FI88578B

FI88578B - Antiplack- och kariesblandning

Info

Publication number: FI88578B
Application number: FI880464A
Authority: FI
Inventors: Jean-Richard Neeser
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1987-02-26
Filing date: 1988-02-02
Publication date: 1993-02-26
Also published as: FI88578C; EP0283675B1; ES2039484T3; EP0283675A2; US4992420A; CH671879A5; JPS63233911A; DE3878951D1; JP2760429B2; ZA88798B; NZ223400A; FI880464A; DE3878951T2; ATE86475T1; US4994441A; EP0283675A3; FI880464A0

Description

1 88578

Plakin ja karieksen vastainen seos - Antiplack- och karies-blandning

Keksinnön tavoitteena on estää hanunasplakkeihin ja -kariekseen syynä olevien bakteereiden kiinnittyminen.

Actinomyces viscosus ja Streptococcus sanauis ovat suuonteloa asuttavia bakteereita, jotka ovat syynä hammasplakin liikkeellelähtöön ja muodostumiseen. Yhdessä Actinomyces naeslundii-bakteerin kanssa ne muodostavat bakteeriryhmän, joka kykenee asuttamaan ennen kaikkea suuontelon. Niillä on johtava osuus tapaussarjassa, joka johtaa hammasplakkiin liittyviin tauteihin, kuten juurikariekseen, ientulehdukseen, juurikalvon tulehdukseen ja paradontolyysiin. Streptococcus mutans on lisäksi pääasiallinen hammaskariekseen liittyvä patogeeni, joka kasvaa hammasplakin käynnistyttyä.

Niistä tekijöistä, jotka osallistuvat mekanismiin, jolla A. viscosus ja S. sanauis-kannat muodostavat hammasplakin, mainittakoon niiden ominaisuus kiinnittyä posken epitelia-soluihin, syljen päällystämien hampaiden pintaan ja niiden taipumus muodostaa kasautumia keskenään ja A. naeslundii-bakteereiden kanssa. Vaikkakin nämä mekanismit ovat äärimmäisen monimutkaisia, A. naeslundii-bakteerin on havaittu tunnistavan galaktoosia tai galaktosamiinia sisältävän reseptorin epiteliasoluilla samoin A. viscosus-bakteerin ekspressoiman kiinnittymiskyvyn avulla, josta käytetään nimitystä tyypin 2 pilit. Muissa töissä on osoitettu, että S. sanauis-bakteerin ja näiden kahden Actinomyces-lajin väliset kasautumisreaktiot saattavat myös perustua tyypin 2 pilien/galaktoosin tunnista-• mi seen.

Yksinkertaistettuna näyttää toisaalta siltä, että tekniikan tason mukaisesti tyypin 2 pii ien ohjaaman bakteereiden kiin nittymisen tavanomainen inhibiittori on laktoosi, joka toimii 2 88578 galaktoosiosansa kautta. Toisaalta harranasplakin muodostumiselle ovat oleellisia muihin tekijöihin perustuvat kiinnitty-mismekanismit, esimerkiksi hampaiden kiinteän pinnan mukaanottaminen.

Patenttijulkaisun US-PS 4.579.736 kohteena on menetelmä, jolla valmistetaan faktoria, joka estää hammasplakin muodostumiseen syynä olevien bakteereiden, S. sanouis ja A. viscosus. kasvun ja metabolian. Tässä menetelmässä hajotetaan Actinobacillus actinomycetemcomitans-bakteerin (joka on juuri kalvon tulehduksen loppuvaiheessa oleva bakteeri) soluseinät ultraääni-käsittelyn avulla ja kyseessä oleva faktori otetaan talteen sentrifugoimalla ja dekantoimalla supernatantti-nestefaasi, tämä puhdistetaan dialysoimal1 a ja kuivataan pakkaskuivaa-malla. Julkaistu eurooppalainen patenttihakemus 184.121 koskee hammashoidon lisäainetta, joka on tarkoitettu lisättäväksi sakkaroosia sisältäviin elintarvikkeisiin ja lääkeaineisiin ja joka muodostuu oleellisesti laktoosin ja galaktoosin seoksesta, joka on saatu fermentoimalla heraa Lactobacillus leichmannii-bakteerilla.

