DE3878951T2

DE3878951T2 - Verwendung von milch-glycoproteinen zur mundhygiene.

Info

Publication number: DE3878951T2
Application number: DE8888101292T
Authority: DE
Inventors: Jean-Richard Neeser
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1987-02-26
Filing date: 1988-01-29
Publication date: 1993-09-16
Anticipated expiration: 2008-01-30
Also published as: EP0283675A3; NZ223400A; ZA88798B; EP0283675A2; DE3878951D1; FI880464A; FI88578C; US4994441A; JPS63233911A; ATE86475T1; EP0283675B1; JP2760429B2; US4992420A; FI880464A0; CH671879A5; FI88578B; ES2039484T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verhinderung der Adhäsion von Bakterien, welche Zahnbelag und Zahnkaries hervorrufen.
Actinomyces viscosus und Streptococcus sanguis sind die Bakterien, welche die Mundhöhle bewohnen, die für die Auslösung und die Bildung von Zahnbelag verantwortlich sind. Mit Actinomyces naeslundii bilden sie eine Gruppe von Bakterien, die fähig sind, als erste die Mundhöhle zu kolonisieren. Sie spielen eine Hauptrolle bei einer Reihe von Ereignissen, die zu den mit Zahnbelag verbundenen Erkrankungen, wie Zahnwurzelkaries, Zahnfleischentzündungen, Zannwurzelhautentzündungen und Parodontolyse führen. Darüberhinaus stellt Streptococcus mutans das mit Zahnkaries verbundene Hauptpathogen dar, welches sich entwickelt, wenn Zahnbelag einmal ausgelöst ist.
Unter den Faktoren,welche einen Bestandteil der Mechanismen bei der Bildung von Zahnbelag durch die Stämme A.viscosus und S.sanquis darstellen, müssen deren Eigenschaften an Epithelzellen der Mundhöhle, auf der Oberfläche von mit Speichel bedeckten Zähnen anzuhaften sowie deren Neigung untereinander Coaggregate, wie mit A.naeslundii auszubilden, angeführt werden. Obwohl diese Mechanismen sehr komplex sind, wurde beobachtet, daß A.naeslundii einen Galactose oder Galactosamin enthaltenden Rezeptor auf den Epithelzellen durch Adhesine wiedererkennt, die in gleicher Weise von A.viscosus exprimiert und Pili Typ 2 genannt werden. In anderen Arbeiten wurde gezeigt, daß die Reaktionen der Coaggregation zwischen S.sanguis und den beiden Arten von Actinomyces in gleicher Weise auf einem Wiedererkennen des Typus Pili Typ 2/Galactose basieren können.
Vereinfachend erscheint es im Stand der Technik einerseits, daß es sich bei dem klassischen Inhibitor der durch Pili Typ 2 regulierten bakteriellen Adhäsion um Lactose handelt, welche über den Weg ihres Galactoserestes wirkt. Andererseits spielen die Mechanismen der Adhäsion, welche auf anderen Faktoren beruhen, welche sich beispielsweise auf der festen Oberfläche der Zähne ereignen, eine Rolle in der Bildung von Zahnbelag.
Die amerikanische Patentschrift Nr. 4 579 736 bezieht sich auf die Herstellung eines, das Wachstum und den Metabolismus der Zahnbelag-bildenden Bakterien S.sanguis und A.viscosus hemmenden Faktors, welche das Aufbrechen der Zellwände von Actinobacillus actinomycetemcomitans, (welches ein Bakterium ist, das während der Endphase von Zahnhautwurzelentzündung auftritt) durch eine Ultraschallbehandlung und das Sammeln des interessierenden Faktors durch Zentrifugieren, anschließendes Dekantieren der überstehenden flüssigen Phase, deren Reinigen durch Dialyse und Trocknen durch Lyophilisieren umfaßt.
