ -O- ist;
R⁵ Methylen ist; und
R⁶ -C(O)- ist;
als ein einzelnes Stereoisomer oder ein Gemisch davon; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Im Besonderen ist diese Erfindung gerichtet auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die geeignet sind bei der Behandlung von Transplantatabstoßung in Säugern, wobei die Zusammensetzungen ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Arzneimittelträger bzw. Exzipienten, eine sub-nephrotoxische Menge Cyclosporin A und eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten, ausgewählt aus den Verbindungen, die in U.S. Patent 6,207,665 offenbart sind, umfassen.
Diese Erfindung richtet sich auch auf die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Arzneimittelträger, eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Formel (I) und eine sub-nephrotoxische Menge Cyclosporin A zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Herztransplantatabstoßung in einem Säuger.
Im Besonderen ist diese Erfindung gerichtet auf die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Arzneimittelträger, eine sub-nephrotoxische Menge Cyclosporin A und eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten, ausgewählt aus den Verbindungen, die offenbart sind in U.S. Patent 6,207,665, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Herztransplantatabstoßung in Säugern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Wirkung eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung auf die Bindung von radioaktiv markiertem MIP-1α an CCR1-exprimierende Zellen aus Ratte.
2 zeigt die Wirkung eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung auf die MIP-1α-induzierte Erhöhung von intrazellulärem Ca²⁺ in CCR1-exprimierenden Zellen aus Ratte.
3 zeigt Plasmakonzentrationen eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung nachfolgend auf chronische subkutane Dosierung in Ratten.
4 zeigt die Wirkung von Kombinationen eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung und Cyclosporin A auf das Überleben allogener Herztransplantate in Ratten.
5 zeigt die Wirkung von Kombinationen eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung und Cyclosporin A auf die Abstoßungsbewertung in Ratten 3 Tage nach Erhalten allogener Herztransplantate.
6 zeigt die Wirkung eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung auf die Plasmagehalte von Cyclosporin A in Ratten.
7 zeigt die Wirkung eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung auf die Adhäsion von Monozyten an aktivierte Endothelzellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Definitionen
Wie hier in der Beschreibung und in den anhängigen Ansprüchen verwendet, haben die folgenden Ausdrücke die nachfolgend angegebene Bedeutung, es sei denn, es ist anders ausgeführt:
„Aminocarbonyl" betrifft den Rest -C(O)NH₂.
„Phenyl" betrifft den Benzolrest, optional substituiert durch einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Halogen, Alkyl, Haloalkyl, Alkoxy, Alkenyl, Nitro, Cyano, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Alkylcarbonyl, Carboxy, Alkoxycarbonyl und Aminocarbonyl.
„Pharmazeutisch verträgliches Salz" umfasst sowohl Säure- als auch Basezugabesalze.
„Pharmazeutisch verträgliches Säurezugabesalz" betrifft diejenigen Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen beibehalten, die nicht biologisch oder auf andere Art unwünschenswert sind, und welche gebildet werden mit anorganischen Säuren, wie etwa Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dgl., und organische Säuren, wie etwa Essigsäure, Propionsäure, Brenztraubensäure, Maleinsäure, Malonsäure, Succinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicyclsäure und dgl.
„Pharmazeutisch verträgliches Basezugabesalz" betrifft diejenigen Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Säuren beibehalten, die nicht biologisch oder ansonsten ungewünscht sind. Diese Salze werden hergestellt durch Zugabe einer anorganischen Base oder einer organischen Base zu der freien Säure. Salze, die von diesen anorganischen Basen abgeleitet sind, umfassen die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Zink-, Aluminiumsalze und dgl. Bevorzugte anorganische Salze sind die Ammonium-, Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Salze, die von organischen Basen abgeleitet sind, umfassen Salze primärer, sekundärer und tertiärer Amine, substituierter Amine, einschließlich natürlich vorkommender substituierter Amine, cyclischer Amine und basischer Ionenaustauschharze, wie etwa Isopropylamin, Trimethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Tripropylamin, Ethanolamin, 2-Dimethylaminoethanol, 2-Diethylaminoethanol, Trimethamin, Dicyclohexylamin, Lysin, Arginin, Histidin, Coffein, Procain, Hydrabamin, Cholin, Betain, Ethylendiamin, Glucosamin, Methylglucamin, Theobromin, Purine, Piperazin, Piperidin, N-Ethylpiperidin, Polyaminharze und dgl. Besonders bevorzugte organische Basen sind Isopropylamin, Diethylamin, Ethanolamin, Trimethylamin, Dicyclohexylamin, Cholin und Coffein.
„Ureido" betrifft einen Rest der Formel -N(H)-C(O)-NH₂.
Es versteht sich aus den obigen Definitionen und Beispielen, dass für Reste bzw. Gruppen, die eine substituierte Alkylgruppe enthalten, jede Substitution auf einem beliebigen Kohlenstoff der Alkylgruppe auftreten kann.
„Herztransplantatabstoßung" betrifft für die Zwecke dieser Erfindung diejenigen Krankheitszustände, die gekennzeichnet sind durch akute oder chronische postoperative Abstoßung eines Herztransplantats und es ist umfasst: frühes Transplantatversagen, frühe akute Abstoßung, frühe systemische Abstoßung und späte chronische Allotransplantatvasculopathie (früh und spät sind definiert als weniger bzw. mehr als sechs Monate bis ein Jahr nach Transplantation).
„Säuger" umfasst Menschen und domestizierte Tiere, wie etwa Katzen, Hunde, Schwein, Rind, Schaf, Ziegen, Pferde, Kaninchen und dgl.
„Sub-nephrotoxische Menge" betrifft eine Menge eines Cyclosporin A, die eine therapeutisch wirksame Menge ist zur Behandlung von Herztransplantatabstoßung in einem Menschen, jedoch nicht verbunden ist mit der ungewünschten Nebenwirkung Nephrotoxizität, die gekennzeichnet ist durch erhöhtes Serumcreatinin, erhöhte Proteinurie, erhöhte Fluidretension, verringerte glomeruläre Filtrationsrate und verringerte Natrium- und Kaliumausscheidung.
„Simultan" betrifft die Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen, umfassend zwei aktive Bestandteile, eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung und eine subnephrotoxische Menge Cyclosporin A, in der Gegenwart von einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträgern, in einer einzigen Formulierung.
„Sequenziell" betrifft die Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen der Erfindung in zwei verschiedenen Formulierungen, jeweils umfassend einen der beiden aktiven Bestandteile, eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung oder eine sub-nephrotoxische Menge Cyclosporin A, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträgern. Die beiden Formulierungen werden einem Säuger, der sie benötigt, zu verschiedenen Zeiten verabreicht.
Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung können in ihrer Struktur asymmetrische Kohlenstoffatome aufweisen. Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten können daher als einzelne Stereoisomere, Racemate und als Gemische von Enantiomeren und Diastereomeren vorliegen. Die absolute Konfiguration bestimmter Kohlenstoffatome innerhalb der Richt-Peptid-CCR1- Rezeptorantagonisten wird, falls bekannt, durch den geeigneten absoluten Deskriptor R oder S angegeben. Der Deskriptor „trans" wird verwendet, um anzugeben, dass R^1a-Substituenten auf gegenüberliegenden Seiten der Piperazinebene sind. Der Deskriptor „cis" wird verwendet, um anzugegeben, dass R^1a-Substituenten auf der gleichen Seite der Piperazinebene sind.
Die Nomenklatur für die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung, die hier verwendet werden, ist eine modifizierte Form des I.U.P.A.C.-Systems, worin die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten, die innerhalb der Erfindung vorgesehen sind, als Piperazinderivate bezeichnet sind, wie in U.S. Patent 6,207,665 beschrieben.
„Therapeutisch wirksame Menge" betrifft diejenige Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Formel (I), wie unten beschrieben, die bei Verabreichung an einen Säuger, der sie benötigt, vorzugsweise ein Mensch, ausreichend ist, um Behandlung, wie unten definiert, von Herztransplantatabstoßung zu bewirken. Die Menge Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist der Erfindung, die eine „therapeutisch wirksame Menge" bildet, wird in Abhängigkeit von dem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten, der verwendet wird, der Schwere der Abstoßung und dem Alter des zu behandelnden Menschen variieren, kann jedoch routinemäßig durch den Fachmann in der Technik bestimmt werden im Hinblick auf seine eigene Kenntnis und diese Offenbarung.
„Behandeln" oder „Behandlung" umfasst, wie hier verwendet, die Behandlung von Herztransplantatabstoßung in einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, und umfasst:

(i) Verhindern des Auftretens von Abstoßung in einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, im Besonderen vor oder nachfolgend auf eine Herztransplantation in einem solchen Säuger;
(ii) Inhibieren des Zustands, d.h. Anhalten der Entwicklung einer Abstoßung; oder
(iii) Lindern des Zustands, d.h. Bewirken einer Regression der Abstoßung.