Olemme havainneet, että maidosta peräisin olevilla glykopepti-deillä on huomattava kyky estää toisaalta tyypin 2 pilien ohjaamia hemaglutinaatioita ja toisaalta A. viscocus, S. sanouis ja S. mutans-bakteereiden kiinnittymistä muovimateriaalien pinnalle. Niiden aktiivisuus tässä suhteessa on selvästi pienempi kuin mitä on havaittu olevan laktoosilla tai galak-toosi11 a.

Esillä olevan keksinnön kohteena on aineseos plakkia ja kariesta vastaan sekä niiden muodostuksen esitämiseksi poskionteloissa, joka on tunnettu siitä, että se muodostuu oleellisesti aktiivisesta komponentista, joka on valittu kappa-kaseiini-glykopeptideistä ja niiden desialyloiduista johdoksista.

Keksinnön mukaisesti ymmärretään kappa-kaseiini-glykopep- i 3 88578 tidellä sekä kaseiini-makroglykopeptidiä, joka on kappa-kaseiinin juoksutehydrolyysistä saatu vesiliukoinen komponentti, että kaseiini-glykopeptidiä, joka on saatu tämän kaseiini-makroglykopeptidin proteolyysistä.

Desialyloiduilla johdoksilla tarkoitetaan johdoksia, jotka on saatu edellisistä glykopeptideistä poistamalla oligosak-karidiketjuista enemmän tai vähemmän täydellisesti sialiini-hapot, so. N-asetyylineuramiini- ja N-glykolyylineuramiini- hapot.

Yksi hyvänä pidetty ryhmä aktiivisia komponentteja muodostuu kappa-kaseiini-makropeptideistä ja niiden desialyloiduista johdoksista, joilla on suurempi aktiivisuus kuin vastaavilla yhdisteillä, jotka ovat olleet proteolyysin kohteina.

Eräs tällainen aine voidaan valmistaa saattamalla maitope-räinen lähtöaine, joka on hydrolysoitu juoksutteella, reagoimaan trikloorietikkahapon kanssa, jolloin muodostuu sakkaa ja supernatanttifaasi, erottamalla supernatantti-faasi, dialysoimalla supernatanttifaasi, valinnaisesti puhdistamalla dialysoitu supernatanttifaasi geelisuoda-tuksen avulla ja kuivaamalla suodatettu tuote.

Maitoperäisiin sopiviin lähtöaineisiin kuuluvat: - natiivin kaseiinin, joka on saatu happosaostamalla kuorittu maito mineraalihapon tai happameksi tekevien fermenttien avulla, juoksutehydrolyysin tuote, johon valinnaisesti on lisätty kalsiumioneja, - kaseinaatin juoksutehydrolyysistä saatu tuote, - makea hera (joka saadaan sen jälkeen, kun judksutteella koaguloitu kaseiini on erotettu), - makea hera, joka on demineralisoitu esimerkiksi elektro-dialysoimalla ja/tai ionivaihtamalla ja/tai käänteisos-moosin avulla ja josta on poistettu laktoosi enemmän tai vähemmän, 4 88578 - heraproteiinien konsentraatfci., joka on saatu ultrasuodat-tamalla ja diasuodattamalla (ultrasuodatus, jossa pesu) makea hera, jolloin tämä jälkimmäinen lähtöaine on erityisen suositeltu.

Menetelmässä on mahdollista käyttää edellä mainittuja meijerituotteita, jotka on saatu minkä tahansa maitoa tuottavan naaraseläimen, mieluummin lehmien, vuohien tai lampaiden maidosta.

Desialyloidut johdokset voidaan valmistaa kohdistamalla saatuun kaseiini-makropeptidiin myöhemmin tapahtuva de-sialylointivaihe, jossa makroglykopeptidin oligosakkaridi-komponentista poistetaan sialiinihapot. Puhdistamaton kaseiini-makroglykopeptidi, jota edeltäkäsin ei ole puhdistettu geelisuodattamalla, voidaan tätä tarkoitusta varten käsitellä entsyymillä, joka erityisesti lohkaisee pois sialiinihapporyhmät, esimerkiksi Clostridium perfrinqens-bakteerin neuraminidaasilla, minkä jälkeen entsyymi: deakti-voidaan lämmön avulla ja liuos väkevöidään ja kuivataan, esimerkiksi pakkaskuivaamalla.

Sialiinihapporyhmät voidaan edullisesti lohkaista pois hydrolysoimalla mineraalihapolla laimeassa vesiliuoksessa, esimerkiksi suolahapolla tai rikkihapolla.

