CN103608031B - 用于治疗IFNα相关病况的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含与载体蛋白分子偶联的IFNα的免疫原性产物及其用于治疗IFNα相关病况的用途，所述免疫原性产物能够在体内诱导抗-IFNα抗体。

Description

用于治疗IFNα相关病况的方法
发明领域
本发明涉及一种免疫原性疫苗及其用于治疗IFNα相关病况例如系统性红斑狼疮的用途。
发明背景
I型IFN家族包括IFNα、IFNβ、IFNδ、IFN1、IFNκ、IFNτ和IFNω。主要形式是IFNα和单个IFNβ，其中IFNα在人中描述了13种紧密联系的蛋白。尽管事实上不同的I型IFN形式可促进不同的生物学应答，但所有的I型IFN在结构上是相关的(其基因缺少内含子并且位于9号染色体的短臂上)并且通过相同的受体亚基转导信号(Van Boxel-Dezaire等，Immunity2006；25：361-372)。
如今I型IFN与自身免疫性病症之间的联系的兴趣日益增加，因为其被诱导的信号，所谓的干扰素标记(signature)，最近已报道于患有不同的自身免疫性疾病的患者中(Baccala等Immunol Rev 2005；204：9-26)。事实上，由于其免疫调制剂作用，I型IFN似乎涉及各种自身免疫性病况的数种致病途径。
自身免疫中I型IFN致病相关性的范例为系统性红斑狼疮(SLE)。SLE是一种慢性疾病，其特征在于多器官累及，这归因于由针对自身抗原的自身抗体所导致的器官反常的损伤。SLE的病因复杂，涉及遗传因素和环境因素。SLE中IFNα的血清水平显示与疾病的严重性相关(Dall’era等Ann Rheum Dis 2005；64：1692-7)。
干燥综合征(syndrome(SS))，也被称作舍格伦综合征(siccasyndrome)，是影响外分泌腺，尤其是唾液腺和泪腺的慢性、全身性的自身免疫性病况。在患有该疾病的患者的血清中也已观察到升高的IFNα活性。最后，其它病况例如糖尿病、类风湿性关节炎、硬皮病、脉管炎和自身免疫性甲状腺炎也已显示出与IFNα的高水平相关。
Sedaghat等近来也提示I型IFN可能在HIV+患者中CD4+T细胞的缺失中起作用，因为他们显示I型IFN通过使平衡偏移向为短寿细胞的Th1效应物而非长寿记忆性T细胞来影响正常CD4+T细胞的稳态(Sedaghat等J.Virol.2008，82(4)：1870-1883)。这在Mandl等中被确认，其中提示了消除由浆细胞样树突状细胞的IFNα产生以缓解病理的免疫激活(Mandl等Nat.Med.2008)。
此外，已报道IFNα的施用加剧了患有牛皮癣、自身免疫性甲状腺炎和多发性硬化症的患者中的潜在疾病并在无自身免疫性疾病既往史的患者中诱导了SLE样综合征。
因此，有抑制IFNα活性的药物的需要。
目前在临床试验中正在用罗利珠单抗(rontalizumab)和西法木单抗(sifalimumab)测试利用单克隆中和抗体的被动免疫用于SLE的治疗。然而，所述治疗具有对于IFNα来说仅靶向这13个子集的一个子集的缺点并且被动施用单克隆抗体的用途可被抗药物抗体的诱导所限制。所述抗药物抗体可中和或以其他方式降低药物的临床疗效并且还可伴有与自体蛋白交叉反应相关的严重不良事件(De Groot等Trends.Immunol.2007，28(11))。
因此本发明提供了通过施用治疗有效量的免疫原性产物在体内抑制IFNα活性的方法及其用于治疗IFNα相关病况的用途，所述免疫原性产物允许主动免疫，其可打破B细胞的免疫耐受并产生高滴度的针对IFNα的多克隆中和抗体。
发明内容
本发明的一个目标是包含与载体蛋白分子偶联的IFNα的免疫原性产物，用于预防或治疗需要其的受试对象中的IFNα相关病况，其中待施用给受试对象的免疫原性产物的治疗有效量为每次施用高于30mcg、优选至少60mcg的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，所述治疗有效量的免疫原性产物的施用防止与IFNα的过量产生相关的疾病症状的发生。
在本发明的另一个实施方案中，所述治疗有效量的免疫原性产物的施用防止与IFNα的过量产生相关的疾病的爆发。
在本发明的另一个实施方案中，所述IFNα相关病况包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、脉管炎、HIV、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎和肌炎。
在本发明的另一个实施方案中，待施用给受试对象的免疫原性产物的治疗有效量为每次施用35mcg-1000mcg，优选60mcg-1000mcg的免疫原性产物。
在本发明的另一个实施方案中，将所述免疫原性产物在一个月内至少两次施用给受试对象。
在本发明的另一个实施方案中，将所述免疫原性产物每三个月另外施用给受试对象至少一次。
