SK1222003A3

SK1222003A3 - Non-peptide CCR1 receptor antagonists in combination with cyclosporin A for the treatment of heart transplant rejection

Info

Publication number: SK1222003A3
Application number: SK122-2003A
Authority: SK
Inventors: Richard Horuk
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 2000-07-31
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2003-09-11
Also published as: ES2261447T3; PT1305047E; PL364521A1; WO2002009762A3; AU2001278073B2; AU7807301A; EE200300047A; SI21123A; HUP0300686A3; IL153933A0; HUP0300686A2; DE60120986T2; BR0113140A; JP2004530630A; NO20030475D0; DE60120986D1; US6740636B2; YU6703A; EP1305047A2; US20020039997A1

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka farmaceutických kompozícií použitelných na liečenie rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, ktoré obsahujú farmaceutický prijateľné vehikulum, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy a subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A. Predložený vynález sa týka tiež spôsobu použitia týchto farmaceutických kompozícií pri liečení rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov.

Doterajší stav techniky

Dôležitú zložku zápalového procesu predstavuje aktivácia a migrácia vybranej populácie leukocytov z obehu a ich akumulácia v poškodenom tkanive. Aj keď myšlienka putovania leukocytov nie je nová, v poslednom čase dochádza k jej obrodeniu v súvislosti s objavením a charakterizáciou selektínových a integrínových rodín adhéznych molekúl a rozsiahlej rodiny selektívnych chemotaktických cytokínov známych ako chemokíny. Chemokínové receptory sú vystavené na leukocytoch a po naviazaní chemokínu produkujú signály, pričom tieto signály prípadne vyvolávajú migráciu alebo aktiváciu leukocytov smerom k zdroju chemokínu. Preto hrajú chemokíny kritickú úlohu pri udržiavaní obrany hostiteľa, a tiež tak pri priebehu imunitnej odpovede, a to prostredníctvom regulácie aktivácie a migrácie leukocytov z periférnej krvi do extravaskulárnych oblasti v orgánoch, koži, kĺboch alebo spojivovom tkanive, alebo iných tkanivách.

Pôvodne sa chemokínová rodina molekúl rozdelila dc dvoch skupín, to znamená podrodiny „C-X-C a podrodiny „C-C. Charakteristickou vlastnosťou obidvoch z týchto skupín je prítomnosť štyroch cysteínových zvyškov v molekulách vo vysoko konzervovaných miestach. V chemokínovej podrodine C-C prvé dva z týchto zvyškov vzájomne susedia, zatial čo v podrodine C-X-C oddeľuje cysteínové zvyšky jedna aminokyselina. Zdá sa, že nedávno opísaI ný -C- chemokín predstavuje novú rodinu chemokínov, pretože tento -C- chemokín nemá dva zo štyroch cysteínových zvyškov prítomných v podrodine C-C alebo podrodine C-X-C.

Jedným z členov podrodiny C-C chemokínov je makrcfágový zápalový proteín-ία. (ΜΙΡ-Ια). Je exprímovaný bunkami, ako sú makrofágy, T a B lymfocyty, neutrofily a fibroblasty. Nedávna štúdia (pozri Karpus, W.J. a kol., J. Immunol. (1995), zv. 155, str. 5003 až 5010) poskytuje významný in vivo spôsob validácie úlohy ΜΙΡ-Ια u myšieho modelu experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE) mnohonásobnej sklerózy. Mnohonásobná skleróza je autoimunitné ochorenie sprostredkované T a B lymfocytmi a makrofágmi, ktoré vedie k rozsiahlemu zápalu a demyelinácii bielej hmoty centrálneho nervového systému. Štúdia ukázala, že protilátky proti ΜΙΡ-Ια predchádzajú ako prvotnému ochoreniu, tak relapsu ochorenia, a tiež predchádzajú infiltrácii mononukleárnych buniek do centrálneho nervového systému. Liečenie protilátkami je tiež schopné znížiť silu následných klinických ochorení. Tieto výsledky viedli výskumných praccvníkov k hypotéze, že ΜΙΡ-Ια hrá v etiológii mnohonásobnej sklerózy dôležitú úlohu. Iná štúdia (pozri Godiska, R. a kol., J. Neuroímmunol. (1995), zv. 58, str. 167 až 176) ukázala upreguláciu mRNA pre mnohé chemokíny, vrátane ΜΙΡ-Ια, v léziách a mieche SJL myši (kmeň myší náchylných na ochorenia Th_lz ako je EAE) v priebehu akútnej EAE.

RANTES je ďalším členom chemokínovej podrodiny C-C (označenie RANTES je akronym odvodený od niektorých pôvodne pozorovaných a predpokladaných charakteristík proteínu a jeho génu: Regulated úpon Activation Normál T celí Expressed presumed Secreted). Našlo sa široké spektrum tkanív exprimujúcich RANTES podľa podobnej schémy ako ΜΙΡ-Ια. Z mnohých štúdii je zrejmé, že sa abnormálna produkcia RANTES zúčastňuje progresie reumatoidnej artritídy (pozri Rathanaswami, P. a kol., J. Biol. Chem. (1993), zv. 268, str. 5834 až 5839 a Snowden, N. a kol·., Lancet (1994), zv. 343, str. 547 až 548). Reumatoidná artritída je chronické zápalové ochorenie čiastočne charakteristické infiltráciou pamäťovými T lymfocytmi a monocytmi, o ktorom sa predpokladá, že je sprostredkované chemotaktickými faktormi uvoľňovanými zápalovými tkanivami. 0 účasti RANTES na patofyziológii reumatoidnej artritídy svedčí tiež ďalšia štúdia (pozri Barnes, D.A. a kol., J. Clin. Invest. (1998), zv. 101, str. 2910 až 2919 a Plater-Zyberk, C.A. a kol., Immunol. Lett. (1997), zv. 57, str. 117 až 120). Napríklad na potkaňom modeli adjuvans-indukovanej artritídy (AIA) protilátky proti RANTES výrazne znižujú rozvoj ochorenia .

Tieto a ďalšie štúdie poskytujú významné dôkazy skutočnosti, že v EAE modeloch mnohonásobnej sklerózy sú zvýšené hladiny ΜΙΡ-Ια a u reumatoidnej artritídy sú zvýšené hladiny RANTES (pozri napr. Glabinski, A.R. a kol., Am. J. Pathol. (1997), zv. 150, str. 617 až 630; Glabinski, A.R. a kol., Methods Enymol. (1997), zv. 288, str. 182 až 190; a Miygishi, R.S. a kol., J. Neuroimmunol. (1997), zv. 77, str. 17 až 26). Ďalej, ako je opísané skôr, sú tieto chemokíny chemoatraktantmi pre T bunky a monocyty, ktoré predstavujú hlavné typy buniek, ktoré sa zúčastňujú na patofyziológii týchto ochorení. Preto by akákolvek molekula, ktorá by inhibovala ľubovoľný z týchto chemokínov, bola užitočná na liečenie týchto ochorení a mohla by sa preto použiť ako proti zápalové činidlo.

Existuje tiež veľa dôkazov spájajúcich RANTES s rejekciou po transplantácii orgánov. Infiltrácia mononukleárnych buniek do interstícia orgánových transplantátov je známkou akútnej bunkovej rejecie. Tento bunkový infiltrát sa primárne skladá z T buniek, makrofágov a eozinofilov. Pri štúdii expresie RANTES v priebehu akútnej rejekcie obličkového aloštepu sa zistila expresia RANTES mRNA v infiltrujúcich mononukleárnych bunkách a epitelových bunkách renálnych tubulov a u RANTES samotného sa zistilo, že sa viaže na povrch endotelu mikrovaskulatúry odmietaného štepu (pozri Pattison, J. a kol., Lancet (1994), zv. 343, str. 209 až 211 a Wiedermann, C. J. a kol., Curr. Biol. (1993), zv. 3, str. 735 až 739). Nedávna štúdia (pozri Pattison, J.M. a kol., J. Heart Lung Transplant. (1996), zv. 15, str. 1194 až 1199) naznačuje, že by RANTES mohol hrať úlohu u aterosklerózy štepu. Zvýšené hladiny RANTES, ako mRNA, tak proteínu, sa stanovili u mononukleárnych buniek, myofibroblastov a endotelových buniek artérií, u ktorých dochádza v porovnaní s normálnymi koronárnymi artériami k urýchlenej ateroskleróze.

Pretože je RANTES ligandom chemokínových receptorov CCR1 a CCR5, tieto receptory, umiestnené na cirkulujúcich mononukleárnych bunkách, potom môžu byť v oblasti transplantačnej biológie použiteľnými terapeutickými cieľmi. Význam CCR1 receptora sa testoval u modelov transplantácie srdca u myši s cielenou deléciou v oblasti CCR1 génu (Gao, W. a kol., J. Clin. Invest. (2000), zv. 105, str. 34 až 44). Pri tejto štúdii vykázali štyri modely prežitia štepu významné predĺženie u príjemcov CCR1(—/—). V jednom modeli viedli hladiny cyklosporínu A, ktorý mal u CCR1(+/+) myší málo významné účinky, k permanentnému prijatiu aloštepu u CCR1(-/-) príjemcov.

U určitých malých molekúl sa pomocou inhibície akrivity RANTES a ΜΙΡ-Ια v poslednom čase ukázalo, že sú nepeptidovými antagonistami CCR1 receptora, a že sú preto použiteľné ako protizépalové činidlá. Pozri publikovanú patentovú PCT prihlášku WO 98/56771, US patentovú prihlášku č. 09/094 397 podanú 9. júna 1998, teraz US patent 6 207 665 udelený 27. marca 2001, Hesseigesser, J. a kol., J. Biol. Chem. (1998), zv. 273, str. 15687 až 15692, Ng, H.P. a kol., J. Med. Chem. (1999), zv. 42, str. 4680 až 4694 , Liang, M. a kol., Eur. J. Pharmacol. (2000a), zv. 389, str. 41 až 49 a Liang, M. a kol., J. Biol. Chem. (2000b), zv.

275, str. 19000 až 19008. Obsah týchto patentových prihlášok a odborných článkov je tu v plnom rozsahu zahrnutý odkazom.