Käytetystä desialylointimenetelmästä riippumatta on suositeltavaa puhdistaa saadut puhdistamattomat tuotteet tarvittavaan puhtauteen liuottamalla uudelleen veteen tai neutraloimalla ja geelisuodattamalla liuos ja tämän jälkeen väkevöimällä ja kuivaamalla puhdistettu liuosesimerkiksi pakkaskuivaamalla.

Kaseiini-glykopeptidit voidaan valmistaa hydrolysoimalla proteolyyttisellä entsyymillä mahdollisesti desialyloitu kaseiini-makroglykopeptidi.

5 88578 Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää mitä tahansa proteolyyt-tistä entsyymiä, joka on aktiivinen happamessa, neutraalissa tai alkalisessa pH-arvossa. Entsyymi voi olla peräisin sienestä, mikrobista (esimerkiksi bronaasi, alkalaasi), kasvista (esimerkiksi bromeliini, fisiini, papaiini) tai eläimestä (esimerkiksi trypsiini, pepsiini, pankreatiini). Entsymaat-tisen käsittelyn jälkeen entsyymi deaktivoidaan, esimerkiksi lämmön avulla. Tämän jälkeen liuos väkevöidään ja kuivataan, esimerkiksi pakkaskuivaamalla, ja saatu tuote mieluummin puhdistetaan liuottamalla uudelleen veteen, geelisuodattamal1 a ja kuivaamalla, esimerkiksi pakkaskuivaamal1 a.

Esillä olevan keksinnön kohteena on myös elintarvike-, farmaseuttinen tai kosmeettinen seos, joka sisältää plakin vastaista ja karieksen vastaista ainetta.

Tätä ainetta voidaan laittaa mukaan makeistuotteeseen, esimerkiksi makeiseen tai purukumiin. Se voidaan liuottaa esimerkiksi makeutettuun juomaan.

Sitä voidaan käyttää suuontelon desinfiointiin ja se voidaan tehdä mihin tahansa tähän käyttöön sopivaan muotoon, esimerkiksi imettäväksi tarkoitetuksi tabletiksi tai pastilliksi, liukoiseksi tabletiksi tai kuutioksi tai suun huuhteluaineena toimivaksi vesiliuokseksi tai -emulsioksi.

Sitä voidaan laittaa mukaan hammas jauheeseen tai hammastahnaan.

Plakin vastainen ja karieksen vastainen aine voi muodostaa 0,1 - 90 paino-% tällaisesta seoksesta.

Keksintöä on havainnollistettu seuraavilla esimerkeillä, joissa painot ja prosentit on laskettu painosta, ellei 6 88578 toisin ole mainittu.

ESIMERKIT 1-6 1. Vesipitoinen puskuriliuos, pH 6,3, valmistetaan 5 g:sta nautaperäistä natriumkaseinaattia ja 100 ml:sta vettä, joka sisältää 10 mM natriumfosfaattia ja 100 mM natriumkloridia. tähän liuokseen lisätään 1 mg juoksutetta (chymosine, Sigma), joka on edeltäkäsin liuotettu puskuriliuokseen. Inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa, minkä jälkeen lisätään hitaasti ja sekoittaen 24-prosenttista (paino/tiLavuus) trikloorietikkahapon (TCA) liuosta niin, että trikloorietikkahapon loppukonsentraatioksi saadaan 12 %. Muodostuva sakka erotetaan sentrifugoimalla, minkä jälkeen supernatanttifaasi otetaan talteen ja dialysoidaan puhdasta vettä vasten ja dialysaatti kuiva*· taan pakkaskuivaamalla. Tällä tavoin saadaan 0,8 g puhdistamatonta naudan kaseiini-makroglykopeptidiä.

2. 320 g jauhemaista proteiinikonsentraattia nautaperäi-sestä makeasta herasta liuotetaan 3,2 litraan vettä. Konsentraatti on saatu ultrasuodattamalla ja diasuodat-tamalla makeaa heraa. Se sisältää 81 % proteiineja, 1,3 % laktoosia, 6,3 % rasvaa ja 3,4 % tuhkaa laskettuna kuiva-aineen painosta.

