SI21123A - Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti v kombinaciji s ciklosporinom A za zdravljenje zavrnitve srčnega presadka - Google Patents

Abstract

Predmetni izum se nanaša na farmacevtske sestavke, koristne pri oskrbi/zdravljenju zavrnitve srčnega presadka pri sesalcih, ki obsegajo farmacevtsko sprejemljiv, inerten dodatek, terapevstko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A.ŕ

Description

Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti v kombinaciji s ciklosporinom A za zdravljenje zavrnitve srčnega presadka

To je neprovizorična prijava, ki uveljavlja prednostno pravico po 35 U.S.C. par. 119 provizoričnih prijav št. 60/222.053, vložene 31. julija 2000, ter št. 60/231.282, vložene 8. septembra 2000.

PODROČJE IZUMA

Predmetni izum se nanaša na farmacevtske sestavke, koristne pri oskrbi/zdravijenju zavrnitve srčnega presadka pri sesalcih, ki obsegajo farmacevtsko sprejemljiv, inerten dodatek, terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A. Predmetni izum se nanaša tudi na postopek za uporabo takih farmacevtskih sestavkov pri oskrbi/zdravijenju zavrnitve srčnih presadkov pri sesalcih.

OZADJE IZUMA

Pomembna komponenta vnetnega procesa obsega potovanje in aktivacijo izbranih populacij levkocitov iz obtoka in njihovo kopičenje v prizadetem tkivu. Čeprav ideja potovanja levkocitov ni nova, pa je nedavno doživela preporod po odkritju in karakterizaciji selektinskih in integrinskih družin adhezijskih molekul in velike družine selektivnih hemotaktičnih citokinov, znanih kot hemokini. Hemokin-receptorji se izražajo na levkocitih in procesirajo signale, ki sledijo vezavi hemokina, pri čemer pride do eventualne transdukcije takih signalov v migracijo ali aktivacijo levkocitov v smeri proti izvoru hemokina. Zato z regulacijo migracije in aktivacije levkocitov iz periferne krvi v ekstravaskularna mesta organov, kože, artikulacij ali veznega tkiva, igrajo hemokini kritično vlogo pri vzdrževanju odpornosti gostitelja, pa tudi pri razvoju imunskega odziva.

Prvotno je bila hemokinska družina molekul razdeljena na dve skupini: na pod-družino (subfamilijo) »C-X-C« in na pod-družino »C-C«. Bistvena značilnost obeh teh pod-družin je prisotnost štirih cisteinskih ostankov v visoko-konzerviranih položajih v molekulah. V hemokinski pod-družini »C-C« sta prva dva ostanka medsebojno priležna (sosednja), medtem ko v poddružini »C-X-C« en sam aminokislinski ostanek loči cisteinske ostanke. Zdi se, da nedaven opis »-C-« hemokina predstavlja novo družino hemokinov, glede tega, da »-C« hemokin nima dveh izmed štirih cisteinskih ostankov, prisotnih v pod-družini »C-C« ali v pod-družini »C-X-C«.

En član iz pod-družine »C-C« hemokinov je makrofag inflamatorni protein-1a (»MIP-1a«), Izražajo ga celice, kot so makrofagi, T- in B-limfociti, nevtrofilci in fibroblasti. Nedavna študija (glej Karpus, W.J. et al. J. Immunol. 1995, zv. 155, str. 5003-5010) nudi močno in vivo konceptno validacijo za vlogo MIP1a pri mišjem eksperimentalnem modelu avtoimunega encefalomielitisa (»EAE«) multiple skleroze. Multipla skleroza je avtoimunska bolezen, posredovana s T- in B-limfociti in makrofagi, kar povzroča ekstenzivno vnetje in demielinacijo bele substance (beline) v centralnem živčnem sistemu. Študija je pokazala, da so protitelesa za MIP-1a preprečila razvoj tako začetne kot tudi recidivne bolezni, pa tudi preprečila infiltracijo mononuklearnih celic v centralni živčni sistem. Zdravljenje s protitelesi je tudi omogočilo izboljšanje težavnosti napredujoče klinične bolezni. Ti rezultati so raziskovalce privedli do zaključka, da MIP-1a igra pomembno vlogo v etiologiji multiple skleroze. Nadaljna študija (glej Godiska, R. et al. J. Neuroimmunol. 1995, zv. 58, str. 167 - 176) je pokazala regulacijo mRNA za številne hemokine vključno MIP-1a, pri lezijah in na hrbtenjači SJL miši (sev miši, ki so občutljive na Th-j bolezni, kot je EAE) med potekom akutne EAE.

RANTES je nadaljni član C-C hemokinske pod-družine (ime RANTES je akronim, izveden iz nekaterih prvotno opazovanih in napovedanih lastnosti proteina in njegovega gena. (Regulated upon Activation Normal T celi Expressed presumed Secreted). Ugotovili so, da cela vrsta tkiv izraža RANTES v podobnem vzorcu kot MIP-1a. Obstajajo dokazi iz številnih študij, ki kažejo na nenormalno proizvodnjo RANTES-a pri napredovanju revmatoidnega artritisa (glej Rathanasvvami, P. et., J. Biol. Chem. (1993), zv. 268, str. 5834-5839 in Snovvden, N. et., Lancet (1994), zv. 343, str. 547548). Revmatoidni artritis je kronična vnetna bolezen, značilna delno po infiltraciji nosilcev imunskega spomina T-limfocita in monocita, kar je domnevno posredovano s hemotaktičnimi faktorji, ki jih sproščajo vneta tkiva. Obstajajo močni dokazi iz drugih študij, da je RANTES vpleten v patofiziologijo revmatoidnega artritisa (Barnes, D. A. et al., J. Ciin. Invest. (1998), zv. 101, str. 2910-2919 in Plater-Zyberk, C. A. et al., Immunol. Lett. (1997), zv. 57, str. 117-120). Tako na primer so pri modelu podganjega artritisa, izzvanega z adjuvansom (»AIA«), protitelesa za RANTES močno omejila razvoj bolezni.

Te študije in druge nudijo močan dokaz, da so ravni MIP-1a povišane pri EAE modelih multiple skleroze in da so ravni RANTES povišane pri revmatoidnem artritisu (glej na primer Glabinski, A. R. et al., Am. J. Pathol. (1997), zv. 150, str. 617-630); Glabinski, A. R. et al., Methods Enzymol. (1997), zv. 288, str. 182-190; in Miyagishi, R. S. et al., J. Neuroimmunol. (1997), zv. 77, str. 17-26). Poleg tega so - kot je zgoraj opisano - ti hemokini hemo-privlačni za T-celice in monocite, ki so glavni celični tipi udeleženi pri patofiziologiji teh bolezni. Zato bi bila vsaka molekula, ki inhibira aktivnost katerega koli izmed teh hemokinov, koristna pri zdravljenju teh bolezni in bi bila zato uporabna kot sredstvo proti vnetju.

Obstajajo tudi močni dokazi, ki povezujejo RANTES z zavrnitvijo organskih presadkov (presadkov). Infiltracija mononuklearnih celic v intersticij organskih presadkov je znak za akutno celično zavrnitev. Ta celični infiltrat obstaja prvenstveno iz T-celic makrofagov in eozinofiicev. Pri študiju RANTESizražanja med akutno zavrnitvijo ledvičnega alogenskega presadka smo ugotovili izražanje RANTES mRNA v infiltrirajočih mononuklearnih celicah in ledvičnih tubularnih epitelijskih celicah, sam RANTES pa smo našli vezan na endotelijsko površino mikrovaskulature v zavrnjenem presadku (glej Pattison, J. et al., Lancet (1994), zv. 343, str. 209-211 in VViedermann, C. J. et al.

Curr. Biol. (1993), zv. 3, str. 735-739). Nedavna študija (glej Pattison, J. M. et al., J. Heart Lung Transplant. (1996), zv. 15, str. 1194-1199) nakazuje, da RANTES lahko igra vlogo pri presadkovni aterosklerozi. Povišane ravni RANTES, tako mRNA in proteina, so ugotovili v mononuklearnih celicah, miofibroblastih in endotelijskih celicah arterij podvrženih pospešeni aterosklerozi, v primerjavi z normalnimi koronarnimi arterijami.

Ker je RANTES ligand za hemokinske receptorje CCR1 in CCR5, so ti receptorji, ki se nahajajo na krožečih mononuklearnih celicah, lahko koristne terapevtske tarče v transplantacijski biologiji. Pomembnost CCR1 receptorja so preiskovali na modelih transplantacije srca pri miših nosilcih ciljne delecije v CCR1 genu. (Gao, W. et al., J. Ciin. Invest. (2000) zv. 105, str. 35-44). V tej študiji so štirje ločeni modeli za preživetje aiogenskega presadka pokazale znatno podaljšanje s prejemniki CCR1 (-/-). Pri enem modelu so ravni ciklosporina A, ki so imele obrobne učinke na CCR1 (+/+) miši, povzročile trajen sprejem aiogenskega presadka v CCR1 (-/-) prejemnikih.

Nedavno se je pokazalo, da so nekatere majhne molekule nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti, z inhibicijo aktivnosti RANTES in MIP-1a, in so zato koristne kot sredstva proti vnetju. Glej PCT objavljeno patentno prijavo WO 98/56771, US patentna prijava št. 09/094.397, vložena 9. junija 1998, sedaj US patent 6.207.665, izdan 27. marca 2001, Hesselgesser, J. et al., J. Biol. Chem. (1998), zv. 273, str. 15687-15692, Ng, H.P. et al., J. Med. Chem. (1999), zv. 42, str, 4680 -4694, Liang, M. et al., Eur. J. Pharmacol. (2000a), zv. 389, str. 41-49 in Liang M. et al., J. Biol. Chem. (2000b), zv. 275., str. 19000-19008. Opisi iz teh patentnih prijav in člankov so vključeni v celoti kot reference v predmetni prijavi.

Ciklosporini so družina nevtralnih lipofilnih cikličnih oligopeptidov (11-merov) proizvedenih iz glive Tolypocladium inflatum Gams, kot tudi drugih Fungi imperfecti. Glavna komponenta je ciklosporin A, dobro znano na tržišču dostopno, imunosupresivno zdravilo, ki selektivno inhibira adaptivne imunske odzive z blokiranjem aktivacije T-celic (glej Kahan, B. D., New Engl. J. Med.