Cyklosporíny sú rodina neutrálnych lipofilných cyklických oligopeptidov (undekamérov) produkovaných hubou Tolypocladium inflatum Gams, a taktiež inými nedokonalými hubami (fungi imperfecti) . Hlavnou zložkou je cyklosporín A, dobre známe komerčne dostupné imunosupresívne liečivo, ktorý selektívne inhibuje adaptívne imunitné odpovede biokovaním aktivácie T buniek (pozri Kahan, B.D., New Engl. J. Med. (1989), zv. 321, str. 1725 až 1738 a Valantine, H., Transplant. Proc. (2000), zv. 32, str. 27S až 44S) . Aj keď je cyklosporín A kritickým faktorom pre úspech orgánovej transplantácie, zostáva významným problémom dlhodobá bezpečnosť spojená s imunosupresiou založenou na cyklosporíne A, zahŕňajúca nefrotoxicitu, hypertenziu, diabetes melitus a potranspiantačné lymfoproliferatívne ochorenie. Preto je žiaduce, aby bolo možné podávať subnefrotoxické dávky cyklosporínu A, a tým redukovať nežiaduce vedlajšie účinky, pri zachovaní imunosupresívnej aktivity potrebnej na zabránenie chronickej rejekcie, ktorá je v prípade srdcovej transplantácie známa ako chronická vaskulopatia štepu, ktorá sa väčšinou prejavuje ako urýchlená artérioskleróza.

Pri nedávnej renálnej transplantačnej štúdii peptidový antagonista chemokínových receptorov Met-RANTES významne redukoval, ak sa podával s nízkymi dávkami cyklosporínu A, renálne poškodenie, vrátane intersticiálneho zápalu, hlavne znížením množstva infiltrujúcich monocytov (Gróne, H. J. a kol., Faseb, J. (1999), zv. 13, str. 1371 až 1383). Táto štúdia podporuje teóriu, že RANTES, prostredníctvom aktivácie špecifických chemokínových receptorov na mononukleárnych bunkách, hrá dôležitú úlohu u rejekcie alcštepov.

Európska patentová prihláška 1 000 626 (Applied Research Systems) opisuje použitie peptidového antagonistu chemokínových receptorov, Met-RANTES, spolu s cyklosporínom A na liečenie ale6 bo prevenciu rejekcie transplantovaných orgánov, tkanív alebo buniek.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka farmaceutických kompozícií použiteľných pri liečení rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, tieto kompozície obsahujú jedno alebo viac farmaceutický prijateľných vehikúl, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy a subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A. Najmä sa predložený vynález týka farmaceutických kompozícií použiteľných pri liečení transplantačnej rejekcie u cicavcov, tieto kompozície obsahujú jedno alebo viac farmaceutický prijateľných vehikúl, subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A a terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy zvoleného zo zlúčenín opísaných v US patente 6 207 665.

Predložený vynález sa týka tiež spôsobu podávania farmaceutickej kompozície použiteľnej na liečenie rejekcie po transplantácii srdca u cicavcov, táto kompozícia obsahuje jedno alebo viac farmaceutický prijateľných vehikúl, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy a subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A, cicavcovi, ktorý to potrebuje. Najmä sa predložený vynález týka spôsobu podávania farmaceutickej kompozície použiteľnej na liečenie rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, táto kompozícia obsahuje jedno alebo viac farmaceutický prijateľných vehikúl, subnefrotoxické množstve cyklosporínu Ά a terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy zvoleného zo zlúčenín opísaných v US patente 6 207 665, cicavcovi, ktorý to potrebuje.

Predložený vynález sa týka tiež spôsobu liečenia rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, tento spôsob zahŕňa podávanie farmaceutickej kompozície obsahujúcej jedno alebo viac farmaceutický prijateľných vehikúl, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy a subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A, cicavcovi, ktorý to potrebuje. Najmä sa predložený vynález týka spôsobu liečenia rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, tento spôsob zahŕňa podávanie farmaceutickej kompozície obsahujúcej jedno alebo viac farmaceutický prijateľných vehukúl, subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A a terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy zvoleného zo zlúčenín opísaných v US patente 6 207 665, cicavcovi, ktorý to potrebuje.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje účinok antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa predloženého vynálezu na väzbu rádioaktívne označeného ΜΙΡ-Ια na potkanie bunky exprimujúce CCR1.

Obr. 2 ukazuje účinok antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa predloženého vynálezu na vzostup íntracelulárnych Ca²⁺ vyvolaný ΜΙΡ-Ια u potkaních buniek exprimujúcich CCR1.

Obr. 3 ukazuje plazmatické koncentrácie antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa predloženého vynálezu po chronickom subkutánnom podávaní potkanom.

Obr. 4 ukazuje účinok kombinácií antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa predloženého vynálezu a cyklosporínu A na prežitie alogénnych srdcových transplantátov u potkanov.

Obr. 5 ukazuje účinok kombinácií antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa predloženého vynálezu a cyklosporínu A na rejekčné skóre potkanov 3 dni po obdržaní alogénnych srdcových transplantátov.

Obr. 6 ukazuje účinok antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa predloženého vynálezu na plazmatické hladiny cyklosporínu A u potkanov.

Obr. 7 ukazuje účinok antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa predloženého vynálezu na adhéziu monocytov k aktivovaným, endoteiovým bunkám.

Detailný opis vynálezu

A. Definícia

Nasledujúce termíny, ako sú použité v rámci predloženého vynálezu, nadobúdajú ďalej uvedené významy, ak nie je uvedené inak.

Termín „aminokarbonylová skupina označuje zvyšok vzorca -C(0)NH₂.

Termín „fenylová skupina” označuje benzénový zvyšok, prípadne substituovaný jedným alebo viacerými substituentami zvolenými zo skupiny zahŕňajúcej hydroxyskupinu, atómy halogénov, alkylové skupiny, halogénalkylové skupiny, alkoxyskupiny, alkenylové skupiny, nitroskupiny, kyanoskupiny, aminoskupiny, monoalkylaminoskupiny, dialkylaminoskupiny, alkylkarbonylové skupiny, karboxyskupiny, alkoxykarbonylové skupiny a aminokarbonylové skupiny.

Termín farmaceutický prijatelná sol zahŕňa ako adičné soli s kyselinou, tak aj so zásadou.

Termín „farmaceutický prijatelná adičná soľ s kyselinou označuje tie soli, ktoré si zachovávajú biologické účinky a vlastností voľných zásad, ktoré nie sú biologicky alebo inak nežiadúce, a ktoré sú vytvorené s anorganickými kyselinami, ako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná a pod., a organickými kyselinami, ako je kyselina octová, kyselina propionová, kyselina pyrohroznová, kyselina maleínová, kyselina malónová, kyselina jantárová, kyselina fumárová, kyselina vínna, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina mandľová, kyselina metánsulfónová, kyselina etánsulfónová, kyselina p-toluénsulfónová, kyselina salicylová a podobne.

Termín „farmaceutický prijatelná adičná sol so zásadou označuje tie soli, ktoré si zachovávajú biologické účinky a vlastnosti voľných kyselín, ktoré nie sú biologicky alebo inak nežiaduce. Tieto soli sa pripravia pridaním anorganickej zásady alebo organickej zásady k voľnej kyseline. Medzi soli odvodené od anorganických zásad patria, bez akéhokoľvek obmedzenia, sodné soli, draselné soli, lítne soli, amónne soli, vápenaté soli, horečnaté soli, zinočnaté soli, hlinité soli a podobne. Výhodnými anorganickými sólami sú soli amónne, sodné, draselné, vápenaté a horečnaté. Medzi soli odvodené od organických zásad patria, avšak bez akéhokolvek obmedzenia, soli primárnych, sekundárnych a terciárnych amínov, substituovaných amínov vrátane prirodzene sa vyskytujúcich substituovaných amínov, cyklických amínov a zásaditých ionomeničových živíc, ako sú izopropylamínové, trimetylamínové, dietylamínové, trietylamínové, tripropylamínové, etanolamínové, 2-dimetylaminoetanolové, 2-dietylaminoetanolové, trimetamínové, dicyklohexylamínové, lyzínové, arginínové, histidínové, kofeínové, prokaínové, hydrabamínové, cholínové, betaínové, etyléndiamínové, glukozamínové, metylglukamínové, teobromínové, purinové, piperazínové, piperidínové, N-etylpiperidínové, polyamínové živice a podobne. Obzvlášť výhodnými organickými zásadami sú izopropylamín, dietylamín, etanolamín, trimetylamín, dicyklohexylamín, cholín a kofeín.

„Ureidoskupina označuje zvyšok vzorca -N(H)-C(O)-NH₂ .

Zo skôr uvedených definícií a z príkladov sa rozumie, že zvyšky obsahujúce substituovanú alkylovú skupinu môžu byť ľubovoľne substituované na ľubovoľnom uhlíkovom atóme alkylovej skupiny.

Termínom „rejekcia srdcového transplantátu sa pre potreby predloženého vynálezu myslí taký chorobný stav, ktorý sa vyznačuje akútnou alebo chronickou pooperačnou rejekciou srdcového transplantátu a tento termín zahŕňa skoré zlyhanie štepu, skorú akútnu rejekciu, skorú systémovú rejekciu a neskorú chronickú vaskulopatiu aloštepu (termíny skorá a neskorá sú definované ako menej, alebo viac, ako šesť mesiacov až rok po transplantácii) .

Termín „cicavec zahŕňa človeka a domáce zvieratá, ako sú mačky, psy, ošípané, dobytok, ovce, kozy, kone, králiky a podobne .

Termín „subnefrotoxické množstvo” označuje množstvo cyklosporínu A, ktoré je terapeuticky účinným množstvom na liečenie rejekcie srdcového transplantátu u človeka, ktoré však nie je spojené s nežiaducimi vedlajšími účinkami nefrotoxicity, ktorá sa vyznačuje zvýšeným sérovým kreatinínom, zvýšenou proteinúriou, zvýšenou retenciou tekutín, zníženou rýchlosťou glomerulárnej filtrácie a zníženou exkréciou sodíka a draslíka.

Termín „súbežne označuje použitie farmaceutických kompozícii obsahujúcich dve účinné látky, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podlá predloženého vynálezu a subnefrotické množstvo cyklosporínu A, v prítomnosti jednej alebo viacerých farmaceutický prijateľných vehikúl, v jedinej formulácii.