在本发明的另一个实施方案中，当在从受试对象获得的血清样品中检不出抗-IFNα抗体的量时，将所述免疫原性产物另外施用给所述受试对象。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物是强烈失活的，其意味着所述产物在测试B的条件中显示低于5％的抗病毒活性。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物在测试C的条件中能够中和IFNα的抗病毒活性。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含至少一种亚型的IFNα。
在本发明的另一个实施方案中，所述IFNα的亚型为IFNα2b并且所述载体蛋白分子为KLH。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物为疫苗，优选呈乳剂的形式。
本发明的另一个目标是包含高于30mcg的免疫原性产物的单位剂型，所述免疫原性产物包含如上文定义的与载体蛋白分子偶联的IFNα。
本发明的另一个目标是包含高于30mcg的免疫原性产物的医疗装置，所述免疫原性产物包含如上文定义的与载体蛋白分子偶联的IFNα。
本发明的另一个目标为一种试剂盒，其含：至少一个包含高于30mcg、优选至少60mcg的免疫原性产物的小瓶，所述免疫原性产物包含如上文定义的与载体蛋白分子偶联的IFNα；至少一个包含佐剂的小瓶；以及用于使所述免疫原性产物与所述佐剂接触和用于乳化水性溶液与所述佐剂的混合物的工具。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含
-至少一个包含高于30mcg、优选至少60mcg的根据本发明的免疫原性产物的小瓶，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子偶联的IFNα；以及用于溶解所述免疫原性产物优选于水性溶液中的工具，或者
-至少一个包含溶液、优选水性溶液的小瓶，所述溶液、优选水性溶液包含高于30mcg、优选至少60mcg的根据本发明的免疫原性产物，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子偶联的IFNα；和
-至少一个包含佐剂的小瓶；以及用于使所述溶液与所述佐剂接触和用于乳化所述溶液与所述佐剂的混合物的工具。
定义
本文所用术语“干扰素α”或“IFNα”是指与IFNα1(Genbank号NP_076918或由Genbank号NM_024013编码的蛋白)具有75％或更高序列同一性的由干扰素α基因座的功能基因编码的IFNα蛋白。人IFNα亚型的实例包括：IFNα1(Genbank号NP_076918)、IFNα2a(Genbank号ITF_A)、IFNα2b(Genbank号AAP20099)、IFNα4(Genbank号NP_066546)、IFNα5(Genbank号P01569)、IFNα6(P05013)、IFNα7(Genbank号P01567)、IFNα8(Genbank号P32881)、IFNα10(Genbank号P01566)、IFNα14(Genbank号P01570)、IFNα16(Genbank号NP_002164)、IFNα17(Genbank号P01571)和IFNα21(Genbank号NP_002166)。如本领域技术人员众所周知的，非人的哺乳动物IFNα亚型的实例可见于Genbank(综述参见Pestka等Immunological reviews 2004，202：8-32)。
本文所用术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原递呈细胞、吞噬细胞以及由以上细胞或肝脏产生的大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的活动。
本文所用“抑制IFNα的生物活性”或“中和IFNα的生物活性”的抗体意指例如通过使用功能性测定例如实施例中所述的那些，与不存在所述抗体的情况下该细胞因子的活性水平相比，以至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多来抑制该细胞因子的活性的抗体。
本文所用术语“载体蛋白分子”是指长度为至少15个氨基酸的蛋白或肽，当与IFNα分子部分共价相连以形成异源复合体时，允许大量的IFNα抗原被提呈给B淋巴细胞。
本文所用术语“受试对象”包括任何的人或非人的哺乳动物，例如灵长类动物、犬、猫、牛、羊等。
本文所用术语“患者”是指受IFNα相关病况影响的受试对象。
本文所用术语“有效量”是指足以导致有益的或所需的临床结果(例如临床症状的改善)的量。