In den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen ist der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist eine Verbindung, ausgewählt aus der Formel (I):
worin:
R^1a ein oder mehrere Substituenten ist, unabhängig ausgewählt, aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl oder Hydroxyalkyl;
R² Fluor an der 4-Position ist;
R³ Phenyl ist, substituiert an der 4-Position mit Chlor und an der 2-Position mit Aminocarbonyl, Ureido oder Glycinamido;
R⁴ -O- ist,
R⁵ Methylen ist; und
R⁶ -C(O)- ist;
als ein einzelnes Stereoisomer oder ein Gemisch davon; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
In dieser Gruppe pharmazeutischer Zusammensetzungen umfasst eine bevorzugte Subgruppe pharmazeutischer Zusammensetzungen diejenigen Zusammensetzungen, worin der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(aminocarbonyl)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin;
(trans)-1-((4-Chlor-2-(glycinamido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin;
(2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin;
(trans)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin;
(2R,5S)-1-((4-Chlor-2-ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; und
(2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(glycinamido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin.

In dieser Gruppe pharmazeutischer Zusammensetzungen umfasst eine andere bevorzugte Subgruppe pharmazeutischer Zusammensetzungen diejenigen Zusammensetzungen, worin der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin ist.
In dieser Subgruppe pharmazeutischer Zusammensetzungen umfasst eine bevorzugte Klasse pharmazeutischer Zusammensetzungen diejenigen Zusammensetzungen, worin der Säuger, der sie benötigt, ein Mensch ist.
Unter den Verfahren zur Verabreichung, wie oben beschrieben, umfasst eine bevorzugte Gruppe von Verfahren diejenigen Verfahren, worin der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist und das Cyclosporin A dem Säuger, der es benötigt, simultan oder schrittweise verabreicht wird.
Bei der Herstellung eines Medikaments gemäß der Erfindung ist der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist eine Verbindung, ausgewählt aus der Formel (I):
worin:
R^1a ein oder mehrere Substituenten ist, unabhängig ausgewählt, aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl oder Hydroxyalkyl;
R² Fluor an der 4-Position ist;
R³ Phenyl ist, substituiert an der 4-Position mit Chlor und an der 2-Position mit Aminocarbonyl, Ureido oder Glycinamido;
R⁴ -O- ist;
R⁵ Methylen ist; und
R⁶ -C(O)- ist;
als ein einzelnes Stereoisomer oder ein Gemisch davon; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Vorzugsweise ist der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

Ebenfalls bevorzugt ist die Verwendung des Richt-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin.
Vorzugsweise ist der zu behandelnde Säuger ein Mensch.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist eine Verbindung, ausgewählt aus der Formel (I):
worin:
R^1a ein oder mehrere Substituenten ist, unabhängig ausgewählt, aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl oder Hydroxyalkyl;
R² Fluor an der 4-Position ist;
R³ Phenyl ist, substituiert an der 4-Position mit Chlor und an der 2-Position durch Aminocarbonyl, Ureido oder Glycinamido;
R⁴ -O- ist;
R⁵ Methylen ist; und
R⁶ -C(O)- ist;
als ein einzelnes Stereoisomer oder als ein Gemisch davon; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Vorzugsweise ist der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

