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Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan. Insbesondere
betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von L-Tryptophan
unter Verwendung einer unbeweglichen Enzymquelle.
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L-Tryptophan ist eine Art Aminosäure und wird in der Medizin als Bestandteil von
Transfusionsflüssigkeiten benutzt. Weiterhin wird derzeit die Verwendung von
L-Tryptophan als Additiv zu Viehfutter weiterentwickelt, wodurch sich eine Vielzahl von
Anwendungsmöglichkeiten ergibt.
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Normalerweise wurde L-Tryptophan bisher durch eine Enzymreaktion unter
Verwendung eines Enzyms wie Tryptophansynthetase und Tryptophanase hergestellt. Diese
Verfahren, bei denen eine unbewegliche Enzymquelle verwendet wird, sind interessant,
da die Trennung des L-Tryptophans von der unbeweglichen Enzymquelle und die
Reinigung desselben einfach sind.
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Wenn L-Tryptophan auf industrieller Ebene unter Verwendung einer unbeweglichen
Enzymquelle hergestellt wird, wobei in Produktionen in kleinerem Rahmen ein
diskontinuierliches Verfahren angewandt werden kann, ist in Produktionen in großem Umfang
ein kontinuierliches, in vieler Hinsicht vorteilhaftes Verfahren erforderlich.
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Der Erfolg eines kontinuierlichen Verfahrens hängt davon ab, ob die Lebensdauer der
Aktivität der unbeweglichen Enzymquelle in ausreichendem Maße verlängert werden
kann oder nicht. Es wird versucht, die Lebensdauer der Aktivität der unbeweglichen
Enzymquelle durch Verbesserung der unbeweglichen Enzymquelle als solche und/oder
durch die geeignete Auswahl der Reaktionsbedingungen zu verlängern.
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Obgleich unter Anwendung der genetischen Rekombinationstechnik und ähnlichen
Techniken an einer Verbesserung der unbeweglichen Enzymquelle oder des Enzyms als
solches gearbeitet wird, wurden noch keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt. Wenn
die unbewegliche Enzymquelle oder das Enzym als solches verbessert wird, so hängt die
Verlängerung der Lebensdauer der Aktivität in großem Maße von der richtigen Wahl der
langwierigen Reaktionsbedingungen ab.
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Bisher wurde die Verlängerung der Lebensdauer des unbeweglichen Enzyms noch nicht
erreicht.
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Daher liegt ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Herstellung von
L-Tryptophan aus L-serin und Indol zur Verfügung zu stellen, welches die Lebensdauer
der Aktivität der unbeweglichen Enzymquelle verlängert.
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Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur kontinuierlichen
Herstellung von L-Tryptophan durch Reagieren von Indol und L-serin unter
Verwendung einer unbeweglichen Enzymquelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Molzahl von
L-serin in dem Reaktionsgemisch zu jedem Zeitpunkt größer als die Molgesamtzahlen
von Indol und L-Tryptophan in dem Reaktionsgemisch ist.
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Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Lebensdauer der
unbeweglichen Enzymquelle ungeachtet der Menge des angesammelten L-Tryptophans verlängert
werden, so daß L-Tryptophan kontinuierlich über eine lange Zeit aus Indol und L-serin
hergestellt werden kann. Weiterhin kann die Konzentration des hergestellten
L-Tryptophans höher sein als in herkömmlichen Verfahren.
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Der Begriff "unbewegliche Enzymquelle", so wie er hier verwendet wird, bedeutet
unbewegliche Tryptophansynthetase, Tryptophanase oder unbeweglicher
Mikroorganismus, der zumindest eines dieser Enzyme erzeugt. Bekannte Mikroorganismen, die
Tryptophansynthetase erzeugen, sind Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19),
Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20) und Neurospora crassa (ATCC 14692).