Tähän liuokseen lisätään hitaasti ja samalla sekoittaen 3,2 1 24-prosenttista (paino/tilavuus) TCA-liuosta. Muodostuu kevyt suspensiomainen sakka. Saadun suspension annetaan seistä 15 - 20 minuuttia, minkä jälkeen sitä sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 3000 kierr./min. Supernatanttifaasi otetaan talteen ja dialysoidaan perinpohjaisesti puhdasta vettä vasten, pH 5, väkevöidään 500 mlrksi, dialysoidaan uudelleen puhdasta vettä vasten, väkevöidään uudelleen ja kuivataan pakkaskuivaamalla. Talteen saadaan 7,06 g puhdistamatonta naudan kaseiini-makroglykopeptidiä. Liuotetaan uudelleen 0,1 M etikka- i 7 88578 ( R) hapon vesiliuokseen ja johdetaan Sephadex G-25 - pylvään läpi eluoimalla 0,1 M etikkahapon vesiliuoksella, tämän jälkeen väkevöidään ja pakkaskuivataan, jolloin saadaan 5,52 g puhdistettua naudan kaseiini-makroglyko-peptidiä.

3.11 vuohen kuorittua maitoa tehdään happameksi 1 N suolahapon vesiliuoksella pH-arvoon 4,65. Kaseiini saostuu hienojakoisena suspensiona. Suspension annetaan seistä yön yli 4°C:ssa. Sentrifugoinnin jälkeen sakka otetaan talteen ja suspendoidaan 500 ml:aan vettä, johon sen jälkeen lisätään sekoittaen 1,7 g kalsiumkloridia liuotettuna 10 ml:aan vettä. Tämän jälkeen vesiseos kuumennetaan vesihauteella 35°C:een ja lisätään 1 N natriumhydroksidin vesiliuosta pH-arvoon 6,8. Tällöin havaitaan muodostuvan suspensio. Suspensioon lisätään hitaasti liuos, jossa on 250 μΐ juoksutetta 5 ml:ssa vettä, samalla hitaasti sekoittaen ja tämän jälkeen sekoitetaan 1 tunti 35°C:ssa, minkä jälkeen pH säädetään arvoon 4,5 suolahapon vesiliuoksella. Sentrifugoinnin jälkeen sakka poistetaan ja supernatanttifaasiin lisätään 24-prosenttista (paino/tilavuus) TCA-liuosta. Tämän jälkeen toimitaan esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.

Talteen saadaan 0,25 g puhdistamatonta vuohi-kaseiini-makroglykopeptidiä. Tämä yhdiste voidaan puhdistaa geelisuodattamalla (Sephadex G 50' ) eluoimalla etikkahapon 0,1 M vesiliuoksella, jolloin saadaan 0,17 g puhdistettua vuohi-kaseiini-makroglykopeptidiä.

4. Lähtemällä 1 litrasta kuorittua naaraslampaan maitoa ja käyttämällä esimerkissä 3 kuvattua menettelyä saadaan 0,37 g puhdistamatonta lammas-kaseiini-makroglykopeptidiä tai 0,23 g geelisuodattamalla puhdistettua tuotetta.

5. Vuohihera, jota saadaan juoksutteella koaguloidusta vuohen juuston valmistuksesta, otetaan välittömästi 8 88578 talteen valmistamisen jälkeen. 3,5 1 tätä heraa sekoitetaan saman tilavuuden kanssa 24-prosenttista (paino/tilavuus) vesipitoista TCA-liuosta. Toimimalla edelleen täsmälleen esimerkissä 2 kuvatulla tavalla saadaan 1,68 g puhdista-matonta vuohi-kaseiini-makroglykopeptidiä tai 0,66 g puhdistettua tuotetta esimerkissä 3 kuvatun geelisuodatta-misen jälkeen.

6. Lähtemällä lammasherasta ja käyttämällä esimerkissä 5 kuvattua menettelyä saadaan 2,29 g puhdistamatonta lammas-kaseiini-makroglykopeptidiä tai 1,44 g puhdistettua tuotetta esimerkissä 3 kuvatun geelisuodatuksen jälkeen.

ESIMERKIT 7-10 7. 400 mg esimerkin 1 puhdistamatonta kaseiini-makroglyko- peptidiä liuotetaan 200 ml:aan sitraatti/fosfaattipuskurin 50 mM vesiliuosta pH-arvossa 5. Tähän liuokseen lisätään 40 yksikköä Clostridium peririnqens-bakteerin neuramini-daasia (47 mg tyyppiä V, Sigma) ja sen jälkeen liuosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Entsyymi denaturoidaan lämmön avulla, minkä jälkeen liuos väkevöidään ja kuivataan pakkaskuivaamalla. Lyofilisaatti liuotetaan 10 ml:aan etikkahapon 10 mM puskuriliuosta ja tämän jälkeen liuos geelisuodatetaan (Sephadex G 50 ) käyttämällä etikka- hapon 10 mM vesiliuosta. Puhdas desialyloitu kaseiini-makroglykopeptidi saadaan väkevöimällä ja pakkaskuivaamalla.