Die europäische Patentschrift Nr. 184.121 betrifft einen die Zähne schonenden Zusatzstoff, welcher dazu bestimmt ist, in Nahrungsmitteln und Medikamenten, die Saccharose enthalten, einverleibt zu werden, welcher Zusatzstoff im wesentlichen aus einem Gemisch von Lactose und Galactose besteht, das durch Fermentation von Molke mittels Lactobacillus leichmannii erhalten wird.
In CA, Band 101, 1984, S.509, Abstract Nr.22354z, ist die Verwendung von Kappa-Caseinoglycopeptiden als Antisekretmittel in der Diätetik und der Ernährung beschrieben, die das Hervorrufen von Bedingungen, welche die Nutzung von Proteinen im ersten Lebensalter begünstigen, durch intravenöse oder intraintestinale Verabreichung umfaßt.
Wir haben festgestellt, daß die aus Milch stammenden Glykopeptide eine bemerkenswerte inhibierende Aktivität einerseits gegenüber der durch die Pili vom Typ 2 regulierten Hämagglutinationen und andererseits der Adhäsion von A.Viscosus, S.sanguis und S.mutans auf Kunststoffoberflächen besitzen, welche Aktivität gut über jenen liegt,wie sie mit Lactose oder Galactose beobachtet werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Kappa-Kaseinoglykopeptiden oder von deren von Sialinsäuren befreiten Derivaten als Antizahnbelagsmittel sowie von deren von Sialinsäuren befreiten Derivaten als Antizahnkariesmittel.
Die Erfindung betrifft in gleicher Weise die Verwendung von Kappa-Kaseinoglykopeptiden in Verbindung mit einem Träger, welcher für die Verabreichung auf oralem oder topischem Weg vorgesehen ist, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die zur Behandlung von Zahnkaries bestimmt ist.
In dieser Erfindung wird unter Kappa-Kaseinoglykopeptiden sowohl ein Kaseinomakroglykopeptid, welches der aus der unter Druck stattfindenden Hydrolyse von Kappa-Kasein stammende wasserlösliche Bestandteil ist, als auch ein Kaseinoglykopeptid verstanden, welches durch die Proteolyse dieses Kaseinomakroglykopeptides erhalten wird.
Unter von Sialinsäuren befreiten Derivaten werden die Derivate verstanden, welche ausgehend von den vorstehenden Glykopeptiden durch mehr oder weniger vorwärtsgetriebene Elimination der Sialinsäuren, wie der N-Acetylneuraminsäuren und N-Glycollylneuraminsäuren von Oligosaccharidketten, erhalten werden.
Eine bevorzugte Gruppe des aktiven Prinzips wird von Kappa-Kaseinomakropeptiden und deren von Sialinsäuren befreiten Derivaten gebildet, deren Aktivität über jenen von entsprechenden Verbindungen liegt,welche einer Proteolyse unterworfen wurden.
Ein solches aktives Prinzip kann hergestellt werden, indem ein aus Milch stammendes Ausgangsmaterial, welches zuvor einer Hydrolyse unter Druck unterworfen wurde, mit Trichloressigsäure auf solch eine Weise umgesetzt wird, daß ein Niederschlag und eine überstehende Lösung ausgebildet wird, die überstehende Lösung abgetrennt und einer Dialyse unterworfen wird, die genannte dialysierte überstehende Lösung gegebenenfalls durch Filtration über ein Gel gereinigt und getrocknet wird.
Als aus Milch stammendes Ausgangsmaterial können zur Information zitiert werden:
- das Produkt der unter Druck stattfindenden Hydrolyse eines nativen Kaseins, welches durch Säurefällung von entrahmter Milch durch eine Mineralsäure oder durch säurebildende Enzyme,gegebenenfalls mit Zugabe von Calciumionen erhalten wird,
- das Produkt der unter Druck stattfindenden Hydrolyse eines Kaseinates,
- eine Süßmolke (welche nach der Abtrennung von durch Druck koaguliertem Kasein erhalten wird),
