PT1305047E - Antagonistas não peptídicos do receptor ccr1 em combinação com ciclosporina a, para o tratamento da rejeição no transplante do coração. - Google Patents

Description

ΕΡ 1 305 047 /PT DESCRIÇÃO "Antagonistas não peptídicos do receptor CCRl em combinação com ciclosporina A, para o tratamento da rejeição no transplante do coração"

Campo do Invento 0 presente invento refere-se a composições farmacêuticas úteis no tratamento da rejeição no transplante do coração em mamíferos, que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico de fórmula (1) e uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A. O presente invento também diz respeito ao uso destas composições farmacêuticas para a preparação de um medicamento para tratamento da rejeição no transplante do coração em mamíferos.

Antecedentes do Invento

Um importante componente do processo inflamatório envolve a migração e a activação de populações seleccionadas de leucócitos da circulação e a sua acumulação no tecido afectado. Ainda que a ideia de movimentação de leucócitos não seja nova, recentemente surgiu a descoberta e caracterização das famílias de moléculas de adesão da selectina e da integrina e a vasta família de citocinas quimiotácticas conhecidas por quimiocinas. Os receptores das quimiocinas estão expressos nos leucócitos e processam os sinais que se seguem à ligação da quimiocina pelo que estes sinais são eventualmente transduzidos na migração ou activação dos leucócitos no sentido da fonte das quimiocinas. Portanto, regulando a migração e a activação de leucócitos a partir do sangue periférico para locais extra-vasculares nos órgãos, pele, articulações ou tecido conjuntivo, as quimiocinas desempenham um papel crítico na manutenção da defesa do hospedeiro bem como no desenvolvimento da resposta imunitária.

Originariamente, a família de moléculas de quimiocinas foi dividida em dois grupos: a subfamília "C-X-C" e a subfamília "C-C". A qualidade característica de ambas as subfamílias é a presença de quatro resíduos de cisteína em 2

ΕΡ 1 305 047 /PT posições altamente conservadas nas moléculas. Na subfamilia "C-C" de quimiocinas, os primeiros dois resíduos são adjacentes um ao outro, enquanto que na subfamilia "C-X-C", um só resíduo de aminoácido separa os resíduos de cisteína. Uma descrição recente de uma quimiocina "-C-" parece representar uma nova família de quimiocinas onde a quimiocina "-C" não tem dois dos quatro resíduos de cisteína presentes na subfamilia "C-C" ou na subfamilia "C-X-C".

Um membro da subfamilia "C-C" de quimiocinas é a proteína-ία inflamatória de macrófagos ("ΜΙΡ-Ια "). É expressa por células como macrófagos, linfócitos T e B, neutrófilos e fibroblastos. Um estudo recente (ver Karpus, W.J. et al., J. Immunol. (1995), Vol. 155, pp. 5003-5010) apresenta uma confirmação forte do conceito in vivo de uma acção de MPI-la num modelo de encefalomielite auto-imune experimental ("EAE") de ratinho de esclerose múltipla. A esclerose múltipla é uma doença auto-imune mediada pelos linfócitos T e B e pelos macrófagos, resultando numa extensa inflamação e desmielinização da matéria branca no sistema nervoso central. 0 estudo mostrou que os anticorpos para a ΜΙΡ-Ια previnem o desenvolvimento tanto da doença inicial como recidiva, assim como previnem a infiltração de células mononucleares no sistema nervoso central. O tratamento com os anticorpos também foi capaz de melhorar a gravidade do avanço da doença clínica. Estes resultados levaram os investigadores a concluir que a ΜΙΡ-Ια desempenha um papel importante na etiologia da esclerose múltipla. Um outro estudo (ver Godiska, R. et al., J Neuroimmunol (1995), Vol. 58, pp.167-176) demonstrou a sobre-regulação de ARNm para várias quimiocinas, incluindo a ΜΙΡ-Ια, nas lesões e na espinal medula de ratinhos SJL (uma estirpe de ratinhos susceptível às doenças Thi, como a EAE) no decurso da EAE aguda. A RANTES é outro membro da subfamilia de quimiocinas C-C (o nome RANTES é um acrónimo derivado de algumas características originais observadas e previstas da proteína e do seu gene: Regulada após Activação Normal da célula T^ Expressa presumidamente Segregada). Verificou-se que uma larga variedade de tecidos expressam RANTES segundo um padrão semelhante ao da ΜΙΡ-Ια. Existem evidências, a partir de um certo número de estudos, que implicam a produção anómala de 3

ΕΡ 1 305 047 /PT RANTES na progressão da artrite reumatóide (ver Rathanaswami, P et al., J. Biol. Chem. (1993) Vol. 268, pp. 5834-5839 e Snowden, N. Etal., Lancet (1994), Vol. 343, pp. 547-548). A artrite reumatóide é uma doença inflamatória crónica caracterizada em parte pela infiltração de monócitos e linfócitos T de memória, que se crê ser mediada por factores quimiotácticos libertados pelos tecidos inflamados. Há forte evidência, a partir de outros estudos, que implica a RANTES na patofisiologia da artrite reumatóide (ver Barnes, D.A. et al., J. Clin. Invest. (1998), Vol. 101, pp. 2910-2919 e Plater-Zyberk, C.A. et al. Immunol. Lett. (1997), Vol. 57, pp. 117-120). Por exemplo, num modelo de artrite induzida por adjuvantes no rato ("AIA"), os anticorpos para RANTES reduziram muito o desenvolvimento da doença.

Estes estudos e outros produzem fortes evidências de que os níveis de ΜΙΡ-Ια estão aumentados nos modelos de EAE de esclerose múltipla e de que os níveis de RANTES estão aumentados na artrite reumatóide (ver p. ex., Glabinski, A.R. et al., Am. J. Pathol. (1997), Vol. 150, pp. 617-630; Glabinski, A.R. et al., Methods Enzymol. (1997), Vol. 288, pp. 182-190; e Miyagishi, R.S. et al., J. Neuroimmunol. (1997), Vol. 77, pp. 17-26). Acresce, conforme se descreveu acima, que estas quimiocinas são quimioatraentes de células T e monócitos que são os principais tipos de células envolvidos na patofisiologia destas doenças. Portanto, qualquer molécula que iniba a actividade de qualquer destas quimiocinas será benéfica no tratamento destas doenças e será portanto útil como agente anti-inflamatório.

Existe também uma forte evidência que liga a RANTES à rejeição dos transplantes de órgãos. A infiltração de células mononucleares no interstício dos transplantes de órgãos é um ponto chave da rejeição celular aguda. Este infiltrado celular consiste principalmente em células T, macrófagos e eosinófilos. Num estudo da expressão de RANTES durante a rejeição aguda de aloenxerto renal, encontrou-se a expressão ARNm de RANTES em células mononucleares infiltradas e em células epiteliais tubulares renais e a própria RANTES foi encontrada ligada à superfície endotelial da microvasculatura dentro do enxerto em rejeição (ver Pattison, J. et al. Lancete (1994), Vol. 343, pp. 209-211 e Wiedermann, C.J. et al., Curr. 4

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Biol. (1993), Vol. 3, pp. 735-739). Um estudo recente (Pattison, J.M. et al., J. Heart Lung Transplant (1996), vol. 15, pp. 1194-1199) sugerem que a RANTES pode desempenhar um papel na aterosclerose do enxerto. Foram detectados níveis aumentados de RANTES, tanto do ARNm como da proteína, em células mononucleares, miofibroblastos e células endoteliais das artérias que sofrem de ateroesclerose acelerada em comparação com as artérias coronárias normais.

Uma vez que a RANTES é um ligando para os receptores de quimiocinas CCR1 e CCR5, estes receptores, localizados nas células mononucleares circulantes, podem ser alvos terapêuticos úteis na biologia da transplantação. A importância do receptor CCR1 foi examinada em modelos de transplantação do coração em ratinhos portadores de uma eliminação direccionada no gene de CCR1 (Gao, W et al., J. Clin. Invest. (2000), Vol. 105, pp. 35-44). Neste estudo, quatro modelos separados de sobrevivência de aloenxertos apresentaram um prolongamento significativo pelos beneficiários CCR1(-/-). Num modelo, os níveis de ciclosporina A que tinham efeitos marginais em ratinhos CCR1(+/+) resultaram na aceitação permanente do aloenxerto em beneficiários CCR1(-/-).

Foi recentemente demonstrado que certas moléculas pequenas são antagonistas não peptídicos do receptor CCR1, por inibição da actividade de RANTES e ΜΙΡ-Ια e são portanto úteis como agentes anti-inflamatórios. Ver Pedido de Patente PCT publicado WO 98/56771, Pedido de Patente U.S. com o n.° de série 09/094,397 apresentado em 9 de Junho, 1998, presentemente a Patente U.S. 6,207,665, concedida em 27 de Março, 2001, Hesselgesser, J. et. al., J. Biol. Chem. (1998), vol 273, pp. 15687-15692, Ng, H.P. et. al., J. Med. Chem. (1999), Vol. 42, pp. 4680-4694, Liang, M. et. al., Eur. J. Pharmacol. (2000a), Vol.389, pp. 41-49, e Liang, M. et. al., J. Biol. Chem. (2000b), Vol 275 pp. 19000-19008.

