DE3712767A1 - Immunologisches adjuvans - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Adjuvans.

Das erfindungsgemäß bereitgestellte immunologische Adjuvans fördert die Immunantwort auf Antigene und kann daher in Impfstoffen eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein immunologisches Adjuvanssystem, das eine Lipidemulsion zusammen mit einem biologischen Adjuvans und einem Antigen enthält. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des immunologischen Adjuvans und dessen Verwendung zur Förderung des Immunansprechens bzw. der Immunantwort auf Antigene.

In der Literatur sind bereits eine Vielzahl von Adjuvantien bzw. Hilfsstoffen beschrieben, welche das Immunansprechen auf zahlreiche Antigene und insbesondere das Immunansprechen auf Impfstoffe bzw. Vakzine verstärken. Bekanntlich stellen die kompletten oder inkompletten Freund-Adjuvantien die klassischen Adjuvantien dar, mit denen die meisten anderen Adjuvantien verglichen werden. Sie können jedoch aufgrund ihrer Reaktivität bei Tieren oder Menschen nicht klinisch eingesetzt werden. Andere Materialien, wie Mineralöl und Aluminiumhydroxid, sind ebenfalls als Adjuvantien eingesetzt worden, weisen jedoch verschiedene Nachteile auf. So führt beispielsweise Mineralöl zu Gewebereizungen und Aluminiumhydroxid fördert das Antikörperansprechen nur wenig. Zudem enthalten viele der derzeit zur Verfügung stehenden Adjuvantien Bestandteile, die im Menschen nicht metabolisierbar und somit nicht abbaubar sind. Dies schränkt deren Einsatz drastisch ein. Außerdem sind die meisten der derzeit eingesetzten Adjuvantien schwierig herzustellen, da dazu zeitaufwendige Verfahren erforderlich sind und da in einigen Fällen eine aufwendige und teure Ausrüstung eingesetzt werden muß, um einen Impfstoff und ein Adjuvanssystem zu formulieren.

Kürzlich wurde von Reynolds et al in "Infection and Immunity, Bd. 78, Nr. 3, Seiten 937-943, 1980" berichtet, daß eine metabolsierbare Lipidemulsion gefunden wurde, die bei inaktivierten viralen Impfstoffen eine gewisse Adjuvansaktivität besitzen. In dieser Untersuchung ist ausgeführt, daß dieses Lipidemulsion-Adjuvans das Immunansprechen verschiedener Warmblüter auf inaktivierte virale Antigene signifikant erhöht. Es ist auch ausgeführt, daß diese Lipidemulsion, die ein hochgereinigtes Erdnußöl aufweist, das in wäßrigen Impfstoffen mit Glycerin und Lecithin emulgiert ist, verschiedene Vorteile besitzt, verglichen mit anderen Adjuvantien auf Ölbasis. So werden beispielsweise die Lipidkomponenten der Emulsion, falls diese bei Menschen oder Tieren eingesetzt wird, durch die "normalen Stoffe" des Wirts metabolisiert. Die Lipidkomponenten können zudem durch leichtes Rühren ohne Schwierigkeiten emulgiert werden und sind verhältnismäßig wenig reaktiv.

Im American Journal of Veterinary Research, Bd. 44, Nr. 1, Seiten 72-75, 1983 werden inaktivierte virale Impfstoffe verglichen, die verschiedene Emulsion-Adjuvantien enthalten. Es ist dort ausgeführt, daß die Immunisierungsuntersuchungen erhebliche Unterschiede in der Wirksamkeit der Adjuvantien auf Basis von Mineralöl verglichen mit dem Adjuvans auf Basis der von Reynolds et al beschriebenen Lipidemulsion zeigten.

Obgleich in der Literatur die Verwendung einer metabolisierbaren Lipidemulsion als Adjuvans beschrieben ist, befindet sich dort kein Hinweis auf die Verwendung einer metabolisierbaren Lipidemulsion zusammen mit anderen Bestandteilen, welche ein Immunansprechen weiter fördern können.