(1989); zv. 321, str. 1725-1738 in Valantine, H., Transplant. Proč. (2000), zv. 32, str. 27S-44S). Čeprav je ciklosporin A kritičen faktor za uspeh transplantacije organov, pa ostanejo glavni problemi varnosti na dolgo dobo, ki so v direktni zvezi z imunosupresijo osnovano na ciklosporinu A, vključno nefrotoksičnost, hipertenzija, diabetes mellitus in post-transplantacijska limfo-proliferativna bolezen. Zato bi bilo zaželeno, da bi bilo možno aplicirati subnefrotoksično dozo ciklosporina A, s čimer bi zmanjšali njegove nezaželene stranske učinke ob ohranitvi imunosupresivne aktivnosti, ki je potrebna za preprečitev kronične zavrnitve, ki je v primeru transplantacije srca znana kot kronična vaskulopatija alogenskega presadka in se v glavnem odraža kot pospešena arterioskleroza.

SORODNI OPISI

V nedavni študiji presaditve ledvic je peptidni hemokin-recepor antagonist Met-RANTES pri aplikaciji z nizkimi dozami ciklosporina A znatno zmanjšal okvare ledvic, vključno intersticijsko vnetje, v glavnem z zmanjšanjem števila infiltriranih monocitov (Grone, H. J. et al., FASEB J. (1999), zv. 13. str. 13711383). Ta študija podpira teorijo, da igra RANTES z aktivacijo specifičnih hemokin-receptorjev na mononuklearnih celicah pomembno vlogo pri zavrnitvi alogenskega presadka.

Objavljena evropska patentna prijava št. 1 000 626 (Applied Research Systems) opisuje uporabo peptidnega hemokin-receptor antagonista, MetRANTES, v kombinaciji s ciklosporinom za zdravljenje ali preventivo zavrnitve transplantiranih organov, tkiva ali celic.

POVZETEK IZUMA

Predmetni izum se nanaša na farmacevtske sestavke, koristne za oskrbo/zdravljenje pri zavrnitvi presadkov pri sesalcih, pri čemer ti sestavki obsegajo enega ali več farmacevtsko sprejemljivih inertnih dodatkov, terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A. Predmetni izum se nanaša zlasti na farmacevtske sestavke, koristne pri oskrbi/zdravljenju pri zavrnitvi presadkov pri sesalcih, pri čemer sestavki obsegajo enega ali več farmacevtsko sprejemljivih inertnih dodatkov, subnefrotoksično količino ciklosporina A ter terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista, izbranega iz spojin, ki so opisane v US patentu 6.207.665.

Predmetni izum se nanaša tudi na metode za aplikacijo sesalcem, ki to potrebujejo, farmacevtskega sestavka koristnega za oskrbo/zdravljenje pri zavrnitvi srčnega presadka pri sesalcih, pri čemer ta sestavek obsega enega ali več farmacevstsko sprejemljivih inertnih dodatkov, terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A. Ta izum se nanaša zlasti na metode za aplikacijo sesalcu, ki to potrebuje, farmacevtskega sestavka koristnega za oskrbo/zdravljenje pri zavrnitvi srčnega presadka pri sesalcih, pri čemer ta sestavek obsega enega ali več farmacevtsko sprejemljivih inertnih dodatkov, subnefrotoksično količino ciklosporina A in terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista, izbranega izmed tistih, ki so opisani v US patentu 6.207.665.

Predmetni izum se nanaša tudi na metode za oskrbo/zdravljenje pri zavrnitvi srčnega presadka pri sesalcih, pri čemer ta metoda obsega aplikacijo sesalcu, ki to potrebuje, farmacevtskega sestavka, ki obsega enega ali več farmacevstsko sprejemljivih inertnih dodatkov, terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A. Ta izum se nanaša zlasti na metode za oskrbo/zdravljenje pri zavrnitvi srčnega presadka pri sesalcih, pri čemer ta metoda obsega aplikacijo sesalcu, ki to potrebuje, farmacevtskega sestavka, ki obsega enega ali več farmacevtsko sprejemljivih inertnih dodatkov, subnefrotoksično količino ciklosporina A in terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista, izbranega izmed spojin, ki so opisani v US patentu 6.207.665.

KRATEK OPIS SKIC

Skica 1 kaže učinek nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu na vezavo radioaktivno-označenih MIP-1a na celice, ki izražajo podganji CCR1.

Skica 2 kaže učinek nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu na porast intracelularnega Ca²⁺ na celice, ki izražajo podganji CCR1, izzvan z MIP-1a.

Skica 3 kaže plazemske koncentracije nepeptidnega CCR1 receptorantagonista po predmetnem izumu, ki sledijo kroničnemu subkutanemu doziranju podganam.

Skica 4 kaže učinke kombinacij nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu in ciklosporina A na preživetje alogenskih srčnih presadkov na podganah.

Skica 5 kaže učinke kombinacij nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu in ciklosporina A na stopnjo zavrnitve pri podganah tri dni po prejemu alogenskih srčnih presadkov.

Skica 6 kaže učinek nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu na ravni ciklosporina A v plazmi podgan.

Skica 7 kaže učinek nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu na adhezijo monocitov na aktivirane endotelijske celice.

-8PODROBEN OPIS IZUMA

A. Definicije

Kot jih uporabljamo v opisu in priloženih zahtevkih, razen če ni definirano drugače, imajo naslednji izrazi pomene:

»Aminokarbonil« se nanaša na ostanek -C(O)NH₂.

»Fenil« se nanaša na benzenski ostanek, ki je opcijsko substituiran z enim ali več substituenti, izbranimi iz skupine, ki obstaja iz: hidroksi, halo, alkil, haloalkil, alkoksi, alkenil, nitro, ciano, amino, aminoalkilamino, dialkilamino, alkilkarbonil, karboksi, alkoksikarbonil in aminokarbonil.

»Farmacevtsko sprejemljiva sol« obsega tako kislinske kot tudi bazične adicijske soli.

»Farmacevtsko sprejemljiva kislinska adicijska sol« se nanaša na tiste soli, ki ohranijo biološko učinkovitost in lastnosti prostih baz, ki niso biološko ali kako drugače nezaželene in ki se tvorijo z anorganskimi kislinami kot klorovodikovo kislino, bromovodikovo kislino, žveplovo kislino, solitrno kislino, fosforovo kislino in podobnimi, ter organskimi kislinami, kot je ocetna kislina, propionska kislina, piruvinska kislina, maleinska kislina, malonska kislina, jantarna kislina, fumarova kislina, vinska kislina, citronska kislina, benzojska kislina, mandljeva kislina, metansulfonska kislina, etansulfonska kislina, p-toluensulfonska kislina, salicilna kislina in podobne.

»Farmacevtsko sprejemljiva bazična adicijska sol« se nanaša na tiste soli, ki ohranijo biološko učinkovitost in lastnosti prostih kislin, ki niso biološko ali drugače nezaželene., Te soli pripravimo z dodatkom anorganske baze ali organske baze k prosti kislini. Soli, ki so izvedene iz anorganskih baz, vključujejo, vendar niso omejene na natrijeve, kalijeve, litijeve, amonijeve, kalcijeve, magnezijeve, cinkove, aluminijeve soli in podobno. Prednostne anorganske soli so amonijeve, natrijeve, kalijeve, kalcijeve in magnezijeve soli. Soli izvedene iz organskih baz, vključujejo vendar niso omejene na soli primarnih sekundarnih in terciarnih aminov, substituiranih aminov, ki vključujejo v naravi nastopajoče substituirane amine, ciklične amine in bazične ionske izmenjalne smole, kot so izopropilamin, trimetilamin dietilamin, trietilamin, tripropilamin, etanolamin, 2-dimetilaminoetanol, 2dietilaminoetanol, trimetamin, diciklohesilamin, lizin, arginin, histidin, kafein, prokain, hidrabamin, holin, betain, etilendiamin, glukozamin, metilglukamin, teobromin, purini, piperazin, piperidin, /V-etilpiperidin, poliaminske smole in podobno. Posebno prednostne organske baze so izopropilamin, dietilamin, etanolamin, trimetilamin, dicikloheksilamin, holin in kafein.

»Ureido« se nanaša na ostanek s formulo-N(H)-C(O)-NH₂.

Razumljivo je iz zgornjih definicij in primerov, da pri ostankih, ki vsebujejo substituirano alkilno skupino, lahko pride do katerekoli substitucije na kateremkoli ogljiku alkilne skupine.

»Zavrnitev srčnega presadka« se nanaša na tista stanja bolezni (za namene predmetnega izuma), ki so značilna po akutni ali kronični postoperativni zavrnitvi srčnega presadka ter vključuje: zgodnji neuspeh presaditve, zgodnjo akutno zavrnitev, zgodnjo sistemsko zavrnitev in pozno kronično vaskulopatijo alogenskega presadka (pri čemer sta zgodnji in pozni definirana kot manj in več kot šest mesecev do enega leta po transplantaciji). »Sesalec« vključuje človeka in udomačene živali, kot so mačke, psi, prašiči, govedo, ovce, koze, konji, zajci in podobno.

»Subnefrotoksična« količina se nanaša na tako količino ciklosporina A, ki je terapevtsko učinkovita količina za oskrbo/zdravljenje zavrnitve srčnega presadka pri človeku, vendar ni povezana z nezaželenim stranskim učinkom nefrotoksičnosti, ki je značilna po povišanem serumskem kreatininu, povišani proteinuriji, povišani retenciji tekočin, zmanjšani stopnji glomerularne filtracije ter zmanjšanega izločanja natrija in kalija.

»Istočasno« se nanaša na uporabo farmacevtskih sestavkov, ki obsegajo dve aktivni sestavini, terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu in subnefrotoksično količino ciklosporina A, v prisotnosti enega ali več farmacevtsko sprejemljivih inertnih dodatkov, v enem samem pripravku.

»Zaporedno« se nanaša na uporabo farmecevtskih sestavkov po predmetnem izumu v dveh različnih pripravkih od katerih vsak obsega eno izmed dveh aktivnih sestavin, terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega

-1010

CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu ali subnefrotoksično količino ciklosporina A, skupaj z enim ali več farmacevtsko sprejemljivih inertnih dodatkov. Oba pripravka dajemo sesalcu, ki to potrebuje, v različnih časih.

Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu imajo lahko asimetrične atome ogljika v njihovi strukturi.

Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti lahko zato obstajajo kot enostavni stereoizomeri, racemati, in kot zmesi enantiomerov in diastereomerov. Naš namen je, da so vsi taki posamezni stereoizomeri, racemati in njihove zmesi v obsegu predmetnega izuma. Absolutna konfiguracija nekaterih atomov ogljika v nepeptidnih CCR1 receptor-antagonistih, če je znana, je označena s primernim absolutnim deskriptorjem R ali S. Deskriptor »trans« je uporabljen za označevanje, da so R^1a substituenti na nasprotnih straneh piperazinske ravnine. Deskriptor »c/s« je uporabljen za označevanje, da so R^ia substituenti na isti strani piperazinske ravnine.

Nomenklatura za nepeptidne CCR1 receptor-antagoniste po predmetnem izumu, kot jo tukaj uporabljamo, je modificirana oblika I.U.P.A.C. sistema, kjer so nepeptidni receptor-antagonisti, ki jih smatramo zaobsežene z izumom poimenovani kot derivati piperazina, kot je opisano v US patentu 6.207.665.

»Terapevtsko učinkovita količina« se nanaša na tisto količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista, prednostno nepeptidnega CCR1 receptorantagonista s formulo (I), kot je opisano spodaj, ki pri aplikaciji sesalcu, ki to potrebuje, prednostno človeku, zadošča za oskrbo/zdravljenje, kot je spodaj definirano, zavrnitve srčnega presadka. Količina nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po izumu, ki predstavlja »terapevtsko učinkovito količino« bo variriala v odvisnosti od uporabljenega nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista, resnosti zavrnitve, ter starosti zdravljenega človeka, povprečen strokovnjak pa jo bo lahko rutinsko določil z ozirom na njegovo lastno znanje in predmetni opis.

-11»Oskrbeti/zdraviti« ali »Oskrba/zdravljenje«, kot izraze tukaj uporabljamo, obsega oskrbo ali zdravljenje zavrnitve srčnega presadka pri sesalcu, prednostno pri človeku, in vključuje:

(i) preprečitev pojava zavrnitve pri sesalcu prednostno človeku, zlasti pred ali po presaditvi srca pri takem sesalcu;

(ii) inhibicijo stanja, to je ustavitev razvoja zavrnitve; ali (iii) olajšanje stanja, to je povzročitev regresije zavrnitve.

B. Prednostne izvedbe

Izmed farmacevstkih sestavkov, ki so opisani zgoraj v Povzetku izuma, vključuje prednostna skupina farmacevtskih sestavkov tiste sestavke, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antogonist spojina izbrana iz formule (I):

kjer je;

R eden ali več substituentov neodvisno izbranih iz skupine, ki obstajajo iz alkila ali hidroksialkila;

R je fluoro v položaju 4;

R³ je fenil, substituiran v položaju 4 s kloro in v položaju 2 z aminokarbonilom, ureido ali glicinamido;

R⁴je -O-;

R⁵ je metilen; in

R⁶je -C(O)-;

kot posamezen stereoizomer ali njihova zmes; ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.

-1212

Izmed te skupine farmacevtskih sestavkov vključuje prednostna podskupina farmacevtskih sestavkov tiste sestavke, v katerih je nepeptidni CCR1 receptor-antogonist izbran iz skupine, ki obstaja iz:

(2R, 5S)-1 -((4-kloro-2-(aminokarbonil)fenoksi)metil)karbonil-2,5“dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(frans)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(2ft)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(frans)-1~((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fiuorobenzil)piperazin;

(2R,5S)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin; in (2R, 5S)-1 -((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin.

V tej skupini farmacevtskih sestavkov nadaljnja prednostna podskupina farmacevtskih sestavkov vključuje tiste sestavke, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil4-(4-fluorobenzil)piperazin.

Izmed te podskupine farmacevtskih sestavkov vključuje prednosten razred farmacevtskih sestavkov tiste sestavke, kjer je sesalec, ki jih potrebuje, človek.

Izmed metod aplikacije, kot je opisano zgoraj »Povzetek izuma«, vključuje prednostna skupina metod tiste metode, kjer sta nepeptidni CCR1 receptorantogonist in ciklosporin A aplicirana sesalcu, ki to potrebuje, istočasno ali zapored.

Izmed te skupine metod vključuje prednostna podskupina metod tiste metode, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antogonist spojina izbrana iz formule (I):

-1313

kjer je:

R^1a eden ali več substituentov neodvisno izbranih iz skupine, ki obstajajo iz alkila ali hidroksialkila;

R je fluoro v položaju 4;

R je fenil, substituiran v položaju 4 s kloro in v položaju 2 z aminokarbonilom, ureido ali glicinamido;

R⁴ je -O-;

R je metilen; in

R⁶je -C(O)-;

kot posamezen stereoizomer ali njihova zmes; ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.

Izmed te podskupine metod vključuje prednosten razred metod tiste, v katerih je nepeptidni CCR1 receptor-antogonist izbran iz skupine, ki obstaja iz:

(2/?,5S)-1-((4-kloro-2-(aminokarbonil)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(frans)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(2/?)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(frar?s)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(2R,5S)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin; in (2R, 5S)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin.

-1414

V tej podskupini postopkov nadaljnja prednostna podskupina postopkov vključuje tiste postopke, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist (2R)-1((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazin.

Izmed tega razreda metod vključuje prednosten podrazred metod tiste metode kjer je sesalec, ki to potrebuje človek.

Izmed metod zdravljenja, opisanih zgoraj v Povzetku izuma, vključuje prednostna skupina metod tiste metode, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantogonist spojina izbrana iz formule (I):

R³ R⁵

(D kjer je:

R eden ali več substituentov neodvisno izbranih iz skupine, ki obstajajo iz alkila ali hidroksialkila;

R je fluoro v položaju 4;

R je fenil, substituiran v položaju 4 s kloro in v položaju 2 z aminokarbonilom, ureido ali glicinamido;

R⁴je -O-;

R⁵ je metilen; in

R⁶je -C(O)-;

kot posamezen stereoizomer ali njihova zmes; ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.

Izmed te skupine metod vključuje prednostna podskupina metod tiste metode, v katerih je nepeptidni CCR1 receptor-antogonist izbran iz skupine, ki obstaja iz:

-1515 (2R, 5S)-1-((4-kloro-2-(aminokarbonil)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(frans)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(fra/is)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

(2R,5S)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin; in (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin.

V tej skupini metod nadaljnja prednostna podskupina metod vključuje tiste metode, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist (2R)-1-((4-kloro-2(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazin.

Izmed te podskupine metod vključuje prednosten razred metod tiste metode, kjer je sesalec, ki to potrebuje, človek.

Izmed te podskupine metod vključuje nadaljnji prednostni razred metod tiste metode, kjer nepeptidni CCR1 receptor-antagonist in ciklosporin A apliciramo sesalcu, ki to potrebuje, istočasno ali zapored.

C. Uporabnost sestavkov po predmetnem izumu

Tukaj opisani farmacevtski sestavki so koristni za oskrbo/zdravljenje zavrnitve srčnega presadka pri sesalcih, prednostno ljudeh.

Izkazalo se je, da je ciklosporin A zelo učinkovit pri obravnavanju neuspešne presaditve, akutne zavrnitve in sistemske zavrnitve v prvem letu, ki sledi presaditvi srca. Vendar pa je dolgotrajna vzdrževalna raba ciklosporina A sicer učinkovita pri obravnavanju kronične vaskulopatije alogenskega

-1616 presadka, vendar pa je direktno povezana s stranskimi učinki, vključno nefrotoksičnostjo, hipertenzijo, diabetes mellitusom in limfoproliferativno boleznijo, kot posledicami presaditve.

Izkazalo se je, da je inhibicija aktivnosti določenih hemokinov ali njihovih receptorjev lahko učinkovita pri živalskih modelih presaditve organov. Kot smo zgoraj opisali, je pri nedavni študiji presaditve ledvic pri podganah hemokinski recetor antagonist Met-RANTES pri dajanju nizkih doz ciklosporina A znatno zmanjšal poškodbe ledvic, vključno intersticialno vnetje, v glavnem z zmanjšanjem števila infiltriranih monocitov (Grone, H. J. et. al., (1999), supra). Pri nadaljnji študiji so preiskovali pomembnost CCR1 receptorja na modelih presaditve srca pri miših, ki so bile nosilci tarčne delecije CCR1 (Gao, W. et. al., (2000) supra). Pri tej študiji so štirje iočeni modeli preživetja alogenskega presadka pokazali znatno podaljšanje s CCR1 (-/-) prejemniki. Pri enem modelu so ravni ciklosporina A, ki so imele obrobne učinke na CCR1 (+/+) miši, povzročile trajen sprejem alogenskega presadka pri CCR1 (-/-) prejemnikih.

Na osnovi teh študij obstaja močan dokaz v prid teorije, da hemokin RANTES, ki deluje preko CCR1 prejemnika, igra pomembno vlogo pri zavrnitvi presadka organov. Pokazalo se je, da nepeptidni CCR1 receptorantagonisti po predmetnem izumu inhibirajo aktivnost RANTES. Zato so nepeptidni CCR1 recetor-antagonisti po tem izumu koristni za oskrbo/zdravljenje zavrnitve presadkov organov, zlasti zavrnitve srčnega presadka.

Kot bomo podrobneje obravnavali v nadaljevanju, so nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu v kombinaciji s ciklosporinom A pokazali nepričakovane rezultate pri oskrbi/zdravljenju zavrnitve srčnega presadka pri sesalcih. Posebno kombinacija terapevtsko učinkovite količine nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksične količine ciklosporina A dokazujeta sposobnost za oskrbo/zdravljenje zavrnitve srčnega presadka brez nezaželenega nefrotoksičnega učinka cikosporina A.

-1717

D. Testiranje spojin po predmetnem izumu

Za dokaz, da nepeptidni CCR1 recpetor-antagonisti po predmetnem izumu inhibirajo učinkovitost hemokinov MIP-1a aii RANTES z delovanjem preko CCR1 receptorja, lahko uporabimo več in vitro testov, ki smo jih predhodno opisali. Glej na primer US patent 6.207.665 ter Hesselgesser, J. et. al. (1998), supra, Ng, H. P. et. al., (1999), supra, Liang, M. et. al., (2000a), supra in Liang, M. et. al., (2000b), supra.