8. 400 mg esimerkin 2 puhdistamatonta kaseiini-makro-glykopeptidiä happohydrolysoidaan kontrolloiduissa olosuhteissa, joko 40 ml:11a 10 mM vesipitoista HCl-liuosta (2 tuntia 80°C:ssa) tai 40 ml:lla 25 mM vesipitoista HjSC^-liuosta tuntia 80°C:ssa). Ympäristön lämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen liuos neutraloidaan pH-arvoon 7 0,5 N natriumhydroksidin vesiliuoksella, väkevöidään ja pakkaskuivataan. Sen jälkeen, kun lyofilisaatti on 9 88578 liuotettu etikkahapon 0,1 M vesiliuokseen, liuos puhdiste-taan geelisuodattamalla (Sephadex G 25 1 ') käyttämällä etikkahapon 0,1 M vesiliuosta. Väkevöinnin ja pakkaskuivauk-sen jälkeen saadaan puhdasta desialyloitua kaseiini-makroglykopeptidiä.

9. Lähtemällä esimerkin 3 puhdistamattomasta kaseiini-makroglykopeptidistä ja toimimalla esimerkissä 8 kuvatulla tavalla saadaan desialyloitua vuohi-kaseiini-makroglykopep-tidiä.

10. Lähtemällä esimerkin 4 mukaisesta puhdistamattomasta kaseiini-makroglykopeptidistä ja toimimalla esimerkissä 8 kuvatulla tavalla saadaan desialyloitua lammas-kaseiini-makroglykopeptidiä.

ESIMERKIT 11-13 11. 2 g esimerkin 2 puhdistamatonta tuotetta liuotetaan 100 ml:aan tris-HCl-puskurin vesiliuosta (tris-(hydroksi-metyyli)-aminometaani, 50 mM, säädetty pH-arvoon 8,2 1 N suolahapon vesiliuoksella). Liuokseen lisätään 50 mg Pronase E-entsyymiä (Merck), minkä jälkeen sitä inkuboidaan 24 tuntia 40°C:ssa, kun mukana on 5 ml tolueenia. Lisätään vielä 25 mg Pronase E-entsyymiä ja liuosta inkuboidaan 48 tuntia 40°C:ssa. Entsyymin lämpöinaktivoinnin jälkeen liuos väkevöidään ja kuivataan pakkaskuivaarna 11a. Lyofilisaatti liuotetaan etikkahapon 0,1 M vesiliuokseen, minkä jälkeen liuos geelisuodatetaan ( R) (Sephadex G 50' ) ja eluoidaan etikkahapon 0,1 M vesi- liuoksella. Väkevöinnin ja pakkaskuivaamisen jälkeen saadaan puhdasta nauta-kaseiini-glykopeptidiä.

12. Esimerkin 8 mukaisen puhdistamattoman tuotteen proteolyysi esimerkissä 11 kuvatulla tavalla antaa ·." puhdasta, desialyoitua nauta-kaseiini-glykopeptidiä.

10 88578 13. Esimerkin 4 mukaisen puhdistamattoman tuotteen proteolyysi esimerkissä 11 kuvatulla tavalla antaa puhdasta lammas-kaseiini-glykopeptidiä.

ESIMERKIT 14-15

Kannat ja viljelyolosuhteet

Keksinnön mukaisten aineiden vaikutuksen testaamiseen käytettiin seuraavia kantoja: - Yksi Actinomyces naeslundii-kanta, ATCC 12104.

- Kaksi Actinomyces vlscosus-kantaa (OMZ 105 ja OMZ 206), yksi Streptococcus sanquis-kanta (OMZ 9) ja yksi Streptococcus mutans-kanta (OMZ 176), joiden sijaintipaikka: Prof. Dr. B. Guggenheim, "Abteilung fiir Orale Mikrobiologie und Allgemeine Immunologie, Zahnärtztliches Institut, Universität Zurich, Sveitsi (Department of Oral Microbiology and General Immunology, Dental Institute, University of Zurich, Sveitsi)".