Termín „postupne označuje použitie farmaceutických kompozícií podlá predloženého vynálezu v dvoch rozdielnych formuláciách, z ktorých každá obsahuje jednu z dvoch účinných látok, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receprora nepeptidovej povahy podľa predloženého vynálezu alebo subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A, spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými vehikulami. Tieto dve formulácie sa podávajú cicavcovi, ktorý to vyžaduje, v rôznych časoch.

Antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy podlá predloženého vynálezu môžu obsahovať vo svojej štruktúre asymetrické atómy uhlíka. Preto môžu antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa predloženého vynálezu existovať ako jednoduché stereoizoméry, racemáty a ako zmesi enantiomérov a diastereomérov.

Všetky tieto jednoduché stereoizoméry, racemáty a ich zmesi sa považujú za súčasť predloženého vynálezu. Absolútna konfigurácia určitých uhlíkových atómov v antagonistoch CCR1 receptora nepeptidovej povahy je, ak je známa, označená príslušným absolútnym deskriptorom R alebo S. Deskriptor trans sa používa na označenie stavu, keď sú substituenty R^la na opačných stranách piperazínovej roviny. Deskriptor cis sa používa na označenie stavu, keď sú substituenty R^la na rovnakej strane piperazínovej roviny.

Tu použitá nomenklatúra pre antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy podía predloženého vynálezu je modifikovanou formou systému IUPAC, podía ktorej sú antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy spadajúce do rozsahu predloženého vynálezu pomenované ako piperazínové deriváty, ako je opísané v US patente 6 207 665.

Termín „terapeuticky účinné množstvo označuje také množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy, výhodne antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy všeobecného vzorca I, ako je opísaný ďalej, ktoré, ak sa podáva cicavcovi, ktorý to potrebuje, výhodne človeku, je dostatočné na účinné liečenie, ako je definované ďalej, rejekcie srdcového transplantátu. Množstvo antagonitu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podía vynálezu, ktoré tvorí „terapeuticky účinné množstvo, sa bude meniť v závislosti od použitého antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy, závažnosti rejekcie a veku liečeného človeka, odborník v odbore ho však môže, vzhľadom na jeho vlastné znalosti a tento opis, stanoviť rutinne.

Termíny „liečenie alebo „ošetrenie, ako sú tu použité, zahŕňajú liečenie rejekcie srdcového transplantátu u cicavca, výhodne človeka, a zahŕňajú:

(i) prevenciu výskytu rejekcie u cicavca, výhodne človeka, najmä pred alebo po transplantácii srdca u tohto cicavca;

(ii) inhibíciu stavu, to znamená zastavenie rozvoja rejekcie; alebo (iii) odstránenie stavu, to znamená spôsobenie regresie rejekcie.

B. Výhodné uskutočnenia

Výhodná skupina farmaceutických kompozícií z farmaceutických kompozícií opísaných skôr zahŕňa také kompozície, v ktorých je antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy zlúčenina všeobecného vzorca I

v ktorom

R^la znamená jeden alebo viac substituentov nezávisle zvolených zo skupiny zahŕňajúcej alkylové skupiny a hydroxyalkylové skupiny;

R² znamená atóm fluóru v polohe 4;

R³ znamená fenylovú skupinu substituovanú v polohe 4 atómom chlóru a v polohe 2 aminokarbonylovou skupinou, ureidoskupinou alebo glycínamidoskupinou;

R⁴ znamená skupinu -0-;

R⁵ znamená metylénovú skupinu; a

R⁵ znamená skupinu -C(0)-;

ako jednoduchý stereoizomér alebo ich zmes; alebo jej farmaceutický prijateľná soľ.

Výhodná podskupina farmaceutických kompozícií z tejto skupiny farmaceutických kompozícií zahŕňa také kompozície, v ktorých je antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy zvolený zo skupiny zahŕňajúcej:

(2R,5S)-1-((4-chlór-2-(aminokarbonyl) fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(trans)-1-( (4-chlór-2-(glycínamido) fenoxy)metyl)karbonyi-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(27?) -1— ( (4-chlór-2- (ureido) fenoxy) metyl) karbonyl-2-met y 1-4- (4-fluórbenzyl)piperazín;

(trans)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyi)piperazín ;

(2R,5S)-i-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyi-4-(4-fluórbenzyl)piperazín; a (2R,5S)-1-((4-chlór-2-(glycínamido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín.

Ďalšia výhodná podskupina farmaceutických kompozícii z tejto skupiny farmaceutických kompozícií zahŕňa také kompozície, v ktorých je antagonistom CCRI receptora nepeptidovej povahy (2R)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy) metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín.

Výhodná trieda farmaceutických kompozícií z tejto podskupiny farmaceutických kompozícií zahŕňa také kompozície, u ktorých je cicavcom, ktorý ich vyžaduje, človek.

Výhodná skupina spôsobov zo spôsobov podávania opísaných skôr zahŕňa také spôsoby, pri ktorých sú antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy a cyklosporín A podávané cicavcovi, ktorý ich vyžaduje, súbežne alebo postupne.

Výhodná podskupina spôsobov z tejto skupiny spôsobov zahŕňa také spôsoby, pri ktorých je antagonistom CCRi receptora nepeptidovej povahy zlúčenina všeobecného vzorca I

v ktorom

R^la znamená jeden alebo viac substituentov nezávisle zvolených zo skupiny zahŕňajúcej alkylové skupiny a hydroxyalkyiové skupiny;

R² znamená atóm fluóru v polohe 4;

R⁴ znamená skupinu -0-;

R⁵ znamená metylénovú skupinu; a

R⁵ znamená skupinu -C(0)-;

ako jednoduchý stereoizomér alebo ich zmes; alebo jej farmaceutický prijatelná sol.

Výhodná trieda spôsobov z tejto podskupiny spôsobov zahŕňa také spôsoby, pri ktorých je antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy zvolený zo skupiny zahŕňajúcej:

(2R, 5S)-1-((4-chlór-2-(aminokarbonyl)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(trans)-1-( (4-chlór-2-(glycínamido)fenoxy) metyl) karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(22?)—1— ((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4- (4-fluórbenzyl)piperazín;

(trans)-1- ( (4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl) karbonyl-2,5-dimetyl-4- (4-fluórbenzyl)piperazín;

(2R,5S)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín; a (2R, 5S) -1- ( (4-chlór-2 - (glycínamido) fenoxy) metyl) karbonyl-2,5-d-imetyl-4- (4-fluórbenzyl)piperazín.

Ďalšia výhodná trieda spôsobov z tejto podskupiny spôsobov zahŕňa také spôsoby, pri ktorých je antagonistom CCRl receptora nepeptidovej povahy (2R)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín.

Výhodná podtrieda spôsobov z tejto triedy spôsobov zahŕňa také spôsoby, u ktorých je cicavcom, ktorý ich vyžaduje, človek.

Výhodná skupina spôsobov zo spôsobov liečenia opísaných skôr zahŕňa také spôsoby, pri ktorých je antagonistom CCRl receptora nepeptidovej povahy zlúčenina všeobecného vzorca I

v ktorom

R^la znamená jeden alebo viac substituentov nezávisle zvolených zo skupiny zahŕňajúcej alkylové skupiny a hydroxyalkýlové skupiny;

R² znamená atóm fluóru v polohe 4;

R⁴ znamená skupinu -0-;

R⁵ znamená metylénovú skupinu; a

R° znamená skupinu -C(0)-;

ako jednoduchý stereoizomér alebo ich zmes; alebc jej farmaceutický prijatelná sol.

Výhodná podskupina spôsobov z tejro skupiny spôsobov zahŕňa také spôsoby, pri ktorých je antagonista CCRl receptora nepeptidovej povahy zvolený zo skupiny zahŕňajúcej:

(trans)-l-((4-chlór-2-(glycínamido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(2R)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(trans]-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín ;

(2R, 5S)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín; a (2R, 5S)-1-((4-chlór-2-(glycínamido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín.

Ďalšia výhodná podskupina spôsobov z tejto skupiny spôsobov zahŕňa také spôsoby, pri ktorých je antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy [2R]-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl- 2-metyl-4- (4-fluórbenzyl)piperazín.

Výhodná trieda spôsobov z tejto podskupiny spôsobov zahŕňa také spôsoby, u ktorých je cicavcom, ktorý ich vyžaduje, človek.

Výhodná trieda spôsobov z tejto podskupiny spôsobov zahŕňa také spôsoby, pri ktorých sú antagonista CCR1 receptora nepeptídovej povahy a cyklosporín A podávané cicavcovi, ktorý ich vyžaduje, súbežne alebo postupne.

C. Použiteľnosť kompozícií podlá vynálezu

Tu opísané farmaceutické kompozície sú použiteľné pri liečení rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, výhodne človeka .

Ukázalo sa, že cyklosporín A je velmi účinný pri ošetrovaní zlyhania štepu, akútnej rejekcii a systémovej rejekcii v prvom roku nasledujúcom po transplantácii. Dlhodobé užívanie udržiavacích dávok cyklosporínu A, aj keď je účinné pri ošetrovaní chronickej vaskulopatie aloštepu, je však priamo spojené s vedľajší17 mi účinkami zahŕňajúcimi nefrotoxicitu, hypertenziu, diabetes melitus a potransplantačné lymfoproliferatívne ochorenie.

Ukázalo sa, že inhibícia aktivity určitých chemokínov alebo ich receptorov môže byť účinná na živočíšnych modeloch orgánovej transplantácie. Ako je opísané skôr, v rámci nedávnej renálnej transplantačnej štúdie u potkanov, antagonista chemokínových receptorov MetRANTES významne znižoval, ak sa podával s nízkymi dávkami cyklosporínu A, poškodenie obličiek, zahŕňajúce intersticiálny zápal, a to hlavne znížením počtu infiltrujúcich monocytov (Grône, H. J. a kol., (1999), skôr). V rámci inej štúdie sa význam CCRl receptora skúšal na modeloch srdcovej transplantácie u myší, ktoré nesú cielenú deléciu CCR1 (Gao, W. a kol., (2000), skôr) . Pri tejto štúdii vykázali štyri modely prežitia štepu významné predĺženie u príjemcov CCRl(-/-). V jednom modeli viedli hladiny cyklosporínu A, ktorý mal u CCR1(+/+) myší málo významné účinky, k permanentnému prijatiu aloštepu u CCR1(-/-) príjemcov.