As ciclosporinas são uma família de oligopéptidos cíclicos lipófilos neutros (11-meros) produzidos pelo fungo Tolypocladium inflatum Gams, assim como por outros fungos imperfeitos. O principal componente é a ciclosporina A, um bem conhecido imunossupressor, disponível no comércio, que inibe 5 ΕΡ 1 305 047 /PT selectivamente as respostas imunitárias adaptativas pelo bloqueio da activação das células T (ver Kahan, B.D. New Engl J. Med. (1989), Vol. 321, pp 1725-1738, e Valantine, H., Transplant. Proc. (2000), Vol 32, pp 27S-44S). Embora a ciclosporina A tenha sido um factor critico no sucesso da transplantação de órgãos, permanecem problemas importantes de longo prazo de segurança directamente associados com a imunossupressão baseada na ciclosporina A, incluindo nefrotoxicidade, hipertensão, diabetes mellitus e doença linfoproliferativa post-transplante. Seria portanto desejável poder administrar uma dose sub-nefrotóxica de ciclosporina A, reduzindo assim os seus efeitos secundários indesejados, enquanto se mantém a actividade imunossupressora necessária para evitar a rejeição crónica que, no caso do transplante de coração, é conhecida como vasculopatia crónica do aloenxerto, manifestada principalmente como arteriosclerose acelerada.

Arte Relacionada

Num estudo recente de transplante renal, o antagonista peptidico de receptor de quimiocinas Met-RANTES, quando administrado com doses baixas de ciclosporina A, reduz significativamente os danos renais, incluindo a inflamação intersticial, principalmente reduzindo o número de monócitos infiltrados (Grone, H.J. et al. FASEB J: (1999), Vol 13, pp. 1371-1383) . Este estudo suporta a teoria segundo a qual a RANTES, através da activação de receptores específicos de quimiocinas nas células mononucleares, desempenha um importante papel na rejeição do aloenxerto. 0 pedido de patente europeia publicado 1 000 626 e/ou WO 00/16796 (Applied Researsh Systems) revela o uso de um antagonista peptidico do receptor de quimiocinas Met-RANTES, juntamente com uma ciclosporina para o tratamento ou prevenção da rejeição de órgãos, tecidos ou células transplantados. WO 99/40061 refere-se a derivados do ácido di-hidroxi-hexanóico, a métodos de utilização e a composições farmacêuticas que os contêm. Em particular, é revelada uma composição farmacêutica que compreende um antagonista não peptidico de CCR1 para o tratamento da rejeição da 6 ΕΡ 1 305 047 /PT transplantado de tecidos e/ou da aterosclerose e a combinação com imunossupressores como a ciclosporina A. WO 99/37619 e/ou WO 99/37617 referem-se ao uso de um composto representado pela fórmula

Z-Y'-(0¾—X~~N

M para tratamento de uma doença associada ao recrutamento e/ou activação de leucócitos aberrantes, onde Z, Y, X, N, M e n têm o significado definido em WO 99/37619 e/ou WO 99/37617. WO 99/37651 revela compostos de fórmula (I)

para serem usados no tratamento de uma doença associada ao recrutamento e/ou activação de leucócitos aberrantes, onde Z, N, M e n têm o significado definido em WO 99/37651. WO 98/38167 refere-se a derivados amida de ácido heteroaril-hexanóico, à sua preparação e ao seu uso como inibidores selectivos da ligação de ΜΙΡ-1-alfa ao seu receptor CCR1. WO 00/44365 refere-se ao uso de um antagonista da função de CCR1 para inibir a rejeição de enxertos onde também é revelada a co-administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo agentes imunossupressores e inibidores da adesão celular.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se a composições farmacêuticas úteis no tratamento da rejeição no transplante do coração em mamíferos, composições que compreendem um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 e uma 7 ΕΡ 1 305 047 /PT quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A, onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é um composto seleccionado da fórmula (I):

onde

Rla é um ou mais substituintes seleccionados independentemente no grupo que consiste em alquilo ou hidroxialquilo; R2 é fluoro na posição 4; R3 é fenilo substituído na posição 4 com cloro e na posição 2 com aminocarbonilo, ureído ou glicinamido; R4 é -0-; R5 é metileno; e R6 é -C(O) na forma de um só estereoisómero ou uma sua mistura; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Em particular, o presente invento refere-se a composições farmacêuticas úteis no tratamento da rejeição de transplantes em mamíferos, composições que compreendem um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 seleccionado entre os compostos revelados na Patente U.S. 6,207,665. O presente invento também se refere ao uso de uma composição farmacêutica que compreende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1, de fórmula (I) e uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A, para o fabrico de um medicamento para o tratamento da rejeição no transplante do coração num mamífero.

Em particular, farmacêutica que este invento visa compreende um o uso de uma composição ou mais excipientes mais 8 ΕΡ 1 305 047 /PT farmaceuticamente aceitáveis, uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1, seleccionado entre os compostos revelados na Patente U.S. 6,207,665, para o fabrico de um medicamento para o tratamento da rejeição no transplante do coração em mamíferos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra o efeito de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento, sobre a ligação de ΜΙΡ-Ια radiomarcada a células que expressam CCR1 de rato. A Fig. 2 mostra o efeito de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento sobre a subida induzida por ΜΙΡ-Ια de Ca2+ intracelular em células que expressam CCR1 de rato. A Fig. 3 mostra as concentrações no plasma de um antagonista não peptídico do receptor CCRl do invento, após dosagem subcutânea crónica em ratos. A Fig. 4 mostra o efeito de combinações de um antagonista não peptídico do receptor CCRl do invento com ciclosporina A sobre a sobrevivência dos transplantes de coração alogeneicos em ratos. A Fig. 5 mostra o efeito de combinações de um antagonista não peptídico do receptor CCRl do invento com ciclosporina A sobre a pontuação de rejeição em ratos, 3 dias após receberem transplantes de coração alogeneicos. A Fig. 6 mostra o efeito de um antagonista não peptídico do receptor CCRl do invento, sobre os níveis no plasma da ciclosporina A em ratos. A Fig. 7 mostra o efeito de um antagonista não peptídico do receptor CCRl do invento, sobre a adesão de monócitos a células endoteliais activadas. 9

ΕΡ 1 305 047 /PT DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO A. Definições

Conforme usados na descrição e reivindicações apensas, quando não se especificar em contrário, os termos a seguir têm os significados indicados: "Aminocarbonilo" refere-se ao radical -C(0)NH2. "Fenilo" refere-se ao radical de benzeno opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados entre o grupo que consiste em hidroxi, halogéneo, alquilo, haloalquilo, alcoxi, alcenilo, nitro, ciano, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alquilcarbonilo, carboxi, alcoxicarbonilo e aminocarbonilo. "Sal f armaceut icamente aceitável" inclui sais de adição de ácidos e de bases. "Sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais que retêm a actividade biológica e as propriedades das bases livres, que não são indesejáveis sob o ponto de vista biológico ou outro, e que são formados com ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes, ácidos orgânicos como ácido acético, ácido propiónico, ácido pirúvico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido salicílico e outros. "Sal de adição de base farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais que retêm o efeito biológico e as propriedades dos ácidos livres, que não são indesejáveis biologicamente ou de outro modo. Estes sais são preparados por adição de uma base inorgânica ou uma base orgânica ao ácido livre. Os sais derivados de bases inorgânicas incluem os sais de sódio, potássio, lítio, amónio, cálcio, magnésio, zinco, alumínio e outros. Os sais inorgânicos preferidos são os sais de amónio, sódio, potássio, cálcio e magnésio. Os sais derivados de bases orgânicas incluem sais de aminas primárias, 10

ΕΡ 1 305 047 /PT secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas que ocorrem naturalmente, aminas cíclicas e resinas permutadoras de iões básicas como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclo-hexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina e outras. São particularmente preferidas entre as bases orgânicas, a isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclo-hexilamina, colina e cafeína. "Ureído" refere-se a um radical de fórmula -N(H) -C(O) -NH2.

Fica entendido das definições acima e exemplos que, para radicais que contenham um grupo alquilo substituído, qualquer substituição pode ocorrer em qualquer carbono do grupo alquilo. "Rejeição no transplante do coração" refere-se aos estados de doença, para os fins deste invento, que são caracterizados pela rejeição post-operatória crónica ou aguda num transplante do coração e incluem: falência prematura do enxerto, rejeição aguda prematura, rejeição sistémica prematura, vasculopatia do aloenxerto crónica tardia (prematuro e tardio são definidos abaixo e acima de 6 meses a 1 ano post-transplante, respectivamente). "Mamífero" inclui seres humanos e animais domésticos como gatos, cães, suínos, vacas, ovelhas, cabras, cavalos, coelhos e outros. "Quantidade sub-nefrotóxica" refere-se a uma quantidade de uma ciclosporina A que seja uma quantidade terapeuticamente eficaz para o tratamento da rejeição no transplante do coração num ser humano, mas que não esteja associada ao efeito secundário indesejado de nefrotoxicidade, que é caracterizado pelo aumento de creatinina sérica, aumento da proteinúria, aumento da retenção de fluidos, velocidade de filtração 11

ΕΡ 1 305 047 /PT glomerular diminuída e diminuição da excreção de sódio e potássio. "Simultaneamente" refere-se ao uso de composições farmacêuticas que compreendem dois ingredientes activos, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento e uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A, na presença de um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, numa só formulação. "Sequencialmente" refere-se ao uso de composições farmacêuticas do invento em duas formulações diferentes, compreendendo, cada uma, um dos dois ingredientes activos, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento ou uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A, juntamente com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As duas formulações são administradas a um mamífero delas necessitado em tempos diferentes.