Hemaglutinaation inhibiitiotestejä varten (esimerkki 14) viljeltiin Actinomyces-kantoja (A. naeslundii ATCC 12104 ja A. viscosus OMZ 105) kaupallisessa alustassa ("Actinomyces-liemi", BBL, Becton, Dickinson % Co., tai Difco Laboratories). Testejä varten, jotka suoritettiin kontrolloimatta bakteerien kasvuvaihetta (taulukko I), tämä alusta täydennettiin lisäämällä natriumtiogly-kolaattia (0,05 %) ja bakteerit otettiin talteen yhden ainoan vaiheen jälkeen. Testejä varten, jotka suoritettiin käyttämällä eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa talteenotettua kantaa (taulukko II), ensimmäinen vaihe kesti 24 tuntia, minkä jälkeen suoritettiin toinen 16 tunnin vaihe kummassakin tapauksessa edellä mainitussa täydentämättömässä alustassa.

11 88578

Testejä varten, joissa määritettiin muovimateriaalin pintaan tapahtuvan adheesion inhibiitio (esimerkki 15), viljeltiin A. vlscosus-kantoja (OMZ 105 ja OMZ 206) 36 tuntia samassa alustassa (täydentämätön). Streptococcus-kantoja (S. sanguis OMZ 9 ja S. mutans OMZ 176) viljeltiin 24 tuntia toisessa kaupallisessa alustassa ("Aivo-sydän-infuusio", Difco), joka oli täydennetty glukoosilla (0,5 %).

14. Actinomyces-kantojen aiheuttaman hemaqlutinaation inhibiitio kappa-kaseiini-glykopeptidin ja sen johdosten läsnäollessa

Bakteereiden talteenoton jälkeen ne pestiin suolavedellä (0,9 % NaCl) ja suspensiot säädettiin optiseen tiheyteen (OD) 8.

Ihmisen erytrosyytit (gr. AR+) desialyloitiin Vibrio chlolera (Behring)-neuraminidaasilla juuri ennen niiden esteissä käyttöä. Usean pesun jälkeen ne suspendoitiin 1 % konsentraatiossa suolaveteen, joka jo sisälsi 1 % metyyli a-mannosidia.

Hemaglutinaatio-tiitterin määrittäminen; "Mikro-tiitteri"-levyllä sekoitettiin 50 y.1 suuruiset erät edellä kuvattuja bakteerisuspensioita, jotka oli ryhmitelty 2:2-laimennussarjoihin, edellä kuvatulla tavalla desialyloitujen erytrosyyttien suspension erien (50 jul) kanssa. Lukemat otettiin sen jälkeen, kun oli immobilisoitu 1 tunti ympäristön lämpötilassa.

Hemaqlutinaatio-inhlbiitiotestit: Nämä testit suoritettiin sekoittamalla keskenään 25 -:· p.1 bakteerisuspensiota, joka vastasi neljää hemaglutinoivaa 12 38578 annosta (tiitteri määritettiin edellä olleella testillä), 50 ui jo kuvattua erytrosyyttisuspensiota ja 25 ui suolaliuosta, joka sisälsi eri inhibiittoreita 2:2— laimennussarjoja. Inhibiittoreiden suspensioiden pH säädettiin tarvittaessa ennen sekoittamista pH-arvoon 7 0,5 N natriumhydroksidin vesiliuoksella. Lukemat otettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 1 tunti ympäristön lämpötilassa. Tulokset on annettu seuraavissa taulukoissa I ja II:

Taulukko I

Desialyloitujen ihmiserytrosyyttien (A+) hemaglutinaation inhibiitio

Tuote Konsentraatio a* (mg/1) A. viscosus A. naeslundii OMZ 105 ATCC 12104

Esimerkki 2 0,63 1,25

Esimerkki 8 0,94 1,88

Esimerkki 11 5 10

Esimerkki 12 2,5 5

Esimerkki 4 4,75 9,5

Esimerkki 10 1,13 2,25

Esimerkki 13 1,88 3,75

Esimerkki 3 1,75 3,5

Esimerkki 9 1,25 2,5

Laktoaasi ei*5* ei*5* (vertailu)

Selitykset a) Pienin konsentraatio, joka täydellisesti estää hemaglutinaation.

b) Ei mitään inhibiitiota 20 mg/ml annokseen asti.