本文所用术语“治疗”是指临床干预，力图改变待治疗受试对象或待治疗患者疾病的自然病程，并且可用于预防或在临床病理过程期间进行。所需效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、遏制、减少或抑制疾病的任何直接或间接的病理后果、降低疾病的进展速度、改善或缓和疾病状态、并引起缓解、维持缓解状态或改善的预后。
具体实施方式
尽管体内天然存在IFNα的调节物，其调节疾病(例如SLE和SS)中细胞因子水平的能力显得有所不足。本发明的抗-IFNα治疗性免疫的目的旨在提高针对细胞因子的抗体水平，同时增强它们的亲和力和中和活性，从而导致过量的细胞因子的减少并抑制其致病作用，而不干扰其他的代谢过程和生理过程。
本发明的一个目标是用于治疗需要其的受试对象中IFNα相关病况的方法，所述方法包括向所述受试对象施用治疗有效量的包含与载体蛋白分子偶联的IFNα的免疫原性产物，其中所述治疗有效量为每次施用高于30mcg(μg)的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，所述治疗有效量为每次施用至少60mcg(μg)的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至1000mcg、优选高于60mcg至1000mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至750mcg，、优选高于60mcg至750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至500mcg、优选高于60mcg至500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至450mcg、优选高于60mcg至450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至400mcg、优选高于60mcg至400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至350mcg、优选高于60mcg至350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至300mcg、优选高于60mcg至300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至250mcg、优选高于60mcg至250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至200mcg、优选高于60mcg至200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至150mcg、优选高于60mcg至150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至100mcg、优选高于60mcg至100mcg。
在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至1000mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至100mcg。
在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至1000mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至240mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至120mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至100mcg。
在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为从40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg、100mcg、110mcg、120mcg、130mcg、140mcg、150mcg、160mcg、170mcg、180mcg、190mcg、200mcg、210mcg、220mcg、230mcg、240mcg、250mcg、260mcg、270mcg、280mcg、290mcg、300mcg、310mcg、320mcg、330mcg、340mcg、350mcg、360mcg、370mcg、380mcg、390mcg至400mcg。
在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至240mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为120mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为240mcg。