Bekannte Mikroorganismen, die Tryptophanase erzeugen, sind Proteus bulgaris (IFO
3167), Escherichia coli (IAM 1268), Aerobacter aerogenes (IFO 12019) und Klebsiella
pneumoniae (ATCC 8724). Die Methode zur Herstellung der unbeweglichen
Enzymquelle, d. h. die Methode, das Enzym oder den Mikroorganismus unbeweglich zu machen,
ist in der Technik gut bekannt. Beispielsweise kann das Enzym oder der
Mikroorganismus nach der bekannten, herkömmlichen Methode in einem Alginat, wie Calciumalginat
und Aluminiumalginat, oder in einem Träger, wie Carrageenan, unbeweglich gemacht
werden.
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Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Molzahl von L-serin in dem
Reaktionsgemisch größer als die Molgesamtzahlen von Indol und L-Tryptophan. Obgleich das
Ergebnis gemäß der vorliegenden Erfindung auch erreicht werden kann, wenn die
Molzahl von L-serin nur leicht größer ist als die Molgesamtzahlen von Indol und
L-Tryptophan und in Fällen, in denen die Konzentration des hergestellten L-Tryptophans
hoch ist, beispielsweise in dem Fall, in dem L-Tryptophan kontinuierlich unter
Verwendung von Mehrfachreaktionsgefäßen hergestellt wird oder in dem Fall, in dem
L-Tryptophan
kontinuierlich durch Zirkulation des Reaktionsgemischs in einem Reaktionsgefäß
hergestellt wird, um die Lebensdauer der unbeweglichen Enzymquelle ausreichend zu
verlängern, damit sie für die Industrie geeignet ist, so ist doch die Molzahl von L-serin in
dem Reaktionsgemisch vorzugsweise 1,2 mal die Molgesamtzahl von Indol und
L-Tryptophan. Da Indol außerdem die Enzymaktivität beträchtlich stärker hemmt als
L-Tryptophan, ist die Molzahl von L-serin in dem Reaktionsgemisch vorzugsweise 1,5
mal größer als die Molzahl von Indol allein. Selbst wenn die Molzahl von L-serin viel
größer ist als die Molgesamtzahl von Indol und L-Tryptophan, wird das Ergebnis der
vorliegenden Erfindung nicht abträglich beeinflußt. Die überschüssige Molzahl von
L-serin kann also entsprechend gewählt werden, so daß sie für die Wiedergewinnung und
Rückfuhrung des unreagierten L-serins geeignet ist. Vom praktischen Gesichtspunkt aus
gesehen sollte die Molzahl von L-serin nicht mehr als 10 mal die Molgesamtzahl von
Indol und L-Tryptophan sein. Es ist anzumerken, daß racemisches Serin in dem
Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, solange die Menge des
L-serins in dem racemischen Serin in den in der vorliegenden Erfindung definierten
Bereich fällt. Außerdem muß L-Tryptophan selbstverständlich nicht in dem
Ausgangsgemisch enthalten sein.
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Obgleich keine Einschränkungen bestehen, sollte die Reaktion vorzugsweise bei einer
Temperatur von 25 bis 60ºC erfolgen. Um die Enzymreaktionsgeschwindigkeit zu
steigern und gleichzeitig die Löslichkeit des L-Tryptophans zu fördern, wird die Reaktion
vorzugsweise bei einer hohen Temperatur innerhalb eines akzeptablen Rahmens durchgeführt.
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Da L-Tryptophan ein Anipholyt ist und die Löslichkeit von dem pH-Wert abhängt, wird
bevorzugt, den pH-Wert in dem für die Enzymaktivität akzeptablen Rahmen höher oder
niedriger als seinen isoelektrischen Punkt einzustellen, um so die Konzentration des
angesammelten L-Tryptophans zu steigern. In vielen Fällen kann der pH-Wert des
Reaktionsgemischs also von dem optimalen pH-Wert des Enzyms abweichen und die
Lebensdauer der unbeweglichen Enzymquelle dadurch verlängert werden. Der pH-Wert des
Reaktionsgemischs liegt normalerweise zwischen 6 und 11, vorzugsweise zwischen 6,5
und 10,0.