Os antagonistas não peptídicos dos receptores CCR1 do invento podem ter átomos de carbono assimétricos na sua estrutura. Os antagonista não peptídicos dos receptores CCR1 podem, portanto, existir como estereoisómeros únicos, racematos, e como misturas de enantiómeros e diastereómeros. A configuração absoluta de certos átomos de carbono dentro dos antagonistas não peptídicos dos receptores CCRl, se conhecida, é indicada pelo descritor absoluto R ou S. O descritor “trans" é usado para indicar que os substituintes Rla estão em lados opostos relativamente ao plano da piperazina. O descritor "cis" é usado para indicar que os substituintes Rla estão do mesmo lado em relação à ao plano da piperazina. A nomenclatura dos antagonistas não peptídicos do receptor CCRl do invento aqui usada é uma forma modificada do sistema I.U.P.A.C. onde os antagonistas não peptídicos do receptor CCRl contemplados pelo invento são designados por derivados de piperazina, conforme descrito na Patente U.S. 6,207,665. "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de um antagonista não peptídico do receptor CCRl de 12 ΕΡ 1 305 047 /PT fórmula (I) conforme descrito abaixo, que, quando administrada a um mamífero dela necessitado, de preferência um ser humano, é suficiente para efectuar o tratamento, conforme definido abaixo, na rejeição no transplante do coração. A quantidade de antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento que constitui uma “quantidade terapeuticamente eficaz" variará conforme o antagonista não peptídico do receptor CCR1 utilizado, a severidade da rejeição e a idade do ser humano a tratar, mas pode ser determinada por rotina por uma pessoa competente na matéria tendo em conta os seus próprios conhecimentos e os desta descrição.

Os termos "tratar" ou "tratamento" conforme aqui usados cobrem o tratamento da rejeição no transplante do coração num mamífero, de preferência um ser humano, e incluem: (i) evitar que a rejeição ocorra num mamífero, de preferência um ser humano, em particular, antes ou após transplante do coração nesse mamífero; (ii) inibir a condição, i.e., parar o desenvolvimento da rejeição, ou (iii) aliviar a condição, i.e., provocar a regressão da rejeição.

Nas composições farmacêuticas do invento o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é um composto seleccionado da fórmula (I):

0) onde:

Rla é um ou mais substituintes independentemente seleccionados do grupo que consiste em alquilo ou hidroxialquilo; R2 é fluoro na posição 4; R3 é fenilo substituído na posição 4 com cloro e na posição 2 com aminocarbonilo, ureído ou glicinamido; R4 é -0-; R5 é metileno; e 13

ΕΡ 1 305 047 /PT R6 é -C(O) na forma de um só estereoisómero ou uma sua mistura; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Deste grupo de composições farmacêuticas, um subgrupo preferido de composições farmacêuticas inclui as composições onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é seleccionado no grupo constituído por: (2R,5S)-1-{(4-cloro-2-(aminocarbonil)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (2R)-l-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2-meti1-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (2R,5S)-1-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; e (2R,5S)-l-((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina.

Deste grupo de composições farmacêuticas, um outro subgrupo preferido de composição farmacêuticas inclui as composições onde o antagonista não péptido do receptor CCR1 é (2R)-l-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carboni1-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazina.

Uma classe preferida de composições farmacêuticas, deste subgrupo de composições farmacêuticas, inclui as composições onde o mamífero que delas necessita é um ser humano.

Um grupo preferido dos métodos de administração descritos acima inclui os métodos em que o antagonista não peptídico do receptor CCR1 e a ciclosporina A são administrados ao mamífero que deles necessita simultânea ou sequencialmente. 14

ΕΡ 1 305 047 /PT

No fabrico de um medicamento de acordo com o invento, o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é um composto seleccionado entre a fórmula (I):

onde

Rla é um ou mais substituintes independentemente seleccionados do grupo que consiste em alquilo ou hidroxialquilo; R2 é fluoro na posição 4. R3 é fenilo substituído na posição 4 com cloro e na posição 2 com aminocarbonilo, ureído ou glicinamido; R4 é -0-; R5 é metileno; e R6 é -C(O) na forma de um só estereoisómero ou uma sua mistura ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

De preferência, o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é seleccionado no grupo que consiste em: (2R, 5S) -1 ((4-cloro-2-(aminocarbonil)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-cloro-2-(glicinamido(fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (2R)-1((4-cloro-2(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; 15

ΕΡ 1 305 047 /PT {2R,5S)-1-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; e (2R, 5S) -1- ((4-cloro-2-(glicinamida)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina.

Também se prefere usar o antagonista não peptídico do receptor CCRl (2R)-1-((4-cloro-2-(urdido)fenoxi)metil)- carboni1-2-meti1-4-(4-fluorobenzil)piperazina.

De preferência, o mamífero que dele necessita é ser humano.

De acordo com o presente invento, o antagonista não peptídico do receptor CCRl é um composto seleccionado da fórmula (I):

(!) onde:

Rla é um ou mais substituintes independentemente seleccionados do grupo que consiste em alquilo ou hidroxialquilo; R2 é fluoro na posição 4; R3 é fenilo substituído na posição 4 com cloro e na posição 2 por aminocarbonilo, urdido ou glicinamido; R4 é -0-; R5 é metileno; e

Na forma de um só estereoisómero ou uma sua mistura; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 16

ΕΡ 1 305 047 /PT

De preferência, o antagonista nao peptídico do receptor CCR1 é seleccionado no grupo que consiste em: (2R,5S) -1- ((4-cloro-2-(aminocarbonil)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (2R)-1-((4-cloro-2-(ureido)fenoxi)metil)carbonil-2-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-cloro-2-(ureido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (2R, 5S) -1- ((4-cloro-2-(ureido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; e (2R, 5S) -1- ((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina.

Também é preferível o uso do antagonista não peptídico do receptor CCR1 (2R)-1-((4-cloro-2-(urdido)fenoxi)metil)- carboni1-2-meti1-4-(4-fluorobenzil)piperazina.

De preferência, o mamífero dele necessitado é um ser humano. O antagonista não peptídico do receptor CCR1 e a ciclosporina A podem ser administrados ao mamífero deles necessitado simultânea ou sequencialmente. C. Utilidade das Composições do Invento

As composições farmacêuticas reveladas aqui são úteis para o tratamento da rejeição nos transplantes do coração em mamíferos, de preferência em seres humanos.

Foi demonstrado que a ciclosporina A é muito eficaz no controlo de insucessos de enxertos, rejeição aguda e rejeição sistémica no primeiro ano após o transplante do coração. Contudo, o uso da ciclosporina A mantido a longo prazo, ainda 17

ΕΡ 1 305 047 /PT que eficaz no controlo da vasculopatia crónica do aloenxerto, está directamente associado a efeitos secundários incluindo nefrotoxicidade, hipertensão, diabetes mellitus e doença linfoproliferativa post-transplante.

Foi demonstrado que a inibição da actividade de certas quimiocinas ou seus receptores pode ser eficaz em modelos animais de transplante de órgãos. Como se descreveu acima, num estudo recente de transplante renal em ratos o antagonista do receptor de quimiocinas Met-RANTES, quando administrado com doses baixas de ciclosporina A reduz significativamente os danos renais incluindo, a inflamação intersticial principalmente ao reduzir o número de monócitos infiltrados (Grõne, H.J. et al., (1999), supra). Num outro estudo, foi examinada a importância do receptor CCR1 em modelos de transplante de coração nos ratinhos portadores de uma eliminação direccionada de CCR1 (Gao, W. et al., (2000), supra). Neste estudo, quatro modelos separados de sobrevivência de aloenxertos apresentaram prolongamento significativo de beneficiários CCR1(-/-). Num modelo os níveis de ciclosporina A que tinham efeitos marginais nos ratinhos CCR1(+/+) resultaram numa permanente aceitação de aloenxertos em beneficiários CCR1(-/-).

Com base nestes estudos há uma forte evidência a suportar a teoria de que a quimiocina RANTES, actuando através do receptor CCR1, desempenha um papel importante na rejeição de transplantes de órgãos. Foi demonstrado que os antagonistas não peptídicos dos receptores CCR1 do invento inibem a actividade da RANTES. Portanto, os antagonistas não peptídicos dos receptores CCR1 do invento são úteis no tratamento da rejeição nos transplantes de órgãos, particularmente na rejeição nos transplantes do coração.