- eine entmineralisierte Süßmolke, welche beispielsweise durch Elektrodialyse und/oder Ionenaustausch und/oder Umkehrosmose entmineralisiert wurde, welche mehr oder weniger von Lactose befreit ist,
- ein Molkeproteinkonzentrat, welches durch Ultrafiltration, anschließende Diafiltration (Ultrafiltration mit Auswaschen) von Süßmolke erhalten wird, wobei dieses letztgenannte Ausgangsmaterial bevorzugt wird.
Man kann die vorstehenden Milchprodukte verwenden, welche aus Milch aller weiblichen Milchtiere erhalten werden, vorzugsweise von Kühen, Ziegen oder Mutterschafen.
Die von Sialinsäuren befreiten Derivate können hergestellt werden, indem das in einem früheren Schritt erhaltene Kaseinomakroglykopeptid der Entfernung von Sialinsäuren unterworfen wird, bei welcher der Oligosaccharidrest des Makroglykopeptides von Sialinsäuren befreit wird. Dazu kann man das rohe Kaseinomakroglykopeptid, d.h. ein solches, welches zuvor nicht durch Filtration über ein Gel gereinigt wurde, mit einem Enzym behandeln, welches spezifisch die Sialinsäurereste abspaltet, beispielsweise mit einer Neuraminidase von Clostridium perfringens, anschließend das Enzym thermisch deaktivieren, die Lösung konzentrieren und sie trockenen, beispielsweise durch Lyophilisieren.
Vorzugsweise kann man die Sialinsäurereste mittels Hydrolyse durch eine Mineralsäure in wäßriger verdünnter Lösung, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, abspalten.
Welches Verfahren zur Entfernung der Sialinsäuren auch angewandt wird, man reinigt die derart erhaltenen Rohprodukte vorzugsweise durch Überführen in eine wäßrige Lösung oder Neutralisieren und Filtrieren der Lösung über ein Gel, anschließendes Konzentrieren und Trocknen der gereinigten Lösung, beispielsweise durch Lyophilisieren.
Die Kaseinoglykopeptide können hergestellt werden, indem man ein Kaseinomakroglykopeptid, welches in diesem Fall zuvor von Sialinsäuren befreit wurde, einer Hydrolyse mittels eines proteolytischen Enzyms unterwirft.
Zu diesem Zweck kann man irgendein proteolytisches Enzym verwenden, welches bei einem sauren, neutralen oder alkalischen pH-Wert wirksam ist. Das Enzym kann aus Pilzen, Mikroorganismen (beispielsweise Pronase, Alcalase), aus Pflanzen (beispielsweise Bromelin, Ficin, Papain) oder Tieren (beispielsweise Trypsin, Pepsin, Pancreatin) stammen. Nach der enzymatischen Behandlung deaktiviert man das Enzym, beispielsweise thermisch, anschließend konzentriert und trocknet man die Lösung,beispielsweise durch Lyophilisieren, und man reinigt das erhaltene Produkt vorzugsweise durch Überführen in eine wäßrige Lösung, Filtrieren über ein Gel und anschließendes Trocknen, beispielsweise durch Lyophilisieren.
Das Mittel kann in einen Konfiserieartikel, beispielsweise ein Bonbon oder einen Kaugummi, einverleibt werden. Es kann beispielsweise in einem gezuckerten Getränk aufgelöst sein.
Es kann zur Desinfizierung der Mundhöhle dienen und in einer für diese Verwendung geeigneten Form, beispielsweise mit Zucker verpreßt oder dragiert, in Form einer Tablette oder verpreßt zum Auflösen oder beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung oder Emulsion, wie einer Munddusche, vorliegen.
Es kann in einem Zahnpulver oder einer Zahnpaste einverleibt sein.
In solch einer Zusammensetzung kann das Antizahnbelags- und Antizahnkariesmittel 0,1 bis 90 Gew.-% umfassen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Soweit nichts anders angeführt, beziehen sich in diesen die Teile und Prozentsätze auf das Gewicht.