在一个实施方案中，所述治疗有效量对应于利用如本领域熟知的Bradford蛋白测定来确定的总蛋白的量。
在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象在一个月内被施用如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物至少两次。
在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象在一个月内被施用两次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。在该实施方案中，所述受试对象可在第0天给药一次并在第7天和第28天之间第二次给药。在另一个实施方案中，受试对象在第0天给药一次并在第7天和第21天之间第二次给药。在一个实施方案中，受试对象在第0天给药一次并在第28天第二次给药。
在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象在一个月内被施用三次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。在该实施方案中，所述待治疗的受试对象可在第0天给药一次，在第7天和第14天之间第二次给药并在第21天和第28天之间第三次给药。在一个实施方案中，所述受试对象在第0天给药一次，在第7天第二次给药并在第28天第三次给药。
在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象在三个月内被施用四次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。在该实施方案中，所述待治疗的受试对象可在第0天给药一次，在第7天和第14天之间第二次给药，在第21天和第28天之间第三次给药并在第77天和第84天之间第四次给药。在一个实施方案中，受试对象在第0天给药一次，在第7天第二次给药，在第28天第三次给药并在第84天第四次给药。
在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每三个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内三次给药，并接着每三个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在三个月内四次给药，并接着每三个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每六个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并接着每六个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并接着每年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每五年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并接着每五年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每十年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并接着每十年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的另一个实施方案中，当针对IFNα的抗体的量在从受试对象中获得的血清样品中检不出时，所述待治疗的受试对象可另外被施用如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并当针对IFNα的抗体的量在从所述受试对象中获得的血清样品中检不出时，接着另外被施用如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
血清样品中针对IFNα的抗体的量的定量可通过本领域已知的常规方法如抗-IFN的ELISA来进行。
进行此类方法的一个实例为以下：
-用100ng用于制备所述免疫原性产物的IFNα的亚型例如IFNα-2b包被96孔板并在2℃-8℃下将板孵育过夜，
-在37℃下，90分钟期间用封闭缓冲液封闭板，
-在37℃下，90分钟期间用血清样品和空白(naive)样品库孵育板：以两倍系列稀释典型地稀释血清样品，从稀释200倍起始，至至少8次稀释，
-用标记的二抗例如与HRP结合的羊抗人的免疫球蛋白孵育板，
-复合物用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物溶液显色。在终止酶反应后，所得颜色的强度通过分光光度法于492nm处确定。
各样品的抗IFN滴度表示为平均OD值高于临界值的最小稀释度：
临界值＝空白血清库的平均OD x 2.08