Nepeptidni CCR1 receptor-antagonist, opisan v US patentu 6.207.665, to je (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil·2-metii-4-(4-fluorobenzil)piperazin, smo testirali glede vezave na CCR1 receptor podgane z in vitro vezivnimi testi, kot je opisano v Primeru 1, rezultati pa so prikazani na Skici 1. Scatchard analiza študij premestitve-vezave je razkrila, daje bila afiniteta nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista 121 ±60 nM (glej Skica 1), približno 10O-krat manj učinkovita za podganji CGR1 receptor kot za humani CCR1 receptor (K, = 1 nM). Poleg tega je bil ta nepeptidni CCR1 receptorantagonist sposoben za kompetitivno premestitev radioaktivno označenega RANTES iz podganjega CCR1 receptorja s podobno Ki . Za isti nepeptidni CCR1 receptor-antagonist se je izkazalo, da je funkcionalen in vitro antagonist podganjega CCR1 receptorja pri izvedbi testov s kalcijevim tokom, kot je spodaj opisano pri Primeru 2 in Skici 2. Začasen porast intracelularne koncentracije Ca , izzvan s 50 nM MIP-1a, je bil inhibiran s predinkubacijskimi celicami izražajočimi podganji CCR1 receptor, s 100 nM nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista (»Spojina«na Skici 2). Ti podatki so pokazali, da čeprav nepeptidni CCR1 receptor-antagonist ni bil tako močan inhibitor podganjega CCR1 receptorja v primerjavi s humanim CCR1 receptorjem, je bil nepeptidni CCR1 receptor-antagonist sposoben za učinkovito tekmovanje pri vezavi in vitro na podganji CCR1 receptor in je bil njegov močan funkcionalen antagonist.

-1818

Farmakokinetične študije smo izvedli na podganah z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom po predmetnem izumu, kot je opisano spodaj pri Primeru 3 in na Skici 3. Vršne ravni v plazmi prvi, četrti in sedmi dan po subkutani aplikaciji nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista, so variirale med 12 in 27 μΜ (glej Skico 3). Absorpcija je bila sorazmerno hitra in opazili smo signifikantne ravni v plazmi 15 minut po izpostavljanju zdravilu. Po osmih urah so bile ravni koncentracij zdravila v plazmi približno 1 do 2 μΜ. Razpolovni čas v plazmi je bil v območju med 2 in 3 urami. Čeprav ni bilo videti vzorca niti za povečanje očistka niti za kopičenje nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista pri ponovnem subkutanem doziranju, smo opazili znatno variabilnost pri hitrosti in stopnji absorpcije zdravila v vseh merjenih dneh. Te študije so pokazale, daje subkutano doziranje nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu po 50 mg/kg trikrat dnevno nudilo zadostne ravni zdravila v 24-urnem obdobju.

In vivo test, ki ga lahko uporabimo za prikaz koristnosti farmacevtskih sestavkov po predmetnem izumu za oskrbo/zdravljenje zavrnitve srčnega presadka pri sesalcih, je model zavrnitve heterotopičnega srčnega presadka pri podgani (glej na primer Nisco, S. et. al., J. Immunol. (1994), zv. 152, str. 3786-3792 in Ono, K. et. al., J. Thorac. Cordiovasc. Surg. (1969), zv. 57, str. 225-229).

Farmacevtske sestavke po predmetnem izumu smo testirali z in vivo testom, ki je opisan v nadaljevanju v Primeru 4, njegovi rezultati pa so prikazani na Skici 4. Pri tem testu ustreza povečanje časa preživetja alogenskega presadka zmanjšanju zavrnitve srčnega presadka pri prejemnikih Levvis podganah, ki so dobile presadke od donorskih ACI podgan. Srednji čas preživetja alogenskega presadka podgan, ki smo jim dali samo nepeptidni CCR1 receptor-antagonist (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2metil-4-(4-fluorobenzil)piperazin (»Spojina« na Skici 4) v mediju je bil 8,8 ±

1,2 dni v primerjavi s 6,8 ± 0,8 dni za živali, ki so bile obdelane samo z medijem (»Kontrola« na Skici 4). Srednji čas preživetja alogenskega presadka za živali, obdelane z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom po

-1919 predmetnem izumu, je bil statistično signifikanten na ravni 0,05 z ozirom na čas preživetja kontrolnih skupin in logaritemska analiza ranga (razvrstitve) testa preživetja je dala p=0,0448 za živali, ki so dobile nepeptidni CCR1 receptor-antagonist, v primerjavi s kontrolo.

Izvršili smo teste, pri katerih smo tretirali živali s terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu, to je (2/?)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazinom, in subnefrotoksično količino (2,5 mg/kg) ciklosporina A. Srednji čas preživetja alogenskega presadka pri živalih, ki smo jim dali samo 2,5 mg/kg ciklosporina A (»Cs 2,5« na Skici 4) je bil 7,3 ± 0,5 dni v primerjavi s

17,5 ± 5,9 dni za živali pri istem protokolu, ki smo jih dodatno tretirali z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom (»Cs 2,5 + Spojina« na Skici 4). Srednji čas preživetja alogenskega presadka pri živalih, ki smo jim dali terapevtsko dozo ciklosporina A, 10 mg/kg (»Cs 10« na Skici 4) je bii 12,9 ± 0,7 dni v primerjavi s 18,4 ± 5,4 dni za živali pri istem protokolu, ki smo jih dodatno tretirali z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom (»Cs 10 + Spojina« na Skici 4). Srednji čas preživetja živali, tretiranih bodisi z 2,5 ali 10 mg/kg ciklosporina A plus nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom, so bili statistično signifikantni z ozirom na srednji čas preživetja živali tretiranih bodisi z 2,5 mg/kg ali 10 mg/kg samega ciklosporina A, z vrednostmi p=0,0009 oziroma p=0,0148.

Svetlobna mikroskopija in imunohistologija za infiltrirane monocite, kot je opisano v nadaljevanju v Primeru 5 in na Skici 5, so potrdili te podatke za preživetje. Tri dni po presaditvi je bil delež zavrnitve znanto zmanjšan s kombiniranim tretiranjem z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom po predmetnem izumu, kot je opisano zgoraj, in ciklosporinom A (»Spojinaciklosporin A« na Skici 5). V presadkih, ki niso bili imunosuprimirani, smo opazili gost mononuklearen infiltrat. Mnogi kardiomiociti so bili vakuolirani ali nekrotični. Izraženi so bili intersticijski edemi. Pri podganah, tretiranih s ciklosporinom A, je bil infiltrat vnetnih celic zmanjšan, čeprav še vedno očiten, specifično okoli venul z žariščnim razpadom kardiomiocitov.

-2020

Podgane, ki so bile tretirane samo z nepeptidnim CCR1 receptorantagonistom, so pokazale žariščne mononuklearne celične infiltrate, ki so bili izraženi s podobno morfologijo kot tisti, ki smo jih opazili pri presadkih, ki niso bili imunosuprimirani. Živali, ki so bile tretirane tako z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom kot tudi s ciklosporinom A, so pokazale dobro ohranjeno kardialno morfologijo z redkimi mononukleamimi celičnimi infiltrati. V presadkih, ki niso bili imunosuprimirani, so mnoge celice gostega mononukleranega celičnega infiltrata obstajale iz monocitov/makrofagov, ki so bili v tesnem stiku z kardiomiociti. Pri podganah, ki so bile tretirane s ciklosporinom A, je bil infiltrat vnetnih celic žariščen in sestavljen prvenstveno iz ED-1 pozitivnih celic. Pri živalih, tretiranih z nepeptidnim CCR1 receptorantagonistom, je mononuklearen celični infiltrat variiral v signifikantni meri; videli smo področja z zmerno gostim monocitičnim infiltratom okoli venul. Kombinirano tretiranje z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom in ciklosporinom A je povzročilo dramatično zmanjšanje infiltracije monocitov/makrofagov v alogenska srca podgan. Na osnovi podatkov iz teh študij je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist po predmetnem izumu, ki smo ga dali v kombinaciji s ciklosporinom A, povzročil jasno sinergistično povečanje učinkovitosti pri presaditvi srca, v primerjavi s samim nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom ali ciklosporinom A.

Čeprav je kombinacija nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in ciklosporina A povzročila jasno sinergistično povečanje preživetja srčnega presadka, pa je ostala možnost, da je bil opaženi učinek posledica interakcij zdravilo/zdravilo, ki stabilizirajo ravni ciklosporina A v krvi ne pa resničnega sinergizma kombinacije zdravil. Izvršili smo farmakokinetične študije za merjenje ravni ciklosporina A v krvi podgan, v odsotnosti ali prisotnosti nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu, to je (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazina, kot je opisano v nadaljevanju v Primeru 6 in na Skici 6. Vizualni pregled krivulj čas/koncentracija sugerira lahno podaljšanje razpolovnega časa ciklosporina A v krvi podgan, ki so bile tretirane z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom (»Spojina« na Skici 6). Vendar pa je iz statistične

-21analize parnih skupin razvidno, da ni signifikantne razlike med obema izračunanima parametroma (P-vrednost za AUC = 0,224 in T1/2 = 0,317). Zato lahko izključimo interakcije zdravilo/zdravilo kot osnovo za jasno sinergistično povečanje preživetja srčnega presadka pri podganah, ki so bile tretirane s kombinacijo nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu in ciklosporina A.