Beispiele 1 bis 6

1. Man stellt eine wäßrige Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,3 von 5 g Natriumkaseinat aus Rindern in 100 ml Wasser, welches 10 mMol Natriumphosphat und 100 mMol NaCl enthält, her. Man leert in diese Lösung 1 mg Labferment (Chymosin Sigma), welches zuvor in der Pufferlösung aufgelöst wurde. Nach der Inkubierung bei 370 während einer Stunde leert man langsam und unter Rühren eine 24%ige (Gewicht/Volumen) Lösung von Trichloressigsäure (TCA) bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 12% TCA hinzu. Es bildet sich ein Niederschlag, welchen man durch Zentrifugieren abtrennt und man sammelt die überstehende Lösung, die man gegen reines Wasser dialysiert, anschließend trocknet man das Dialysat durch Lyophilisieren. Man erhält so 0,8 g rohes Kaseinomakroglykopeptid aus Rindern.
2. Man löst 320 g eines Pulverkonzentrates von Proteinen aus Süßmolke von Rindern in 3,2 l Wasser auf. Das Konzentrat wird durch Ultrafiltration und anschließende Diafiltration von Süßmolke erhalten und beinhaltet, bezogen auf das Gewicht der trockenen Materialien, 81 % Proteine, 1,3 % Lactose, 6,3% Fett und 3,4 % Asche.
Zu dieser Lösung leert man langsam und unter Rühren 3,2 l einer 24%igen (Gewicht/Volumen) Lösung von TCA hinzu. Es bildet sich ein leichter Niederschlag in Suspension. Nachdem man die erhaltene Suspension während 15 bis 20 Minuten ruhen gelassen hat, zentrifugiert man sie bei 3.000 U/min während 15 min. Man verwendet die überschüssige Lösung, welche man gegen reines Wasser auf extensive Weise bis zu einem pH-Wert von 5 dialysiert, man engt diese bis zu einem Volumen von 500 ml ein, anschließend dialysiert man diese nochmals gegen reines Wasser, man konzentriert abermals und man trocknet durch Lyophilisieren. Man gewinnt 7,06 g rohes Kaseinomakroglykopeptid aus Rindern. Dieses nimmt man in einer 0,1 M wäßrigen Essigsäurelösung auf und leitet diese über eine Kolonne mit Sephadex G-25 ,wobei man mit einer wäßrigen 0,1 M Essigsäurelösung eluiert, man erhält nach dem Einengen und Lyophilisieren 5,52 g gereinigtes Kaseinomakroglykopeptid aus Rindern.
3. Man säuert 1 Liter entrahmte Ziegenmilch mit einer 1N wäßrigen Chlorwasserstoffsäurelösung bis zu einem pH-Wert von 4,65 an.Das Kasein fällt als feine Suspension aus. Man läßt die Suspension bei 4ºC während der Nacht ruhen. Nach Abzentrifugieren sammelt man den Niederschlag. Man suspendiert in 500 ml Wasser und gießt unter Rühren 1,7 g in 10 ml Wasser gelöstes CaCl&sub2; hinzu. Anschließend erhitzt man das Gemisch auf einem Wasserbad bis auf 35ºC und leert eine wäßrige 1N NaOH-Lösung bis zum einem pH-Wert von 6,8 hinzu. Es wird die Bildung einer Suspension beobachtet.
Unter langsamem Rühren leert man langsam eine Lösung von 250 µl Labferment in 5 ml Wasser zur Suspension hinzu, anschließend wird nach einer Stunde Rühren bei 35ºC der pH-Wert mit einer wäßrigen HCl-Lösung auf 4,5 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren entfernt man den Niederschlag und fügt zu der überstehenden Lösung eine 24%ige (Gewicht/Volumen) TCA-Lösung hinzu. Die folgenden Schritte werden wie in Beispiel 2 angegeben, ausgeführt. Man sammelt 0,25 g rohes Kaseinomakroglykopeptid aus Ziegen. Diese Verbindung kann durch Filtration über ein Gel (Sephadex G 50 ) und Eluieren mit einer 0,1 M wäßrigen Essigsäurelösung gereinigt werden, um 0,17 g gereinigtes Kaseinomakroglykopeptid aus Ziegen zu erhalten.
4. Man wiederholt das Verfahren aus Beispiel 3, wobei man von 1 l entrahmter Milch von Mutterschafen ausgeht und man erhält 0,37 g rohes Kaseinomakroglykopeptid aus Schafen, bzw. 0,23 g Produkt, welches durch Filtration über ein Gel gereinigt wurde.
5. Man verwendet Ziegenmolke, welche aus der Herstellung von Ziegenkäse stammt, die unmittelbar nach der Herstellung mit Labferment koaguliert wurde. Man mischt 3,5 l dieser Molke mit dem gleichen Volumen einer wäßrigen 24%igen (Gewicht/- Volumen) TCA-Lösung. Die folgenden Schritte werden in gleicher Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgeführt. Man erhält 1,68 g rohes Kaseinomakroglykopeptid aus Ziegen bzw. 0,66 g Produkt, welches durch Filtration über ein Gel, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, gereinigt wurde.
6. Man wiederholt das Verfahren aus Beispiel 5, wobei man von Molke von Mutterschafen ausgeht und man erhält 2,29 g rohes Kaseinomakroglykopeptid aus Schafen bzw. 1,44 g Produkt, welches durch Filtration über ein Gel, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, gereinigt wurde.