Die vorliegende Erfindung ist somit gerichtet auf ein immunologisches Adjuvans, ein Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Steigerung des Immunansprechens auf Antigene.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein neues immunologisches Adjuvans, das

• (i) eine Lipidemulsion (lipid emulsion system; LES), die
  • a) ein metabolisierbares Öl,
  • b) ein Polyol mit einem niedrigen Molekulargewicht und
  • c) Lecithin enthält,
  und
• (ii) ein gereinigtes, detoxifiziertes bakterielles biologisches Adjuvans aufweist.

Bei dem gereinigten, detoxifizierten, bakteriellen, biologischen Adjuvans kann es sich um ein gereinigtes, detoxifiziertes Endotoxin (RDE = refined detoxified endotoxin), Trehalosedimycolat (TDM) und ein Protein von Salmonella typhimurium (STM) handeln.

Es wurde überraschend gefunden, daß das erfindungsgemäße immunologische Adjuvans das Immunansprechen auf bzw. gegen eine Vielzahl von sowohl natürlichen als auch synthetischen Antigenen, beispielsweise viralen, bakteriellen, pilzartigen oder Protozoen-Antigenen, verstärkt. Von dem im erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvanssystem eingesetzten Antigen ist lediglich zu fordern, daß es in der Lage ist, ein Immunansprechen in einem Wirt hervorzurufen. Zudem muß da Ansprechen durch das erfindungsgemäße Adjuvans, mit dem das Antigen kombiniert ist, gefördert werden.

Das erfindungsgemäße Adjuvans ist auch nützlich zur Steigerung des Immunansprechens auf bzw. gegen Antigene, bei denen es sich um genetisch engineerte Proteine sowie um Antigene handelt, die in vitro synthetisierte Peptide sind. Es kann sich dabei um Antigene handeln, die im Zusammenhang mit Poliovirus, Influenzavirus, AIDS-verwandten Viren, Hepatitisviren, Herpesviren, Zytomegali-Viren, Maul- und Klauenseuche-Virus, Felin-Leukämievirus (feline leukemia virus), Lyssa-Virus, infektiösem Rinderrhinotracheitis- Virus, Rinder-Diarrhöe-Virus, Newcastle-Diseas- Virus, Fowl-Hepatitis, Schweine-Choleravirus, Pseudolyssa- Virus, Malaria-Peptiden etc. auftreten. Das erfindungsgemäße Adjuvanssystem ist auch nützlich bei natürlichen Proteinen, wie Toxoiden von Diphterien, Teranus, enterotoxogenen Koli und Pertussis-Bakterien.

Das Immunansprechen auf Polysaccharid-Impfstoffe, wie denjenigen, die aus den Kapseln von Pneumococci, Meningococci, Hemophilus influenzae oder Pilzen stammen, oder auf Polysaccaride aus den Zellwänden von sowohl gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien wird durch das erfindungsgemäße Adjuvanssystem gesteigert.

Auch Impfstoffe bzw. Vakzine auf Basis von inaktivierten ganzen Viren, Bakterien, Pilzen oder Protozoen besitzen in diesem Adjuvanssystem eine größere immunologische Wirksamkeit. Diese können die obengenannten Agentien und auch Mykobakterien, Klostridia, enterische Bazillen, Kuhpockenviren und dergleichen enthalten.

Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Adjuvans, das sowohl die Lipidemulsion als auch ein geeignetes gereinigtes bakterielles Adjuvans der oben bezeichneten Art enthält, Antigene wirksamer "unterstützen" als jede der Komponenten alleine. Die gemeinsame Verwendung beider Bestandteile führt zu einem stärkeren Effekt, der größer ist, als die Gesamtsumme der Effekte der einzelnen Bestandteile.