Ebenfalls bevorzugt ist die Verwendung des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin.
Vorzugsweise ist der Säuger, der damit zu behandeln ist, ein Mensch.
Der nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist und das Cyclosporin A können dem Säuger, der sie benötigt, simultan oder sequenziell verabreicht werden.
C. Anwendbarkeit der Zusammensetzungen der Erfindung
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hier offenbart sind, sind geeignet zum Behandeln von Herztransplantatabstoßung in Säugern, vorzugsweise Menschen.
Es ist gezeigt worden, dass Cyclosporin A sehr wirkungsvoll ist beim Umgang mit Transplantatversagen, akuter Abstoßung und systemischer Abstoßung im ersten Jahr nachfolgend auf Herztransplantation. Jedoch ist die Langzeitanwendung von Cyclosporin A, wenngleich sie wirkungsvoll ist im Umgang mit chronischer Allotransplantatvasculopathie, direkt verbunden mit Nebenwirkungen, einschließlich Nephrotoxizität, Hypertension, Diabetes mellitis und post-Transplantat-Lymphoprolieferationskrankheit.
Es ist gezeigt worden, dass die Inhibierung der Aktivität bestimmter Chemokine oder ihrer Rezeptoren wirkungsvoll sein kann in Tiermodellen von Organtransplantationen. Wie oben beschrieben, verringerte in einer jüngeren Renaltransplantationsuntersuchung in Ratten der Chemokinrezeptorantagonist Met-RANTES, bei Verabreichung mit geringen Dosen Cyclosporin A, wesentlich renales Trauma, einschließlich Interstitialentzündung, hauptsächlich durch Verringern der Anzahl von infiltrierenden Monozyten (Gröne, H.J. et al., (1999), supra). In einer anderen Untersuchung wurde die Bedeutung des CCR1-Rezeptors in Herztransplantationsmodellen in Mäusen untersucht, die eine Targetdeletion von CCR1 tragen (Gao, W. et al., (2000), supra). In dieser Untersuchung zeigten vier getrennte Modelle von Allotransplantatüberleben wesentliche Verlängerung durch CCR1(–/–)-Rezipienten. In einem Modell führten Gehalte von Cyclosporin A, die marginale Wirkungen in CCR1(+/+)-Mäusen hatten, zur permanenten Allotransplantatakzeptanz in CCR1(–/–)-Rezipienten.
Basierend auf diesen Untersuchungen gibt es starke Beweise, um die Theorie zu unterstützen, dass das Chemokin RANTES, das durch den CCR1-Rezeptor wirkt, eine wichtige Rolle bei Organtransplantatabstoßung spielt. Es ist gezeigt worden, dass die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung die Aktivität von RANTES inhibieren. Daher sind die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung geeignet bei der Behandlung von Organtransplantatabstoßung, insbesondere Herztransplantatabstoßung.
Wie unten detaillierter diskutiert, zeigten die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung in Kombination mit Cyclosporin A unerwartete Ergebnisse bei der Behandlung von Herztransplantatabstoßung in Säugern. Im Speziellen zeigen die Kombination einer therapeutisch wirksamen Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten und einer sub-nephrotoxischen Menge Cyclosporin A die Fähigkeit zur Behandlung von Herztransplantatabstoßung ohne die ungewünschte nephrotoxische Wirkung von Cyclosporin A.
D. Testen der Verbindungen der Erfindung
Um aufzuzeigen, dass die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung die Aktivität der Chemokine MIP-1α oder RANTES, die über den CCR1-Rezeptor wirken, können mehrere in vitro-Untersuchungen verwendet werden, die zuvor beschrieben worden sind. Siehe z.B. U.S. Patent 6,207,665 und Hesselgesser, J. of al., (1998), supra, Ng, H.P. et al., (1999), supra, Liang, M. et al., (2000a), supra und Liang, M. et al., (2000b), supra.
Ein Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist, der in U.S. Patent 6,207,665 offenbart ist, d.h. (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin, wurde auf Bindung an den CCR1-Rezeptor aus Ratte durch in vitro-Bindungsuntersuchungen, die in Beispiel 1 beschrieben sind, getestet, wobei die Ergebnisse davon in 1 dargestellt sind. Scatchard-Analyse der Umlagerungsbindungsuntersuchungen ergaben, dass die Affinität des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten 121 ± 60 nM war (siehe 1), ungefähr 100 mal weniger wirkungsvoll für den CCR1-Rezeptor aus Ratte als für den CCR1-Rezeptor aus Mensch (K_j = 1 nM). Zusätzlich war dieser Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist in der Lage zum kompetitiven Ersetzen von radioaktiv markiertem RANTES des CCR1-Rezeptors aus Ratte mit einem ähnlichen K_j. Der gleiche Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist erwies sich als funktioneller in vitro-Antagonist des CCR1-Rezeptors aus Ratte durch Durchführen von Calcium-Fluss-Untersuchungen, die unten in Beispiel 2 und 2 beschrieben sind. Die vorübergehende Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺⁺-Konzentration, induziert durch 50 nM MIP-1α, wurde inhibiert durch Präinkubieren von CCR1-Rezeptor aus Ratte, der Zellen mit 100 nM des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten („Verbindung" in 2) exprimiert. Diese Daten zeigten, dass wenngleich der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist im Vergleich mit dem CCR1-Rezeptorantagonisten aus Mensch kein so potenter Inhibitor des CCR1-Rezeptors aus Ratte war, der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist in der Lage war, wirkungsvoll um die Bindung an CCR1-Rezeptor aus Ratte in vitro zu binden und ein potenter funktioneller Antagonist davon in vitro war.
Pharmacokinetische Untersuchungen wurden in Ratten mit einem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung durchgeführt, wie unten in Beispiel 3 und in 3 beschrieben. Maximalplasmagehalte 1, 4 und 7 Tage nachfolgend auf die subkutane Verabreichung des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten variierten zwischen 12 und 27 μM (siehe 3). Die Absorption war relativ schnell bei signifikanten Plasmagehalten, beobachtet 15 Minuten nach Arzneimittelexposition. Nach 8 Stunden waren die Plasmaarzneimittelgehalte ungefähr 1 bis 2 μM. Die Plasmahalbwertszeit lag im Bereich zwischen 2 bis 3 Stunden. So traten keine Muster von entweder verstärktem Clearing oder Akkumulierung des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten bei wiederholter subkutaner Dosierung auf, wobei ein beachtliches Ausmaß Variabilität der Rate und des Ausmaßes der Arzneimittelabsorption an allen Messtagen beobachtet wurde. Diese Untersuchungen zeigten, dass subkutane Dosierung eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung mit 50 mg/kg, dreimal pro Tag, für angemessene Arzneimittel- bzw. Wirkstoffgehalte über eine Dauer von 24 Stunden sorgten.
In einer in vivo-Untersuchung, die verwendet werden kann, um die Eignung der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung bei der Behandlung von Herztransplantatabstoßung in Säugern zu zeigen, ist das Ratte-heterotopes Herztransplantationsabstoßungsmodell (siehe, z.B. Nisco, S. et al., J. Immunol. (1994), Band 152, S. 3786-3792 und Ono, K. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1969), Band 57, S. 225-229). Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung wurden in einer in vivo-Untersuchung, die unten in Beispiel 4 beschrieben wird, getestet, wobei die Ergebnisse davon in 4 dargestellt sind. In diesen Untersuchungen entspricht eine Erhöhung der Allotransplantat-Überlebenszeit einer Abnahme der Herztransplantationsabstoßung in den Rezipienten-Lewis-Ratten, die Donor ACI-Ratten-Transplantat erhielten. Die mittlere Allotransplantat-Überlebenszeit von Tieren, denen nur der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist, d.h. (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin („Verbindung" in 4) verabreicht wurde, war im Vehikel 8,8 ± 1,2 Tage, im Vergleich mit 6,8 ± 0,8 Tage für Vehikel-behandelte Tiere („Kontrolle" in 4). Die mittlere Allotransplantat-Überlebenszeit mit einem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung behandelten Tiere war statistisch signifikant bei dem Gehalt von 0,05, bezogen auf die Überlebenszeit der Kontrollgruppen und log-Klassifizierungs-Analyse des Überlebenstests ergab ein p = 0,0048 für Tiere, die den Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten erhielten, im Vergleich zur Kontrolle.
Untersuchungen wurden durchgeführt, worin Tiere behandelt wurden mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung, d.h. (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin, und einer sub-nephrotoxischen Menge (2,5 mg/kg) Cyclosporin A. Die mittlere Allotransplantat-Überlebenszeit von Tieren, denen nur 2,5 mg/kg Cyclosporin A („Cs 2.5" in 4) verabreicht wurde, war 7,3 ± 0,5 Tage, im Vergleich mit 17,5 ± 5,9 Tage für Tiere im gleichen Protokoll, die zusätzlich mit dem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten („Cs 2.5 + Verbindung" in 4) behandelt wurden. Die mittlere Allotransplantat-Überlebenszeit von Tieren, denen eine therapeutische Dosis von Cyclosporin A gegeben wurde, 10 mg/kg („Cs 10" in 4), war 12,9 ± 0,7 Tage, im Vergleich mit 18,4 ± 5,4 Tage für Tiere im gleichen Protokoll, die zusätzlich behandelt wurden mit dem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten („Cs 10 + Verbindung" in 4). Die mittleren Überlebenszeiten der entweder mit 2,5 oder 10 mg/kg Cyclosporin A plus dem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten behandelten Tiere waren statistisch signifikant hinsichtlich der mittleren Überlebenszeiten der Tiere, die mit entweder 2,5 mg/kg oder 10 mg/kg Cyclosporin A alleine behandelt wurden, mit Werten von p = 0,0009 bzw. p = 0,0148.
Lichtmikroskopie und Immunhistologie auf infiltrierende Monozyten, wie unten in Beispiel 5 und in 5 beschrieben, bestätigten diese Überlebensdaten. Drei Tage nach Transplantation war die Abstoßungsbewertung signifikant verringert durch die kombinierte Behandlung des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung, wie oben beschrieben, und Cyclosporin A („Verbindung-Cyclosporin A" in 5). In nicht-immunsuprimierten Transplantaten wurde ein dichtes mononukleäres Infiltrat beobachtet. Viele Cardiomyocyten waren vakuolär oder nekrotisch. Interstitielles Ödem war ausgeprägt. In den Cyclosporin A-behandelten Ratten war das entzündliche Zellinfiltrat verringert, wenngleich deutlich nachweisbar, im Speziellen um Venen mit fokaler Beschädigung von Cardiomyocyten. Die nur mit dem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten behandelten Ratten zeigten fokale mononukleäre Zellinfiltrate, die zum Ausdruck kamen mit ähnlicher Morphologie wie diejenigen, die in nicht-immunsuprimierten Transplantaten gezeigt wird. Die mit sowohl dem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten als auch Cyclosporin A behandelten Tiere zeigten gut erhaltene Cardialmorphologie mit spärlichen mononukleären Zellinfiltraten. In nicht-immunsuprimierten Transplantaten bestanden viele Zellen des dichten mononukleären Zellinfiltrats aus Monozyten/Makrophagen, die eng an die Cardiomyocyten angelagert waren. In den mit Cyclosporin A behandelten Ratten war das Entzündungszellinfiltrat fokal und war primär aus ED-1-positiven Zellen aufgebaut. In den mit Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist behandelten Tieren variierte das mononukleäre Zellinfiltrat signifikant; Bereiche mit moderat dichtem Monozyteninfiltrat um Venen wurden beobachtet. Die kombinierte Behandlung des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten und Cyclosporin A führten zu einer dramatischen Verringerung von Monozyt/Makrophage-Infiltration in die allogenen Rattenherzen. Basierend auf den Daten aus diesen Untersuchungen führte der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist der Erfindung, verabreicht in Kombination mit Cyclosporin A, zu einer deutlichen synergistischen Erhöhung der Effizienz bei Herztransplantation, im Vergleich mit Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist oder Cyclosporin A alleine.