Izvršili smo teste in vitro adhezije in »rolling test« (test kotaljenja), da bi določili, ali je dramatično zmanjšanje infiltracije monocitov/makrofagov v alogenska srca podgan morda vsaj delno posledica inhibicije hemokinov, ki učinkujejo preko CCR1 receptorja. Predhodna dela so pokazala, da kažejo monocitične celice povečano vezavo na IL-1 β-aktivirane endotelijske celice, ki vežejo RANTES po predinkubaciji z eksogenim RANTES v 30 minutah (Grone, H. J. et. al., (1999), supra). Izolirane humane krvne monocite smo obdelali z naraščajočimi količinami nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu, to je (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazina, in izvršili vezavo na mikrovaskularne endotelijske celice tako, kot je opisano v nadaljevanju v Primeru 7 in na Skici 7. Adhezijo monocitov na IL-1 β-aktivirane mikrovaskularne endotelijske celice, ki je bila posredovana z RANTES in obstojna na strig, je bila v odvisnosti od doze inhibirana z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom (»Spojina« na Skici 7A). Odstotek monocitov, za katere smo ugotovili, da so bili podvrženi »rolling« (kotaljenju) ali da so vzdrževali »rolling« interakcije, kar služi za obratni ukrep za ustavitev monocitov, je bil tudi v odvisnosti od doze inhibiran z nepeptidnim CCR1 receptor-antagonistom (»Spojina« na Skici 7B). Ti podatki močno podpirajo koncept resničnega sinergizma za kombinacijo nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu in ciklosporina A pri oskrbi/zdravljenju zavrnitve srčnih presadkov pri živalih.

-2222

E. Aplikacija sestavkov po izumu

Aplikacijo farmacevtskih sestavkov po izumu lahko izvedemo na kateri koli ustaljeni oziroma sprejeti način aplikacije ali sredstev za dajanje podobnih koristnih sredstev. Tako je aplikacija lahko na primer oralna, nazalna, parenteralna, lokalna, transdermalna ali rektalna, v obliki trdnega poitrdnega ali liofiliziranega praška, ali v tekočih dozirnih oblikah, kot so na primer tablete, supozitoriji, pilule, mehke elastične in trde želatinske kapsule, praški, raztopine, suspenzije ali aerosoli ali podobno, prednostno v oblikah dozirnih enot, ki so primerne za enostavno dajanje natančnih doziranj. Sestavki vključujejo običajen farmacevtski nosilec ali inerten dodatek (ekscipient) in spojino po predmetnem izumu kot eno ali več aktivnih sredtev, dodatno pa lahko vključujejo druga medicinska sredstva farmacevtska sredstva, nosilce, dodatke itd.

Na splošno vsebujejo v odvisnosti od nameravanega načina aplikacije farmacevtski sestavki okoli 1 % do okoli 99 mas./mas.% aktivne sestavine v sestavku, to je nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista ali njegove farmacevtsko sprejemljive soli, ter ciklosporina A in 99 % do 1 mas./mas.% primernega farmacevtskega inertnega dodatka (ekscipienta). Prednostno bo v sestavku okoli 5% do 75 mas./mas.% aktivnih sestavin, ostanek pa bodo primerni farmacevtski inertni dodatki (ekscipienti).

Prednosten način aplikacije je oralen, z uporabo primernega dnevnega dozirnega programa, ki ga lahko nastavimo v skladu s težavnostjo zavrnitve srčnega presadka. Za tako oralno dajanje tvorimo farmacevtski sestavek po predmetnem izumu z vgradnjo enega ali več normalno uporabljenih farmacevtskih inertnih dodatkov, kot na primer manitola, laktoze, škroba, preželatiniziranega škroba, magnezijevega stearata, natrijevega saharata, smukca, derivatov celuloznih etrov, glukoze, želatine, saharoze, citrata, propilgalata in podobnega, s farmacevtsko čistoto. Taki sestavki imajo obliko raztopin, suspenzij, tablet, pilul, kapsul, praškov, pripravkov z odloženim sproščanjem in podobnega.

-2323

Prednostno bodo imeli taki farmacevtski sestavki obliko kapsule, kapice ali tablete in bodo zato vsebovali tudi razredčilo, kot je laktoza, saharoza, dikalcijev fosfat in podobno; dezintegracijsko sredstvo kot natrijevo kroskarmelozo ali njene derivate; maziva kot magnezijev stearat in podobno; in vezivo kot škrob, akacijino gumo, poiivinilpirolidon, želatino, derivate celuloznih etrov in podobno.

Farmacevtske sestavke po predmetnem izumu lahko formuliramo tudi v supozitorije, na primer z uporabo okoli 0,5 do okoli 50 % aktivnih sestavin, ki se nahajajo v nosilcih, katera se v telesu počasi raztapljajo, na primer polioksietilenglikoli in polietilenglikoli (PEG), na primer PEG 1000 (96 %) in PEG 4000 (4 %).

Tekoči farmacevtski sestavki za aplikacijo se dajo pripraviti na primer z raztapljanjem, dispergiranjem itd. farmacevtskih sestavkov po predmetnem izumu (okoli 0,5 do okoli 20 %) in opcijskih farmacevtskih dodatkov v nosilcu, kot je na primer voda, slanica, vodna dekstroza, glicerol, etanol in podobno, pri čemer se tvori raztopina ali suspenzija.

Po želji lahko farmacevtski sestavki po predmetnem izumu vsebujejo tudi manjše količine pomožnih snovi, kot so omočilna ali emulgirna sredstva, sredstva za zapufranje pH, antioksidanti in podobno, kot je na primer citronska kislina, sorbitan-monolavrat, trietanolamin-oleat, butiliran hidroksitoluen itd.

Dejanske metode, ki se jih da uporabiti za pripravo zgornjih sestavkov, so znane ali pa bodo očitne za strokovnjaka; glej na primer RemingtoiTs Pharmaceutical Sciences 18. izdaja, (Mačk Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990). Farmacevtski sestavki, namenjeni za aplikacijo, bodo v vsakem primeru vsebovali enega ali več farmacevtsko sprejemljivih inertnih dodatkov, terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptorantagonista po predmetnem izumu in subnefrotoksično količno ciklosporina A za oskrbo/zdravljenje zavrnitve srčnega presadka.

-2424

Terapevtsko učinkovita količina nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista, prednostno nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista s formulo (I), bo variirala v odvisnosti od raznovrstnih faktorjev, vključno aktivnosti specifične uporabljene spojine; metabolične stabilnosti in trajanja učinka spojine; starosti, telesne mase, splošnega zdravstvenega stanja, spola in prehrane pacienta; načina in časa aplikacije; hitrosti izločanja, težavnosti zavrnitvenega procesa ter pacienta-gostitelja, na katerem se izvaja terapija. Na splošno je terapevtsko učinkovita dnevna doza od okoli 0,14 do okoli 14,3 mg/kg telesne mase dnevno za nepeptidni CCR1 receptor-antagonist s formulo (I); prednostno od okoli 0,7 do okoli 10 mg/kg telesne mase dnevno; in najbolj prednostno od okoli 1,4 mg do okoli 7,2 mg/kg telesne mase dnevno. Tako na primer bo za aplikacijo 70 kg težki osebi dozirno območje od okoli 10 mg do okoli 1,0 gramov dnevno nepeptidnega CCR1 receptorantagonista; prednostno od okoli 50 mg do okoli 700 mg dnevno in še najbolj prednostno od okoli 100 mg do okoli 500 mg dnevno.

F. Priprava sestavkov po predmetnem izumu

Nepeptidne CCR1 receptor-antagoniste po predmetnem izumu pripravimo po postopkih, opisanih v US patentu 6.207.665. Ciklosporini po predmetnem izumu so nevtralni lipofilni ciklični peptidi (11-meri) pridobljeni iz glive Tolypocladium inflatum Gams, kot tudi iz drugih Fungi imperfecti. Na voljo so za raziskovalne namene. Dva pripravka ciklosporina A, to je Sandimmune® in Neoral® (Novartis), se dandanes uporabljata za oskrbo/zdravijenje zavrnitve presadkov človeških organov.

Naslednje primere nudimo kot vodilo za pomoč pri izvedbi predmetnega izuma, njihov namen pa ni omejitev obsega izuma.

PRIMER 1 in vitro test

Ta test dokazuje afiniteto za vezavo nepeptidnih CCR1 receptor-2525 antagonistov po predmetnem izumu, prednostno nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista s formulo (I), za vezavo na podganji CCR1 receptor.

Reagenti in raztopine:

Hemokini: MIP-1a in RANTES (Peprotech Inc.)

Celice: podganje mononuklearne celice periferne krvi - (PBMC) smo izolirali iz popolne krvi Lewisovih podgan z Accu-paque™ (Accurate Chemical & Scientific Corp.) centrifugiranjem.

ne 19^

Ligand: l-MIP-1a in l-RANTES iz New England Nuclear (specifična aktivnost je 2200 Ci/mmol, 25 pCi/stekleničko) smo dopolnili z 1 mL H2O. Testni pufer: 130 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MnCh, 50 mM Tris, 30 pg/mL Bacitracina 0,1 % BSA, pH 7,4.

Izpiralni pufer: raztopina fosfatnega pufra (PBS).

Spojine po predmetnem izumu: Osnovna raztopina spojin je bila 1 mM v 100% DMSO. Najvišja koncentracija pri testu je bila 10 pM in lahko variira v odvisnosti od jakosti spojin. Naredili smo serijske 1:3 razredčine iz najvišje koncentracije s testnim pufrom. Na po šestih koncentracijah vsake spojine smo napravili značilen skrining (presejanje), da smo ustvarili krivuljo doz, iz katere smo določili vrednost K,.

Testni postopek

Teste smo izvedli na mikrotitrskih ploščah z V-dnom ter 96 vdolbinicami, s skupnim volumnom 100 pL. Podganji PBMC smo enkrat izprali s PBS in ponovno suspendirali v testnem pufru do okoli 0,2 do 1,0 krat 10⁶ celic/mL. Celice smo inkubirali z ¹²⁵l-MIP-1a aii ¹²⁵I-RANTES v prisotnosti ali odsotnosti variiranih koncentracij neoznačenega MIP-1a, RANTES, ali spojine pri 4 °C 30 minut.

Reakcije smo dokončali z odstranitvijo alikvotov iz suspenzije celic in ločili celice od pufra s centrifungiranjem skozi zmes silikon/parafinsko olje, kot je opisano zgoraj v Hesselgesser et. al., (1998), supra.

-2626

Nespecifično vezavo smo določali v prisotnosti 100 nM ali 1 μΜ neoznačenega MIP-1a ali RANTES. Koncentracije spojin pri testu so bile značilno od 10 μΜ do 30 nM v 1:3 razredčinah ter koncentracije bolj aktivnih spojin so bile nižje, v odvisnosti od jakosti.