Die in den erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvantien eingesetzte Lipidemulsion zeichnet sich zudem dadurch aus, daß sie metabolisierbar ist. Sie besitzt daher wünschenswerte Eigenschaften, welche übliche Adjuvantien, wie Mineralöl, nicht aufweisen. Wie bereits oben ausgeführt, ist es bekannt, daß nicht-metabolisierbare Adjuvantien, wie Mineralöl, bei Tieren ein granulomatöses Ansprechen induzieren und daher für die Behandlung von Menschen nicht eingesetzt werden können. Außerdem wurde gefunden, daß die Kosten für die Herstellung eines Mittels, beispielsweise eines Impfsstoffes, das ein Antigen und das erfindungsgemäße immunologische Adjuvans enthält, wesentlich niedriger sind als bei den Wasser-in-Öl-Emulsionen des Standes der Technik. Da außerdem die erfindungsgemäßen Adjuvanssysteme in kürzerer Zeit hergestellt werden können, werden weitere Kosten eingespart.

Die erste Komponente des erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvans ist ein Lipidemulsion-System (LES), das ein metabolisierbares Öl, ein Polyol mit einem niedrigen Molekulargewicht, beispielsweise Glycerin, und Lecithin enthält. Bei dem metabolisierbaren Öl handelt es sich vorzugsweise um ein Fettöl aus vorwiegend Diglyceriden und Triglyceriden von Öl- und Linolsäuren. Insbesondere bevorzugt sind fette pflanzliche Öle, wie diejenigen, die in Erdnußöl, Sonnenblumensamenöl, Safflorsamenöl, Maisöl und dergleichen enthalten sind oder daraus gewonnen werden. Andere Öle, wie Olivenöl, Baumwollsamenöl oder Squalen können ebenfalls in den erfindungsgemäßen Adjuvantien zur Anwendung gebracht werden. Das Hauptkriterium ist somit, daß das Öl metabolisierbar, mit den anderen Bestandteilen des Emulsionssystems und dem Adjuvans selbst kompatibel und wirksam in der Kombination mit den anderen Bestandteilen zur Förderung des Immunansprechens gegen Antigene ist.

Erfindungsgemäß kann eine große Vielzahl von Polyolen in der Lipidemulsion eingesetzt werden. Bei den eingesetzten Polyolen handelt es sich um Polyole mit einem niedrigen Molekulargewicht, die flüssig und mit dem metabolisierbaren Öl mischbar sind und in denen das Lecithin löslich ist. Geeignete Polyole sind unter anderem Ethylenglykol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, Glycerin, 1,4- Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,2,4-Butantriol und 1,5-Pentandiol.

Die dritte Komponente der Lipidemulsion ist Lecithin. Mit dem hier verwendeten Ausdruck "Lecithin" sind Phospholipide der folgenden allgemeinen Formel bezeichnet:

worin R₁ und R₂ Fettsäuren mit bis zu 22 Kohlenstoffatomen bedeuten und R₃ für Cholin steht. Bei diesen Phospholipiden handelt es sich gewöhnlich um eine Mischung von Diglyceriden von Stearin-, Palmitin-, Linol- und Linolen- Fettsäuren, die mit dem Cholinester der Phosphorsäure verbunden sind.

Die drei Komponenten der Lipidemulsion, d. h. das metabolisierbare Öl, das Polyol und das Lecithin sind bekannte Stoffe und im Handel erhältlich. Die in der Lipidemulsion eingesetzten drei Komponenten sind selbstverständlich hoch gereinigt und für pharmazeutische Zwecke geeignet. Die Lipidemulsion enthält vorzugsweise etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% eines metabolisierbaren Öls, etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% eines Polyols mit einem niedrigen Molekulargewicht und etwa 1 bis 15 Gew.-% Lecithin.