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In dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können Coenzyme, wie
Pyridoxalphosphat zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben werden. Außerdem können in Fällen,
in denen Calciumalginat oder Aluminiumalginat als Unbeweglichkeitsträger verwendet
wird, Calciumionen oder Aluminiumionen vorhanden sein, um das Zerbrechen des Gels
zu verhindern.
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Die Reaktion kann mittels Wiederholung des diskontinuierlichen Verfahrens oder unter
Verwendung eines Tankreaktorgefäßes mittels kontinuierlichen Strömens des
Reaktionsgemischs oder unter Verwendung eines Festbettreaktionsgefäßes oder eines
Fließbettreaktionsgefäßes mittels kontinuierlichen Strömens des Reaktionsgemischs durchgeführt
werden. Auch können diese Arten von Reaktionsgefäßen kombiniert werden.
Beispielsweise kann das Speisereaktionsgemisch, das sowohl Indol und L-Tryptophan als auch
L-serin über die Molgesamtzahl hinaus enthält, und wahlweise der obengenannte
Bestandteil zur Förderung der Enzymaktivität mit der vorgeschriebenen
Strömungsgeschwindigkeit und Temperatur in ein Reaktionsgefäß gegeben werden; das erzeugte
Reaktionsgemisch, das das neue, in dem Reaktionsgefäß erzeugte
L-Tryptophan enthält, kann dem Reaktionsgefäß kontinuierlich mit der gleichen
Strömungsgeschwindigkeit, in der das Speisereaktionsgemisch hinzugegeben wurde,
entzogen werden. Bei der besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung erfolgt, wie in
nachstehendem Beispiel 3 beschrieben, die Reaktion in einer Vielzahl von reihenweise
miteinander verbundenen und mit Rührern versehenen Tankreaktorgefäßen, wobei das
Ziel der vorliegenden Erfindung in jedem Reaktionsbad erreicht wird. In diesem
Verfahren wird dem zweiten oder einem folgenden Reaktionsgefäß das erzeugte
Reaktionsgemisch aus dem vorherigen Reaktionsgefäß zugeführt. Sollte in diesem Fall das Ziel der
vorliegenden Erfindung in einem Reaktionsgefäß nicht erreicht werden, wird
zusätzliches L-serin zu dem in dem vorherigen Reaktionsgefäß erzeugten Reaktionsgemisch in
das Reaktionsgefäß gegeben.
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Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Herstellung von
L-Tryptophan aus Indol und L-serin 200 Stunden lang ungeachtet des in dem
Reaktionsgemisch aufgelösten L-Tryptophans fortzusetzen und so die Lebensdauer der
unbeweglichen Enzymquelle erheblich zu verlängern. Weiterhin kann durch das Verfahren der
vorliegenden Erfindung die Konzentration des L-Tryptophans höher als in
herkömmlichen Verfahren werden. Beispielsweise kann durch kontinuierliche Herstellung von
L-Tryptophan unter Verwendung der später beschriebenen Vielzahl von
Reaktionsgefäßen oder durch kontinuierliche Herstellung von L-Tryptophan mittels Zirkulation des
Reaktionsgemischs in einem einzigen Reaktionsgefäß eine L-Tryptophan-Konzentration
von 10 g/l oder mehr erreicht werden, was für die industrielle Produktion von
L-Tryptophan besonders vorteilhaft ist.
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Es folgt eine detailliertere Beschreibung der vorliegenden Erfindung anhand von
Beispielen.
Beispiel 1
Herstellung einer unbeweglichen Enzymquelle
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Tryptophansynthetase erzeugende Bakterien, Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-
19), wurden in 100 ml Kulturnährboden mit der in Tabelle 1 dargestellten
Zusammensetzung, der sich in einem 500 ml Gefäß befand, eingeimpft und der entstandene
Kulturnährboden wurde 24 Stunden lang inkubiert. Zweihundert Milliliter (zwei Gefäße) der
Kultur wurden in 15 Liter Kulturnährboden mit der in Tabelle 2 dargestellten
Zusammensetzung, der sich in einem 30 Liter Gärungsstandgefäß befand, eingeimpft und der
entstandene Kulturnährboden wurde 30 Stunden bei 35ºC, pH 6,8 (angereichert mit 28%
Salmiakgeist) inkubiert.