Conforme se discute em maior detalhe, adiante, os antagonistas não peptídicos dos receptores CCR1 do invento em combinação com a ciclosporina A mostraram resultados inesperados no tratamento da rejeição nos transplantes do coração em mamíferos. Em particular, a combinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 e uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A demonstra a capacidade para tratar a rejeição 18

ΕΡ 1 305 047 /PT no transplante do coração sem o indesejável efeito nefrotóxico da ciclosporina A. D. Avaliação dos Compostos do Invento

Para demonstrar que os antagonistas não peptídicos dos receptores CCR1 do invento inibem a actividade das quimiocinas ΜΙΡ-Ια ou RANTES actuando através do receptor CCRl, podem ser utilizados vários ensaios in vitro que foram anteriormente descritos. Ver, p. ex., U.S. Patent 6,207, 665 e Hesselgesser, J.et al., (1988), supra, Ng, H.P. et. al., (1999), supra,

Liang, M et. Al., (2000a), supra, e Liang, M. et al., (2000b), supra.

Um dos antagonistas não peptídicos dos receptores CCRl revelado na Patente U.S. 6,207,665, i.e., (2R)-1-((4-cloro-2- (ureído)fenoxi)metil)carboni1-2-meti1-4-(4-fluorobenzil)-piperazina, foi ensaiado quanto à ligação ao receptor CCRl de rato por ensaios de ligação in vitro, descritos no Exemplo 1, estando os resultados patentes na Figura 1. A análise de Scatchard do estudo de deslocamento de ligações revelou que a afinidade do antagonista não peptídico do receptor CCRl era 121±60 nM (ver Figura 1), aproximadamente 100 vezes menos eficaz para o receptor CCRl do rato de que para o receptor CCRl humano Kj= 1 nM) . Além disso, estes antagonistas não peptídicos do receptor CCRl são capazes de deslocar competitivamente RANTES radiomarcados do receptor CCRl de rato com Kj semelhante. Mostrou-se que o mesmo antagonista não peptídico do receptor CCRl é um antagonista funcional in vitro do receptor CCRl de rato realizando ensaios do fluxo de cálcio descritos adiante no Exemplo 2 e Figura 2. O aumento transitório da concentração intracelular de Ca2+ induzido por ΜΙΡ-Ια 50 nM foi inibido pela pré-incubação de células que expressam o receptor CCRl de rato com 100 nM dos antagonistas não peptídicos dos receptores CCRl ("Composto" na Fig 2). Estes resultados demonstraram que ainda que o antagonista não peptídico do receptor CCRl não seja tão potente como inibidor do receptor CCRl de rato, em comparação com o receptor CCRl humano, o antagonista não peptídico do receptor CCRl foi capaz de competir eficazmente pela ligação e foi um potente antagonista funcional do receptor CCRl de rato in vitro. 19

ΕΡ 1 305 047 /PT

Foram conduzidos estudos farmacocinéticos em ratos com um antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento, conforme descrito adiante no Exemplo 3 e Figura 3. Os níveis plasmáticos de pico, 1, 4 e 7 dias após a administração subcutânea do antagonista não peptídico do receptor CCRl variaram entre 12 e 27 μΜ (ver figura 3) . A absorção foi relativamente rápida com níveis plasmáticos significativos observados 15 minutos após a exposição à droga. Após 8 horas, os níveis de droga no plasma eram aproximadamente de 1 a 2 μΜ. A semivida no plasma situou-se entre 2 a 3 horas. Ainda que não parecesse haver qualquer padrão quer de depuração quer de acumulação melhoradas do antagonista não peptídico do receptor CCRl por aplicação repetida de doses subcutâneas, observou-se uma quantidade considerável de variabilidade no rato e extensão da absorção da droga em todos os dias de medição. Estes estudos mostraram que a administração de doses subcutâneas de um antagonista não peptídico do receptor CCRl do invento, a 50 mg/kg três vezes ao dia, proporcionou níveis adequados da droga ao longo de um período de 24 horas.

Um ensaio in vivo que pode ser empregue para demonstrar a utilidade das composições farmacêuticas do invento no tratamento da rejeição nos transplantes do coração em mamíferos é o modelo da rejeição no transplante do coração heterotópico no rato (ver, p.ex., Nisco, S. et. ai. , J. Immunol. (1994), Vol.152, pp. 3786-3792, e Ono, K. et. al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1969) vol. 57, pp. 225-229). As composições farmacêuticas do invento foram testadas num ensaio in vivo descrito adiante no Exemplo 4 e os resultados são ilustrados na Fig. 4. Neste ensaio um aumento no tempo de sobrevivência do aloenxerto corresponde a um decréscimo da rejeição no transplante do coração nos ratos Lewis beneficiários de enxertos de ratos ACI dadores. O tempo médio de sobrevivência do aloenxerto dos animais que tomaram somente o antagonista não peptídico do receptor CCRl, i.e., (2R)-1((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carboni1-2-meti1-4-(4-fluorobenzil)piperazina ("Composto" na Figura 4), em veículo, foi de 8,8 ± 1,2 dias em comparação com 6,8 ± 0,8 dias para animais tratados com veículo ("Controlo na Figura 4). O tempo médio de sobrevivência do aloenxerto dos animais tratados com o antagonista não peptídico do receptor CCRl do invento foi estatisticamente significativo ao nível de 0,05 com respeito 20

ΕΡ 1 305 047 /PT ao tempo de sobrevivência dos grupos de controlo e a análise de tipo logarítmico do teste de sobrevivência deu um p=0,0048 para animais que receberam o antagonista não peptídico do receptor CCR1 em comparação com o controlo.

Foram efectuados ensaios em que os animais foram tratados com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento, i. e., (2R)-1-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carboni1-2-meti1-4-(4-fluorobenzil)piperazina, e uma quantidade sub-nefrotóxica (2,5 mg/kg) de ciclosporina A. O tempo médio de sobrevivência do aloenxerto dos animais a que foram dados somente 2,5 mg/kg de ciclosporina A ("Cs 2,5" na Figura 4) foi de 7,3 ±0,5 dias em comparação com 17,5±5,9 dias para animais sob o mesmo protocolo que foram tratados adicionalmente com o antagonista não peptídico do receptor CCR1 ("Cs 2,5+ Composto" na Figura 4). 0 tempo médio de sobrevivência do aloenxerto dos animais a quem foi administrada uma dose terapêutica de ciclosporina A, 10 mg/kg ("Cs 10" na Figura 4), foi de 12,9±0,7 dias em comparação com 18,4±5,4 dias para animais com o mesmo protocolo que foram tratados adicionalmente com o antagonista não peptídico do receptor CCR1 ("Cs 10 + Composto" na Figura 4) . Os tempos médios de sobrevivência dos animais tratados seja com 2,5 seja com 10 mg/kg de ciclosporina A mais o antagonista não peptídico do receptor CCR1 foram estatisticamente significativos comparados com os tempos médios de sobrevivência dos animais tratados seja com 2,5 mg/kg seja com 10 mg/kg de ciclosporina A sozinha, com valores de p=0,0009 e p=0,0148, respectivamente. A microscopia óptica e a imuno-histologia para a infiltração de monócitos, conforme descrito adiante no Exemplo 5 e Figura 5, confirmaram estes resultados de sobrevivência. Três dias após a transplantação, a pontuação da rejeição foi significativamente reduzida pelo tratamento combinado com o antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento, conforme descrito acima e com a ciclosporina A ("Composto-Ciclosporina A na Figura 5) . Em transplantes não imunossuprimidos foi observado um denso infiltrado mononuclear. Muitos cardiomiócitos eram vacuolados ou necróticos. O edema intersticial era pronunciado. Nos ratos tratados com ciclosporina A, o infiltrado de células 21

ΕΡ 1 305 047 /PT inflamatórias foi reduzido, embora ainda claramente evidente, especificamente em volta de vénulas com destruição focal dos cardiomiócitos. Os ratos tratados somente com o antagonista não peptidico do receptor CCR1 apresentaram infiltrados de células mononucleares focais que eram pronunciados, com morfologia semelhante à observada em transplantes não imunossuprimidos. Os animais tratados com antagonista não peptidico do receptor CCR1 e ciclosporina A mostraram uma morfologia cardíaca bem preservada com infiltrados de células mononucleares esparsas. Em transplantes não imunossuprimidos, muitas células do infiltrado denso de células mononucleares eram monócitos/macrófagos que estavam densamente justapostos aos cardiomiócitos. Em ratos tratados com ciclosporina A, o infiltrado de células inflamatórias era focal e constituído principalmente por células positivas ED-1. Nos animais tratados com antagonista não peptidico do receptor CCR1, o infiltrado de células mononucleares variou significativamente; observaram-se áreas com infiltrado moderadamente denso de monócitos à volta de vénulas. O tratamento combinado com antagonista não peptidico do receptor CCR1 e ciclosporina A resultou numa redução acentuada da infiltração de monócitos/macrófagos nos corações de ratos alogénicos. Com base nos resultados destes estudos, o antagonista não peptidico do receptor CCR1 do invento, administrado em combinação com ciclosporina A, resultou num nítido aumento sinérgico da eficácia em transplantes de coração, comparada com a do antagonista não peptidico do receptor CCR1 ou com a ciclosporina A, sozinhos.