Beispiele 7 bis 10

7. Man löst 400 mg rohes Kaseinomakroglykopeptid aus Beispiel 1 in 200 ml einer wäßrigen Lösung von 50 mMol Citrat/Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 5. Man leert zu dieser Lösung 40 U Neuraminidase von Clostridium perfringens (47 mg vom Typ V, Sigma) und man inkubiert bei 37ºC während einer Stunde. Nach der thermischen Denaturierung des Enzyms konzentriert man die Lösung und trocknet sie durch Lyophilisieren. Nach Auflösung des Lyophilisates in 10 ml 10 mM Essigsäurepufferlösung filtriert man die Lösung mit wäßriger 10 mM Essigsäurelösung über ein Gel (Sephadex G 50 ). Man erhält durch Konzentrieren und anschließendes Lyophilisieren ein reines, von Sialinsäuren befreites Kaseinomakroglycopeptid.
8. Man führt an 400 mg rohem Kaseinomakroglykopeptid aus Beispiel 2 eine saure Hydrolyse unter schonenden Bedingungen durch, entweder mit Hilfe von 40 ml einer 10 mM wäßrigen HCl-Lösung (während 2 Stunden bei 80ºC) oder mit 40 ml einer 25 millimolaren wäßrigen H&sub2;SO&sub4;-Lösung (während 2 Stunden bei 80ºC). Nach Abkühlen auf Raumtemperatur neutralisiert man die Lösung mit Hilfe einer wäßrigen 0,5 N NaOH-Lösung bis zu einem pH-Wert von 7, anschließend konzentriert und lyophilisiert man die Lösung. Nach Auflösen des Lyophilisates in einer 0,1 M wäßrigen Essigsäurelösung reinigt man die Lösung durch Filtration über Sephadex G 25 -Gel mit einer 0,1 M wäßrigen Essigsäurelösung. Nach Konzentrieren und Lyophilisation erhält man ein reines, von Sialinsäuren befreites Kaseinomakroglykopeptid.
9. Man verfährt wie in Beispiel 8, wobei von rohem Kaseinomakroglykopeptid aus Beispiel 3 ausgegangen wird und man erhält ein von Sialinsäuren befreites Kaseinomakroglykopeptid aus Ziegen.
10. Man verfährt wie in Beispiel 8, wobei von rohem Kaseinomakroglykopeptid aus Beispiel 4 ausgegangen wird und man erhält ein von Sialinsäuren befreites Kaseinomakroglykopeptid aus Schafen.