Tieto štúdie sú významným dôkazom na podporenie teórie, že chemokín RANTES, ktorý pôsobí prostredníctvom CCRl receptora, hrá dôležitú úlohu pri rejekcii orgánových transplantátov. Ukázalo sa, že antagonisty CCRl receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu, inhibujú aktivitu RANTES. Preto sú antagonisty CCRl receptora nepeptidovej povahy použiteľné pri liečení rejekcie po transplantácii orgánov, najmä rejekcie po transplantácii srdca.

Ako je podrobnejšie opísané ďalej, priniesli antagonisty CCRl receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu v kombinácii s cyklosporínom A neočakávané výsledky pri liečení rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov. Najmä kombinácia terapeuticky účinného množstva antagonistu CCRl receptora nepeptidovej povahy a subnefrotoxického množstva cyklosporínu A vykazovala schopnosť liečiť rejekciu srdcového transplantátu bez nežiaduceho nefrotoxického účinku cyklosporínu A.

D. Testovanie zlúčenín pódia vynálezu

Na preukázanie, že antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu inhibujú aktivitu chemokínov ΜΙΡ-Ια alebo RANTES pôsobiace prostredníctvom CCR1 receptora, je možné použiť niektoré in vitro analýzy, ktoré sú opísané skôr. Pozri napr. US patent 6 207 665 a Hesselberger, J. a kol., (1998), uvedené skôr, Ng, H.P. a kol., (1999), uvedené skôr, Liang, M. a kol., (2000a), uvedené skôr a Liang, M. a kol., (2000b), uvedené skôr.

Antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy opísaný v US patente 6 207 665, to znamená (2R)-1-((4-chiór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín, sa testoval na väzbu na potkaní CCR1 receptor pomocou in vitro väzbových analýz opísaných v príklade 1, ktorých výsledky sú zobrazené na obr. 1. Scatchardova analýza substitučných väzbových štúdii odhalila, že afinita antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy predstavovala 121 ± 60 nmol (pozri obr. 1), asi stokrát menej účinný na potkaňom CCR1 receptore ako na ľudskom CCR1 receptore (Kj. = 1 nmol). Ďalej bol tento antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy schopný kompetitívne vytlačiť rádioaktívne označený RANTES z potkanieho CCR1 receptora s podobnou hodnotou fL. Uskutočnením analýz kalciového prúdu opísaných ďalej v príklade 2 a na obr. 2 sa ukázalo, že rovnaký antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy je funkčným in vitro antagonistom potkanieho CCR1 receptora. Prechodné zvýšenie intracelulárnej koncentrácie Ca²⁺ vyvolané 50 nmol ΜΙΡ-Ια je u preinkubovaných potkaních buniek exprimujúcich CCR1 receptor rnhibované 100 nmol antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy (zlúčenina' na obr. 2). Tieto údaje ukazujú, že aj keď antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy nie je tak silným inhibítorcm potkanieho CCR1 receptora v porovnaní s ľudským CCR1 receptorom, je anragonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy in vitro schopný účinne súťažiť o väzbu na potkaní CCR1 receptor a je silným funkčným antagonistom tohto receptora.

Na potkanoch sa uskutočnili farmakokinetrcké štúdie s anta19 gonistami CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu, ako je opísané ďalej v príklade 3 a na obr. 3. Vrcholové plazmatické hladiny 1, 4 a 7 dní po subkutánnom podaní antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy sa pohybovali v rozsahu 12 a 27 μπιοί (pozri obr. 3). Absorpcia je relatívne rýchla, významné plazmatické hladiny sa pozorovali 15 minút po podaní liečiva. Po 8 hodinách predstavovali plazmatické hladiny liečiva asi 1 až 2 μπιοί. Plazmatický polčas sa pohyboval v rozsahu 2 až 3 hodín. Aj keď sa po opakovanom subkutánnom podaní neobjavil žiadny prejav zvýšeného klírens alebo akumulácie antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy, v priebehu všetkých meraných dní sa pozorovala významná variabilita rýchlosti a rozsahu absorpcie liečiva. Tieto štúdie ukázali, že subkutánne podávanie antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podlá vynálezu v dávke 50 mg/kg, trikrát denne, poskytlo zodpovedajúce hladiny liečiva v priebehu 24 hodín.

In vivo analýzou, ktorú je možné použiť na preukázanie využiteľnosti farmaceutických kompozícií podľa vynálezu pri liečení rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, je potkaní model rejekcie heterotopického srdcového transplantátu (pozri napr. Nisco S. a kol., J. Immunol. (1994), zv. 152, str. 3786 až 3792, a Ono, K. a kol., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1969), zv. 57, str. 225 až 229). Farmaceutické kompozície podlá vynálezu sa testovali pomocou in vivo analýzy opísanej ďalej v príklade 4, ktorej výsledky sú zobrazené na obr. 4. V tejto štúdii zodpovedá vzostup času prežitia aloštepu zníženiu rejekcie srdcového transplantátu u príjemcov - potkanov Lewis, ktorým sa transplantovali štepy od donorových ACI potkanov. Stredný čas prežitia aloštepu predstavoval u zvierat, ktorým sa podával len antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy, to znamená (2R)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4- (4-fluórbenzyl)piperazín („zlúč. na obr. 4), vo vehikule, 8,8 ± 1,2 dni, v porovnaní so 6,8 ± 0,8 dňami u zvierat ošetrených vehikulom („kontrola na obr. 4). Stredný čas prežitia aloštepu bol u zvierat liečených antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu, vzhľadom na čas prežitia u kontrolnej skupiny štatisticky významný na hladine 0,05 a pomocou Log rank analýzy testu prežitia sa u zvierat užívajúcich antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy v porovnaní s kontrolou získala hodnota p = 0,0048.

Uskutočnili sa analýzy, pri ktorých sa zvieratá ošetrili terapeuticky účinným množstvom antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu, to znamená (2R)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazínu, a subnefrotoxickým množstvom (2,5 mg/kg) cyklosporínu A. Stredný čas prežitia aloštepu u zvierat, ktoré užívali len 2,5 mg/kg cyklosporínu A („Cs 2,5 na obr. 4), predstavoval 7,3 ± 0,5 dňa v porovnaní so 17,5 ± 5,9 dňami u zvierat ošetrovaných rovnako a naviac liečených antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy („Cs 2,5 + zlúč. na obr. 4). Stredný čas prežitia predstavoval u zvierat, ktoré užívali terapeutickú dávku cyklosporínu A vo výške 10 mg/kg („Cs 10” na obr. 4), 12,9 ±0,7 dňa v porovnaní s 18,4 ±5,4 dňami u zvierat ošetrovaných rovnako a naviac liečených antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy („Cs 10 + zlúč. na obr. 4). Stredné časy prežitia sú u zvierat ošetrovaných buď 2,5 alebo 10 mg/kg cyklosporínu A plus antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy štatisticky významné, oproti stredným časom prežitia u zvierat ošetrovaných buď 2,5 mg/kg alebo 10 mg/kg cyklosporínu A samotného, s hodnotami p = 0,0009, príp. p = 0,0148.

Tieto údaje o prežití potvrdilo vyšetrenie na infiltrujúce monocyty pomocou svetelného mikroskopu a imunohistologické vyšetrenie, ako je opísané ďalej v príklade 5 a na obr. 5. Rejekčné skóre sa tri dni po transplantácii významne znížilo pomocou kombinovaného liečenia antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu, ako je opísané skôr, a cyklosporínu A (zlúčenina-cyklosporín A na obr. 5). U transplantátov, ktoré neboli imunosuprimované, sa pozoroval hustý mononukleárny infiltrát. Mnoho kardiomyocytov bolo vakuolovaných alebo nekrotických. Intersticiálny edém bol výrazný. U potkanov liečených cyklosporinom A bol zápalový bunkový infiltrát obmedzený, aj keď bol stále jasne zrejmý, najmä okolo venúl s fokálnou deštrukciou kardiomyocytov. U potkanov liečených len antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy sa pozorovali fokálne infiltráty mononukleárnych buniek, ktoré mali výrazne podobnú morfológiu, ako sa pozorovala u transplantátov, ktoré neboli imunosuprimované. U zvierat liečených ako antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy, tak cyklosporinom A, sa pozorovala dobre zachovaná morfológia srdca s riedkymi infiltrátmi mononukleárnymi bunkami. U transplantátov, ktoré neboli imunosuprimované, predstavovali mnohé bunky hustého infiltrátu mononukleárnymi bunkami monocyty/makrofágy, ktoré sa nachádzali v tesnej blízkosti kardiomyocytov. U potkanov liečených cyklosporinom A je zápalový bunkový infiltrát fokálny a je zložený prevažne z ED-1 pozitívnych buniek. U zvierat liečených antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy sa infiltrát mononukleárnymi bunkami významne líšil; pozorovali sa oblasti so stredne hustým monocytovým infiltrátom v okolí venúl. Výsledkom kombinovaného liečenia antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy a cyklosporinom A je významné zníženie monocytovej/makrofágovej infiltrácie do aiogénnych sŕdc potkanov. Na základe údajov z týchto štúdií je zrejmé, že antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu, podávaný v kombinácii s cyklosporinom A veoie pri transplantácii srdca k jasnému synergickému zvýšeniu účinnosti v porovnaní s antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy alebo cyklosporinom A samotnými.

Aj keď vedie kombinácia antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy a cyklosporínu A k jasnému synergickému zvýšeniu času prežitia srdcového transplantátu, zostáva možnosť, že k pozorovanému účinku došlo vďaka vzájomnému pôsobeniu liečivo/liečivo, ktoré stabilizuje krvné hladiny cyklosporínu A, skôr ako vďaka pravému synergizmu kombinácie liečiv. Na stanovenie krvných hladín cyklosporínu A u potkanov za absencie alebo prítomnosti antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu, to znamená (2R)-l-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazínu, sa uskutočnili farmakokinetické štúdie, ako je opísané ďalej v príklade 6 a na obr. 6. Pohlad na krivky čas - koncentrácia naznačuje ľahké predĺženie krvného polčasu cyklosporínu A u potkanov liečených antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy („zlúč. na obr.