Apesar da combinação de um antagonista não peptidico do receptor CCR1 com ciclosporina A resultar num nítido aumento sinérgico da sobrevivência nos transplantes do coração, permanece a possibilidade de o efeito detectado ser devido às interacções droga/droga que estabilizam os níveis sanguíneos de ciclosporina A em vez de um verdadeiro sinergismo da combinação de drogas. Foram efectuados estudos farmacocinéticos para medir os níveis sanguíneos da ciclosporina A em ratos, na ausência ou na presença de um antagonista não peptidico do receptor CCR1 do invento, i.e., (2R)-1-((4-cloro-2-(ureido)fenoxi)metil)carboni1-2-meti1-4-(4-fluorobenzil)piperazina, conforme descrito adiante no

Exemplo 6 e Figura 6. A observação visual das curvas de tempo- 22 ΕΡ 1 305 047 /PT concentração sugeriu um ligeiro prolongamento da semivida da ciclosporina A no sangue em ratos tratados com o antagonista não peptidico do receptor CCR1 ("Composto" na Figura 6). Contudo, a análise estatística dos grupos emparelhados indicou que não havia diferenças significativas entre os dois parâmetros calculados (valor P para AUC= 0,224 e para Ti/2 = 0,317). Portanto, as interacções droga/droga podem ser rejeitadas como base para um nítido aumento sinérgico da sobrevivência em transplantes do coração em ratos tratados com uma combinação do antagonista não peptidico do receptor CCR1 do invento e ciclosporina A.

Realizaram-se ensaios de adesão e migração ("rolling") in vitro para determinar se a drástica redução na infiltração de monócitos/macrófagos nos corações de ratos alogeneicos pode ser devida, pelo menos em parte, à inibição das quimiocinas que actuam através do receptor CCR1. Trabalhos anteriores mostraram que as células monocíticas apresentam ligação aumentada às células endoteliais activadas por IL-Ιβ que ligam RANTES após pré-incubação com RANTES exógeno durante 30 minutos (Grone, H.J. et. al., (1999), supra). Foram tratados monócitos isolados de sangue humano com quantidades crescentes de um antagonista não peptidico do receptor CCR1 do invento, i.e., (2R)-1-((4-cloro-2-(ureido)fenoxi)metil)-carbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazina, e a ligação a células microvasculares endoteliais foi conduzida como se descreve adiante no Exemplo 7 e Figura 7. A adesão, mediada por RANTES e resistente às forças de corte, de monócitos às células endoteliais microvasculares activadas por IL-Ιβ foi inibida, de forma dependente da dose, pelo antagonista não peptidico do receptor CCR1 ("Composto" na figura 7A). A percentagem de monócitos que se verificou sofrerem migração ("rollig") ou manterem interacções de migração ("rolling"), que serve como uma medida inversa para a paragem dos monócitos, foi também inibida de forma dependente da dose, pelo antagonista não peptidico do receptor CCR1 ("Composto" na Figura 7B) . Estes resultados reforçam suportam o conceito do verdadeiro sinergismo da combinação de um antagonista não peptidico do receptor CCR1 do invento e a ciclosporina A no tratamento da rejeição no transplante de coração em animais. 23

ΕΡ 1 305 047 /PT Ε. Administração das Composições do Invento A administração das composições farmacêuticas do invento pode ser conduzida por qualquer dos modos de administração aceites ou agentes de utilizações semelhantes. Assim, a administração pode ser, por exemplo, oral, nasal, parentérica, tópica, transdérmica ou rectal na forma sólida, semi-sólida, de pó liofilizado ou em formas de dosagem liquida, como por exemplo comprimidos, supositórios, pílulas, cápsulas de gelatina duras e elásticas moles, pós, soluções, suspensões ou aerossóis, ou outras, de preferência em formas de dose unitária convenientes para administração simples de dosagens precisas. As composições incluirão um transportador ou excipiente farmacêutico convencional e um composto do invento como o/um agente activo, e, além disso, podem incluir outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, transportadores, adjuvantes, etc.

Geralmente, dependendo do modo de administração desejado, as composições farmacêuticas conterão cerca de 1% até cerca de 99% em peso de ingredientes activos das composições, i.e., o antagonista não peptídico do receptor CCR1 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e ciclosporina A, e 99% a 1% em peso de um excipiente farmaceuticamente adequado. De preferência, a composição terá cerca de 5% a 75% em peso de ingredientes activos, sendo o resto excipientes adequados farmaceuticamente. A via de administração preferida é a oral, usando um regímen de dosagem diária conveniente que pode ser ajustado de acordo com o grau de gravidade da rejeição do transplante de coração. Para esta administração oral, uma composição farmacêutica do invento é constituída pela incorporação de um ou mais dos excipientes farmacêuticos normalmente empregues, como por exemplo, manitol, lactose, amido, amido pré-gelatinizado, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, derivados de éter de celulose, glicose, gelatina, sacarose, citrato, gaiato de propilo e outros, de qualidade farmacêutica. Estas composições tomam as formas de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada e outras. 24

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De preferência, estas composições farmacêuticas tomarão a forma de cápsulas, caplets ou comprimidos e, portanto, também conterão um diluente como lactose, sacarose, fosfato dicálcico e outros; um desintegrador como croscarmelose de sódio ou seus derivados; um lubrificante como estearato de magnésio e semelhantes; e um aglutinante como amido, goma arábica polivinilpirrolidona, gelatina, derivados de éter de celulose e outros.

As composições farmacêuticas do invento podem também ser formuladas em supositórios usando, por exemplo, cerca de 0,5% a cerca de 50% de ingredientes activos dispostos num transportador que se dissolve lentamente dentro do corpo, p.ex., polioxietilenoglicóis e polietilenoglicóis (PEG), p.ex., PEG 1000 (96%) e PEG 4000 (4%).

As composições liquidas, farmaceuticamente administráveis, podem, por exemplo, ser preparadas dissolvendo, dispersando, etc., as composições farmacêuticas do invento (desde cerca de 0,5% até cerca de 20%) e adjuvantes farmacêuticos opcionais num veiculo, como por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol e outros, para formarem desse modo uma solução ou suspensão.

Se for desejado, as composições farmacêuticas do invento também podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares como agentes molhantes e emulsionantes, agentes tampão de pH, antioxidantes e outros como, por exemplo, ácido cítrico, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, hidroxitolueno butilado, etc.

Os métodos que podem ser usados para preparar as composições acima, são conhecidos ou evidentes para os peritos na arte; por exemplo, ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990). As composições farmacêuticas a administrar conterão, em qualquer caso, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento e uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A, para tratamento da rejeição no transplante do coração. 25

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Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptidico do receptor CCR1, de preferência um antagonista não peptidico do receptor CCR1 de fórmula (I), variará dependendo de diversos factores que incluem a actividade do composto específico utilizado; a estabilidade metabólica e a duração da acção do composto; a idade, peso de corpo, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o modo e tempo de administração; a velocidade de excreção; a gravidade do processo de rejeição; e do hospedeiro submetido à terapia. Geralmente, uma dose diária terapeuticamente eficaz está entre cerca de 0,14 mg e cerca de 14,3 mg/kg peso de corpo, por dia, de um antagonista não peptidico do receptor CCR1 de fórmula (I); de preferência entre 0,7 mg e cerca de 10 mg/kg de peso de corpo por dia; e ainda com maior preferência, entre cerca de 1,4 mg e cerca de 7,2 mg/kg de peso de corpo por dia. Por exemplo, para administrar a uma pessoa com 70 kg, a gama de dosagem deve ser entre cerca de 10 mg e cerca de 1,0 grama por dia de antagonista não peptidico do receptor CCR1; de preferência entre cerca de 50 mg e cerca de 700 mg por dia e com maior preferência desde cerca de 100 mg a cerca de 500 mg por dia. F. Preparação das Composições do Invento

Os antagonistas não peptídicos dos receptores CCR1 do invento são preparados de acordo com os métodos descritos em Patente U. S. 6,207,665.

As ciclosporinas do invento são péptidos neutros lipófilos cíclicos (11-meros) produzidos pelo fungo Tolypocladium inflatum Gams, assim como outros fungos imperfeitos. Estão disponíveis para fins de investigação. Duas preparações de ciclosporina A, Sandimmune® e Neoral® (Novartis), são usadas correntemente no tratamento da rejeição no transplante de órgãos humanos. 26

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Ensaio de ligação in EXEMPLO 1 Ensaio in vitro vitro para antagonistas não peptídicos do receptor CCRl

Este ensaio demonstra as afinidades do antagonista não peptidico do receptor CCR1 do invento, de preferência um antagonista não peptidico do receptor CCR1 de fórmula (I), para ligação ao receptor CCRl de rato.