13 38578

Taulukko II

A-viscosus OMZ-kannan (otettu talteen eksponentiaalivaiheessa) aiheuttama deslalyloitumlnen lhmlserytrosyyttlen (A+) hemaqlutlnaation lnhiblitlo a )

Tuote Konsentraatlo (mq/ml)

Ilmoitettu kuiva- Ilmoitettu ga- Aktiivisuus painona/ml laktosidiekvi- suhteessa ver- valentteina/ml tailuna käytet tyyn esimerkkiin (x kertaa)

Esimerkki 2 5 0,36 3

Esimerkki 8 0,075 0,008 120

Esimerkki 11 15 2,12 0,5

Esimerkki 12 4,5 0,97 1

Esimerkki 6 eib* >0,34

Esimerkki 10 5 0,23 4

Esimerkki 5 ei*3^ >1,46

Laktoosi ei*^ >10 (vertailu)

Selitykset: kts. taulukko I

Edellä olevista tuloksista voidaan havaita, että eri keksinnön mukaiset aineet ovat erittäin voimakkaita tyypin 2 pilien ohjaamien hemaglutinaatioiden inhibiittoreita.

Taulukko II osoittaa erityisen selvästi desialyloidun nauta-kaseiini-makroglykopeptidin (esimerkistä 8) erittäin voimakkaan aktiivisuuden. Testeissä käytetyissä olosuhteissa tunnettu näiden pilien ohjaaman bakteereiden kiinnittymisen inhibiittori (laktoosi) on täysin tehoton.

14 88578 15. A. viscosus, S. sanguis ja S. mutans-kantojen muovimateriaalin pintaan tapahtuvan kiinnittymisen inhiblitio nauta-kappa-kaseiini-qlykopeptidien ja niiden johdosten läsnäollessa

Talteenoton jälkeen bakteerit pestiin vesipitoisella puskuriliuoksella (0,9 % NaCl, 1 mM Tris, 0,1 mM CaC^, 0,1 mM MgC^, 0,02 % NaN^) ja suspensiot säädettiin optiseen tiheyteen 0,4. A. viscosus OMZ 206-kannan tapauksessa suspensio oli säädettävä uudelleen optiseen tiheyteen 0,4 6 tunnin kasvun jälkeen edellä mainitussa puskuriliuoksessa. 1 ml osat näitä bakteerisuspensioita dekantoitiin polypropyleeniputkiin, jotka sisälsivät eri arvioita yhdisteitä tai eivät sisältäneet näitä. Sen jälkeen suspensiota sekoitettiin 10 sekuntia joka tunti. 4 tunnin kuluttua ja kussakin tapauksessa mitattiin saadun suspension optinen tiheys dekantoinnin jälkeen. Alkuperäisen optisen tiheyden ja jäljelle jääneen optisen tiheyden välinen ero suhteutettiin lopuksi lähtösuspension optiseen tiheyteen (kiinnittymis-%). Inhibiitioprosentti voitiin laskea kussakin tapauksessa niiden tulosten välisestä suhteesta, jotka saatiin inhibiittorin läsnäollessa ja ilman sitä. Tulokset on esitetty seuraavissa taulukoissa III ja IV.

i 15 88578

Taulukko III

Kiinnittyminen muoviputkiin 1a bakteerelden kiinnittymisen inhibiitio S.sanguis S.mutans A.viscosus A.viscosus OMZ 9a) OMZ 176 OMZ 105a) OMZ 206 Tuote Kiinnittyminen (%)

Ei mitään (vertailu) 90 71 43 37

Inhibiitio (%)

Esimerkki 2 (1 mg/ml)1 86 83 93 86

Esimerkki 8 (1 mg/ml)1 97 80 100 78

Laktoosi (1 mg/ml)1 12 4 14 15

Galaktoosi (1 mg/ml)1 12 4 12 n.t.c)

Metyyli a-mannosidi (1 mg/ml) 11 3 10 n.t.

Polyglutamiinihappo (1 mg/ml) 6 20 22 n.t.

Polysiini (1 mg/ml) 12 30 46 n.t.

a) Näiden kahden kannan tapauksessa olivat alustavat kokeet osoittaneet kaseiini-makroglykopeptidien.ja niiden desialyloitujen nauta-johdosten estovaikutuksen spesifisyyden suhteessa glukoosin ja glysiinin epäaktiivisuuteen .. tällaisessa koesysteemissä.

Jokaisella neljällä kannalla muut testit ovat osoittaneet, ie 88578 että kaseiini-makroglykopeptidien ja niiden desialyloitujen nauta-johdosten tähän estovaikutukseen ei vaikuta haitallisesti syötävien sokereiden (glukoosi, sakkaroosi, tärkkelys ja fruktoosi), eri konsentraatioiden (0,05,0,1,0,2 ja 0,5 %) mukanaolo.

c) n.t. = ei testattu.