6) . Štatistická analýza párových skupín však ukázala, že medzi dvoma vypočítanými parametrami nie je žiadny významný rozdiel (hodnota P pre AUC (plocha pod krivkou) = 0,224 a pre Ti_/2 = 0,317). Preto je možné vzájomné pôsobenie liečivo/liečivo ako príčinu jasného synergického zvýšenia času prežitia srdcového transplantátu u potkanov liečených kombináciou antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu a cyklosporínu A vylúčiť.

Na stanovenie, či významné zníženie monocytovej/makroíágovej infiltrácie do alogénnych sŕdc potkanov môže byť spôsobené, aspoň čiastočne, inhibíciou chemokínov pôsobiacich prostredníctvom CCR1 receptora, sa uskutočnili adhézne a rotačné (odlučovacie) testy in vitro. Skoršie práce ukázali, že monocytové bunky vykazujú zvýšenú väzbu na IL-ip-aktivované endotelové bunky, ktoré viažu RANTES po preinkubácii s exogénnym RANTES počas 30 minút (Grone, H. J. a kol., (1999), uvedené skôr). Izolované ľudské krvné monocyty sa ošetrili zvyšujúcim sa množstvom antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podlá vynálezu, to znamená (2R)-l-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazínu, a väzba na mikrovaskulárne endotelové bunky sa uskutočnila, ako je opísané v príklade 7 na obr. 7. Adhézia monocytov na IL-ip-aktivované mikrovaskulárne endotelové bunky sprostredkovaná RANTES a odolná proti strihu sa v závislosti od dávky inhibovala antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy („zlúč. na obr. 7A) . Percento monocytov, u ktorých sa zistilo, že sa odlúčili alebo zostali odlúčené, čo slúži ako inverzné meranie pre väzbu monocytov, sa inhibovalo antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy („zlúč. na obr. 7B) tiež v závislosti od dávky. Tieto údaje významne podporujú predstavu pravého synergizmu kombinácie antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu a cyklosporínu A pri liečení rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov.

E. Podávanie kompozícií podľa vynálezu

Podávanie farmaceutických kompozícií podľa vynálezu je možné uskutočňovať prostredníctvom lubovolného zo spôsobov podávania alebo prostriedkov na podávanie podobných činidiel. Teda podávanie môže byť napr. orálne, nazálne, parenterálne, topické, transdermálne alebo rektálne, v podobe pevných, polopevných liekových foriem, lyofilizovaného prášku alebo kvapalných liekových foriem, ako sú napríklad tablety, čapíky, pilulky, mäkké elastické a tvrdé želatínové kapsuly, prášky, roztoky, suspenzie alebo aerosóly alebo podobné, výhodne v jednotkových liekových formách vhodných na jednoduché podávanie presných dávok. Kompozície budú obsahovať konvenčný farmaceutický nosič alebo vehikulum a zlúčeninu podľa vynálezu ako účinnú látku, a ďalej môžu obsahovať ďalšie liečivé agensy, farmaceutické agensy, nosiče, adjuvans atď.

Všeobecne budú farmaceutické kompozície, v závislosti cd zamýšľaného spôsobu podávania, obsahovať asi 1% až asi 95% hmotn. účinných látok, vztiahnuté na kompozíciu, to znamená antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli a cyklosporínu A, a 99% až 1% hmotn. vhodného farmaceutického vehikula. Výhodne budú kompozície obsahovať asi 5% až 75% hmotn. účinných látok, pričom zvyšok budú tvoriť vhodné farmaceutické vehikulá.

Výhodným spôsobom podávania je cesta orálna s použitím bežného denného dávkovacieho režimu, ktorý je možné upraviť podlá stupňa závažnosti rejekcie srdcového transplantátu. Na také orálne podávanie je farmaceutická kompozícia podlá vynálezu vytvorená inkorporáciou jedného alebo viacerých normálne používaných farmaceutických vehikúl, ako sú napr. farmaceutické stupne kvality manitolu, laktózy, škrobu, predželatinizovaného škrobu, stearátu horečnatého, nátriumsacharínu, mastenca, celulózových éterových derivátov, glukózy, želatíny, sacharózy, citrátu, propylgalátu a pod. Také kompozície sú vo forme roztokov, suspenzií, tabliet, piluliek, kapsúl, práškov, formulácií s ustáleným uvolňovaním (sustained release formulations) a pod.

Výhodne budú mať tieto farmaceutické kompozície podobu kapsúl, piluliek alebo tabliet, a preto budú obsahovať také riedidlo, ako je laktóza, sacharóza, dikalciumfosfát a pod.; dezintegračné činidlo, ako je nátriumkroskarmelóza alebo jej deriváty; lubrikant, ako je stearát horečnatý a pod.; a spojivo, ako je škrob, arabská guma, polyvinylpyrolidón, želatína, celulózové éterové deriváty a pod..

Farmaceutické kompozície pódia vynálezu môžu byť tiež pripravené v podobe čapíkov, napríklad s použitím asi 0,5% až asi 50% účinných látok v nosiči, ktorý sa v tele pomaly rozpúšťa, napr. polyoxyetylénglykoloch a polyetylénglykoloch (PEG), napr. PEG 1000 (96%) a PEG 4000 (4%).

Kvapalné, farmaceutický podávatelné kompozície je možné napríklad pripraviť pomocou rozpustenia, dispergovania atď., farmaceutických kompozícií podľa vynálezu (asi 0,5% až asi 20%) a prípadných farmaceutických adjuvans v nosiči, ako je napríklad voda, fyziologický roztok, vodné dextróza, glycerol, etanol a pod., a tak sa vytvorí roztok alebo suspenzia.

Ak je to žiaduce, môžu farmaceutické kompozície podlá vynálezu obsahovať tiež menšie množstvo pomocných látok, ako sú zvlhčovadlá alebo emulgátory, pufrovacie činidlá, antioxidanty a pod., ako je napríklad kyselina citrónová, sorbitanmonolaurát, trietanolamínolešt, butylovaný hydroxytoluén atď..

Vhodné spôsoby, ktoré je možné použiť na prípravu skôr uvedených kompozícií sú známe alebo budú odborníkovi v odbore zrejmé; pozri napr. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie, (Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990). Podávané farmaceutické kompozície na liečenie rejekcie srdcového transplantátu budú v každom prípade obsahovať jedno alebo viac farmaceutických vehikúl, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podlá vynálezu a subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A.

Terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptióovej povahy, výhodne antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy všeobecného vzorca I, sa bude líšiť v závislosti od rôznych faktorov vrátane účinnosti konkrétne použitej zlúčeniny; metabolickej stability a dĺžky účinku zlúčeniny; veku, telesnej hmotnosti, všeobecného zdravotného stavu, pohlavia a diéty pacienta; spôsobu a času podávania; rýchlosti vylučovania; závažnosti rejekčného procesu; terapie, ktorou prešiel hostiteľ. Všeobecne predstavuje terapeuticky účinná denná dávka od asi 0,14 mg do asi 14,3 mg/kg telesnej hmotnosti na deň antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy všeobecného vzorca I; výhodne od asi 0,7 mg do asi 10 mg/kg telesnej hmotnosti na deň; a najvýhodnejšie od asi 1,4 mg do asi 7,2 mg/kg telesnej hmotnosti na deň. Napríklad pri podávaní osobe s hmotnosťou 70 kg by dávkový rozsah predstavoval asi od 10 mg do asi 1,0 g antagonisru CCR1 receptora nepeptidovej povahy na deň; výhodne asi od 50 mg do asi 700 mg na deň a najvýhodnejšie asi od 100 mg do asi 500 mg na deň.

E. Príprava kompozícií podlá vynálezu

Antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu sa pripravia spôsobmi opísanými v US patente 6 207 665.

Cyklosporíny podľa vynálezu sú neutrálne lipofilné cyklické peptidy (undekaméry) produkované hubou Tolypocladium inflatum

Gams, a tiež ďalšími nedokonalými hubami. Sú dostupné pre výskumné potreby. Pri liečení rejekcie ľudských orgánových transplantátov sa v súčasnosti používajú dva prípravky cyklosporínu A - Sandimmune® a Neoral® (Novartis).

Nasledujúce príklady uskutočnenia vynálezu sú určené na ilustráciu predloženého vynálezu a nemajú slúžiť na akékoľvek obmedzenie jeho rozsahu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

In vitro analýza

In vitro väzbová analýza antagonistov CCR1 receptora nepeptidovej povahy

Táto analýza ukazuje afinitu antagonistov CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu, výhodne antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy všeobecného vzorca ľ, k väzbe na potkaní CCR1 receptor.

Reagencie a roztoky:

Chemokíny: Bunky:

Ligand:

Analyzačný pufor:

Premývací pufor: Zlúčeniny podlá vynálezu

ΜΙΡ-Ια a RANTES (Peprotech Inc.)

Potkanie mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC) sa izolovali z celej krvi potkanov Lewis pomocou Accu-paque® (Accurate Chemical & Scientific Corp.) hustotnej centrifugácie.

¹²⁵I-MI?-Ia a ^l25I-RANTES od New England Nuclear (špecifická aktivita predstavuje 2200 Ci/mmol·, 25 pCi/nádobka) sa obnovili v 1 ml rbO.

130 mmol NaCl, 5 mmol KC1, 1 mmol MnCl2, 50 mmol Tris, 30 gg/ml bacitracínu, 0,1% BSA, pH 7,4.

Roztok fosfátového pufra (PBS).

Zásobný roztok zlúčenín bol 1 mM v 100% DMSO (dimetylsulfoxidu). Najvyššia kon27 centrácia v rámci testu predstavovala 10 μιηοΐ a mohla sa líšiť v závislosti od účinnosti zlúčenín. S analyzačným pufrom sa uskutočnili sériové riedenia 1:3 z najvyššej koncentrácie. Typicky sa skúšalo šesť koncentrácií každej zlúčeniny s cieľom vytvoriť dávkové krivky, z ktorých sa stanovili hodnoty Ki.

Analyzačná procedúra:

Analýzy sa uskutočňovali na 96-jamkových mikrotitračných doskách s v-dnom v celkovom objeme 100 μΐ.

Potkanie PBMC sa raz premyli v PBS a resuspendovali v analyzačnom pufri na asi 0,2 až 1,0 x 10⁶ buniek/ml. Bunky sa inkubovali so ¹²⁵I-MIP-la alebo ¹²⁵I-RANTES za prítomnosti alebo absencie rôznych koncentrácií neoznačeného ΜΙΡ-Ια, RANTES alebo zlúčeniny pri 4°C počas 30 minút.