Reagentes e Soluções

Quimiocinas: ΜΙΡ-Ια e RANTES (Peprotech Inc) Células: Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de rato foram isoladas do sangue completo de ratos Lewis por centrifugação de densidade Accu-paque™ (Accurate Chemical & Scientific Corp.). Ligando: Reconstituiu-se 125I-MIP-la e 125I-RANTES de New-England Nuclear (a actividade especifica é 2200 Ci/mmol, 25 pCi/frasco) em 1 ml de H2O. Tampão de ensaio: NaCl 130 mM, KC1 5 mM, MnCl2 1 mM, Tris 50 mM, 30 yg/ml de bacitracina, 0,1% BSA, pH 7,4 Tampão de lavagem: Solução tampão de fosfato (PBS) Compostos do Invento: A solução-mãe dos compostos era 1 mM em DMSO a 100%. A maior concentração no ensaio foi de 10 μΜ e pode variar dependendo da potência dos compostos. Foram preparadas diluições de 1:3 em série a partir da concentração mais alta com tampão do ensaio. Normalmente foram pesquisadas seis concentrações de cada composto para gerar a curva de doses a partir da qual foi determinado 0 valor Kj. 27

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Procedimento de ensaio;

Os ensaios foram realizados em placas de microtitulação de 96 poços de fundo em v, num volume total de 100 μΐ.

As PBMC de rato foram lavadas uma vez em PBS e ressuspensas no tampão do ensaio até cerca de 0,2 até Ι,ΟχΙΟ1 2 células/ml. As células foram incubadas com 125I-MIP-1oí ou I-RANTES na presença ou ausência de concentrações varias de ΜΙΡ-Ια não marcadas, RANTES não marcadas ou do composto a 4°C durante 30 minutos.

Terminaram-se as reacções removendo alíquotas da suspensão de células e separando as células do tampão por centrifugação por uma mistura de silício/óleo de parafina como está descrito em Hesselgesser et al. (1998), supra. A ligação não específica foi determinada na presença de 100 nM ou de 1 μΜ de ΜΙΡ-1-α ou RANTES não marcadas. A concentração dos compostos no ensaio foram normalmente de 10 μΜ até 30 nM em diluições 1:3 e as concentrações para os compostos mais potentes foram mais baixas conforme a potência. Cálculos: 1

Foram criadas curvas de doses de cada composto com 2 pontos de concentração e os resultados da ligação foram ajustados à curva pelo programa de computador IGOR (Wavermetrics) para determinar a afinidade e o número de locais.

Os antagonistas não peptídicos do receptor CCR1 do invento, quando testados neste ensaio, demonstraram a sua afinidade para se ligarem ao receptor CCR1 de rato. EXEMPLO 2

Ensaio In Vitro: Fluxo de Cálcio Ensaio funcional in vitro para antagonistas não peptídicos do receptor CCR1.

Como o receptor CCRl responde à ligação dos seus ligandos, ΜΙΡ-Ια e RANTES, mobilizando o cálcio intracelular livre, pode-se medir a actividade biológica por avaliação do fluxo de cálcio usando o corante fluorescente Fura-2. No 28

ΕΡ 1 305 047 /PT ensaio seguinte mediu-se a capacidade dos antagonistas, não peptidicos, do receptor CCR1 do invento, bloquearem a resposta biológica.

Protocolo: 1) PBMC do rato foram isoladas como se descreveu no

Exemplo 1, peletizadas por centrifugação e ressuspensas em Hanks Ca2+ (50 ml Hanks, 1,0 ml, Hepes 1M, 1,6 ml CaCl2 500 mM, pH 7,4) . As células foram lavadas duas vezes neste meio. 2) As células foram ressuspensas no meio a uma densidade de lxlO6 células/ml na presença de uma concentração final de Fura-2 AM 1,25 μΜ (Sondas Moleculares) (a solução-mãe foi preparada dissolvendo 50 pg de Fura-2 em 50 μΐ de DMSO). 3) As células foram incubadas a 37°C durante 30 minutos na presença ou ausência de várias concentrações dos antagonistas, não peptidicos, do receptor CCR1 do invento. As células foram lavadas por centrifugação, como acima, para remover Fura-2 livre. As células foram ressuspensas a lxlO6 células/min. Tiraram-se alíquotas (2,0 ml) das células numa cuvete e colocaram-se num espectrofluorímetro PTI Deltascan Model 4000. As células foram estimuladas com ΜΙΡ-Ια 50 nM (Peprotech Inc.) e a libertação de Ca2+ foi medida no espectrofluorímetro em função do tempo. 4) Os resultados foram corrigidos quanto ao Ca2+ nM libertado pela adição de 100 μΐ de 0,1% Triton X-100 (para valores máximos) seguida de 100 μΐ de EGTA 500 mM, pH 8,5 (para valores mínimos). Os antagonistas, não peptidicos, do receptor CCR1 do invento, quando avaliados por este ensaio, demonstraram a sua capacidade de inibirem a mobilização do Ca2+ em resposta à ligação de ΜΙΡ-Ια ao receptor CCR1 do rato. EXEMPLO 3

Ensaio in vivo

Estudos Farmacocinéticos em Ratos Lewis

Foram usados nestes estudos ratos Lewis (RTll), machos adultos, livres de patogénicos específicos (Charles River, Boston), pesando 200 a 250 g. 29

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Uma solução a 40% de ciclodextrina foi preparada juntando ciclodextrina (400 g, Aldrich) a uma garrafa de plástico estéril de 1 litro. Juntou-se soro não tamponado contendo apenas cloreto de sódio e de potássio e agitou-se a mistura que se mexeu durante a noite para dissolver. Juntou-se soro até um volume total de 1 litro. Filtrou-se a solução por um filtro de 0,45 pm para uma garrafa estéril, etiquetou-se e guardou-se a 4°C. Preparou-se uma solução a 25 mg/ml do composto em ciclodextrina dissolvendo o composto na solução a 40% ciclodextrina no soro. Agitou-se a solução e juntaram-se 230 μΐ de HC1 concentrado. Agitou-se a mistura para dissolver. Depois da dissolução se completar (1 h) mediu-se o pH da solução e juntou-se KOH 1M para subir o pH até 4,5. Filtrou-se a solução por um filtro de 0,45 pm e guardou-se a 4°C.

Os antagonistas não peptídicos do receptor CCR1 do invento foram preparados num veiculo de 40% ciclodextrina/soro e injectaram-se ratos subcutaneamente (s.c.) (50 mg/kg 3 vezes ao dia), durante 7 dias. Recolheram-se amostras de sangue por punctura cardíaca em tubos contendo EDTA em várias alturas, centrifugaram-se e o plasma foi guardado congelado até ser analisado quanto a níveis da droga.

As amostras de plasma foram analisadas quer por HPLC usando detecção por UV quer por HPLC-MS (modo de electropulverização operado sob modo de ião positivo). Foram determinadas as concentrações dos antagonistas não péptidos do receptor CCR1 do invento através de uma curva de calibração construída em plasma e analisada em condições idênticas. Usaram-se compostos relacionados como padrões internos nestas análises.

Método HPLC-UV 1) Alíquotas de 100 pl de plasma foram adicionadas a 200 pl de metanol ácido (1% ácido acético), arrefecido a gelo, contendo uma quantidade fixa de um padrão interno e misturou-se bem. 2) O precipitado de proteína resultante foi removido por centrifugação a 5000xg e recolheu-se o sobrenadante. 30

ΕΡ 1 305 047 /PT 3) Em paralelo, amostras de controlo de plasma foram reforçadas com quantidades várias de antagonistas não peptídicos dos receptores CRR1 do invento, normalmente na zona dos 0,3 a 25 μΜ, e processadas como acima. 4) Os sobrenadantes foram evaporados à secura num evaporador a vácuo, reconstituídos com uma solução metanol/água (1:2) (contendo 0,1% TFA), passados ao vórtex durante 30 s e centrifugados para remover sedimentos. 5) Os sobrenadantes resultantes foram injectados numa coluna de fase inversa YMC AQ ODS e analisados em condições de HPLC em gradiente, a um caudal de 1 ml/min. O detector UV foi fixado a 230 nm.

6) As condições do gradiente foram: inicialmente, solvente A

22%/solvente B 78%; 2 min, solvente A 22%/ solvente B 78%; 33 min solvente A 45%/solvente B 55%; 37 min, solvente A 80%/solvente B 20%; 47 min, solvente A 80%/solvente B 20%; 49 min, regresso às condições iniciais. 7) As razões de áreas dos picos entre o pico do padrão interno e o do composto foram calculadas ao longo da gama de concentrações da curva padrão e esta razão foi usada para construir uma curva de calibração. A concentração do composto em causa foi obtido a partir desta curva calculando a razão de áreas de pico entre o pico do composto e do padrão interno.