Tabelle 1
Zusammensetzung des Kulturnährbodens
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Ehrlich's Meat Extrakt 10 g
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Polypepton 10 g
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NaCl 5 g
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Aufgelöst in 1 Liter destilliertem Wasser (pH 6,8)
Tabelle 2
Zusammensetzung des Wachstumsnährstoffes
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Glucose 10 g
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(NH&sub4;)&sub2; SO&sub4; 1,5 g
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MgSO&sub4; 7H&sub2;O 1 g
-
Polypepton 0,5 g
-
Nährhefe 0,5 g
-
L-Tryptophan 0,15 g
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Tensid (Adecanol LG-805, hergestellt von Asahi Denka
Co., Ltd.)
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Aufgelöst in 1 Liter destilliertem Wasser (pH 6,8)
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Nach Fertigstellung der Kultur wurde der Kulturnährboden geschleudert, um 600 g
Naßgewicht Bakterienzellen zu erhalten. Die Bakterienzellen wurden in ein
verschlossenes Gefäß gegeben, bei 4ºC in einem Eisschrank aufbewahrt und für die Herstellung
der unbeweglichen Enzymquelle verwendet.
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Ein Teil der oben beschriebenen nassen Bakterienzellen und ein Teil physiologisches
Saline wurden unter Verwendung eines Rührers vermischt. Außerdem wurden 7,76
Gewichtsteile destilliertes Wasser und 0,24 Gewichtsteile Natriumalginat (NSPLL
hergestellt von Kibun Food Chemifa, Co., Ltd.) unter Verwendung eines Rührers vermischt
und der pH-Wert desselben wurde bei 8,5 dem Natriumhydroxid angeglichen.
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Zwei Teile der Suspension der Zellen und 8 Teile der Natriumalginatlösung wurden unter
Verwendung eines Rührers vermischt, das erzeugte Gemisch wurde in eine Spritze
gegeben und von einer Nadelspitze mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm bis 0,8 mm in
eine Gelierungslösung getropft.
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Bei der Gelierungslösung handelte es sich um eine 0,5 M wässerige Calciumchlorid-
Dihydratlösung, deren pH-Wert bei 8,5 der 6 N Kaliumhydroxidlösung angeglichen, bei
10ºC aufbewahrt und in der Menge von 10 Teilen benutzt wurde.
Tabelle 2
Zusammensetzung des Wachstumsnährstoffes
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Glucose 10 g
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(NH&sub4;)&sub2; SO&sub4; 1,5 g
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MgSO&sub4; 7H&sub2;O 1 g
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Polypepton 0,5 g
-
Nährhefe 0,5 g
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L-Tryptophan 0,15 g
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Tensid (Adecanol LG-805, hergestellt von Asahi Denka
Co., Ltd.)
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Aufgelöst in 1 Liter destilliertem Wasser (pH 6,8)
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Nach Fertigstellung der Kultur wurde der Kulturnährboden geschleudert, um 600 g
Naßgewicht Bakterienzellen zu erhalten. Die Bakterienzellen wurden in ein
verschlossenes Gefäß gegeben, bei 4ºC in einem Eisschrank aufbewahrt und für die Herstellung
der unbeweglichen Enzymquelle verwendet.
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Ein Teil der oben beschriebenen nassen Bakterienzellen und ein Teil physiologisches
Saline wurden unter Verwendung eines Rührers vermischt. Außerdem wurden 7,76
Gewichtsteile destilliertes Wasser und 0,24 Gewichtsteile Natriumalginat (NSPLL
hergestellt von Kibun Food Chemifa, Co., Ltd.) unter Verwendung eines Rührers vermischt
und der pH-Wert desselben wurde bei 8,5 dem Natriumhydroxid angeglichen.