Izračuni: ustvarili smo krivulje za doze vsake spojine s 6 koncentracijskimi točkami in podatke za vezanje opremili s krivuljo z računalniškim programom IGOR (VVavemetrics) za določitev afinitete in števila mest.

Nepeptidni OCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu so pri tem poskusnem testu dokazali svojo afiniteto za vezavo podganjega CCR1 receptorja.

PRIMER 2

In vitro test: tok kalcija

Funkcionalni in vitro test za nepeptidne CCR1 receptor-antagoniste Ker CCR1 receptor reagira na vezavo njegovih ligandov, MIP-1a in RANTES, z mobilizacijo prostega intracelularnega kalcija, lahko izmerimo biološko aktivnost s testi kalcijevega toka z uporabo fluorescenčne barve Fura-2. V naslednjem testu smo izmerili sposobnost nepeptidnih CCR1 receptorantagonistov po predmetnem izumu za blokiranje tega biološkega odziva. Protokol:

Podganji PBMC so bili izolirani tako, kot je opisano v Primeru 1, peletirani s centrifugiranjem in ponovno suspendirani v Hanks Ca²⁺ (50 mL Hanks, 1,0 mL 1 M Hepes, 1,6 mL 500 mM CaCl2, pH 7,4). Celice smo dvakrat izprali v tem mediju.

Celice smo ponovno suspendirali v mediju z gostoto 1 χ 10⁶ celic/mL v prisotnosti končne koncentracije 1,25 μΜ Fura-2 AM (Molecular Probes) (Osnovno raztopino smo pripravili z raztapljanjem 50 pg Fura-2 v 50 pL DMSO).

Celice smo inkubirali pri 37 °C 30 minut v prisotnosti ali odsotnosti raznih koncentracij nepetidnih CCR1 receptor-antagonistov po predmetnem izumu. Celice smo izprali s centrifugiranjem kot zgoraj, da smo odstranili prosto Fura-2. Celice smo ponovno suspendirali v 1 χ 10⁶ celic/mL.

-2727

Celice smo nato v alikvotni količini (2,0 mL) vnesli v kiveto in namestili v spektrofluorimeter PTI Deltascan model 4000. Celice smo stimulirali s 50 nM MIP-1a (Peprotech Inc.) ter izmerili sproščanje Ca v spektrofluorimetru kot funkcijo časa.

2+

Podatke smo korigirali za nM sproščenega Ca z dodatkom 100 pL 0,1 % Triton X -100 (za maksimalne vrednosti), temu pa je sledilo 100 pL 500 mM EGTA, pH 8,5 (za minimalne vrednosti).

Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu so pri tem testu pokazali sposobnost za inhibicijo mobilizacije Ca²⁺ kot odziv na vezavo MIP-1a na podganji CCR1 receptor.

PRIMER 3

In vivo test

Farmakokinetične študije na Levvis podganah

Pri teh študijah smo uporabili odrasle samce Lewis (RT11) podgan (Charles River, Boston), ki so bile specifično brez patogenov in so imele mase 200 do 250 g.

Pripravili smo raztopino 40 % ciklodekstrina z dodatkom 400 g ciklodekstrina (Aldrich) v 1-litrsko sterilno steklenico iz plastike. Dodali smo nezapufrano slanico, ki je vsebovala samo natrijev in kalijev klorid, ter zmes stresali in mešali čez noč, da smo dosegli raztapljanje. Dodali smo slanico do popolnega volumna enega litra. Raztopino smo filtrirali skozi 0,45 pm filter v sterilno steklenico, označili in shranili pri 4 °C. Pripravili smo 25 mg/mL raztopino spojine v ciklodekstrinu z raztapljanjem spojine v 40% ciklodekstrina v slanici. Zmes smo stresali, nato pa dodali 230 pL koncentrirane HCI. Zmes smo mešali do raztapljanja. Po dokončanem raztapljanju (1 ura) smo izmerili pH raztopine in dodali 1 M KOH, da smo pH dvignili na 4,5. Raztopino smo filtrirali skozi 0,45 pm filter ter shranili pri 4 °C. Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu so bili pripravljeni v mediju 40% ciklodekstrina/slanice in podganam smo subkutano (s.c.) dajali doze (50 mg/kg trikrat dnevno) v teku 7 dni. Vzorce krvi dobljene s kardialno punkcijo smo zbirali v epruvetke, ki so vsebovale EDTA, v

-2828 različnih časih, centrifugirali in shranili zamrznjeno plazmo, dokler nismo analizirali ravni koncentracije zdravila.

Vzorce plazme smo analizirali bodisi s HPLC z uporabo UV-detekcijskih metod ali HPLC-MS (izvedba z elektrosprejem, ki funkcionira na način pozitivnih ionov). Koncentracije nepeptidnih CCR1 receptor-antagonistov po predmetnem izumu smo določili z umeritveno krivuljo, konstruirano s plazmo ter analizirano pod identičnimi pogoji. Pri teh analizah smo uporabili sorodne spojine kot interen standard.

HPLC-UV metoda:

1) 100 pL alikvote plazemskih vzorcev smo dodali k 200 pL ledenomrzlega, kislega metanola (1 % ocetne kisline), ki je vseboval določeno količino internega standarda, in dobro mešali.

2) Nastali proteinski precipitat smo odstranili s centrifugiranjem pri 5.000 x g ter zbrali vrhnje sloje.

3) Pri paralelki pa smo kontrolnim plazemskim vzorcem dodali razne količine nepeptidnih CCR1 receptor-antagonistov po predmetnem izumu, značilno v območju 0,3 do 25 pM, ter dalje obdelali kot zgoraj.

4) Vrhnje sloje smo uparili do suhega v vakuumskem uparjalniku, dopolnili z raztopino 1:2 metanola.vode (ki je vsebovala 0,1 % TFA), obdelovali 30 sekund v vortexu ter centrifugirali, da smo odstranili usedlino.

5) Nastale vrhnje sloje smo injicirali v YMC AQ ODS kolono z reverzno fazo ter analizirali pri gradientnih HPLC pogojih pri pretočni hitrosti 1 mL/min. UV-detektor smo nastavili na 230 nm.

6) Gradientni pogoji: začetni, topilo A 22 %/topilo B 78 %; 2 minuti topilo A 22 %/topilo B 78 % 33 minut, topilo A 45 %/topilo B 55 %; 37 minut topilo A 80 %/topilo B 20 %; 47 minut, topilo A 80 %/topilo B 20 %; 49 minut, vrnitev k začetnim pogojem.

Razmerja vršnega področja med internim standardnim vrhom (pikom) in spojino smo izračunali za koncentracijsko območje standardne krivulje in uporabili to razmerje za konstrukcijo umeritvene krivulje. Koncentracijo spojine, ki nas zanima, smo izpeljali iz te krivulje z izračunanjem razmerja vršnega področja med pikom za spojino in za interni standard.

-2929

HPLC-MS metoda:

1) Uporabljena metodologija je bila podobna kot zgoraj opisana, le da smo pripravo vzorca ustavili pri stopnji precipitacije z metanolom ter uporabili kratko/hitro izokratično metodo namesto gradientne metode.

2) FISONS VG Platform enojni štiripolni inštrument smo uporabili z elektrosprejnim vhodom, ki je obratoval pri 3,57 kV. Uporabili smo YMC AQ ODS reverznofazno kolono pri pretočni hitrosti 1 mL/min., pri čemer gre celoten tok v UV-detektor pri 214 nm.

3) Tok smo razcepili, da smo vnesli tok 50 pL/min. v masni spektrometer. Kromatograme smo zbrali za celotni obratovalni čas 7,5 minut na vzorec s 50 pl_ injekcijo v kolono. Ione smo zbrali na način pozitivne ionizacije z eno vrsto ionov.

4) Kvantificiranje smo dosegli z integralom površine pod ionskimi tokovi (kontrola nepeptidni CCR1 receptor-antagonist po predmetnem izumu in interni standardi) in z ustvarjenjem umeritvene krivulje, kot je zgoraj opisano. Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu so pri tem testu pokazali primerne ravni zdravila v plazmi podgan v 24-urnem obdobju.

PRIMER 4

In vivo test

Heterotopična zavrnitev srčnega presadka (Lewis ali ACI podgane)

Pri teh študijah smo uporabili odrasle, specifično brezpatogenske samce ACI (RT1a) in Lewis (RT1I) podgan (Charles River, Boston, MA) z maso po 200 do 250 g, kot donorje oziroma prejemnike. Vaskularizirane srčne alogenske presadke smo heterotopično presadili v abdomen podgan - prejemnikov z uporabo modifikacije (Nisco, S. et. al., (1994), supra) tehnike Ono in Lindsay (Ono, K. et. al., (1969), supra). Napravili smo anastomoze konec-stranska stena iz ascendentne aorte donorskega srca na abdominalno aorto prejemnika in od donorske pulmonarne arterije na vena cava inferior prejemnika, po ligaciji vena cava in pulmonarnih ven donorja. Vsak dan smo otipali abdominalne alogenske presadke, da smo kontrolirali funkcijo presadka in smatrali, da je bila zavrnitev dokončana, kadar so prenehale otipljive ventrikularne kontrakcije.

-3030

Kardialne alogenske presadke iz ACI podgan smo heterotopično transplantirali v abdomen Lewisowih podgan - prejemnikov in tem živalim dajali bodisi: 40 % ciklodekstrina s.c. 3 krat dnevno; 50 mg/kg nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu v 40 % ciklodekstrina s.c. 3 krat dnevno; ciklosporin A v olivnem olju s pitanjem po 10 mg/kg 1 krat dnevno v teku 4 dni; ciklosporin A v olivnem olju s pitanjem po 2,5 mg/kg 1 krat dnevno v teku trajanja študije; ciklosporin A v olivnem olju s pitanjem po 10 mg/kg 1 krat dnevno v teku 4 dni plus 50 mg/kg nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista v 40 % ciklodekstrina s.c. 3 krat dnevno; ali ciklosporin A v olivnem olju s pitanjem po 2,5 mg/kg 1 krat dnevno v teku trajanja študije plus 50 mg/kg nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista v 40 % ciklodekstrina s.c. 3 krat dnevno. Transplantirana srca smo evaivirali dnevno glede na znake zavrnitve v teku študije.

Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu so pri zgornjem testiranju pokazali sposobnost, da znatno podaljšajo čas preživetja srčnega presadka pri aplikaciji v kombinaciji s ciklosporinom A.

PRIMER 5

In vivo test

Histologija, imunohistokemija in morfometrija

Transplantirana srca smo odstranili v globoki anesteziji, hitro popivnali kri, stehtali in nato obdelali, kot je potrebno za histologijo in imunohistokemijo. Organe smo narezali na 1-mm tanke rezine in nato bodisi fiksirali s potapljanjem v 4 % formaldehid v slanici, zapufrani s fosfatom (PBS) pH 7,35, (PBS: 99 mM Na^PCA, 108 mM NaH2PO₄, in 248 mM NaCl) v teku 24 ur, ali s fiksiranjem v methacarn v teku 8 ur in vnosom v parafin. Svetlobno mikroskopijo smo izvedli na 3 pm rezinah obarvanih s perjodovo kislinoSchiff ali Goldner Elastica. Svetlobno mikroskopijo smo izvedli na alogenskih srčnih presadkih 3 dni po transplantaciji.

ED1 monoklonsko protitelo (Serotec/Camon) smo uporabili na tkivu (3 pm) vdelanem v parafin, ki je bil fiksiran z methacarn, za obarvanje podganjih monocitov/makrofagnih celic. Za vizualizacijo smo uporabili detekcijski

-3131 sistem: alkalna fosfataza anti-alkalna fosfataza (Dako). Za negativno obarvanje smo napravili kontrole, ki so izpustile prvo ali drugo protitelo za vsako rezino. Za ED 1-pozitivne monocite/makrofage v alogenskih srčnih presadkih smo napravili imunohistološko obarvanje 3 dni po transplantaciji. Histopatološko zavrnitev pri alogenskem srcu podgane smo ocenjevali v skladu z Billingham-om (Billingham M.E. v: Cardiac transplantation, str. 133 - 152, Butterworths, Boston, 1990). Blaga akutna zavrnitev (ocena: 1) ie bila značilna po redkem intersticijskem mononuklearnem infiltratu, pogosto poudarjenem v perivaskularnih prostorih. Zmerna akutna zavrnitev (ocena: 2) je bila za zmerno gost perimiocitičen mononuklearen infiltrat z nekoliko miocitne nekroze. Huda akutna zavrnitev (ocena: 3) je pokazala gost monocitičen infiltrat z žariščno krvavitvijo in nadomestitev miocitov ter občasen endotelialitis intrastenskih arterij. Oceno zavrnitve smo izračunali za vsak blok tkiva ter izračunali povprečno oceno iz različnih blokov za vsako transplantirano srce, saj so postopki zavrnitve težili k žariščnosti.

Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu so pri zgornjem testiranju znatno znižali oceno zavrnitve in obseg infiltracije monocitov v presadek, če smo jih aplicirali v kombinaciji s ciklosporinom A.

PRIMER 6

In vivo test

Ravni ciklosporina A v krvi podgan

Lewisovim podganam s kanilami (6 na skupino) smo aplicirali bodisi eno samo dozo 2,5 mg/kg ciklosporina A (raztopina Neoral Oral, Sandoz, East Hannover, NJ) razredčenega v olivnem olju, ali eno samo dozo istega ciklosporina A, čemur so sledile s.c. injekcije 3 krat dnevno 50 mg/kg nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista po predmetnem izumu v 40 % ciklodekstrina. Zbrali smo popolno kri z uporabo EDTA kot antikoagulanta v različnih časih po doziranju. Izmerili smo ravni ciklosporina A v plazmi z uporabo kompleta Cyclo-Trac SP-Whole Blood Radioimmunoassay za ciklosporin (DiaSorin, Stillwater M.N.), pri čemer smo v osnovi sledili navodilom proizvajalca. Stopnjo ekstrakcije z metanolom smo izvedli pred testom za standarde, kontrole in vzorce. Metanolne ekstrakte smo združili s

-3232

125 slednim sredstvom (»tracer«) ciklosporina, označenega z I . Dodali smo zmes mišjega monoklonskega protitelesa specifičnega za ciklosporin A in protitelo osel - anti-miš, v enem samem reagentu. Po enourni inkubaciji smo epruvetke centrifugirali, dekantirali in šteli. Količina radioaktivnosti v peletki je bila obratno sorazmerna koncentraciji ciklosporina A v vzorcu. Umeritveno krivuljo smo dobili z uporabo programa, ki ustreza 4-parametrski logistični krivulji, z narisanjem diagrama med iznosom vezave proti log. koncentraciji. Koncentracije ciklosporina A smo interpolirali iz standardne krivulje. Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu pri zgornjem testiranju niso signifikantno prizadeli razpolovnega časa eliminacije ciklosporina v popolni krvi podgan.

PRIMER 7

In vitro test

Prilepljenje (»adhezija«) in kotaljenje (»rolling«) monocitov

Funkcionalni In vitro test za nepeptidne CCR1 receptor-antagoniste Interakcijo monocitov z endotelijem smo proučevali na testih laminarnega toka, v bistvu tako, kot je bilo opisano (Grone H.J. et. al., (1999), supra, in VVeber K. S. et. al., Eur. J. Immunol. (1999), zv. 29, str. 700-712).

Humane kožne mikrovaskularne endotelialne celice smo gojili do zlitja (»konfluence«) v petrijevkah ter stimulirali z 10 ng/mL IL-1 β v teku 12 ur, ali pa pustili neobdelano. Pred študijo smo celice predhodno inkubirali z 10 ng/mL RANTES v teku 30 minut. Plošče smo sestavili kot spodnjo steno v pretočni komori z vzporednimi stenami ter montirali na Olympus IMT-2 invertni mikroskop z 20x in 40x fazno kontrastnimi objektivi. Monocite humane krvi smo izolirali z Nycodenz hiperosmolarnim gradientnim centrifugiranjem in ponovno suspendirali s 5 χ 10⁶ celic/mL v testnem pufru (10 mM Hepes, 0,5 % HSA, pH 7,4). Tik pred testom smo koncentracije Mg in Ca nastavili na 1mM. Celične suspenzije smo vzdrževali v grelnem bloku pri 37 °C med testom'in pretakali v pretočno komoro s 1,5 din/cm² v teku 5 minut. Za testiranje inhibicije smo monocite predhodno inkubirali 10 minut pri 37 °C z raznimi koncentracijami nepeptidnih CCR1 receptor-33antagonistov po predmetnem izumu ali DMSO kontrole. Prešteli smo število trdno prilepljenih celic v vsaj petih poljih z analizo slik, posnetih z dolgo integracijsko JVC 3CCD videokamero ter JVC SR 900 E videorekorderjem. Rezultati so izraženi v celicah/mm². Kot obratno merilo za priiepljenje (»adhezijo«), smo testirali število monocitov s kotaljenjem (»rolling«) pri majhnem strigu, v vsaj 30 sekundnem intervalu v obdobju petih minut, in izrazili kot odstotek vseh interakcij na analiziranih poljih.

Nepeptidni CCR1 receptor-antagonisti po predmetnem izumu so pri zgornjem testiranju inhibirali priiepljenje monocitov na aktivirane endotelialne celice in so povečali odstotek monocitov, pri katerih je prišlo do kotaljenja (»rolling«) ali je bilo le-to vzdrževano.

PRIMER 8

Ta Primer prikazuje pripravo reprezentativnih farmacevtskih sestavkov po izumu za oralno dajanje.

A.

Sestavine	Mas./mas. %
Aktivne sestavine	20,0 %
Laktoza	79,5 %
Magnezijev stearat	0,5 %

Zgornje sestavine smo pomešali in vnesli v kapsule iz trde želatine, ki so vsebovale vsaka 100 mg, pri čemer je bila ena kapsula približno celotna dnevna doza.

B.

Sestavine	Mas./mas. %
Aktivne sestavine	20,0 %
Magnezijev stearat	0,9 %
Škrob	8.6 %
Laktoza	69,6 %
PVP (polivinilpirolidon)	0,9 %

-3434

Zgornje sestavine z izjemo magnezijevega stearata smo združili in granulirali z uporabo vode kot granulacijske tekočine. Pripravek smo nato sušili, pomešali z magnezijevim stearatom in oblikovali v tablete s primernim tabletirnim strojem.

C.

Sestavine
Aktivne sestavine	0,1 g
Propilenglikol	20,0 g
Polietilenglikol 400	20,0 g
Polisorbat 80	1,0 g
Voda	q.s. 100 mL

Aktivne sestavine smo raztopili v propilenglikolu, polietilenglikolu 400 in polisorbatu 80. Nato smo dodali dovolj vode ob mešanju, da smo dobili 100 mL raztopine, katero smo filtrirali in ustekleničili.

D.

Sestavine	Mas./mas.%
Aktivne sestavine	20,0 %
Arašidovo olje	78,0 %
Špan 60	2,0 %

Zgornje sestavine smo stalili, pomešali in vnesli v kapsule iz mehke želatine.

E.

Sestavine	Mas./mas. %
Aktivne sestavine	1,0 %
Metil- ali karboksimetilceluloza	2,0 %
0,9% slanica	q.s. 100 mL

Aktivne sestavine smo raztopili v raztopini celuloze/slanice, filtrirali in ustekleničili za uporabo.

-3535

PRIMER 9

Ta Primer prikazuje pripravo reprezentativnega farmacevtskega sestavka po izumu za parenteralno dajanje.

Sestavine
Aktivne sestavine	0,02 g
Propilenglikol	20,0 g
Polietilenglikol 400	20,0 g
Polisorbat 80	1,0 g
0,9% raztopina slanice	q.s. 100 mL

Aktivne sestavine smo raztopili v propilenglikolu, polietilenglikolu 400 in polisorbatu 80. Nato smo dodali dovolj 0,9% raztopine slanice ob mešanju, da smo dobili 100 mL intravenozne raztopine, katero smo filtrirali skozi 0,2 pm membranski filter in pakirali v sterilnih pogojih.

PRIMER 10

Ta Primer prikazuje pripravo reprezentativnih farmacevtskih sestavkov po izumu v obliki supozitorija.

Sestavine	Mas./mas.%
Aktivne sestavine	1,0 %
Polietilenglikol 1000	74,5 %
Polietilenglikol 4000	24,5 %

Sestavine smo skupaj stalili, pomešali na parni kopeli in ulili v forme, ki so vsebovale po 2,5 g skupne mase.