Método HPLC-MS 1) A metodologia usada foi semelhante à descrita acima, excepto na preparação da amostra que foi parada no passo da precipitação pelo metanol e no método curto isocrático que foi usado em vez do método do gradiente. 2) Foi usado um instrumento FISONS VG Platform Single

Quadrupole com uma entrada de electropulverização operada a 3,57 kV. Usou-se uma coluna YMC AG ODS de fase inversa sob um caudal de 1 ml/min indo o caudal total para um detector UV a 214 nm. 3) O caudal foi dividido de modo a introduzir 50 μΐ/min no espectrómetro de massa. Obtiveram-se cromatogramas ao longo de uma operação de 7,5 min por amostra com uma injecção de 50 μΐ na coluna. Os iões foram recolhidos num modo de ionização por ião positivo simples. 31

ΕΡ 1 305 047 /PT 4) A quantificação foi obtida por integração da área sob as correntes de iões (controlo dos antagonistas, não peptidicos, do receptor CCR1 do invento e padrões internos) e desenhando uma curva de calibração como acima se descreveu.

Os antagonistas não peptidicos do receptor CCR1 do invento, quando testados neste ensaio demonstraram níveis de droga adequados no plasma do rato ao longo de um período de 24 horas. EXEMPLO 4

Ensaio In Vivo

Rejeição no Transplante Heterotópico Cardíaco (Ratos Lewison ou ACI)

Ratos machos adultos, livres de patogénicos específicos ACI (RTla) e Lewis (RT11) (Charles River, Boston, MA), pesando 200 a 250 g foram usados como dadores e recipientes, respectivamente, nestes estudos. Foram transplantados heterotopicamente aloenxertos cardíacos vascularizados no abdómen dos ratos beneficiários usando uma modificação (Nisco, S. e t al, (1994), supra) da técnica de Ono e Lindsay (Ono, K. et al., (1969), supra). Foram executadas anastomoses termino-laterais da aorta descendente do coração do dador na aorta abdominal do beneficiário e da artéria pulmonar do dador na veia cava inferior do beneficiário, depois da veia cava e veias pulmonares do coração do dador serem ligadas. Os aloenxertos abdominais foram apalpados diariamente para avaliar o funcionamento do enxerto e a rejeição foi considerada completa quando cessaram as contracções ventriculares palpáveis.

Aloenxertos cardíacos de ratos ACI foram heterotopicamente transplantados no abdómen de ratos Lewis beneficiários e a estes ratos foi dado um dos tratamentos seguintes: ciclodextrina a 40% s.c. três vezes ao dia; 50 mg/kg de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 do invento em ciclodextrina a 40% s.c. três vezes por dia; ciclosporina A em azeite por sonda esofágica, 10 mg/kg uma vez por dia durante 4 dias, ciclosporina A em azeite por sonda esofágica, 2,5 mg/kg, uma vez por dia, durante todo o estudo; 32

ΕΡ 1 305 047 /PT ciclosporina A em azeite por sonda esofágica, 10 mg/kg, uma vez por dia, durante 4 dias mais 50 mg/kg do antagonista não péptido do receptor CCR1 em ciclodextrina a 40% s.c. três vezes por dia, ou ciclosporina A em azeite por sonda esofágica, 2,5 mg/kg, uma vez por dia, durante todo o estudo mais 50 mg/kg do antagonista não péptido do receptor CCR1 em ciclodextrina a 40% s.c. três vezes por dia. Os corações transplantados foram avaliados diariamente quanto a sinais de rejeição no decurso do estudo.

Os antagonistas não peptídicos do receptor CCR1 do invento, quando testados neste ensaio, demonstraram capacidade de prolongar significativamente o tempo de sobrevivência do transplante do coração quando administrados em combinação com ciclosporina A. EXEMPLO 5

Ensaio In Vivo

Histologia, Imuno-histoquímica e Morfometria

Corações transplantados foram removidos sob anestesia profunda, rapidamente tornados livres de sangue, pesados e depois processados conforme necessário para a histologia e imuno-histoquímica. Os órgãos foram cortados em fatias de 1 mm e fixados por imersão ou em 4% formaldeído em soro tamponado com fosfato (PBS) pH 7,35, (PBS: NaH2P04 99 mM, NaH2P04 108 mM e NaCl 248 mM) durante 24 h ou fixados em "Methacarn" durante 8 h e incluídos em parafina. Realizou-se microscopia óptica em secções de 3 pm coradas com ácido de Schiff periódico ou Goldner-Elastica. Realizou-se microscopia óptica em transplantes alogeneicos do coração 3 dias depois da transplantação.

Usou-se o anticorpo monoclonal EDI (Serotec/Camon) no tecido (3 pm) embebido em parafina fixado com "Methacarn" para corar as células monócitos/macrófagos de rato. Usou-se um sistema de detecção de fosfatase alcalina fosfatase anti-alcalina para visualização (Dako). Foram utilizados controlos que omitem o primeiro ou o segundo anticorpo para cada secção para coloração negativa. A coloração imuno-histológica para monócitos/macrófagos positivos para EDI em transplantes 33 ΕΡ 1 305 047 /PT alogeneicos do coração foi realizada 3 dias após transplantação. A rejeição histopatológica no coração alogeneico do rato foi classificada de acordo com Billingham (Billingham, M.E. em Cardiac transplantation, pp 133-152, Butterworths, Boston, 1990). A rejeição aguda leve (pontuação: 1) era caracterizada por um escasso infiltrado mononuclear intersticial frequentemente acentuado em espaços perivasculares. A rejeição aguda moderada (pontuação: 2) era um infiltrado mononuclear perimiocitico moderadamente denso com alguma necrose de miócitos. A rejeição aguda grave (pontuação: 3) apresentava um denso infiltrado monocitico com hemorragia focal e substituição de miócitos e com endotelialite ocasional de artérias intramurais. A pontuação da rejeição foi calculada para cada bloco de tecidos e calculou-se uma pontuação média dos diferentes blocos para cada coração transplantado pois que os processos de rejeição tendem a ser focais.

Os antagonistas não peptídicos do receptor CCR1 do invento, quando testados neste ensaio, reduziram significativamente a pontuação de rejeição e a extensão da infiltração do enxerto por monócitos, quando administrados em combinação com ciclosporina A. EXEMPLO 6

Ensaio In Vivo Níveis de Ciclosporina A no Sangue dos Ratos A ratos Lewis canulados (6 por grupo) foi administrada uma única dose de 2,5 mg/kg de ciclosporina A (solução Neoral Oral, Sandoz, East Hannover, NJ) diluída em azeite ou uma dose única da mesma ciclosporina A seguida de injecções s.c., três vezes por dia, de 50 mg/kg de um antagonista não peptidico do receptor CCR1 do invento em ciclodextrina a 40%. Foi recolhido sangue total usando EDTA como anticoagulante a várias alturas após dosagem. Os níveis de ciclosporina A no plasma foram medidos usando um kit Cyclo-Trac SP-Whole Blood

Radioimmunoassay for Cyclosporin (DiaSorin, Stillwater, MN) seguindo basicamente as instruções do fabricante. Realizou-se um passo de extracção com metanol para os padrões, controlos e amostras antes do ensaio. Os extractos de metanol foram 34

ΕΡ 1 305 047 /PT combinados com um traçador de ciclosporina marcada com I125. Juntou-se uma mistura de um anticorpo monoclonal de ratinho especifico para ciclosporina A e anticorpo de burro anti-ratinho num só reagente. Após 1 hora de incubação, os tubos foram centrifugados, decantados e contados. A quantidade de radioactividade na pelete era inversamente proporcional à concentração de ciclosporina A na amostra. Obteve-se uma curva de calibração usando um programa de ajustamento logístico da curva com 4 parâmetros pondo em gráfico a extensão da ligação versus log da concentração. As concentrações de ciclosporina A foram interpoladas a partir da curva padrão.

Os antagonistas não peptídicos do receptor CCR1 do invento, quando testados neste ensaio, não afectaram significativamente a semivida de eliminação da ciclosporina no sangue total dos ratos. EXEMPLO 7

Ensaio In Vitro: Adesão e Mobilização ("rolling") de Monócitos Ensaio funcional in vitro de antagonistas não peptídicos do receptor CCR1

Estudou-se a interacção dos monócitos com o endotélio em ensaios de fluxo laminar essencialmente como foi descrito (Grõne, H.J. et al. (1999),supra, e Weber, K.S. et al., Eur. J. Immunol. (1999), Vol, 29, pp 700-712). Células endoteliais microvasculares da derme humana foram cultivadas até à confluência em placas de Petri e estimuladas com 10 ng/ml de IL-Ιβ durante 12 horas ou foram deixadas por tratar. Antes do estudo, as células foram pré-incubadas com 10 ng/ml de RANTES durante 30 minutos. As placas foram dispostas formando a parede inferior numa câmara de fluxo paralelo à parede e montadas na plataforma de um microscópio invertido Olympus IMT-2 com objectivas de contraste de fase 20x e 40x. Os monócitos do sangue humano foram isolados por centrifugação em gradiente hiper-osmolárico Nycodenz e ressuspensos a 5xl06 células/ml no tampão do ensaio (HEPES 10 mM, 0,5% HSA, pH 7,4). Um pouco antes da avaliação, as concentrações de Mg2+ e Ca2+ foram ajustadas a 1 mM. As suspensões de células foram mantidas num bloco de aquecimento a 37°C durante o ensaio e perfundidas na câmara de fluxo a uma taxa de 1,5 dine/cm2 durante 5 minutos. Para as experiências de inibição, os 35 ΕΡ 1 305 047 /PT monócitos foram pré-incubados durante 10 minutos a 37°C com várias concentrações de antagonistas não peptidicos do receptor CCR1 do invento ou um controlo de DMSO. O número de células firmemente aderentes foi contado em pelo menos cinco campos por análise de imagens registadas com uma câmara de vídeo JVC 3CCD de integração longa e com o gravador de vídeo JVC SR 900 E. Os resultados foram expressos em células/mm2. Como medida inversa da adesão, foi avaliado o número de monócitos em migração a baixa tensão de corte no último intervalo de 30 segundos do período de cinco minutos e foi expresso como percentagem das interacções totais dentro dos campos analisados.