Zur Herstellung der Lipidemulsion geht man beispielsweise wie folgt vor. Man löst einen Teil (10 g) des sterilen Lecithins in 10 Teilen (100 g) weißem Glycerin, indem man auf einer Heizplatte unter Rühren mit einem Magnetstäbchen langsam auf 60°C erhitzt. Das Glycerin sterilisiert man vor der Anwendung, indem man es durch eine 0,2 Mikrometerfilter gibt. Danach gibt man die Mischung aus Glycerin und Lecithin in ein steriles Mischgefäß und gibt zu der Mischung aus Glycerin und Lecithin unter Mischen bei langsamer Geschwindigkeit 10 Teile (100 g) Erdnußöl zu, das man ebenfalls mit Hilfe eines 0,2 Mikrometerfilters sterilisiert.

Die zweite Komponente des immunologischen Adjuvans ist ein gereinigtes, detoxifiziertes bakterielles Adjuvans. Insbesonders bevorzugt ist gereinigtes, detoxifiziertes Endotoxin, das im Rahmen der vorliegenden Unterlagen als RDE bezeichnet ist und das aus Re-Mutantenstämmen von Salmonella erhalten wurde. Das detoxifizierte Endotoxin kann man auch aus anderen Enterobakteriaciae erhalten, wie dies in der US-PS 44 36 728 offenbart ist, auf die hiermit Bezug genommen wird. Man kann das detoxifizierte Endotoxin auch synthetisch oder mit Hilfe genetischer Engineering- Techniken herstellen. Auch kann man andere gereinigte, detoxifizierte bakterielle Adjuvantien entweder allein oder zusammen mit RDE einsetzen. Dazu gehören beispielsweise Trehalosedimycolat (TDM) und das Protein von Salmonella typhimurium (STM).

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvanssystems stellt man das Antigen und die zweite Komponente getrennt voneinander her, indem man das Antigen in steriler Kochsalzlösung zum gereinigten, detoxifizierten Endotoxin gibt, das ebenfalls in steriler Kochsalzlösung vorliegt und in der die Konzentration des Antigens etwa 1 bis etwa 1000 µg pro 0,2 ml beträgt und die Konzentration des Endotoxins etwa 25 bis 200 µg pro 0,2 ml beträgt.

Die erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvantien, die die Lipidemulsion und das biologische Adjuvans und das Antigen enthalten, stellt man zweckmäßigerweise her, indem man zuerst das metabolisierbare Öl, das Polyol und das Lecithin vermischt und so die Lipidemulsion bildet. Das gereinigte, detoxifizierte Endotoxin, stellt man, wie bereits oben ausgeführt, getrennt davon in steriler Kochsalzlösung her, die man mit dem ebenfalls in steriler Kochsalzlösung vorliegenden Antigen versetzt. Danach gibt man die sterile Kochsalzlösung, die das Antigen und das gereinigte, detoxifizierte Endotoxin enthält, zur Lipidemulsion und vermischt das Gemisch in einer Vortex-Vorrichtung oder in einer Mischvorrichtung, bis man eine Emulsion erhält.

Vorteilhafterweise gibt man drei Volumina der Antigen-RDE- Lösung zu einem Volumen der Lipidemulsion und vermischt das ganze wie oben ausgeführt, wobei man eine weiße milchige Lösung (Emulsion) erhält. Im allgemeinen erhält man die Emulsion nach 2- bis 5minütigem Vermischen der beiden Komponenten.

Obgleich das optimale Verhältnis der beiden Komponenten des immunologischen Adjuvans derart ist, daß drei Volumina der Antigen-RDE-Kochsalzlösung pro einem Volumen der Lipidemulsion vorliegen, kann das Verhältnis von Antigen- RDE-Mischung zur Lipidemulsion etwa 1 zu 1 bis etwa 8 zu 1 betragen, wobei ein Verhältnis von 3 zu 1 bevorzugt ist.