Beispiele 11 bis 13

11. Man löst 2 g Rohprodukt aus Beispiel 2 in 100 ml einer wäßrigen Lösung des Puffers Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 50 mM, welche mit einer wäßrigen 1 N HCl- Lösung auf einen pH-Wert von 8,2 gebracht wurde). Nach Zugabe von 50 mg Pronase E (Merck) inkubiert man die Lösung bei 40ºC während 24 Stunden in Gegenwart von 5 ml Toluol. Man fügt neuerlich 25 mg Pronase E hinzu und inkubiert die Lösung während 48 Stunden bei 40ºC. Nach der thermischen Inaktivierung des Enzyms konzentriert man die Lösung und trocknet diese durch Lyophilisieren. Man löst das Lyophilisat in einer 0,1 M wäßrigen Essigsäurelösung, anschließend filtert man die Lösung über Sephadex G 50 -Gel und eluiert mit einer 0,1 M wäßrigen Essigsäurelösung. Nach Konzentrieren und Trocknen durch Lyophilisieren erhält man ein reines Kaseinoglykopeptid aus Rindern.
12. Man verfährt wie in Beispiel 11 mit der Proteolyse des Rohproduktes aus Beispiel 8 und man erhält ein reines, von Sialinsäuren befreites Kaseinoglykopeptid aus Rindern.
13. Man verfährt wie in Beispiel 11 mit der Proteolyse des Rohproduktes aus Beispiel 4 und man erhält ein reines Kaseinoglykopeptid aus Schafen.

Beispiele 14 bis 15

Stämme und Kulturbedingungen

Die folgenden Stämme wurden verwendet, um die Wirkung der erfindungsgemäßen Mittel nachzuweisen.
- Ein Stamm von Actinomyces naeslundii ATCC 12104.
- Zwei Stämme von Actinomyces viscosus (OMZ 105 und OMZ 206), ein Stamm von Streptococcus sanguis (OMZ 9) und ein Stamm von Streptococcus mutans (OMZ 176), welche von Prof. Dr.B. Guggenheim, Abteilung für Orale Mikrobiologie und Allgemeine Immunologie, Zahnärztliches Institut, Universität Zürich, Schweiz, erhalten wurden.
Für die Versuche zur Hemmung von Hämaglutination (Beispiel 14), wurden die Stämme von Actinomyces (A.naeslundii ATCC 12104 und A.viscosus OMZ 105) in einem handelsüblichen Medium ("Actinomyces broth", BBL, Becton, Dickinson & Co, oder Difco Laboratories) kultiviert. Für die Versuche, welche ohne Kontrolle der bakteriellen Wachstumsphase (Tabelle I) ausgeführt wurden, wurde dieses Medium durch Zugabe von Natriumthioglykolat (0,05%) ergänzt und die Bakterien wurden nach einem einmaligen Durchgang gesammelt. Für die Versuche, welche mit einem Stamm durchgeführt wurden, der in der Phase des exponentiellen Wachstums gesammelt wurde (Tabelle II), wurde ein erster Durchgang von 24 Stunden, gefolgt von einem zweiten Durchgang von 16 Stunden verwendet, wobei beim zweiten Mal das Medium nicht ergänzt wurde.
Für die Versuche zur Hemmung der Adhäsion auf der Oberfläche von Kunststoffmaterialien (Beispiel 15) wurden die Stämme von A.viscosus (OMZ 105 und OMZ 206) 36 Stunden im gleichen (nicht ergänzten) Medium kultiviert. Die Stämme von Streptococcus (S.sanguis OMZ 9 und S.mutans OMZ 176) wurden 24 Stunden in einem anderen handelsüblichen Medium ("Brain- Heart Infusiont", Difco), welches durch Glucose (0,5 %) ergänzt wurde, kultiviert.

14. Hemmung der Hämagglutination, welche durch Stämme von Actinomyces hervorgerufen wird, in Gegenwart von Kappa-Kaseinoglykopeptid und -derivaten.