Wenngleich die Kombination eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten und Cyclosporin A zu einer deutlichen synergistischen Erhöhung von Herztransplantatüberleben führte, verblieb eine Möglichkeit, dass die Wirkung, die beobachtet wurde, zurückzuführen war auf Arzneimittel/Arzneimittel-Wechselwirkungen, die eher Blut-Cyclosporin A-Gehalte stabilisieren, als auf einen tatsächlicher Synergismus der Arzneimittelkombination. Pharmacokinetische Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Blutgehalte von Cyclosporin A in Ratten in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist der Erfindung, d.h. (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin, zu messen, wie unten in Beispiel 6 und 6 gezeigt. Visuelle Untersuchung der Zeit- Konzentration-Kurven legte eine leichte Verlängerung der Bluthalbwertszeit von Cyclosporin A in Ratten nahe, die behandelt wurden mit dem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten („Verbindung" in 6). Jedoch zeigten statistische Analysen der Paar-Gruppen, dass es keinen wesentlichen Unterschied zwischen den beiden berechneten Parametern gab (P-Wert für AUC = 0,224 und für T_1/2 = 0,317). Daher können Arzneimittel/Arzneimittel-Wechselwirkungen als die Basis für die klare synergistische Erhöhung von Herztransplantatüberleben in Ratten ausgeschlossen werden, die behandelt werden mit einer Kombination aus einem Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung und Cyclosporin A.
In vitro-Adhäsion- und Roll (Rolling)-Untersuchungen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die dramatische Verringerung von Monozyt/Makrophage-Infiltration in den allogenen Rattenherzen zurückzuführen sein kann, zumindest zum Teil, auf die Inhibierung von Chemokinen, die durch den CCR1-Rezeptor wirken. Frühere Arbeit zeigte, dass Monozytenzellen erhöhte Anhaftung an IL-1β-aktivierte Endothelzellen zeigen, die RANTES binden, nachfolgend auf Präinkubation mit exogenem RANTES für 30 Minuten (Gröne, H.J. et al., (1999), supra). Isolierte humane Blutmonozyten wurden mit steigenden Mengen eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung, d.h. (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl(4-(4-fluorbenzyl)piperazin behandelt und die Anhaftung an mikrovaskuläre Endothelzellen wurde durchgeführt wie in unten angegebenem Beispiel 7 und 7 beschrieben. Die RANTES-vermittelte und die Scherresistenzadhäsion von Monozyten an IL-1β-aktivierte mikrovaskuläre Endothelzellen wurde dosisabhängig inhibiert durch den Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten („Verbindung" in 7A). Der Prozentanteil Monozyten, von denen gefunden wurde, dass sie ein Rollen bzw. Rolling eingehen oder Rolling-Wechselwirkungen beibehalten, was als ein inverses Maß für Monozyten-Arrest dient, wurde ebenfalls dosisabhängig inhibiert durch den Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten („Verbindung" in 7B). Diese Daten unterstützen stark das Konzept von tatsächlichem Synergismus der Kombination eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung und Cyclosporin A bei der Behandlung von Herztransplantatabstoßung in Tieren.
E. Verabreichung der Zusammensetzungen der Erfindung
Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung kann über eine beliebige der anerkannten Arten zur Verabreichung oder über Mittel, die für ähnliche Anwendungen dienen, durchgeführt werden. Daher kann die Verabreichung z.B. oral, nasal, parenteral, topisch, transdermal oder rektal erfolgen, in der Form von festem, halbfestem, lyophilisiertem Pulver oder in flüssigen Dosisformen, wie etwa z.B. Tabletten, Suppositorien, Pillen, weiche elastische und harte Gelatinekapseln, Pulvern, Lösungen, Suspensionen oder Aerosolen oder dgl., vorzugsweise in Einheitsdosisformen, die geeignet sind für einfache Verabreichung von genauen Dosen. Die Zusammensetzungen werden einen herkömmlichen pharmazeutischen Träger oder Arzneimittelträger und eine Verbindung der Erfindung als den/einen wirksamen aktiven Bestandteil enthalten, und können zusätzlich andere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Hilfsmittel usw. enthalten.
Im Allgemeinen, in Abhängigkeit von der vorgesehenen Verabreichungsart, werden die Zusammensetzungen etwa 1 % bis etwa 99 % bezüglich des Gewichts des aktiven Bestandteils der Zusammensetzungen umfassen, d.h. Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und Cyclosporin A, und 99 % bis 1 % bezüglich des Gewichts eines geeigneten pharmazeutischen Arzneimittelträgers. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung etwa 5 % bis 75 % bezüglich des Gewichts aus den aktiven Bestandteilen bestehen, wobei der Rest geeignete pharmazeutische Arzneimittelträger sind.
Die bevorzugte Verabreichungsroute ist oral, unter Verwendung eines geeigneten täglichen Dosisablaufs, der eingestellt werden kann gemäß dem Schwergrad der Abstoßung des Herztransplantats. Für eine solche orale Verabreichung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung gebildet durch die Aufnahme eines oder mehrerer der normalerweise verwendeten pharmazeutischen Arzneimittelträger, wie etwa z.B. pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, vorgelatisierte Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Celluloseetherderivate, Glucose, Gelatine, Sucrose, Citrat, Propylgallat und dgl. Solche Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspension, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen für verzögerte Freisetzung und dgl. ein.
Vorzugsweise werden solche Zusammensetzungen in der Form von Kapseln, Kapletten oder Tabletten sein und werden daher ebenfalls ein Verdünnungsmittel, wie etwa Lactose, Sucrose, Dicalciumphosphat und dgl.; ein Disintegrationsmittel, wie etwa Croscarmellosenatrium oder Derivate davon; ein Gleitmittel, wie etwa Magnesiumstearat und dgl.; und ein Bindemittel, wie etwa Stärke, Akaziengummi, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Celluloseetherderivate und dgl., enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können ebenfalls formuliert werden zu einem Suppositorium, unter Verwendung von z.B. etwa 0,5 % bis etwa 50 % aktiven Bestandteilen, angeordnet in einem Träger, der sich langsam innerhalb des Körpers auflöst, z.B. Polyoxyethylenglykole und Polyethylenglykole (PEG), z.B. PEG 1000 (96 %) und PEG 4000 (4 %).
Flüssige pharmazeutisch verabreichbare Zusammensetzungen können z.B. hergestellt werden durch Lösen, Dispergieren usw. der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung (etwa 0,5 % bis etwa 20 %) und optionaler pharmazeutischer Hilfsmittel in einem Träger, wie etwa z.B. Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose, Glycerol, Ethanol und dgl., um dadurch eine Lösung oder Suspension zu bilden.
Falls es gewünscht ist, können pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung auch kleinere Mengen Hilfssubstanzen enthalten, wie etwa Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Wert-Puffermittel, Antioxidationsmittel und dgl., wie etwa z.B. Zitronensäure, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat, butyliertes Hydroxytoluol usw.
Aktuelle Verfahren, die verwendet werden können, um die obigen Zusammensetzungen herzustellen, sind bekannt oder werden für den Fachmann in der Technik ersichtlich; siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe (Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990). Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zu verabreichen sind, werden in jedem Fall ein oder mehrere pharmazeutischverträgliche Arzneimittelträger, eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung und eine sub-nephotoxische Menge Cyclosporin A zur Behandlung von Herztransplantatabstoßung enthalten.
Eine therapeutisch wirksame Menge einesNnicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten, vorzugsweise eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Formel (I), wird varieren in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich der Aktivität der spezifischen verwendeten Verbindung; der Metabolismusstabilität und der Wirkungsdauer der Verbindung; dem Alter, Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht und der Diät des Patienten; der Art und Zeit der Verabreichung; der Ausscheidungsrate; der Schwere des Abstoßungsprozesses; und der Therapie, die der Wirt eingeht. Im Allgemeinen ist eine therapeutisch wirksame tägliche Dosis von etwa 0,14 mg bis etwa 14,3 mg/kg Körpergewicht pro Tag eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Formel (I); vorzugsweise von etwa 0,7 mg bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag; und am bevorzugtesten von etwa 1,4 mg bis etwa 7,2 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Zum Beispiel würde zur Verabreichung an eine Person mit 70 kg die Dosis im Bereich von etwa 10 mg bis etwa 1,0 Gramm pro Tag des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten liegen, vorzugsweise von etwa 50 mg bis etwa 700 mg pro Tag und am bevorzugtesten von etwa 100 mg bis etwa 500 mg pro Tag.
F. Herstellung der Zusammensetzungen der Erfindung
Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung werden gemäß den in U.S. Patent 6,207,665 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Die Cyclosporine der Erfindung sind neutrale lipophile cyclische Peptide (11-mere), hergestellt aus dem Pilz Tolypocladium inflatum Gams, als auch anderen fungi imperfecti. Sie sind erhältlich für Forschungszwecke. Zwei Präparate von Cyclosporin A, Sandimmune^® und Neoral^® (Novartis), werden derzeit bei der Behandlung von humaner Organtransplantatabstoßung verwendet.
BEISPIEL 1
In Vitro-Untersuchung
In vitro-Bindungsuntersuchung für Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten

Diese Untersuchung zeigt die Affinität des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung, vorzugsweise ein Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist der Formel (I), zur Bindung an den CCR1-Rezeptor aus Ratte. Reagenzien und Lösungen:

Chemokine:	MIP-1α und RANTES (Peprotech Inc.)
Zellen:	Mononukleäre periphäre Blutzellen aus Ratte (PBMC)
	wurden isoliert aus Gesamtblut von Lewis-Ratten durch
	Accu-pague^TM (Accurate Chemical & Scientific Corp.)-
	Dichtezentrifugation.
Ligand:	¹²⁵I-MIP-1α und ¹²⁵I-RANTES von New England
	Nuclear (spezifische Aktivität ist 2200 Ci/mmol), 25
	μCi/Gläschen) wurde in 1 ml H₂O rekonstituiert.
Untersuchungspuffer:	130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MnCl₂, 50 mM Tris, 30
	μg/ml Bacitracin, 0,1 % BSA, pH-Wert 7,4.
Waschpuffer:	Phosphatpufferlösung (PBS)
Verbindungen der Erfindung:	Die Stammlösung der Verbindungen war 1 mM in
	100 % DMSO. Die höchste Konzentration in der
	Untersuchung war 10 μM und kann variieren in
	Abhängigkeit von der Potenz der Verbindungen. 1:3-
	Reihenverdünnungen von der höchsten Konzentration

	wurden mit Untersuchungspuffer hergestellt. Sechs
	Konzentrationen jeder Verbindung wurden
	typischerweise untersucht, um eine Dosiskurve zu
	erzeugen, aus welcher der K_j-Wert bestimmt wurde.

Untersuchungsverfahren:
Untersuchungen bzw. Assays wurden in v-Boden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt.
PBMC aus Ratte wurde einmal in PBS gewaschen und resuspendiert in dem Untersuchungspuffer auf etwa 0,2 bis 1,0 × 10⁶ Zellen/ml. Zellen wurden mit ¹²⁵I-MIP-1α oder ¹²⁵I-RANTES in der Gegenwart oder Abwesenheit variierender Konzentrationen von unmarkiertem MIP-1α, RANTES oder Verbindung bei 4 °C für 30 Minuten inkubiert.
Die Reaktionen wurden beendet durch Entfernen von Aliquoten aus der Zellsuspension und Abtrennen von Zellen von Puffer durch Zentrifugation durch ein Silikon/Paraffin-Ölgemisch, wie in Hesselgesser et al., (1998), supra, beschrieben.
Die nicht-spezifische Bindung wurde bestimmt in der Gegenwart von 100 nM oder 1 μM unmarkiertem MIP-1α oder RANTES. Die Konzentrationen von Verbindungen in der Untersuchung waren typischerweise von 10 μM bis 30 nM in 1:3-Verdünnungen und die Konzentrationen für potentere Verbindungen waren geringer, in Abhängigkeit von der Potenz.
Berechnungen:
Von jeder Verbindung wurden die Dosiskurven mit 6 Konzentrationspunkten erzeugt und die Bindungsdaten wurden an die Kurve angepasst mit dem Computerprogramm IGOR (Wavemetrics), um die Affinität und die Anzahl von Stellen zu bestimmen.
Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung zeigten beim Testen in dieser Untersuchung ihre Affinität zum Binden an den CCR1-Rezeptor aus Ratte.
BEISPIEL 2
In Vitro-Untersuchung: Calcium-Fluss
Funktionelle in vitro-Untersuchung für Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten Da der CCR1-Rezeptor auf die Bindung seiner Liganden, MIP-1α und RANTES, antwortet durch Mobilisieren von freiem intrazellulärem Calcium, kann man biologische Aktivität durch Calcium-Fluss-Untersuchungen unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Fura-2 messen. In der folgenden Untersuchung wurde die Fähigkeit des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung zum Blockieren dieser biologischen Antwort gemessen.
Protokoll:

1) PBMC aus Ratte wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert, durch Zentrifugation pelletiert und resuspendiert in Hanks Ca²⁺ (50 mL Hanks, 1,0 mL 1 M Hepes, 1,6 mL 500 mM CaCl₂, pH-Wert 7,4). Die Zellen wurden zweimal in diesem Medium gewaschen.
2) Die Zellen wurden resuspendiert in Medium bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/mL in der Gegenwart einer Endkonzentration von 1,25 μM Fura-2 AM (Moleculare Probes) (die Stammlösung wurde hergestellt durch Lösen von 50 μg Fura-2 in 50 μL DMSO).
3) Die Zellen wurden inkubiert bei 37 °C für 30 Minuten in der Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen des Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung. Zellen wurden gewaschen durch Zentrifugation, wie oben beschrieben, um freies Fura-2 zu entfernen. Zellen wurden resuspendiert bei 1 × 10⁶ Zellen/mL. Zellen wurden dann in Aliquoten (2,0 mL) in eine Küvette übergeführt und in einem PTI Deltascan-Modell 4000 Spektrofluorimeter angeordnet. Die Zellen wurden stimuliert mit 50 nM MIP-1α (Peprotech Inc.) und Ca²⁺⁺- Freisetzung wurde in dem Spektrofluorimeter als eine Funktion der Zeit gemessen.
4) Die Daten wurden hinsichtlich nM Ca²⁺⁺, freigesetzt durch Zugabe von 100 μL 0,1 % Triton X-100 (für Maximalwerte), gefolgt von 100 μL 500 nM EGTA, pH-Wert 8,5 (für Minimalwerte) korrigiert.

Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung zeigten, bei einem Test in dieser Untersuchung ihre Fähigkeit zum Inhibieren von Ca²⁺-Mobilisierung als Antwort auf die Bindung von MIP-1α an den CCR1-Rezeptor aus Ratte.
BEISPIEL 3
In Vivo-Untersuchung
Pharmacokinetische Studien in Lewis-Ratten Erwachsene, männliche, spezifisch Pathogen-freie Lewis (RT1l)-Ratten (Charles River, Boston) mit einem Gewicht von 200 bis 250 g wurden in diesen Studien verwendet.
Eine Lösung von 40 % Cyclodextrin wurde hergestellt durch Zugeben von Cyclodextrin (400 g, Aldrich) in eine sterile 1 Liter Kunststoffflasche. Ungepufferte Salzlösung, enthaltend nur Natrium- und Kaliumchlorid, wurde zugegeben und das Gemisch wurde geschüttelt und über Nacht gemischt, um es zu lösen. Die Salzlösung wurde bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter zugegeben. Die Lösung wurde durch 0,45 μm-Filter in eine sterile Flasche filtriert, markiert und bei 4 °C aufbewahrt. Eine 25 mg/ml Lösung von Verbindung in Cyclodextrin wurde hergestellt durch Lösen der Verbindung in dem 40 % Cyclodextrin in Salzlösung. Das Gemisch wurde geschüttelt, gefolgt durch die Zugabe von 230 μL konzentrierter HCl. Das Gemisch wurde zum Lösen gerührt. Nachdem die Verdünnung abgeschlossen war (1 h) wurde der pH-Wert der Lösung gemessen und 1 M KOH wurde zugegeben, um den pH-Wert auf 4,5 zu erhöhen. Die Lösung wurde durch ein 0,45 μm Filter filtriert und bei 4 °C aufbewahrt.
Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung wurden hergestellt in einem Vehikel aus 40 % Cyclodextrin/Salzlösung und Ratten erhielten subkutan (s.c.) eine Dosis (50 mg/kg dreimal pro Tag) für sieben Tage. Blutproben wurden gesammelt durch Cardial-punktieren in EDTA-enthaltenden Röhrchen zu verschiedenen Zeiten, zentrifugiert und Plasma wurde gefroren aufbewahrt bis es auf Arzneimittelgehalte analysiert wurde.
Plasmaproben wurden analysiert, entweder durch HPLC unter Verwendung von UV-Detektionsverfahren oder HPLC-MS (Elektronensprühmodus, betrieben unter einem positiv-Ionen-Modus). Konzentrationen der Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung wurden bestimmt über eine Kalibrationskurve, konstruiert in Plasma und analysiert unter identischen Bedingungen. Verwandte Verbindungen wurden als interne Standards in diesen Analysen verwendet.
HPLC-UV-Verfahren:

1) 100 μL-Aliquote von Plasmaproben wurden zu 200 μl eiskaltem angesäuertem Methanol (1 % Essigsäure), enthaltend eine fixierte Menge eines internen Standards gegeben, und gut gemischt.
2) Das resultierende Proteinpräzipitat wurde durch Zentrifugation bei 5000 × g entfernt und die Überstände wurden gesammelt.
3) Parallel wurden Kontrollplasmaproben dotiert mit verschiedenen Mengen Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung, typischerweise im Bereich von 0,3 bis 25 μM, und wie oben vorgegangen.
4) Die Überstände wurden bis zur Trockene in einem Vakuumverdampfer eingedampft, rekonstituiert mit einer 1:2-Methanol:Wasser-Lösung (enthaltend 0,1 % TFA), 30 sec gevortext und zentrifugiert, um Sedimente zu entfernen.
5) Die resultierenden Überstände wurden auf eine YMC AQ ODS-reverse Phase-Säule injiziert und analysiert unter Gradienten-HPLC-Bedingungen, bei einer Flussrate von 1 ml/min. Der UV-Detektor wurde auf 230 nm eingestellt.
6) Die Gradientenbedingungen waren: Anfangs, Lösungsmittel A 22 %/Lösungsmittel B 78 %; 2 min; Lösungsmittel A 22 %/Lösungsmittel B 78 %; 33 min Lösungsmittel A 45 %/Lösungsmittel B 55 %; 37 min Lösungsmittel A 80 %/Lösungsmittel B 20 %; 47 min Lösungsmittel A 80 %, Lösungsmittel B 20 %; 49 min. zurück zu den Anfangsbedingungen.
7) Signalflächenverhältnisse zwischen dem internen Standardsignal und der Verbindung wurden berechnet über den Konzentrationsbereich der Standardkurve und dieses Verhältnis wurde verwendet, um eine Kalibrationskurve zu entwickeln. Die Konzentration der interessierenden Verbindung wurde aus dieser Kurve erhalten durch Berechnen des Signalflächenverhältnisses zwischen der Verbindung und Signalen des internen Standards.

HPLC-MS-Verfahren:

1) Die verwendete Methodologie war ähnlich der oben beschriebenen, ausgenommen, dass die Probenherstellung beendet wurde beim Methanolpräzipitationsschritt und ein kurzes isokratisches Verfahren anstelle des Gradientenverfahrens verwendet wurde.
2) Ein FISONS VG Plattform-Einzelquadrupol-Gerät wurde verwendet mit einem Elektronensprüheinlass, betrieben bei 3,57 kV. Eine YMC AQ ODS-reverse Phase-Säule wurde unter einer Flussrate von 1 ml/min verwendet, wobei der Gesamtfluss in den UV-Detektor bei 214 nm eingeleitet wurde.
3) Der Fluss wurde aufgeteilt, um 50 μl/min in das Massenspektrometer einzuführen. Chromatogramme wurden über eine Gesamtlaufzeit von 7,5 min pro Probe aufgenommen, bei 50 μl Injektion auf die Säule. Die Ionen wurden in einem Einzelionen-Positiv-Ionisationsmodus gesammelt.
4) Quantifizierung wurde durchgeführt durch Integrieren der Fläche unter den Ionenströmen (Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist-Kontrolle der Erfindung und interne Standards) und Erzeugen einer Kalibrationskurve, wie oben beschrieben.

Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung zeigten beim Testen in dieser Untersuchung geeignete Arzneimittelgehalte in Rattenplasma über eine Dauer von 24 Stunden.
BEISPIEL 4
In Vivo-Untersuchung
Heterotope Herztransplantatabstoßung (Lewis- oder ACI-Ratten)
Erwachsene, männliche, spezifisch Pathogen-freie ACI (RT1a)- und Lewis (RT1l)-Ratten (Charles River, Boston, MA), mit einem Gewicht von 200 bis 250 g, wurden als Donoren bzw. Rezipienten in diesen Studien verwendet. Vaskularisierte Kardial-Allotransplantate wurden heterotopikal in das Abdomen von Rezipienten-Ratten transplantiert, unter Verwendung einer Modifikation (Nisco, S. et al., (1994), supra) der Technik von Ono und Lindsay (Ono, K. et al., (1969), supra). Ende-an-Seite-Anastomosen wurden hergestellt aus aufsteigender Aorta des Donorherzens an die abdominale Aorta des Rezipienten und aus der Donorpulmonararterie an die Rezipienten-Vena-cava-inferior, nachdem die Vena cava inferior und Pulmonalvenen des Donorherzens ligiert wurden. Abdominale Allotransplantate wurden täglich palpiert, um Transplantatfunktion zu bewerten, und Abstoßung wurde als komplett aufgefasst wenn palpable Ventrikularkontraktionen aufhörten.
Cardialallotransplantate von ACI-Ratten wurden heterotopisch in das Abdomen von Rezipienten-Lewis-Ratten transplantiert und diese Tiere erhielten entweder: 40 %-iges Cyclodextrin s.c. dreimal pro Tag; 50 mg/kg eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung in 40 %-igem Cyclodextrin s.c., dreimal pro Tag; Cyclosporin A in Olivenöl, durch Sondenfütterung von 10 mg/kg einmal pro Tag für vier Tage; Cyclosporin A in Olivenöl durch Sondenfütterung von 2,5 mg/kg einmal pro Tag für die Dauer der Studie; Cyclosporin A in Olivenöl durch Sondenfütterung einmal pro Tag von 10 mg/kg für vier Tage plus 50 mg/kg Nicht- Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist in 40 %-igem Cyclodextrin s.c., dreimal pro Tag; oder Cyclosporin A in Olivenöl durch Sondenfütterung von 2,5 mg/kg einmal pro Tag für die Dauer der Untersuchung, plus 50 mg/kg Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonist in 40 %-igem Cyclodextrin s.c., dreimal pro Tag. Die transplantierten Herzen wurden täglich auf Abstoßungssignale über den Verlauf der Studie beurteilt.
Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung zeigten beim Testen in dieser Untersuchung die Fähigkeit zum wesentlichen Verlängern der Herztransplantatüberlebenszeit bei Gabe in Kombination mit Cyclosporin A.
BEISPIEL 5
In vivo-Untersuchung
Histologie, Immunhistochemie und Morphometrie
Transplantierte Herzen wurden unter tiefer Anästhesie entfernt, schnell blutfrei getupft, gewogen und dann bedarfsmäßig für Histologie und Immunohistochemie verarbeitet. Die Organe wurden in 1 mm-Scheiben geschnitten und entweder durch Eintauchen fixiert in 4 % Formaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH-Wert 7,45 (PBS: 99 mM NaH₂PO₄, 108 mM NaH₂PO₄ und 248 mM NaCl) für 24 h oder fixiert in Methacarn für 8 h und eingebettet in Paraffin. Lichtmikroskopie wurde in 3 μm-Abschnitten durchgeführt, gefärbt durch Periodsäure-Schiff oder Goldner-Elastica. Lichtmikroskopie wurde auf allogenen Herztransplantaten 3 Tage nach Transplantation durchgeführt.
Der monoklonale ED1-Antikörper (Serotec/Camon) wurde verwendet auf in Methacarn-fixiertem Paraffin eingebettetem Gewebe (3 μm), um auf Monozyten/Makrophagenzellen aus Ratte zu färben. Eine alkalische Phosphatase-anti-alkalisches Phosphatase-Nchweissystem wurde zur Darstellung verwendet (Dako). Kontrollen, die den ersten oder zweiten Antikörper für jeden Abschnitt auslassen, wurden für negative Färbung durchgeführt. Die immunhistologische Färbung für ED1-positive Monozyten/Makrophagen in allogenen Herztransplantaten wurden 3 Tage nach Transplantation durchgeführt.
Histopathologische Abstoßung im allogenen Rattenherz wurde bewertet gemäß Billingham (Billingham, M.E. In: Cardiac transplantation, S. 133-152, Butterworths, Boston, 1990). Schwache akute Abstoßung (Bewertung: 1) wurde charakterisiert durch ein spärliches interstitielles mononukleäres Infiltrat, häufig akzentuiert in perivaskulären Räumen. Moderate akute Abstoßung (Bewertung: 2) war ein moderat dichtes perimycozytisches mononukleäres Infiltrat mit einigen Myocytnekrosen. Starke akute Abstoßung (Bewertung: 3) zeigte ein dichtes monozytisches Infiltrat mit fokaler Hämorrhagie und Ersatz von Monozyten und mit gelegentlicher intramularer Endothelialitis-Arterien. Die Abstoßungsbewertung wurde berechnet für jede Gewebeblockierung und eine mittlere Bewertung wurde berechnet aus den verschiedenen Blöcken für jedes transplantierte Herz wenn Abstoßungsprozesse dazu neigten, fokal zu sein.
Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung verringerten beim Testen in dieser Untersuchung wesentlich die Abstoßungsbewertungen und das Ausmaß von Monozyten-Transplantat-Infiltration bei Gabe in Kombination mit Cyclosporin A.
BEISPIEL 6
In vivo-Untersuchung
Blut-Cyclosporin A-Gehalte in Ratten
Mit Kanülen versehene Lewis-Ratten (6 pro Gruppe) erhielten entweder eine Einzeldosis von 2,5 mg/kg Cyclosporin A (Neoral Oral-Lösung, Sandoz, East Hannover, NJ), verdünnt in Olivenöl oder eine Einzeldosis des gleichen Cyclosporin A, gefolgt von s.c.-Injektionen, dreimal pro Tag, von 50 mg/kg eines Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung in 40 % Cyclodextrin. Gesamtblut wurde gesammelt unter Verwendung von EDTA als Anticoagulationsmittel zu verschiedenen Zeiten nach der Zudosierung. Plasma-Cyclosporin A-Gehalte wurden gemessen unter Verwendung eines Cyclo-Trac SP-Gesamtblut-Radioimmunoassays für Cyclosporin-Kit (DiaSorin, Stillwater, MN), im Grunde unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers. Ein Methanolextraktionsschritt wurde für die Standards, Kontrollen und Proben vor der Untersuchung durchgeführt. Die Methanolextrakte wurden kombiniert mit I¹²⁵-markiertem Cyclosporin Tracer. Ein Gemisch aus einem monoklonalen Antikörper aus Maus, spezifisch für Cyclosporin A, und Anti-Maus-Antikörper aus Esel, in einem einzelnen Reagenz, wurde zugegeben. Nachfolgend auf eine einstündige Inkubation wurden die Rööhrchen zentrifugiert, dekantiert und ausgezählt. Die Radioaktivitätsmenge in dem Pellet war invers proportional zur Konzentration von Cyclosporin A in der Probe. Eine Kalibrierungskurve wurde erhalten unter Verwendung eines 4-Parameter-Logistik-Kurvenabstimmungsprogramms durch Auftragen des Bindungsausmaßes gegenüber log-Konzentration. Cyclosporin A-Konzentrationen wurden aus der Standardkurve interpoliert.
Die nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung beeinflussten beim Testen in dieser Untersuchung nicht wesentlich die Eliminierungshalbwertszeit von Cyclosporin im Gesamtblut von Ratten.
BEISPIEL 7
In vitro-Untersuchung: Monozytenadhäsion und Rolling
Funktionelle in vitro-Untersuchung auf nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten Die Wechselwirkung von Monozyten mit Endothel wurde untersucht in Laminarflussuntersuchungen, im Wesentlichen wie beschrieben (Gröne, H.J. et al., (1999), supra und Weber, K.S. et al., Eur. J: Immunol. (1999), Band 29, S. 700-712). Humane dermale mikrovaskuläre Endothelialzellen wurden bis zur Konfluenz gezüchtet in Petrischalen und stimuliert mit 10 ng/ml IL-1β für 12 Stunden oder unbehandelt belassen. Vor der Untersuchung wurden die Zellen präinkubiert mit 10 ng/ml RANTES für 30 Minuten. Die Platten wurden angeordnet als die untere Wand in einer Parallelwandflusskammer und aufgebracht auf dem Tisch eines Olympus IMT-2 Inversionsmikroskops mit 20 × - und 40 × -Phasekontrastobjektiven. Humanblutmonozyten wurden isoliert durch Nycodenzhyperosmolare Gradientenzentrifugation und resuspendiert bei 5 × 10⁶ Zellen/ml in Untersuchungspuffer (10 mM HEPES, 0,5 % HSA, pH-Wert 7,4). Kurz vor der Untersuchung wurden die Mg²⁺ und Ca²⁺-Konzentrationen eingestellt auf 1 mM.
Die Zellsuspensionen wurden in einem Heizblock bei 37 °C während der Untersuchung gehalten und perfundiert in die Flusskammer, mit einer Rate von 1,5 dyn/cm² für 5 Minuten. Für Inhibierungsversuche wurden Monozyten präinkubiert für 10 Minuten bei 37 °C, bei verschiedenen Konzentrationen von nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung oder einer DMSO-Kontrolle. Die Anzahl von fest anhaftenden Zellen wurde gezählt in mindestens fünf Feldern, durch Analyse von Bildern, aufgezeichnet mit einer Langintegrations-JVC-3CCD-Videokamera und einem JVC SR 900 E Videorekorder. Ergebnisse wurden ausgedrückt als Zellen/mm². Als eine inverse Messung der Adhäsion wurde die Anzahl von Roll-Monozyten bzw. Rolling-Monozyten bei niederer Scherung in dem letzten 30 Sekunden-Intervall der fünf Minuten Periode bewertet und ausdrückt als der Prozentanteil der Gesamtwechselwirkungen innerhalb der analysierten Felder.
Die Nicht-Peptid-CCR1-Rezeptorantagonisten der Erfindung inhibierten beim Testen in dieser Untersuchung die Adhäsion von Monozyten an aktivierte Endothelzellen und erhöhten den Prozentanteil von Monozyten, die ein Rolling eingehen oder beibehalten.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von repräsentativen pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung zur oralen Verabreichung: A.