其中N临界值等于2.08。
接下来，各样品的抗IFN滴度将表示为平均OD值高于所述临界值的最小稀释度。最初稀释度为200，若在1/200的OD低于所述临界值则患者视为阴性(Mire-Sluis等2004J.Immunol Meth.289：1-16)。
在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象患有IFNα相关病况。
在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象在血清中显示检不出量的抗-IFNα抗体。
[作用机制]
本发明还涉及可用于在施用了其的哺乳动物中诱导免疫应答(包括体液免疫应答，其中抗体中和了内源性细胞因子IFNα的免疫抑制性质、凋亡性质或血管生成性质)的免疫原性产物。
本发明还涉及用于在需要其的哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括将如上文所述的免疫原性产物施用给所述哺乳动物。在一个实施方案中，所述免疫应答包括体液免疫应答，其中中和内源性细胞因子的免疫抑制性质、凋亡性质或血管生成性质的抗体被诱导。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫原性产物是失活的且是与T辅助刺激外来载体蛋白例如KLH化学偶联的IFNα的免疫原性细胞因子衍生物。所述免疫原性产物具有破坏B细胞对IFNα的耐受而非T细胞对IFNα的耐受的能力。针对自身的辅助性T细胞的耐受通过将IFNα连接所述外来载体蛋白来避免。
特异性针对IFNα的B细胞在抗原结合后被激活，内吞免疫原性产物，并且载体特异性肽经由主要组织相容性复合体(MHC)II类分子来提呈。在T依赖性抗原的情况下该活化信号不足以诱导B细胞的分化，但由于B细胞加工自身抗原和所述载体抗原，T细胞辅助可通过特异性针对所述自身蛋白或所述载体蛋白的T细胞来实现。由于T细胞的选择是非常严格的，因此没有针对自身抗原的特异性T细胞活化。
树突状细胞(DC)也可摄取自身抗原和载体分子并经由其MHC II类分子提呈载体特异性肽。因此DC能够激活特异性针对载体的初始T辅助细胞。T辅助细胞反过来能够将载体-特异性T辅助细胞提供给特异性针对自身抗原的B细胞和将载体肽提呈在其MHC II类分子上。
特异性针对载体的T辅助细胞与特异性针对自身抗原的B细胞相互作用，引发针对自身抗原的正常的抗体应答。
所述免疫原性产物主要用于治疗与IFNα的过量产生相关的疾病的疫苗组合物中。
更特别地，本发明涉及用于治疗与IFNα的过量产生相关的疾病的方法，其包括向受试对象施用治疗有效量的本发明的免疫原性产物的步骤。
本发明还涉及用于治疗与IFNα的过量产生相关的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物的施用防止了所述疾病的症状的发生。
本发明还涉及用于治疗与IFNα的过量产生相关的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物的施用防止了所述疾病的爆发。
本发明还涉及用于治疗与IFNα的过量产生相关的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物的施用诱导了中和内源IFNα活性的抗体的产生。
本发明还涉及用于治疗与IFNα的过量产生相关的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物的施用诱导了内源IFNα的活性的中和。
与IFNα的过量产生相关的疾病的实例包括但不限于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、脉管炎、HIV、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎和肌炎。
本发明的另外的目标由诱导抗体产生的方法组成，所述抗体中和受试对象中内源IFNα的活性，所述方法包括向所述受试对象施用治疗有效量的免疫原性产物的步骤。
[免疫原性产物]
本发明所用的免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中所述免疫原性产物是失活的。
本发明所用的免疫原性产物为至少一种重组IFNα亚型和至少一种载体蛋白分子例如KLH之间的复合物，所述复合物通过用戊二醛偶联并随后用甲醛灭活获得。
在本发明的一个实施方案中，所述载体蛋白分子可为免疫学中常规使用的任何载体分子例如：KLH(钥孔戚血蓝蛋白)、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、破伤风类毒素、白喉类毒素(toxoid diphteric)、霍乱毒素B、突变的无毒性白喉毒素(CRM197)、脑膜炎奈瑟氏菌外膜囊泡的外膜蛋白、不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白、铜绿假单胞菌毒素A、病毒样颗粒(VLP)等。在一个优选的实施方案中，所述载体为KLH。优选地，所述KLH起始产物由从对海洋腹足软体动物大锁孔帽贝(Megathura cremulata)的淋巴中提取的高度纯化的KLH。天然产生的KLH一般由二-十聚体结构组成，其为20个亚基的非共价管状组合体。