Reakcie sa ukončili odstránením alikvotných častí z bunkovej suspenzie a oddelením buniek od pufra centrifugáciou cez zmes silikón/parafínový olej, ako je opísané v Hesselgesser a kol., (1998), uvedené skôr.

Nešpecifická väzba sa stanovovila v prítomnosti 100 nmol alebo 1 pmol neoznačeného ΜΙΡ-Ια alebo RANTES. Koncentrácie zlúčenín pri analýze typicky predstavovali od 10 pmol do 30 nmol v riedeniach 1:3 a koncentrácie u účinnejších zlúčenín boli nižšie, v závislosti od účinnosti.

Výpočty

Vytvorili sa dávkové krivky každej zlúčeniny so šiestimi koncentračnými bodmi a väzbové údaje sa prispôsobili krivke pomocou výpočtového programu Igor (Wavemetrics) na stanovenie afinity a počtu miest.

Antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynále28 zu ukazujú, pri testovaní v rámci tejto analýzy, svoju afinitu k väzbe na potkaní CCR1 receptor.

Príklad 2

In vitro analýza - prúd vápnikových iónov

Funkčná in vitro analýza antagonistov CCR1 receptora nepeptidovej povahy

Pretože CCR1 receptor reaguje na väzbu jeho ligandov, to znamená ΜΙΡ-Ια a RANTES, mobilizáciou voľného intraceľulárneho kalcia, je možné merať biologickú aktivitu pomocou analýz prúdu vápnikových iónov s použitím fluorescenčného farbiva Fura-2. V nasledujúcej analýze sa stanovovala schopnosť antagonistov CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu blokovať túto biologickú odpoveď.

Protokol

1) Potkanie PBMC sa izolovali spôsobom opísaným v príklade 1, peletovali centrifugáciou a resuspendovali v roztoku Hanks Ca²⁺ (50 ml Hanks, 1,0 ml IM Hepes, 1,6 ml 500 nM CaCl₂, pH 7,4) . Bunky sa dvakrát premyli v tomto médiu.

2) Bunky sa resuspendovali v médiu v hustote 1 x 10⁶ buniek/ml za prítomnosti výslednej koncentrácie 1,25 μτηοΐ Fura-2 AM (Mclecular Probes) (zásobný roztok sa pripravil rozpustením 50 μς Fura-2 v 50 μΐ DMSO).

3) Bunky sa inkubovali pri 37°C počas 30 minút za prítomnosti alebo absencie rôznych koncentrácií antagonistov CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu. Bunky sa premyli odstreďovaním, ako je uvedené skôr, s cieľom odstrániť volný Fura-2. Bunky sa resuspendovali na 1 x 10⁶ buniek/ml. Potom sa bunky rovnomerne rozdelili (2,0 ml) v kyvete a umiestnili do spektrofiuorimetra PTI Deltascan Model 4000. Bunky sa stimulovali 50 nmol ΜΙΡ-Ια (Peprotech Inc.) a v spektrofluorimetri sa stanovovalo uvoľňovanie Ca²⁺ ako funkcia ča29 su .

4) Dáta sa upravili na nmol uvoľnených Ca²⁺ pridaním 100 μΐ

0,1% Triton X-100 (pre maximálne hodnoty) nasledovaných

100 μΐ 500 mmol EGTA, pH 8,5 (pre minimálne hodnoty).

Antagonisty CCRl receptora nepeptidovej povahy podlá vynálezu pri testovaní v rámci tejto štúdie ukázali svoju schopnosť inhibovať mobilizáciu Ca²⁺ pri odpovedi na väzbu ΜΙΡ-1α na potkaní CCRl receptor.

Príklad 3

In vivo analýza

Farmakokinetické štúdie u potkanov Lewis

Pri týchto štúdiách sa použili dospelé samce potkanov Lewis bez špecifického patogénu (RT11) (Charles River, Boston) s hmotnosťou 200 až 250 g.

Pripravil sa roztok 40% cyklodextrínu pridaním prípravku Cyclodextrin (400 g, Aldrich) do jednolitrovej sterilnej plastovej fľašky. Pridal sa nepufrovaný fyziologický roztok obsahujúci len chlorid sodný a draselný a zmes sa pretrepávala a miešala celú noc do rozpustenia. Fyziologický roztok sa pridal do celkového objemu 1 litra. Roztok sa filtroval cez 0,45 μιη filter do sterilnej fľašky, označil a uchovával pri 4°C. Pripravil sa 25 mg/ml roztok zlúčeniny v cyklodextríne rozpustením zlúčeniny v 40% cyklodextríne vo fyziologickom roztoku. Zmes sa pretrepávala, potom nasledovalo pridanie 230 μΐ koncentrovanej HCI. Zmes sa miešala do rozpustenia. Potom, ako bolo rozpustenie úplné (1 h) stanovilo sa pH roztoku a pridal sa 1 M KOH na zvýšenie pH na 4,5. Roztok sa filtroval cez 0,45 μπι filter a uchovával pri 4°C.

Antagonisty CCRl receptora nepeptidovej povahy podía vynálezu sa pripravili vo vehikule zo 40% cyklodextrínu/fyzíoloaického roztoku a subkutánne (s.c.) sa podávali (50 mg/kg, trikrát denne) potkanom počas siedmich dní. Krvné vzorky sa odoberali srdcovou punkciou do skúmaviek obsahujúcich EDTA (kyselina etyléndiamíntetraoctová) v rôznych časoch, odstredili a plazma sa uchovávala zmrazená pokial sa neanalyzovala na hladiny liečiva.

Vzorky plazmy sa analyzovali buď HPLC pomocou UV detekčných metód alebo HPLC-MS (režim elektrospreja pracoval za režimu kladných iónov). Koncentrácie antagonistov CCR1 receptorov podlá vynálezu sa stanovovali prostredníctvom kalibračnej krivky konštruovanej v plazme a analyzovanej za zhodných podmienok. Ako vnútorné štandardy sa pri týchto analýzach použili príbuzné zlúčeniny.

Metóda HPLC-UV

1) 100 μΐ alikvotné časti vzoriek plazmy sa pridali k 200 μΐ ľadového kyslého metanolu (1% kyselina octová) obsahujúcim pevné množstvo vnútorného štandardu a dobre premiešali.

2) Vzniknutý proteínový precipitát sa odstránil centrifugáciou pri 5000 x g a odobral sa supernatant.

3) Paralelne sa kontrolné vzorky plazmy naočkovali rôznymi množstvami antagonistov CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu, typicky v rozsahu 0,3 až 25 μπιοί, a spracovali, ako je opísané skôr.

4) Supernatanty sa odparili do sucha vo vákuovej odparovačke, obnovili v roztoku 1:2 metanol:voda (obsahujúcom 0,1% TFA (kyseliny trifluóroctovej)), vírili počas 30 sekúnd a cdstreďovali do odstránenia sedimentu.

5) Výsledné supernatanty sa injikovali na stĺpec YMC AQ ODS s reverznou fázou a analyzovali za podmienok gradientovej HPLC pri rýchlosti prietoku 1 ml/min. UV detektor sa nastavil na 230 nm.

6) Podmienky gradientu boli: začiatočné, rozpúšťadlo A 22%/rozpúšťadlo B 78%; 2 min, rozpúšťadlo A 22%/rozpúšťadlo B 78%;

min rozpúšťadlo A 45%/rozpúšťadlo B 55%; 37 min, rozpúšťadlo A 80%/rozpúšťadlo B 20%; 47 min, rozpúšťadlo A

80%/rozpúšťadlo B 20%; 49 min, späť na začiatočné podmienky.

7) Vypočítali sa pomery plôch píkov medzi píkom vnútorného štandardu a zlúčeniny oproti koncentračnému rozsahu štandardnej krivky a tento pomer sa použil na vytvorenie kalibračnej krivky. Koncentrácia konkrétnej zlúčeniny sa odvodila z tejto krivky vypočítaním pomeru plôch píkov medzi píkmi zlúčeniny a vnútorného štandardu.

Metóda HPLC-MS

1) Použitá metodológia je podobná tej skôr opísanej, s tou výnimkou, že príprava vzorky sa ukončila v stupni metanolovej precipitácie a namiesto gradíentovej metódy sa použila krátka izokratická metóda.

2) Použilo sa zariadenie Fisons VG Platform single quadrupole s elektrosprejovým prívodom pracujúcim pri 3,57 kV. Použil sa stĺpec YMC AQ ODS s reverznou fázou za rýchlosti prietoku 1 ml/min s celkovým prúdom idúcim do UV detektora pri 214 nm.

3) Prúd sa rozdelil s cielom vtoku 50 μΐ/min do hmotnostného spektrometra. Chromatogramy sa zhromažďovali po celkový čas behu 7,5 minút na vzorku za 50 μΐ injekcie na stĺpec. Ióny sa zhromažďovali v jednoduchom ión pozitívnom ionizačnom režime.

4) Výpočty sa dokončili integráciou plochy pod iónovými prúdmi (kontrolný antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu a interné štandardy) a vytvorením kalibračnej krivky, ako je opísané skôr.

Antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy podía vynálezu pri testovaní v rámci tejto analýzy ukázali zodpovedajúce hladiny liečiva v krvnej plazme potkanov v priebehu 24 hodín.

Príklad 4

In vivo analýza

Rejekcia heterotopických srdcových transplantátov (potkany Lewis alebo ACI)

Ako darcovia, respektíve príjemcovia, sa pri tejto štúdii použili dospelé samce potkanov ACI (RTla) a Lewis (RTli) bez patogénu (Charles River, Boston, MA) s hmotnosťou 200 až 250 g. Do brucha potkanov - príjemcov sa heterotopicky transplantovali vaskularizované srdcové aloštepy pomocou modifikácie (Nisco, S. a kol., (1994), uvedené skôr) techniky Ono a Lindsay (Ono, K. a kol., (1969), uvedené skôr). Zhotovili sa anastomózy end-to-side (koniec k boku) ascendentnej aorty darcovho srdca a abdominálnej aorty príjemcu a darcovej pulmonárnej artérie a dolnej dutej žily (vena cava ínferíor) príjemcu, potom sa vena cava a pulmonárne vény darcovho srdca ligovaii. Abdominálne aloštepy sa denne palpovali na zhodnotenie funkcie štepu a rejekcia sa považovala za úplnú, keď hmatateľné ventrikulárne kontrakcie ustali.