Nach dem obigen Verfahren erhält man eine Emulsion der wäßrigen Antigenlösung. Letztere bewirkt eine langsame Freisetzung des Antigens, eine Verlängerung der antigenischen Stimulierung und eine zelluläre Stimulierung ähnlich der des Antigens, die durch die detoxifizierten bakteriellen Adjuvantien induziert wird. Diese Kombination von Aktivitäten steigert das Ansprechen des Wirts auf das Antigen, wie dies aus der in den Beispielen aufgeführten Tabelle 1 ersichtlich ist.

Wie oben ausgeführt, steigern die erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvantien zusammen mit einer Vielzahl von Antigenen das Immunansprechen auf solche Antigene und können daher in Impfstoffen für Mensch und Tier Anwendung finden.

Das erfindungsgemäße Adjuvans fördert das Immunansprechen auf Antigene, die genetisch engineerte Proteine sind, sowie Antigene, bei denen es sich um in vitro synthetisierte Peptide handelt. Dazu zählen Antigene, die im Zusammenhang stehen mit Poliovirus, Influenzavirus, AIDS-verwandten Viren, Hepatitisviren, Herpesviren, Zytomegali-Viren, Maul- und Klauenseuche-Viren, Felin-Leukämievirus (feline leukemia virus), Lyssa-Virus, infektiösem Rinderrhinotracheitis- Virus, Rinder-Diarrhoe-Virus, Newcastle- Diseas-Virus, Fowl-Hepatitis, Schweine-Choleravirus, Pseudolyssa-Virus, Malaria-Peptiden etc. Das erfindungsgemäße Adjuvanssystem kann auch bei natürlichen Proteinen, wie Toxoiden von Diphterie, Tetanus, enterotoxogenen Koli und Pertussisbakterien Anwendung finden.

Das Immunansprechen auf Polysaccharid-Impfstoffe, wie diejenigen, die aus den Kapseln von Pneumococci, Meningococci, Hemophilus influenzae oder Pilzen oder aus den Zellwänden sowohl gram-positiver als auch gram-negativer Bakterien stammen, wird durch das Adjuvanssystem verstärkt.

Auch Impfstoffe, die aufgebaut sind aus inaktivierten ganzen Viren, Bakterien, Pilzen und Protozoen, besitzen in diesem Adjuvanssystem eine größere immunologische Wirksamkeit. Dazu zählen die obengenannten Agentien und auch Mikrobakterien, Klostridia, enterische Bazillen, Vaccinia Virus und etc.

Das gereinigte, detoxifizierte Endotoxin wird zweckmäßigerweise in einer Konzentration von etwa 25 bis 200 µg pro Dosis zur Anwendung gebracht, wobei ein besonders verstärktes Immunansprechen bei etwa 100 µg pro Dosis stattfindet. Gewünschtenfalls können andere Komponenten oder Additive zusammen mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien zur Anwendung kommen.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Die Antikörperantwort von Mäusen, die mit einem viralen Maul- und Klauenseuchepeptid (FMD) allein und zusammen mit dem erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvans immunisiert worden waren, wurde untersucht. BALB/C-Mäusen mit einem Alter von 6 bis 8 Wochen wurde eine einzelne subkutane Injektion (0,2 ml) des synthetischen Maul- und Klauenseuche- Viruspeptid (FMD) verabreicht. Die verabreichte Dosis betrug 200 µg/Maus. Bei anderen Injektionen wurde FMD mit RDE und/oder LES kombiniert. RDE wurde in einer Dosis von 100 µg verabreicht. LES wurde mit der wäßrigen FMD-Lösung in einem Verhältnis von 1 : 1 V/V vermischt. Die Mischung wurde in einer Vortex-Apparatur 2 Min. bei Raumtemperatur behandelt. Die Mäuse wurden durch den retro-orbitalen Sinus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inokulation ausgeblutet.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefaßt:

Tabelle I

Antikörperansprechen von BALB/C-Mäusen, die mit FMD- viralem Peptid zusammen mit RDE-LES-Lipidemulsion immunisiert wurden

Obige Daten zeigen, daß die immunologischen Adjuvantien mit zwei Komponenten eine überraschende und unerwartete Verstärkung des Immunansprechens unter deutlicher Verlängerung der antigenischen Stimulation bewirken. Bei einer Dosis von 100 µg von RDE wurde ein beträchtlich stärkeres Immunansprechen beobachtet.