在本发明的另一个实施方案中，重组IFNα亚型可为IFNα1、IFNα2a、IFNα2b、IFNα4、IFNα5、IFNα6、IFNα7、IFNα8、IFNα10、IFNα14、IFNα16、IFNα17和IFNα21中的任何亚型。
重组IFNα亚型可由本领域已知的常规方法利用如上文所述的来自Genbank的序列来获得。例如，重组IFNα亚型的产生可通过培养包含含有所述IFNα亚型的基因的表达质粒的细胞并接着收获包涵体并最后纯化所述IFNα亚型来进行。
在本发明的一个实施方案中，重组IFNα亚型为IFNα2b亚型。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫原性产物至少包含IFNα2b亚型。
在本发明的一个实施方案中，重组IFNα亚型在液态溶液中，优选在呈pH在3.5-7.8、优选6-7.8的缓冲液中。
在一个实施方案中，当待治疗的受试对象为人时，所用重组IFNα为人的。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中所述免疫原性产物被抗-IFNα抗体识别。
免疫原性产物被抗-IFNα抗体的识别可通过本领域已知的常规方法例如夹心ELISA抗-IFNα/载体蛋白来进行。所述ELISA(测试D)通过本领域已知的任何比色方法来显色，所述比色方法例如使用生物素标记的检测抗体、聚链霉亲和素HRP扩增体系和邻苯二胺二盐酸盐底物溶液。
所述方法的一个实例为以下：
-用捕获抗体例如兔多克隆抗-KLH抗体包被板，
-在37℃下，90分钟期间用封闭缓冲液(例如含2％酪蛋白的PBS)封闭板，
-在37℃下，90分钟期间用从250ng/ml至8次两倍稀释的系列稀释的免疫原性产物或阴性对照例如KLH和IFNα孵育板，
-在37℃下将板用检测抗体例如生物素化的抗-IFNα抗体孵育90分钟，
-在37℃下，30分钟期间用链霉亲和素-HRP孵育板并在30分钟期间将复合物用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物显色。终止酶反应后，所得颜色的强度通过分光光度法于490nm处确定。
当包含所述免疫原性产物的孔的光密度是包含阴性对照的孔的光密度至少10倍高时，本领域的技术人员认为所述免疫原性产物被抗-IFNα抗体识别并且所述免疫原性产物中的IFNα与KLH偶联。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中所述免疫原性产物是强免疫原性的，这意指所述产物在以下测定的测试A的条件中能够在体内诱导抗-IFNα的抗体。
测试A依据以下方法进行：
将0.3-10μg所述免疫原性产物的总蛋白(如通过Bradford蛋白测定确定)在30天内(优选在第0天和第21天)两次注射至6-8周的Balb/c小鼠中。在免疫前获得血清样品(免疫前的血清样品)并在第30天至第40天之间、优选在第31天获得血清样品(测试血清样品)。抗-IFNαELISA如上文所说明的进行。
简言之，用100ng用于制备所述免疫原性产物的IFNα亚型例如IFNα-2b包被96孔板并在2℃-8℃孵育过夜。然后将板在37℃下90分钟期间用封闭缓冲液封闭，将以1/2500稀释的100μl免疫前样品和从1/2500至8次两倍系列稀释的(免疫前和测试)血清样品加入孔中。最后将标记的抗小鼠免疫球蛋白的二抗例如HRP结合的抗体加入孔中并用本领域中已知的任何比色法例如邻苯二胺二盐酸盐底物溶液将ELISA显色。
当包含所述测试血清样品的孔的光密度是包含所述免疫前血清样品的孔的光密度的至少2倍高时，本领域的技术人员认为所述免疫原性产物是有免疫原性的，其意指其已在体内诱导了抗-IFNα的抗体。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中IFNα是强烈失活的，其意指在下面引用的测定B的条件中所述产物显示出低于5％、优选低于1％的IFNα的抗病毒活性。在一个实施方案中，浓度为500ng/mL或更高的本发明的免疫原性产物在测定B的条件中显示出低于5％、优选低于1％的浓度在500ng/mL或更高的IFNα的抗病毒活性。
该测定是基于IFNα对水泡性口炎病毒(VSV)之于马-达氏牛肾(MDBK)细胞的细胞病变效应(CPE)的保护作用。该测定也可利用Hep-2C或A549人细胞及EMCV病毒进行。
测定B依照以下方法进行：