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Zwei Teile der Suspension der Zellen und 8 Teile der Natriumalginatlösung wurden unter
Verwendung eines Rührers vermischt, das erzeugte Gemisch wurde in eine Spritze
gegeben und von einer Nadelspitze mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm bis 0,8 mm in
eine Gelierungslösung getropft.
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Bei der Gelierungslösung handelte es sich um eine 0,5 M wässerige Calciumchlorid-
Dihydratlösung, deren pH-Wert bei 8,5 der 6 N Kaliumhydroxidlösung angeglichen, bei
10ºC aufbewahrt und in der Menge von 10 Teilen benutzt wurde.
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Die durch Hineintropfen des Gemischs in die Gelierungslösung gebildeten Partikel
wurden durch Rühren in der Gelierungslösung ungefähr 1 Stunde gereift, um eine
unbewegliche Enzymquelle zu erhalten.
Synthesereaktion von L-Tryptophan
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Es wurden vier Lösungen A, B, C und D mit der gleichen Zusammensetzung, jedoch mit
Ausnahme der in Tabelle 3 dargestellten L-serin-Konzentration, hergestellt und der pH-
Wert wurde bei 8,5 angeglichen. 100 ml einer jeden Lösung und 50 ml der oben
beschriebenen unbeweglichen Bakterienzellen wurden in ein 500 ml Glasreaktionsgefäß
mit Rührer gegeben. Das Reaktionsgefäß wurde in ein warmes Wasserbad gestellt, um
die Temperatur des Reaktionsgefäßes bei 35ºC zu halten. Die Lösung mit der gleichen
Zusammensetzung wie die Lösung in jedem der Reaktionsgefäße wurde kontinuierlich
mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml hinzugegeben und das Reaktionsgemisch
wurde dem Reaktionsgefäß mit der gleichen Strömungsgeschwindigkeit kontinuierlich
entzogen. Dem Reaktionsgemisch wurden in bestimmten Zeitabständen Stichproben
entnommen. Die Konzentrationen von L-Tryptophan, von verbleibendem Indol und
verbleibendem L-serin wurden unter Verwendung der Flüssigkeitschromatographie
bestimmt. Die Menge des in dem Reaktionsgefäß neu hergestellten L-Tryptophans wurde
unter Berücksichtigung des hinzugefügten Indols bestimmt, weiterhin wurde der
Zeitraum, in dem sich diese Menge auf 50% verringert, d. h. die halbe Lebensdauer der
Enzymaktivität, bestimmt. Dies geht aus Tabelle 3 als die Lebensdauer des Enzyms
hervor.
Tabelle 3
Konzentration des Bestandteils Lösung A Lösung B Lösung C Lösung D (g/l) Indol L-Tryptophan Calciumchlorid-Dihydrat Pyridoxalphosphat L-serin Molverhältnis von L-serin zur Gesamtzahl von Indol und L-Tryptophan Lebensdauer (Stunden)
Beispiel 2
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Es wurde die gleiche kontinuierliche Reaktion wie in Beispiel 1 wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme, daß sich das Speisereaktionsgemisch aus 30 g/l L-Tryptophan, 2 g/l
Indol, 2,5 g/l Calciumchlorid-Dihydrat, 10 mg/l Pyridoxalphosphat und 70 g/l L-serin
zusammensetzte, d. h. ungefähr 4 mal die Molgesamtzahlen von Indol und L-Tryptophan.
Der pH-Wert des Reaktionsgemischs betrug 10,0 und die Reaktionstemperatur 40ºC.
Innerhalb von 650 Stunden verringerte sich die Menge des L-Tryptophans auf 50%.