Beispiel 2

Bei dieser Untersuchung wurde BALB/C-Mäusen (6 Mäuse/ Gruppe) eine subkutane Injektion (0,2 ml/Tier) aus folgenden Bestandteilen verabreicht: Gruppe 1, 100 µg Dextran in Kochsalzlösung; Gruppe 2, 100 µg Dextran + 50 µg RDE in Kochsalzlösung; Gruppe 3, 100 µg Dextran + 50 µg RDE, emulgiert in einem gleichen Volumen von LES; Gruppe 4, 100 µg Dextran, emulgiert in einer Ampulle, die eine lyophilisierte Emulsion aus 50 µg RDE + 50 µg Trehalosedimycolat (TDM) enthielt; Gruppe 5 erhielt kein Antigen.

Am Tag 20 nach der ersten Immunisierung wurde allen Mäusen eine zweite Injektion gegeben, die auf die gleiche Weise hergestellt wurde wie die erste Injektion.

Einzelne Serumproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung durch Reihenausblutungen erhalten.

Die erzielten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Passive Hämagglutinin (HA)-Titer der Sera von Mäusen, die immunisiert wurden mit Dextran-Antigen allein oder in Kombination mit MPL-Adjuvans in verschiedenen Lösungen

Claims (12)

1. Immunologisches Adjuvans mit:

• (i) einer Lipidemulsion, die
  • a) ein metabolosierbares Öl,
  • b) ein Polyol mit einem niedrigen Molekulargewicht und
  • c) Lecithin enthält, und
• (ii) einem gereinigten, detoxifizierten bakteriellen Adjuvans.

2. Adjuvans nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das metabolisierbare Öl ein Fettöl ist, das vorwiegend aus Diglyceriden und Triglyceriden von Öl- und Linolsäuren besteht.

3. Adjuvans nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das metabolisierbare Öl ein pflanzliches oder ein tierisches Öl ist.

4. Adjuvans nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das pflanzliche Öl Erdnußöl, Sonnenblumensamenöl oder Safflorsamenöl ist.

5. Adjuvans nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das tierische Öl Squalen ist.

6. Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidemulsion etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% metabolisierbares Öl, etwa 30 bis 60 Gew.-% eines Polyols und etwa 1 bis etwa 15 Gew.-% Lecithin enthält

7. Adjuvanssystem, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Antigen und das immunologische Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.

8. Adjuvanssystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen und das gereinigte, detoxifizierte bakterielle Adjuvans in einer sterilen Kochsalzlösung vorliegen.

9. Adjuvanssystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Antigens in der sterilen Kochsalzlösung etwa 5 bis etwa 5000 µg/ml und die Konzentration des gereinigten, detoxifizierten bakteriellen Adjuvans in der sterilen Kochsalzlösung etwa 125 bis 1000 µg/ml betragen.

10. Adjuvanssystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidemulsion etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% eines metabolisierbaren Öls, etwa 30 bis 60 Gew.-% eines Polyols und etwa 1 bis 15 Gew.-% Lecithin enthält und daß die Konzentration des Antigens in der sterilen Kochsalzlösung etwa 5 bis etwa 5000 µg/ml und die Konzentration des gereinigten detoxifizierten bakteriellen Adjuvans in der sterilen Kochsalzlösung etwa 125 bis 1000 µg/ml betragen.

11. Adjuvans nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte, detoxifizierte bakterielle Adjuvans ein gereinigtes, detoxifiziertes Endotoxin, Trehalosedimycolat oder ein Protein von Salmonella typhimurium ist.

12. Adjuvanssystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte, detoxifizierte, bakterielle Adjuvans ein gereinigtes, detoxifiziertes Endotoxin ist.