PRIMER 11

Ta Primer prikazuje pripravo reprezentativnih farmacevtskih sestavkov po izumu za insuflacijo.

-3636

Sestavine	Mas./mas.%
Mikronizirane aktivne sestavine	1,0 %
Mikronizirana laktoza	99,0 %

Sestavine smo zmleli, pomešali in pakirali v insuflator, opremljen z dozirno črpalko.

PRIMER 12

Ta Primer prikazuje pripravo reprezentativnih farmacevtskih sestavkov po izumu v obliki meglice.

Sestavine	Mas./mas.%
Aktivne sestavine	0,005 %
Voda	89,995 %
Etanol	10,000 %

Aktivne sestavine smo raztopili v etanolu in pomešali z vodo. Pripravek smo pakirali v aparat za tvorbo meglice, opremljen z dozirno črpalko.

PRIMER 13

Ta Primer prikazuje pripravo reprezentativnih farmacevtskih sestavkov po izumu v obliki aerosola.

Sestavine	Mas./mas.%
Aktivne sestavine	0,10 %
Propelant 11/12 (potisni plin)	98,90 %
Oljna kislina	1,00 %

Aktivne sestavine smo dispergirali v oljni kislini in potisnih plinih. Nastalo zmes smo nato izlili v vsebnik za aerosol, opremljen z dozirnim ventilom.

-3737

Sicer smo predmetni izum opisali z ozirom na njegove specifične izvedbe, je pa za strokovnjake razumljivo, da je možno napraviti razne spremembe in zamenjati ekvivalente, ne da bi se oddaljili od prave zamisli in obsega izuma. Poleg tega je možno napraviti mnoge modifikacije za prilagoditev specifični situaciji, materialu, sestavi snovi, postopku, fazam postopka, namenu, zamisli in obsegu predmetnega izuma.

Naš namen je, da so vse take modifikacije v okviru priloženih patentnih zahtevkov.

Claims (29)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Farmacevtski sestavek, koristen pri oskrbi/zdravljenju zavrnitve srčnega presadka pri sesalcih, pri čemer ta sestavek obsega enega ali več farmacevtsko sprejemljivih, inertnih dodatkov (ekscipientov), terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A.
2. 2. Farmacevtski sestavek po zahtevku 1, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantogonist spojina izbrana iz formule (I):

   ₃/< 5'^R R³ R⁵ (I) kjer je:

   1 a

   R eden ali več substituentov neodvisno izbranih iz skupine, ki obstajajo iz alkila ali hidroksialkila;

   R²je fluora v položaju 4;

   R je fenil, substituiran v položaju 4 s kloro in v položaju 2 z aminokarbonilom, ureido ali glicinamido;

   R^{3 4} je -O-;

   R je metilen; in R⁶je-C(O)-;

   kot posamezen stereoizomer ali njihova zmes; ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.
3. 3. Farmacevtski sestavek po zahtevku 2, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantagonist izbran iz skupine, ki jo tvorijo:

   -3939 (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(aminokarbonil)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

   (frans)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

   (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

   (irans)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

   (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin; in (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin.
4. 4. Farmacevtski sestavek po zahtevku 2, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantagonist (2ft)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4-(4fluorobenzil)piperazin.
5. 5. Farmacevtski sestavek po zahtevku 4, kjer je sesalec, ki ga potrebuje, človek.
6. 6. Farmacevtski sestavek ki obsega enega ali več farmacevtsko sprejemljivih, inertnih dodatkov (ekscipientov), terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A, za aplikacijo sesalcu ki to potrebuje in ki je koristen za oskrbo/zdravljenje zavrnitve srčnega presadka pri sesalcih.
7. 7. Farmacevtski sestavek po zahtevku 6, kjer nepeptidni CCR1 receptorantagonist in ciklosporin A dajemo sesalcu, ki ga potrebuje, istočasno ali zapored.
8. 8. Farmacevtski sestavek po zahtevku 7, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantagonist spojina izbrana iz formule (I):

   -4040 (I) kjer je:

   1 a

   R eden ali več substituentov neodvisno izbranih iz skupine, ki obstajajo iz alkila ali hidroksialkila;

   R²je fluoro v položaju 4;

   R je fenil, substituiran v položaju 4 s kloro in v položaju 2 z aminokarbonilom, ureido ali glicinamido;

   R⁴ je -O-;

   R⁵ je metilen; in R^sje-C(O)-;

   kot posamezen stereoizomer ali njihova zmes; ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.
9. 9. Farmacevtski sestavek po zahtevku 8, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantagonist izbran iz skupine, ki jo tvorijo:

   (2/?,5S)-1-((4-kloro-2-(aminokarbonil)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

   (frans)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

   (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

   (irans)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

   (2ft,5S)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin; in (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4-4141 (4-fluorobenzil)piperazin.
10. 10. Farmacevtski sestavek po zahtevku 8, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantagonist (2F?)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4-(4fluorobenzil)piperazin.
11. 11. Farmacevtski sestavek po zahtevku 8, kjer je sesalec, ki jo potrebuje, človek.
12. 12. Farmacevtski sestavek ki obsega enega ali več farmacevtsko sprejemljivih, inertnih dodatkov (ekscipientov), terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A za oskrbo/zdravljenje zavrnitve srčnega presadka pri sesalcu z aplikacijo sesalcu, ki to potrebuje.
13. 13. Farmacevtski sestavek po zahtevku 12, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantagonist spojina izbrana iz formule (I):

    R^1a

    0) kjer je:

    g

    R eden ali več substituentov neodvisno izbranih iz skupine, ki obstajajo iz alkila ali hidroksialkila;

    R²je fluoro v položaju 4;

    R³ je fenil, substituiran v položaju 4 s kloro in v položaju 2 z aminokarbonilom, ureido ali glicinamido;

    -4242 β

    R je metilen; in

    R⁶je -C(0)-;

    kot posamezen stereoizomer ali njihova zmes; ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.
14. 14. Farmacevtski sestavek po zahtevku 13, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantagonist izbran iz skupine, ki jo tvorijo:

    (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(aminokarbonil)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (frans)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (frans)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin; in (2/?,5S)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin.
15. 15. Farmacevtski sestavek po zahtevku 13, kjer je nepeptidni CCR1 receptorantagonist (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4-(4fluorobenzil)piperazin.
16. 16. Farmacevtski sestavek po zahtevku 15, kjer je sesalec, ki ga potrebuje, človek.
17. 17. Farmacevtski sestavek po zahtevku 15, kjer nepeptidni CCR1 receptorantagonist in ciklosporin A dajemo sesalcu, ki ga potrebuje, istočasno ali zapored.

    -4343
18. 18. Uporaba farmacevtskega sestavka ki obsega enega ali več farmacevtsko sprejemljivih, inertnih dodatkov (ekscipientov), terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A, za izdelavo zdravila za aplikacijo sesalcu ki to potrebuje in ki je koristen za oskrbo/zdravljenje zavrnitve srčnega presadka pri sesalcih.
19. 19. Uporaba po zahtevku 18, kjer nepeptidni CCR1 receptor-antagonist in ciklosporin A dajemo sesalcu, ki ga potrebuje, istočasno ali zapored.
20. 20. Uporaba po zahtevku 19, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist spojina izbrana iz formule (I):

    -Rt -R® R^1a R³ R⁵

    R^z (I) kjer je:

    R eden ali več substituentov neodvisno izbranih iz skupine, ki obstajajo iz alkila ali hidroksialklla;

    R je fluoro v položaju 4;

    R je fenil, substituiran v položaju 4 s kloro in v položaju 2 z aminokarbonilom, ureido ali glicinamido;

    R⁴ je-O-;

    R je metilen; in R⁶je -C(O)-;

    kot posamezen stereoizomer ali njihova zmes; ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.
21. 21. Uporaba po zahtevku 20, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist izbran iz skupine, ki jo tvorijo:

    (2/?,5S)-1-((4-kloro-2-(aminokarbonil)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    -4444 (frans)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (irans)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin; in (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin.
22. 22. Uporaba po zahtevku 20, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist (2R)-1((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazin.
23. 23. Uporaba po zahtevku 20, kjer je sesalec, ki jo potrebuje, človek.
24. 24. Uporaba farmacevtskega sestavka ki obsega enega ali več farmacevtsko sprejemljivih, inertnih dodatkov (ekscipientov), terapevtsko učinkovito količino nepeptidnega CCR1 receptor-antagonista in subnefrotoksično količino ciklosporina A za izdelavo zdravila za oskrbo/zdravljenje zavrnitve srčnega presadka pri sesalcu z aplikacijo sesalcu, ki to potrebuje.
25. 25. Uporaba po zahtevku 24, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist spojina izbrana iz formule (I):

    kjer je:

    1 a

    R eden ali več substituentov neodvisno izbranih iz skupine, ki obstajajo iz alkila ali hidroksialkila;

    -4545

    R je fluoro v položaju 4;

    o

    R je fenil, substituiran v položaju 4 s kloro in v položaju 2 z aminokarbonilom, ureido ali glicinamido;

    R⁴je -O-;

    R⁵ je metilen; in R⁶je -C(O)-;

    kot posamezen stereoizomer ali njihova zmes; ali njena farmacevtsko sprejemljiva sol.
26. 26. Uporaba po zahtevku 25, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist izbran iz skupine, ki jo tvorijo;

    (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(aminokarbonil)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (frans)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (2R)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (frans)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin;

    (2R,5S)-1-((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin; in (2/?,5S)-1-((4-kloro-2-(glicinamido)fenoksi)metil)karbonil-2,5-dimetil-4(4-fluorobenzil)piperazin.
27. 27. Uporaba po zahtevku 25, kjer je nepeptidni CCR1 receptor-antagonist (2R)-1((4-kloro-2-(ureido)fenoksi)metil)karbonil-2-metil-4-(4-fluorobenzil)piperazin.
28. 28. Uporaba po zahtevku 27, kjer je sesalec, ki ga potrebuje, človek.
29. 29. Uporaba po zahtevku 27, kjer nepeptidni CCR1 receptor-antagonist in ciklosporin A dajemo sesalcu, ki ga potrebuje, istočasno ali zapored.