Nach dem Sammeln werden die Bakterien mit Salzwasser (0,9 % NaCl) gewaschen und die Suspensionen werden auf eine optische Dichte (DO) von 8 eingestellt.
Die menschlichen Erythrozyten (Gruppe AR+) wurden mit Hilfe der Neuraminidase von Vibrio cholera (Behring) unmittelbar vor ihrer Verwendung in den Testversuchen von Sialinsäuren befreit. Nach mehrmaligem Waschen wurden sie in einer Konzentration von 1% in Salzwasser suspendiert, welches bereits 1% Methyl-α-Mannosid enthielt.

Bewertung des Hämagglutinationstiters:

Auf einer "Mikro- Titer"-Platte wurden Portionen von 50 µl der vorstehend beschriebenen Bakteriensuspensionen, welche in Verdünnungsreihen von je 2 und 2 angeordnet waren, mit Portionen (50 µl) der Erythrocytensuspension vermischt, welche in der gleichen vorstehend beschriebenen Weise von Sialinsäuren befreit worden war. Die Ablesungen erfolgten nach einer Stunde der Immobilisierung bei Umgebungstemperatur.

Tests betreffend die Hämagglutinationshemmung:

Diese Tests wurden durch Vermischen von 25 µl der Bakteriensuspension, welche 4 Hämaglutinationsdosen entsprechen (der Titer wurde durch das vorstehende Experiment bestimmt), 50 µl der bereits beschriebenen Erythrozythensuspension und 25 µl einer Salzlösung, welche Verdünnungsreihen von je 2 und 2 der verschiedenen Inhibitoren enthielt, durchgeführt. Notwendigenfalls wurde der pH-Wert der Inhibitorsuspensionen mit einer 0,5 N wäßrigen NaOH-Lösung vor dem Durchführen des Vermischens auf 7 eingestellt. Die Ablesungen erfolgten nach einer Stunde der Immobilisierung bei Umgebungstemperatur. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen I und II angeführt. Tabelle I Hemmung der Hämagglutination von menschlichen Erythrozyten (A&spplus;), welche von Sialinsäuren befreit sind Konzentrationa) (mg/ml) Produkt A. viscosus A.naeslundii Beispiel Lactose (zum Vergleich) Legende: a) Minimalkonzentration, welche zu einer vollständigen Hemmung der Hämagglutination fürt. b) Keine Hemmung bis zu 20 mg/ml. Tabelle II Hemmung der Hämagglutination von menschlichen Erythrozyten (A&spplus;), welche von Sialinsäuren befreit sind, durch A.viscosus OMZ, welcher in der exponentiellen Phase gewonnen wurde) Konzentrationa) (mg/ml) Produkt ausgedrückt in Trockengewicht/ml ausgedrückt in Galactosidäquivalent/ml Aktivität relativ zu Beispiel 12 als Referenz (x-mal) Beispiel Lactose (zum Vergleich) Legende: vgl. Tabelle I
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die verschiedenen erfindungsgemäßen Mittel sehr starke Inhibitoren der durch die Pili vom Typ 2 regulierten Hämagglutination sind. Die Tabelle II veranschaulicht insbesondere die sehr starke Aktivität von Kaseinomakroglykopeptid aus Rindern, welches von Sialinsäuren befreit wurde (nach Beispiel 8). Unter den Versuchsbedingungen ist der bekannte Inhibitor der durch die Pili regulierten bakteriellen Adhäsion (Lactose) völlig unwirksam.

15. Hemmung der Adhäsion von Stämmen von A.viscous, S.sanguis und S.mutans auf einer Oberfläche aus Kunststoffmaterial in Gegenwart von Kappa-Kaseinoglykopeptiden aus Rindern und deren Derivaten