Beispiel 3
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In diesem Beispiel entsprachen sowohl die Methode zur Herstellung der unbeweglichen
Enzymquelle, die Art des Reaktionsgefäßes, die Menge des Gemischs in dem
Reaktionsgefäß als auch die Menge der unbeweglichen Enzyme denen in Beispiel 1. Jedoch
wurden in diesem Beispiel 4 Reaktionsgefäße hintereinander über Rohre verbunden und
nur das Gemisch aus dem vorherigen Reaktionsgefäß wurde in das folgende
Reaktionsgefäß gegeben.
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Das Reaktionsgemisch mit der in Tabelle 4 dargestellten Zusammensetzung wurde mit
einer Geschwindigkeit von 48 ml/Std. in das erste Reaktionsgefäß gegeben und eine
Indol-Lösung in Methanol mit einer Konzentration von 62,5 g/l wurde tropfenweise mit
einer Geschwindigkeit von 2 ml/Std. in das erste Reaktionsgefäß und vierte
Reaktionsgefäß gegeben. Außerdem wurde in das dritte Reaktionsgefäß kontinuierlich L-serin-
Pulver mit einer Geschwindigkeit von 0,655 g/Std. zwecks Synthesereaktion von
L-Tryptophan hinzugegeben. Weiterhin wurde zum Zwecke des Vergleichs das gleiche
Verfahren ausgeführt, jedoch ohne daß L-serin in das dritte Reaktionsgefäß gegeben
wurde. Obgleich die Reaktion unter den in der vorliegenden Erfindung genannten
Bedingungen erfolgte, war in diesem Fall die Menge von L-serin in dem vierten
Reaktionsgefäß geringer als die der vorliegenden Erfindung entsprechende unterste Begrenzung.
Tabelle 4
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L-serin 11,7 g/l
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Pyridoxalphosphat 0,01 g/l
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Calciumchlorid-Dihydrat 1,5 g/l
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pH 8,5 g
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Die Lebensdauer des Enzyms in jedem Reaktionsgefäß ist Tabelle 5 zu entnehmen.
Weiterhin ist Tabelle 5 das Molverhältnis von L-serin zu Indol und das Molverhältnis von
L-serin zu der Gesamtzahl von Indol und L-Tryptophan am Einlaß eines jeden
Reaktionsgefäßes zu entnehmen.
Tabelle 5
Erster Schritt Zweiter Schritt Dritter Schritt Vierter Schritt (Vergleichsbeispiel) Menge des hinzugegebenen L-Tryptophans (g/Std.) Menge des hinzugegebenen Indols (g/Std.) Menge des hinzugegebenen L-serins (g/Std.) Molverhältnis von L-serin/Indol Molverhältnis von L-serin zu Indol + L-Tryptophan Lebensdauer der unbeweglichen Enzyme (Std.)
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Erfolgt die Reaktion nur unter Verwendung des ersten Reaktionsgefäßes, auch wenn
L-serin im Übermaß vorhanden ist, so beträgt die maximale Hinzufügungsmenge von
Indol in das Speisereaktionsgemisch 0,125 g/Std. und die maximale Herstellung von
L-Tryptophan in dem Reaktionsgemisch 0,2179 g/Std. mit einer Konzentration von
4,36 g/l. Dies ist für industrielle Verfahren nicht ausreichend.
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In diesem Beispiel ist zu sehen, daß, wenn die Reaktion kontinuierlich gemäß den
Bedingungen der vorliegenden Erfindung ausgeführt wird (d. h. wenn zusätzliches L-serin in
das dritte Reaktionsgefäß gegeben wird), die Lebensdauer der unbeweglichen Zellen
erheblich verlängert werden kann. Wird jedoch kein zusätzliches L-serin in das dritte
Reaktionsgefäß gegeben, fällt das Molverhältnis von L-serin zu Indol und L-Tryptophan
aus dem Rahmen der vorliegenden Erfindung, so daß die Lebensdauer der unbeweglichen
Zellen nicht zufriedenstellend verlängert werden kann.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann für die industrielle, kontinuierliche
Herstellung von L-Tryptophan verwendet werden, das als Bestandteil in
Transfusionsflüssigkeiten oder als Additiv zu Viehfutter nützlich ist.