Bestandteile % Gew.-/Gew.

Aktive Bestandteile 20,0 %

Lactose 79,5 %

Magnesiumstearat 0,5 %
Die obigen Bestandteile werden gemischt und dispensiert in Gelatinekapseln mit harter Hülle, enthaltend jeweils 100 mg, wobei eine Kapsel ungefähr einer Tagesdosis entspricht. B.

Bestandteile % Gew.-/Gew.

Aktive Bestandteile 20,0 %

Magnesiumstearat 0,9 %

Stärke 8,6 %

Lactose 69,6 %

PVP (Polyvinylpyrrolidin) 0,9 %
Die obigen Bestandteile, mit der Ausnahme des Magnesiumstearats, werden vereinigt und granuliert, unter Verwendung von Wasser als eine Granulierungsflüssigkeit. Die Formulierung wird dann getrocknet, gemischt mit dem Magnesiumstearat und in Tabletten mit einer geeigneten Tablettiervorrichtung geformt. C.

Bestandteile

Aktive Bestandteile 0,1 g

Propylenglykol 20,0 g

Polyethylenglykol 400 20,0 g

Polysorbat 80 1,0 g

Wasser q.s. 100 ml
Die aktiven Bestandteile werden in Propylenglykol, Polyethylenglykol 400 und Polysorbat 80 gelöst. Eine ausreichende Menge Wasser wird dann unter Rühren zugegeben, um 100 ml der Lösung bereitzustellen, welche filtriert und in Flaschen abgefüllt wird. D.

Bestandteile % Gew.-/Gew.

Aktive Bestandteile 20,0 %

Erdnussöl 78,0 %

Span 60 2,0 %
Die obigen Bestandteile werden geschmolzen, gemischt und in weiche elastische Kapseln eingefüllt. E.

Bestandteile % Gew.-/Gew.

Aktive Bestandteile 1,0 %

Methyl- oder Carboxymethylcellulose 2,0 %

0,9 % Kochsalzlösung q.s. 100 ml
Die aktiven Bestandteile werden in der Cellulose/Kochsalzlösung gelöst, filtriert und zur Verwendung in Flaschen abgefüllt.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer repräsentativen pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung für parenterale Verabreichung: Bestandteile

Aktive Bestandteile 0,02 g

Propylenglykol 20, 0 g

Polyethylenglykol 400 20,0 g

Polysorbat 80 1,0 g

0,9 % Kochsalzlösung q.s. 100 ml
Die aktiven Bestandteile werden in Propylenglykol, Polyethylenglykol 400 und Polysorbat 80 gelöst. Eine ausreichende Menge von 0,9 % Kochsalzlösung wird dann unter Rühren zugegeben, um 100 ml der i.v.-Lösung zu ergeben, welche filtriert wird durch ein 0,2 μm Membranfilter und unter sterilen Bedingungen verpackt wird.
BEISPIEL 10
Diese Beispiel zeigt die Herstellung einer repräsentativen pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung in Suppositorienform:

Bestandteile % Gew.-/Gew.

Aktive Bestandteile 1,0 %

Polyethylenglykol 1000 74,5 %

Polylethylenglykol 4000 24,5 %
Die Bestandteile werden zusammengeschmolzen und auf einem Dampfbad gemischt und in Formen gegossen, die 2,5 g Gesamtgewicht aufweisen.
BEISPIEL 11
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer repräsentativen pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung zur Insufflation:

Bestandteile % Gew:-/Gew.

Mikronisierte aktive Bestandteile 1,0 %

Mikronisierte Lactose 99,0 %
Die Bestandteile werden gemahlen, gemischt und in einer Insufflationsvorrichtung verpackt, die ausgestattet ist mit einer Dosierpumpe.
BEISPIEL 12
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer repräsentativen pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung in vernebelter Form:

Bestandteile % Gew.-/Gew.

Aktive Bestandteile 0,005 %

Wasser 89,995 %

Ethanol 10,000 %
Die aktiven Bestandteile werden in Ethanol gelöst und mit Wasser gemischt. Die Formulierung wird dann in einem Vernebler, der ausgestattet ist mit einer Dosierpumpe, verpackt.
BEISPIEL 13
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung einer repräsentativen pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung in Aerosolform:

Bestandteile % Gew.-/Gew.

Aktive Bestandteile 0,10 %

Treibmittel 11/12 98,90 %

Ölsäure 1,00 %
Die aktiven Bestandteile werden in Ölsäure und den Treibmitteln dispergiert. Das resultierende Gemisch wird dann in ein Aerosolbehältnis, das ausgestattet ist mit einer Dosierventil, gegossen.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, die geeignet ist zur Behandlung der Herztransplantatabstoßung bei Säugern, wobei die Zusammensetzung ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Arzneimittelträger, eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonisten und eine subnephrotoxische Menge von Cyclosporin A enthält, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist eine Verbindung ist, ausgewählt aus der Formel (I):
worin: R^1a ein oder mehrere Substituenten ist, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl oder Hydroxyalkyl; R² Fluor an der 4-Position ist; R³ Phenyl ist, substituiert an der 4-Position mit Chlor und an der 2-Position durch Aminocarbonyl; Ureido oder Glycinamido; R⁴ -O- ist; R⁵ Methylen ist; und R⁶ -C(O)- ist; als ein einzelnes Stereoisomer oder ein Gemisch davon; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(aminocarbonyl)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (trans)-1-((4-Chlor-2-(glycinamido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (trans)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; und (2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(glycinamido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist und das Cyclosporin A für simultane oder sequenzielle Verabreichung sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Arzneimittelträger, eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonisten und eine subnephrotoxische Menge Cyclosporin A, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Herztransplantatabstoßung in einem Säuger, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist eine Verbindung ist, ausgewählt aus der Formel (I):
worin: R^1a ein oder mehrere Substituenten ist, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl oder Hydroxyalkyl; R² Fluor an der 4-Position ist; R³ Phenyl ist, substituiert an der 4-Position mit Chlor und an der 2-Position durch Aminocarbonyl, Ureido oder Glycinamido; R⁴ -O- ist; R⁵ Methylen ist; und R⁶ -C(O)- ist; als ein einzelnes Stereoisomer oder ein Gemisch davon; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung nach Anspruch 6, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(aminocarbonyl)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (trans)-1-((4-Chlor-2-(glycinamido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (trans)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; und (2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(glycinamido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin.
Verwendung nach Anspruch 6, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin der Säuger, der die Anwendung benötigt ist, ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist und das Cyclosporin A zur simultanen oder sequenziellen Verabreichung sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung in zwei verschiedenen Formulierungen, wobei jede einen der beiden aktiven Bestandteile enthält: eine therapeutisch wirksame Menge eines Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonisten zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträgern, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist eine Verbindung ist, ausgewählt aus der Formel (I):
worin: R^1a ein oder mehrere Substituenten ist, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl oder Hydroxyalkyl; R² Fluor an der 4-Position ist; R³ Phenyl ist, substituiert an der 4-Position mit Chlor und an der 2-Position durch Aminocarbonyl, Ureido oder Glycinamido; R⁴ -O- ist; R⁵ Methylen ist; und R⁶ -C(O)- ist; als ein einzelnes Stereoisomer oder ein Gemisch davon; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder eine subnephrotoxische Menge von Cyclosporin A zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträgern, geeignet zur Behandlung von Herztransplantatabstoßung in Säugern.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin der Nicht-Peptid-CCR-1-Rezeptorantagonist ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(aminocarbonyl)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (trans)-1-((4-Chlor-2-(glycinamido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (2R)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2-methyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (trans)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; (2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(ureido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin; und (2R,5S)-1-((4-Chlor-2-(glycinamido)phenoxy)methyl)carbonyl-2,5-dimethyl-4-(4-fluorbenzyl)piperazin.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin die beiden Formulierungen zur sequenziellen Verabreichung sind.