Srdcové aloštepy od potkanov ACI sa heterotopicky transplantovali do brucha príjemcov - potkanov Lewis a týmto zvieratám sa podávalo buď: 40% cyklodextrín s.c. trikrát denne; 50 mg/kg antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu v 40% cyklodextrínu s.c. trikrát denne; cyklosporín A v olivovom oleji v dávke 10 mg/kg raz denne počas štyroch dní; cyklosporín A v olivovom oleji v dávke 2,5 mg/kg raz denne počas trvania štúdie; cyklosporín A v olivovom oleji v dávke 10 mg/kg raz denne počas štyroch dní plus 50 mg/kg antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy v 40% cyklodextrínu s.c. trikrát denne; alebo cyklosporín A v olivovom oleji v dávke 2,5 mg/kg raz denne počas trvania štúdie plus 50 mg/kg antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy v 40% cyklodextrínu s.c. trikrát denne. Transplantované srdcia sa v priebehu štúdie denne hodnotili na známky rejekcie.

Antagonisty CCRI receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu pri testovaní v rámci tejto analýzy ukázali, ak sa podávali v kombinácii s cyklosporínom A, schopnosť významne predlžovať čas prežitia srdcového transplantátu.

Príklad 5

In vivo analýza

Histológia, imunohistochémia a morfometria

Transplantované srdcia sa vybrali za hlbokej anestézie, rýchlo sa zbavili krvi, odvážili a potom spracovali, ako je potrebné na histologické a imunohistochemické vyšetrenie. Orgány sa rozrezali na 1 mm plátky a buď imerzne fixovali v 4% formaldehyde vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) s pH 7,35 (PBS: 99 mmol NaH₂PO₄, 108 mmol NaH₂PO₄ a 248 mmol NaCl·) počas 24 hodín alebo fixovali v „methacarne počas 8 hodín a uložili v parafíne. Vyšetrenie pomocou svetelného mikroskopu sa uskutočňovalo na 3 μπι rezoch zafarbených pomocou kyseliny jodistej Schiffove farbivá alebo Goldner-Elastica. Vyšetrenie pomocou svetelného mikroskopu sa uskutočňovalo na alogénnych srdcových transplantátoch 3 dni po transplantácii.

Na farbenie na potkanie monocyty/makrofágové bunky na „methacarnom fixovaných, v parafíne uložených tkanivách (3 μπι) sa použila monoklonálna protilátka EDI (Serotec/Camon) . Na vizualizáciu sa použil detekčný systém alkalická fosfatáza - anti-alkalická fosfatáza (Dáko). Na negatívne zafarbenie sa urobili kontroly, u ktorých sa vynechala prvá alebo druhá protilátka. Imunohistologické farbenie alogénnych srdcových transplantátov na EDl-pozitívne monocyty/makrofágy sa uskutočnilo 3 dni po transplantácii .

Histopatologická rejekcia u alogénnych sŕdc potkanov sa odstupňovala podlá Billinghama (Billingham, M.E., v: Cardiac transplantation, str. 133 až 152, Butterworths, Boston, 1990).

Mierna akútna rejekcia (skóre: 1) bola charakterizovaná riedkym intersticiálnym mononukleárnym infiltrátom často zdôrazneným v perivaskulárnych priestoroch. Stredná akútna rejekcia (skóre: 2) bola charakterizovaná stredne hustým perimyocytovým mononukleárnym infiltrátom s niekoľkými nekrózami myocytov. Ťažká akútna rejekcia (skóre: 3) bola charakterizovaná hustým monocytovým infiltrátom s fokálnou hemorágiou a náhradou myocytov a s príležitostnou endotelitídou intramurálnych artérií. Rejekčné skóre sa vypočítalo na každý tkanivový blok a priemerné skóre sa vypočítalo na každé transplantované srdce z rôznych blokov, pretože rejekčné procesy majú tendenciu byť fokálne.

Antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu pri testovaní v rámci tejto analýzy významne znižovali, ak sa podávali v kombinácii s cyklosporínom A, rejekčné skóre a rozsah monocytovej infiltrácie štepu.

Príklad 6

In vivo analýza

Krvné hladiny cyklosporínu A u potkanov

Kanylovaným potkanom Lewis (6 v skupine) sa podávala buď jedna dávka 2,5 mg/kg cyklosporínu A (Neoral Oral sclution, Sandoz, East Hannover, NJ) rozriedená v olivovom oleji alebo jedna dávka rovnakého cyklosporínu A nasledovaná s.c. injekciami 50 mg/kg antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy podlá vynálezu v 40% cyklodextríne trikrát denne. Celá krv sa odobrala v rôznych časoch s použitím EDTA ako antikoagulačného činidla. Plazmatické hladiny cyklosporínu A sa stanovovali pomocou sady Cyclo-Trac SP-Whole Blood Radioimmunoassay for Cyclosporin kit (DiaSorin, Stillwater, MN) jednoduchým nasledovaním pokynov výrobcu. Pred analýzou sa uskutočnil metanolový extrakčný stupeň pre štandardy, kontroly a vzorky. Metanolové extrakty sa zmiešali s cyklosporínovým izotopom označeným I¹²⁵. Pridala sa zmes myšej monoklonálnej protilátky špecifickej pre cyklosporín A a oslej anti-myšej protilátky v jednom reagens. Po jednohodinovej inkubácii sa skúmavky odstreďovali, dekantovali a spočítali. Množstvo rádioaktivity v peletách je inverzne proporcionálne ku koncentrácii cyklosporínu A vo vzorke. Kalibračná krivka sa získala s použitím štvorparametrového logistického programu na prispôsobenie kriviek vynesením rozsahu väzby proti log koncentrácii. Koncentrácie cyklosporínu A sa interpolovali zo štandardnej krivky.

Antagonisty CCRl receptora nepeptidovej povahy podlá vynálezu pri testovaní v rámci tejto štúdie významne neovplyvňovali polčas eliminácie cyklosporínu v celej krvi potkanov.

Príklad 7

In vitro analýza: adhézia a odlučovanie monocytov

Funkčná in vitro analýza antagonistov CCRl receptora nepeptidovej povahy

Interakcia monocytov s endotelom sa testovala v analýze s laminárnym prúdením v podstate tak, ako je opísané (Gróne, H.J. a kol., (1999), uvedené skôr, a Weber, K.S. a kol., Eur. J. Immunol. (1999), zv. 29, str. 700 až 712). Ľudské kožné mikrovaskulárne endotelové bunky sa kultivovali do splynutia na Petriho miskách a stimulovali 10 ng/ml IL-Ιβ počas 12 hodín alebo sa nechali neošetrené. Pred štúdiou sa bunky predinkubovali s 10 ng/ml RANTES počas 30 minút. Dosky sa zostavili ako spodná stena v paralelnej stene prietokovej komory a namontovali sa na stojan invertného mikroskopu Olympus IMT-2 s 20x a 40x fázovými kontrastnými objektívmi. Ľudské krvné monocyty sa izolovali hyperosmolárnou gradientovou centrifugáciou Nycodenz a resuspendovali na 5 x 10⁶ buniek/ml v analyzačnom pufri (10 mmol Hepes, 0,5¾ HSA, pH 7,4). Krátko pred analýzou sa upravili koncentrácie Mg²⁺ a Ca²⁺ na 1 mmol. Bunkové suspenzie sa v priebehu analýzy uchovávali v zahrievacích blokoch pri 37°C a vháňali do prietokových komôr rýchlosťou 1,5 dyn/cm² počas 5 minút. Na inhibíciu experimentov sa monocyty predinkubovali počas 10 minút pri 37°C s rôznymi koncentráciami antagonistov CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu alebo DMSO kontrolou. Spočítal sa počet pevne adherovaných buniek aspoň v piatich poliach pomocou analýzy obrazov zaznamenaných videokamerou JVC 3CCD s dlhým integračným časom a videorekordérom JVC SR 900 E. Výsledky sa vyjadrili ako počet buniek/mm². Ako inverzné meranie adhézie sa stanovoval počet odlúčených monocytov pri nízkych strižných silách aspoň v 30 sekundovom intervale päťminútového obdobia a vyjadril sa ako percento zo všetkých interakcií v analyzovaných poliach.

Antagonisty CCR1 receptora nepeptidovej povahy podľa vynálezu pri testovaní v rámci tejto analýzy inhibovali adhéziu monocytov na aktivované endotelové bunky a zvyšovali percento monocytov, ktoré sa odlúčili alebo zostali odlúčené.

Príklad 8

Tento príklad ilustruje prípravu reprezentatívnych farmaceutických kompozícií podľa vynálezu na orálne podávanie:

A.

Zložky	% hmotn./hmotn.
Účinné látky	20,0%
Laktóza	79, 5%
Stearát horečnatý	0,5%

Uvedené zložky sa zmiešajú a rozdelia do tvrdých želatínových kapsúl obsahujúcich každá 100 mg, pričom jedna kapsula predstavuje asi celkovú dennú dávku.

B.

Zložky	% hmotn./hmotn.
Účinné látky	20,0%
Stearát horečnatý	0,9%
Škrob	8, 6%
Laktóza	69, 6%

PVP (polyvinylpyrolidón)

0, 9%

Uvedené zložky sa, okrem stearátu horečnatého, zmiešajú a granulujú s použitím vody ako granulačnej kvapaliny. Prípravok sa potom suší, zmieša so stearátom horečnatým a tvaruje do tabliet pomocou vhodného tabletovacieho zariadenia.

C.

Zložky
Účinné látky	0,1 g
Propylénglykol	20,0 g
Polyetylénglykol 400	20,0 g
Poiysorbát 80	1,0 g
Voda	q.s. 100 ml

Účinné látky sa rozpustia v propylénglykole, polyetylénglykole 400 a polysorbáte 80. Za miešania sa potom pridá dostatočné množstvo vody, čím vznikne 100 ml roztoku, ktorý sa filtruje a dáva do flašiek.

D.

Zložky	% hmotn./hmotn.
Účinné látky	20,0%
Arašidový olej	78,0%
Span 60	2,0%

Uvedené zložky sa zmiešajú, miešajú a pima do mäkkých elastických kapsúl.