Os antagonistas não peptidicos do receptor CCR1 do invento, quando estudados neste ensaio, inibiram a adesão de monócitos a células endoteliais activadas e aumentaram a percentagem de monócitos que sofrem ou mantêm a migração. EXEMPLO 8

Este exemplo ilustra a preparaçao de composições farmacêuticas do invento, para administração oral: A. Ingredientes % p/p

Ingredientes activos 20,0%

Lactose 79,5%

Estearato de magnésio 0,5%

Os ingredientes acima são misturados e colocados em cápsulas de gelatina dura, contendo 100 mg cada, sendo uma cápsula aproximadamente uma dose total diária.

Ingredientes %p/p Ingredientes activos 20, 0% Estearato de magnésio 0,9% Amido 8,6% Lactose 69,6% PVP (polivinilpirrolidina) 0,9%

Os ingredientes acima, com excepção do estearato de magnésio, são combinados e granulados usando água como líquido de granulação. A formulação foi depois seca, misturada com o 36 ΕΡ 1 305 047 /PT estearato de magnésio e enformada em comprimidos por uma máquina apropriada. C. Ingredientes Ingredientes activos o,i g Propilenoglicol 20,0 g Polietilenoglicol 400 20,0 g Polissorbato 80 1,0 g Água q.b. 100 ml Os ingredientes activos sao dissolvidos em propilenoglicol, polietilenoglicol 400 e polissorbato 80. Juntou-se então uma quantidade suficiente de água sob agitaçao para se obterem 100 ml de solução que foi filtrada e engarrafada. D. Ingredientes %p/p Ingredientes activos 20,0% Óleo de amendoim 78,0% Span 60 2,0% Os ingredientes acima são fundidos, misturados e vão encher cápsulas elásticas moles • E. Ingredientes %p/p Ingredientes activos 1, 0% Metil- ou carboximetilcelulose 2,0% Soro a 0,9% qbp 100 ml Os ingredientes activos são dissolvidos em solução celulose/soro, filtrada e engarrafada para uso futuro. EXEMPLO 9 0 exemplo ilustra a preparaçao de uma composição farmacêutica representativa do parentérica: invento, para administração Ingredientes Ingredientes activos 0,02 g Propilenoglicol 20,0 g Polietilenoglicol 400 20,0 g Polissorbato 80 1,0 g Soro a 0,9% qbp 100 ml 37

ΕΡ 1 305 047 /PT

Os ingredientes activos são dissolvidos em propilenoglicol, polietilenoglicol 400 e polissorbato 80. Junta-se então uma quantidade suficiente de soro a 0,9%, sob agitação, para se obterem 100 ml da solução I.V., que é filtrada por um filtro de membrana de 0,2 ym e embalada sob condições estéreis. EXEMPLO 10

Este exemplo ilustra a preparação de uma composição farmacêutica representativa do invento, sob a forma de supositório.

Ingredientes %p/p Ingredientes activos 1,0% Polietilenoglicol 1000 74, 5% Polietilenoglicol 4000 24, 5%

Os ingredientes são fundidos em conjunto e misturados em banho de vapor e vertidos para moldes que podem conter 2,5 g de peso total. EXEMPLO 11 0 exemplo ilustra a preparação de uma composição farmacêutica representativa do invento, para insuflação: %P/P 1,0% 99,0%

Ingredientes

Ingredientes activos micronizados Lactose micronizada

Os ingredientes são moídos, misturados e colocados num insuflador equipado com uma bomba doseadora. EXEMPLO 12 O exemplo ilustra a preparação de uma composição farmacêutica representativa do invento, sob forma nebulizada:

Ingredientes %p/p

Ingredientes activos 0,005% Água 89,995%

Etanol 10,000% 38

ΕΡ 1 305 047 /PT

Os ingredientes activos são dissolvidos em etanol e misturados com água. A formulação é depois embalada num nebulizador equipado com uma bomba doseadora. EXEMPLO 13

Este exemplo ilustra a preparação de uma composição farmacêutica representativa do invento, sob forma de aerossol:

Ingredientes %p/p

Ingredientes activos 0,10%

Propulsor 11/12 98,90% Ácido oleico 1,00%

Os ingredientes activos foram dispersos no ácido oleico e no propulsor. A mistura resultante é depois vertida num recipiente de aerossol equipado com uma válvula medidora.

Lisboa,

Claims (13)

1. ΕΡ 1 305 047 /PT 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica útil no tratamento da rejeição do transplante do coração em mamíferos, composição esta que compreende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 e uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A, onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é um composto escolhido entre os de fórmula (I):

   onde: Rla é um ou mais substituintes escolhidos entre o grupo constituído por alquilo ou hidroxialquilo; R2 é fluoro na posição 4; R3 é fenilo substituído na posição 4 com cloro e na posição 2 com aminocarbonilo, ureído ou glicinamido; R4 é -0-; R5 é metileno; e R6 é -C(0) na forma de um estereoisómero único ou de uma sua mistura; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é escolhido do grupo constituído por: (2R,55)-1-((4-cloro-2-(aminocarbonil)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazina; (2R)-l-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2-meti1-4-(4-fluorobenzil)piperazina; ΕΡ 1 305 047 /PT 2/5 (trans)-1-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (5S) -1- (( 4-cloro-2 - (ureído) f enoxi) met il) carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; e (2R,5S)—1-((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina.
3. 3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é (2R)-1-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazina.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 e a ciclosporina A são para administração simultânea ou sequencial.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes onde o mamífero é um ser humano.
6. 6. Uso de uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 e uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A, para fabrico de um medicamento para tratamento da rejeição no transplante do coração num mamífero, onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é um composto escolhido da fórmula (I):

   onde: Rla é um ou mais substituintes escolhidos independentemente entre o grupo constituído por alquilo ou hidroxialquilo; R e fluoro na posição 4; ΕΡ 1 305 047 /PT 3/5 R3 é fenilo substituído na posição 4 com cloro e na posição 2 com aminocarbonilo, ureído ou glicinamido; R4 é 1 0 1 R5 é metileno; R6 é -C(0)-; Na forma de um estereoisómero único ou de uma sua mistura; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Uso de acordo com a reivindicação 6 onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é escolhido entre o grupo constituído por: (2R,5S) -1- ((4-cloro-2-(aminocarbonil)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazina; (2R)-l-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (2R,5S)-l-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; e (2R,5S) —1-((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina.
8. 8. Uso de acordo com a reivindicação 6 onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é (2R)-1-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carboni1-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazina.
9. 9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6- 8 onde o mamífero necessitado é um ser humano.
10. 10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6- 9 onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 e a ΕΡ 1 305 047 /PT 4/5 ciclosporina A são para administração simultânea ou sequencialmente.
11. 11. Composição farmacêutica em duas formulações diferentes compreendendo, cada uma, um dos dois ingredientes activos: uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista não peptídico do receptor CCR1 juntamente com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é um composto escolhido da fórmula (I):

    onde: Rla é um ou mais substituintes escolhidos independentemente entre o grupo constituído por alquilo ou hidroxialquilo; R2 é fluoro na posição 4; R3 é fenilo substituído na posição 4 com cloro e na posição 2 com aminocarbonilo, ureído ou glicinamido; R4 é -0-; R5 é metileno; e R6 é -C(O) Na forma de um estereoisómero único ou de uma sua mistura; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma quantidade sub-nefrotóxica de ciclosporina A juntamente com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, úteis no tratamento da rejeição no transplante do coração em mamíferos.
12. 12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11 onde o antagonista não peptídico do receptor CCR1 é escolhido no grupo constituído por: ΕΡ 1 305 047 /PT 5/5 (2R,55)-1-((4-cloro-2-(aminocarbonil)fenoxi)metil)carbonil 2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; ,5- -(4- (trans)-1-((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2 dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazina; (2R)-1-((4-cloro-2-(ureido)fenoxi)metil)carbonil-2-metil-4 fluorobenzil)piperazina; (trans)-1-((4-cloro-2-(ureído)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; (2R,55)-1-((4-cloro-2-(ureido)fenoxi)metil)carbonil-2,5-dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina; e ,5- a duas (2R,55)-1-((4-cloro-2-(glicinamido)fenoxi)metil)carbonil-2 dimetil-4-(4-fluorobenzil)piperazina.
13. 13. Composição farmacêutica de acordo com reivindicação 11 ou a reivindicação 12, onde as formulações são para administração sequencial. Lisboa