Nach ihrer Gewinnung wurden die Bakterien mit einer wäßrigen Pufferlösung (0,9 % NaCl, 1mM Tris, 0,1 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM MgCl&sub2;, 0,02% NaN&sub3;) gewaschen und die Suspensionen wurden auf eine DO von 0,4 eingestellt. Im Fall von A.viscosus OMZ 206 mußte die Suspension nach 6 Stunden Wachstum in der vorstehenden Pufferlösung wieder auf eine DO von 0,4 eingestellt werden. Anteile von 1 ml dieser Bakteriensuspensionen wurden in Polypropylenröhrchen übergeführt, welche keine oder die verschiedenen zu bewertenden Verbindungen enthielten. Diese Suspensionen wurden in der Folge während 10 Sekunden pro Stunde gerührt. Nach 4 Stunden und in jedem einzelnen Fall wurde die DO der entstandenen Suspension nach Umgießen gemessen. Der Unterschied zwischen der ursprünglichen und der verbleibenden DO wurde abschließend mit der DO der Ausgangsuspension in Beziehung gebracht (% Adhäsion). Das Verhältnis zwischen den Resultaten, welche in Gegenwart und unter Fehlen des Inhibitors erhalten wurden, erlaubte es, in jedem einzelnen Fall den Prozentsatz der Hemmung zu berechnen. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen III und IV angeführt. TABELLE III Adhäsion und Hemmung der Bakterienadhäsion auf Kunststoffröhrchen S.sanguis S.mutans A.viscosus Prodükt Adhäsion (%) Keines (Kontrolle) Hemmung (%) Beispiel Lactose Galactose α-Methylmannosid Polyglutaminsäure Polylysin a) Im Fall dieser beiden Stämme haben vorhergehende Versuche die Spezifität der hemmenden Wirkung von Caseino-Makroglycopeptiden und ihren Derivaten aus Rindern, welche von Sialinsäuren befreit sind, im Vergleich zur nicht-vorhandenen Aktivität von Glukose und Glycin in diesem experimentellen System gezeigt. b) Mit jedem dieser vier Stämme wurde in anderen Versuchen gezeigt, daß diese inhibierende Wirkung der Caseino-Makroglycopeptide und ihrer Derivate aus Rindern, welche von Sialinsäuren befreit sind, durch das Vorhandensein verschiedener Konzentrationen (0,05, 0,1, 0,2 und 0,5 %) von Ernährungszuckern (Glukose, Saccharose, Stärke und Fruktose) nicht beeinträchtigt wird. c) n.t. = nicht untersucht. TABELLE IV Hemmung der Adhäsion von S.sanguid OMZ 9 und S.mutans OMZ 176 auf Kunststoffröhrchen bei der Konzentration von 100 ug/ml Hemmung, % Produkt S.Sanguis OMZ 9 S.mutans OMZ 176 Beispiel
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Mittel gegen eine Adhäsion auf einer Oberfläche aus Kunststoffmaterial wirksam sind, was ebenso die Streptococci-Stämme wie jene von Actinomyces betrifft. Solche ein experimentelles Modell ist für die Situation, welche in der Mundhöhle vorherrscht repräsentativ.
Die zum Vergleich untersuchte Lactose und Galactose zeigten keineswegs das gleiche Aktivitätsniveau.

Claims

1. Verwendung von Kappa-Kaseinoglykopeptiden oder von deren von Sialinsäuren befreiten Derivaten als Antizahnbelagsmittel.

2. Verwendung von Kappa-Kaseinoglykopeptiden in Verbindung mit einem Träger, welcher für die Verabreichung auf oralem oder topischem Weg vorgesehen ist, um eine zur Behandlung von Zahnkaries bestimmte Zusammensetzung zu erhalten.

3. Verwendung von Kappa-Kaseinoglykopeptidderivaten, welche von Sialinsäuren befreit sind, als Antizahnkariesmittel.

4. Verwendung eines Kaseinomakroglykopeptids aus Rindern, Schafen oder Ziegen nach Anspruch 1 oder 2.

5. Verwendung eines von Sialinsäuren befreiten Kappa-Kaseinoglykopeptidderivates aus Rindern, Schafen oder Ziegen nach Anspruch 1 oder 3.

6. Verwendung eines von Sialinsäuren befreiten Kaseinomakroglykopeptidderivates aus Rindern nach Anspruch 5.