Taulukko IV

S. sanguis OMZ 9 ja S. mutans OMZ 176-kantoien muoviputkiin tapahtuvan kiinnittymisen inhibiitio konsentraatiossa 100 ug/ml

Tuote Inhibiitio-% S. sanguis S. mutans OMZ 9 OMZ 176

Esimerkki 2 61 65

Esimerkki 8 69 69

Esimerkki 11 24 23

Esimerkki 12 24 44

Edellä olevat tulokset osoittavat, että keksinnön mukaiset aineet vaikuttavat aktiivisesti muovimateriaalin pintaan tapahtuvan kiinnittymisen vastaisesti, kun kyse on Streptococci-kannoista sekä Actinomyces-kannasta. Tällainen kokeellinen malli on tyypillinen tilanteelle, joka vallitsee poskiontelossa.

Vertailuna todettakoon, että laktoosilla ja galaktoosilla ei ole lainkaan samoja aktiivisuustasoja.

i

Claims

1. Aineseos plakkia ja kariesta vastaan sekä niiden muodostuksen estämiseksi, tunnettu siitä, että se muodostuu oleellisesti aktiivisesta komponentista, joka on valittu kappa-kaseiini-glykopeptideistä ja niiden desialyloiduista johdoksista.

2. Blandning enligt patentkrav 1, kännetecknad därav, att den aktiva komponenten är en nöt-, lamm- eller get-kasein-makroglykopeptid.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seos, tunnettu siitä, että aktiivinen komponentti on nauta-, lammas- tai vuohi-kaseiini-makroglykopeptidi.

3. Blandning enligt patentkrav 1, kännetecknad därav, att den aktiva komponenten är en desialylerad nöt-, lamm- eller get-kasein-makroglykopeptid.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seos, tunnettu siitä, että aktiivinen komponentti on desialyloitu nauta-, lammas- tai vuohi-kaseiini-makroglykopeptidi.

4. Blandning enligt patentkrav 1, kännetecknad därav, att den aktiva komponenten är en desialylerad nöt-, kasein-makroglykopeptid.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seos, tunnettu siitä, että aktiivinen komponentti on desialyloitu nauta-kaseiini-makroglykopeptidi.

5. Blandning enligt patentkrav 1, kännetecknad därav, att den aktiva komponenten erhälles frän en med tri-klorättiksyra icke utfällbar fraktion av ett koncentrat av mjölkproteiner, som erhällits genom uitrafi1trering och dia-filtrering av nötbaserad söt vassla.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seos, tunnettu siitä, että aktiivinen komponentti saadaan maitoproteiinien konsentraatin, joka tulee nautaperäisen makean heran ultra-suodatuksesta ja diasuodatuksesta, trikloorietikkahapolla saostumattomasta jakeesta. .··. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen seos, tunnettu siitä, että aktiivinen komponentti saadaan puhdistamattomassa muodossa maitoproteiinikonsentraatin vesiliuoksesta saostamal-la proteiinijae trikloorietikkahapolla, ottamalla liukoinen jae talteen, dialysoimalla puhdasta vettä vasten ja kuivaa-* *. maila. ‘ 7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen seos, tunnettu · siitä, että aktiivinen komponentti puhdistetaan geelisuodat-tamalla. is 88578

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen seos, tunnettu siitä, että aktiivinen komponentti desialyloidaan happohydro-lyysin tai entsymaattisen hydrolyysin avulla. 19 88578 Patentkrav , 1. Ämnesblandning mot plack och caries och deras bildning, kännetecknad därav, att den bestär av en väsent-ligen aktiv komponent, som valts av kappa-kaseinglykopeptider och desialylerade derivat av dessa.

6. Blandning enligt patentkrav 5, kännetecknad därav, att den aktiva komponenten erhälles i orenad form frän en vattenlösning av ett mjölkproteinkoncentrat genom utfäll-ning av en proteinfraktion med triklorättiksyra, tillvaratag-ning av den lösliga fraktionen, dialys mot rent vatten och -j torkning.

7. Blandning enligt patentkrav 5, kännetecknad därav, att den aktiva komponenten renas genom gel fi1trering. 20 8 8 5 7 8

8. Blandning enligt patentkrav 5, kännetecknad därav, att den aktiva komponenten desialyleras genom syrahyd-rolys eller enzymatisk hydrolys.