E.

Zložky	% hmotn./hmotn.
Účinné látky	1,0%
Metyl- alebo karboxymetylcelulóza	2,0%
0,9% fyziologický roztok	q.s. 100 ml

Účinné látky sa rozpustia v roztoku celuióza/fyziologický roztok, filtrujú a dávajú do flašiek na použitie.

Príklad 9

Tento príklad ilustruje prípravu reprezentatívnej farmaceutickej kompozície podľa vynálezu na parenterálne podávanie:

Zložky
Účinné látky	0,02 g
Propylénglykol	20,0 g
Polyetylénglykol 400	20,0 g
Polysorbát 80	1,0 g
0,9% fyziologický roztok	g.s. 100 ml

Účinné látky sa rozpustia v propylénglykole, polyetylénglykole 400 a polysorbáte 80. Za miešania sa potom pridá dostatočné množstvo 0,9% fyziologického roztoku, čím vznikne 100 ml i.v. roztoku, ktorý sa filtruje cez 0,2 μιη membránový filter a balí za sterilných podmienok.

Príklad 10

Tento príklad ilustruje prípravu reprezentatívnej farmaceutickej kompozície podľa vynálezu v podobe čapíka:

Zložky	% hmotn./hmotn.
Účinné látky	1,0%
Polyetylénglykol 1000	74,5%
Polyetylénglykol 4000	24,5%

Zložky sa zmiešajú dokopy a miešajú na parnom kúpeli a vylejú do tvaru s celkovou hmotnosťou 2,5 g.

Príklad 11

Tento príklad ilustruje prípravu reprezentatívnej farmaceutickej kompozície podľa vynálezu na insufláciu:

Zložky	% hmotn./hmotn.
Mikronizované účinné látky	1, 0%
Mikronizovaná laktóza	99,0%

Zložky sa melú, miešajú a balia do insuflátora vybaveného dávkovacou pumpou.

Príklad 12

Tento príklad ilustruje prípravu reprezentatívnej farmaceutickej kompozície podlá vynálezu v nebulizovanej forme:

Zložky	% hmotn./hmotn.
Účinné látky	0,005%
Voda	89,995%
Etanol	10,000%

Účinné látky sa rozpustia v etanole a zmiešajú s vedou. Prípravok sa potom balí do nebulizéra vybaveného dávkovacou pumpou.

Príklad 13

Tento príklad ilustruje prípravu reprezentatívnej farmaceutickej kompozície podlá vynálezu v podobe aerosólu:

Zložky	% hmotn./hmotn.
Účinné látky	0,10%
Propelant 11/12	98,90%
Kyselina olejová	1,00%

Účinné látky sa dispergujú v kyseline olejovej a propelantoch. Výsledná zmes sa potom naleje do aerosolového zásobníka vybaveného odmeriavacím ventilom.

Aj keď je predložený vynález opísaný so zreteľom na jeho konkrétne uskutočnenia, odborník by mal pochopiť, že môže urobiť rôzne zmeny a nahradiť ekvivalenty bez toho, aby sa odchýlil od skutočného zmyslu a rozsahu vynálezu. Ďalej je možné vykonať mnohé modifikácie na prispôsobenie sa konkrétnej situácii, materiálu, kompozícii látok, procesu, stupňa alebo stupňov procesu v podstate, zmysle a rozsahu predloženého vynálezu. Rozumie sa, že všetky tieto modifikácie spadajú do rozsahu predloženého vynálezu a jeho patentových nárokov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozícia použitelná pri liečení rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, vyznačujúca sa tým, že obsahuje jedno alebo viac farmaceutický prijateľných vehikúl, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy a subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A.
2. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy je zvolený zo skupiny zahŕňajúcej zlúčeniny všeobecného vzorca I v ktorom

R^la znamená jeden alebo viac substituentov nezávisle zvolených zo skupiny zahŕňajúcej alkylové skupiny a hydroxyalkýlové skupiny;

R² znamená atóm fluóru v polohe 4;

R³ znamená fenylovú skupinu substituovanú v polohe 4 atómom chlóru a v polohe 2 aminokarbonylovou skupinou, ureidoskupinou alebo glycínamidoskupinou;

R⁴ znamená skupinu -O-;

R⁵ znamená metylénová skupinu; a

R⁶ znamená skupinu -C(O)-;

ako jednoduché stereoizoméry alebo ich zmes; alebo ich farmaceutický prijateľnú soľ.
3. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 2, vyznačujúca sa t ý m, že antagonista CCR1 receptora nepeptidovej po41 váhy je zvolený zo skupiny zahŕňajúcej:

(2R,5 S)-1-((4-chlór-2-(aminokarbonyl)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazin;

(trans)-1-((4-chlór-2-(glycínamido)fenoxy)metyl)karbony1-2, 5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazin;

(2 R)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-'4-fluórbenzyl)piperazin;

[trans) -1- ( (4-chlór-2- (ureido) fenoxy) metyl) karbonyl-2,5-dirr.etyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazin;

(2R,5S)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2, 5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazin; a [2R, 5S)-1-((4-chlór-2-(glycínamido)fenoxy)metyl)karbonyi-2,5-dímetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazin.
4. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 2, vyznačujúca sa t ý m, že antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy je [2R)-1-( (4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyi-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazin.
5. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 4, vyznačujúca sa t ý m, že cicavcom, ktorý ju potrebuje, je človek.
6. Spôsob podávania farmaceutickej kompozície použiteľnej pri liečení rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov cicavcovi, ktorý to potrebuje, vyznačujúci sa tým, že kompozícia obsahuje jedno alebo viac farmaceutický prijateľných vehikúl, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy a subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy a cyklospo42 rín A podávajú cicavcovi, ktorý to potrebuje, súbežne alebo postupne.
8. Spôsob podlá nároku 7, vyznačujúci sa tým, že antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy je zvolený zo skupiny zahŕňajúcej zlúčeniny všeobecného vzorca I .R⁴ ,R®

R³ R⁵ N v ktorom

R^la znamená jeden alebo viac substituentov nezávisle zvolených zo skupiny zahŕňajúcej alkylové skupiny a hydroxyalkýlové skupiny;

R² znamená atóm fluóru v polohe 4;

R³ znamená fenylovú skupinu substituovanú v polohe 4 atómom chlóru a v polohe 2 aminokarbonylovou skupinou, ureidoskupinou alebo glycínamidoskupinou;

R⁴ znamená skupinu -0-;

R⁵ znamená metylénovú skupinu; a

R⁶ znamená skupinu -C(0)-;

ako jednoduché stereoizoméry alebo ich zmes; alebo ich farmaceutický prijateľnú sol.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy je zvolený zo skupiny zahŕňajúcej:

(2R,5S)-1-((4-chlór-2-(aminokarbonyl)fenoxy)metyl)karbonyl -2 , 5-dimetyl-4-(4-fluórbenzylJpiperazŕn;

(trans)-1-((4-chlór-2-(glycínamido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4- (4-fluórbenzyl)piperazín;

(2R)-l-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(trans)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4- (4-fluórbenzyl)piperazín;

(2R, 5S)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2, 5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín; a (2R, 5S)-1-((4-chlór-2-(glycínamido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín.
10. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy je (2í?) —1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl) piperazín.
11. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že cicavcom, ktorý ho potrebuje, je človek.
12. Spôsob liečenia rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie farmaceutickej kompozície obsahujúcej jedno alebo viac farmaceutický prijateľných vehikúl, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy a subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A cicavcovi, ktorý to potrebuje.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy je zvolený zo skupiny zahŕňajúcej zlúčeniny všeobecného vzorca I v ktorom

R^la znamená jeden alebo viac substituentov nezávisle zvolených zo skupiny zahŕňajúcej alkylové skupiny a hydroxyalkylové s kupiny;

R² znamená atóm fluóru v polohe 4;

R³ znamená fenylovú skupinu substituovanú v polohe 4 atómom chlóru a v polohe 2 aminokarbonylovou skupinou, ureidcskupinou alebo glycínamidoskupinou;

R⁴ znamená skupinu -0-;

R⁵ znamená metylénovú skupinu; a

R⁶ znamená skupinu —C(0)—;

ako jednoduché stereoizoméry alebo ich zmes; alebo ich farmaceutický prijateľnú soľ.
14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa z ý m, že antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy je zvolený zo skupiny zahŕňajúcej:

(2R,5S)-1-((4-chlór-2-(aminokarbonyl)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(trans)-1- ((4-chlór-2-(glycinamido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(2R)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbcnyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(trans)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl)piperazín;

(2R, 5 S)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2,5-dimetyl-4-(4-fluórbenzyl(piperazín; a (2R, 5S)-1-((4-chlór-2-(glycinamido)fenoxy)metyl)karbonyl-2, 5-dime tyl-4 - ( 4-fluórbenzyl)piperazín.
15. Spôsob podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že antagonistom CCR1 receptora nepeptidovej povahy je (2R)-1-((4-chlór-2-(ureido)fenoxy)metyl)karbonyl-2-metyl-4-(4-fluórbenzyl)pipera zin.
16. Spôsob podlá nároku 15, vyznačujúci sa tým, že cicavcom, ktorý ho potrebuje je človek.
17. Spôsob podlá nároku 15, vyznačujúci sa tým, že sa antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy a cyklosporín A podávajú cicavcovi, ktorý to potrebuje, súbežne alebo postupne.

Anotácia

Názov vynálezu: Farmaceutické kompozície obsahujúce antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy v kombinácii s cyklosporínom A na liečenie rejekcie srdcového transplantátu

Farmaceutické kompozície použiteľné pri liečení rejekcie srdcového transplantátu u cicavcov, ktoré obsahujú jedno alebo viac farmaceutický prijateiných vehikúl, terapeuticky účinné množstvo antagonistu CCR1 receptora nepeptidovej povahy a subnefrotoxické množstvo cyklosporínu A, pričom antagonista CCR1 receptora nepeptidovej povahy je výhodne zvolený zo skupiny zahŕňajúcej zlúčeniny všeobecného vzorca v ktorom majú symboly R^la, R², R³, R⁴, R⁵ a R⁶ významy uvedené v opisnej časti, ako jednoduché stereoizoméry alebo ich zmes; alebo ich farmaceutický prijateľnú sol.