将所述免疫原性产物和用于制备所述免疫原性产物的重组IFNα亚型(阳性对照)各自以至少500ng/ml和至少1000U/ml稀释于基础培养基(补充了2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1mM Hepes的RPMI)中。将50μl的免疫原性产物和阳性对照置于96孔板中并以两倍稀释系列稀释于基础培养基中。将含2×104个MDBK细胞的50μl细胞培养基(补充有4％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM Hepes的RPMI)加入各孔中并将板在37℃、5％CO2下孵育过夜。接着将病毒稀释于基础培养基至至少10倍TCID50(组织培养感染剂量50：杀死50％感染细胞的稀释度的10倍)。倾空板并加入100μl所述稀释的病毒。接着将板于37℃，5％CO2下孵育过夜。
在培养结束时，所述MDBK细胞的生活力用本领域熟知的方法来评价。所述方法的一个实例为以下：将20μl/孔的MTS/PMS溶液(100μl MTS/5μl PMS；Promega G5430)加入孔中并将板在37℃、5％CO2下再孵育4小时。接着将板在分光光度计上于490nm处读数。
如下计算抗病毒活性的百分比：
抗病毒活性％＝[(OD产物-OD病毒)/平均OD细胞-OD病毒)]*100
OD产物表示含所述免疫原性产物或含所述阳性对照(IFNα亚型)的孔的光密度。
OD病毒表示仅含病毒的对照孔的光密度。
OD细胞表示含IFNα和病毒的对照孔的光密度。
EC50值，相对应导致50％抑制病毒介导的死亡的免疫原性产物的量，通过将在生活力/浓度图上的x轴上插入所述EC50值来确定。
对比所述免疫原性产物的EC50与所述阳性对照(用于制备所述免疫原性产物的重组IFNα亚型)的EC50允许确定所述免疫原性产物是否显示低于5％、优选低于1％的抗病毒活性。
可计算失活系数EC50产物/EC50IFNα：当所述免疫原性产物显示出低于5％、优选显示出低于1％的抗病毒活性时，所述失活系数大于20，优选大于100。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中所述免疫原性产物能够在以下引用的测试C的条件中中和IFNα的抗病毒活性。依照本发明，进行该测定以评价从免疫了所述免疫原性产物的小鼠中获得的血清的中和能力。所述中和能力可通过存在在MDBK细胞中复制的水疱性口炎病毒的情况下评价细胞生活力来评估。该测定还可利用Hep-2C人细胞及EMCV病毒进行。
测定C依照以下方法进行：
将0.3-10μg所述免疫原性产物的总蛋白(如通过Bradford蛋白测定确定的)在30天内(优选在第0天和第21天)两次注射至6-8周的Balb/c小鼠中。在免疫前获得血清样品(免疫前的血清样品)并在第30天至第40天之间、优选在第31天获得血清样品(测试血清样品)。
将25μl的免疫前血清样品和测试血清样品以1/200稀释从1/200至8次稀释接种于96孔板中。将阳性对照(来自PBL，Piscataway，NJ，ref.31100-1的多克隆抗-IFNα)以3125UI/孔-100UI/孔而典型地稀释于基础培养基(补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mMhepes的RPMI)中以能够中和IFNα活性并取25μl也接种于板中。
将25μl含25U/孔(终浓度)IFNα的基础培养基加入各孔中并将板在室温下孵育60分钟。
将含20000个MDBK细胞的测定培养基(补充有4％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM Hepes的RPMI)加入各孔中并将板在37℃、5％CO2下孵育过夜。
将病毒稀释于病毒培养基(补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM hepes的RPMI)中至至少10倍TCID50(杀死50％感染细胞的稀释度的10倍)。倾空板并将100μl病毒加入各孔中，接着将板于37℃、5％CO2下孵育24小时。
在培养结束时，MDBK细胞的生活力用本领域熟知的方法来评价。所述方法的一个实例为以下：将20μl/孔的MTS/PMS溶液(100μl MTS/5μl PMS；Promega G5430)加入孔中并将板在37℃/5％CO2下再孵育4小时。接着将板在分光光度计上于490nm处读数。
如下计算相对细胞生活力：
％＝[(OD样品-OD病毒)/平均ODIFN+病毒)]*100
OD样品表示含从免疫了所述免疫原性产物的小鼠中获得的血清或含阳性对照(多克隆抗IFN的抗体)的孔的光密度。
OD病毒表示仅含病毒的对照孔的光密度。
ODIFN+病毒表示含IFNα和病毒的对照孔的光密度。
NC50值，对应于导致50％中和病毒介导的死亡的血清的稀释度，表示为稀释系数或中和单位/ml，通过将NC50值插入在生活力/浓度图上的x轴上来确定。
在测试C中，显示从免疫了免疫原性产物的小鼠中获得的血清并不使MBDK细胞免受死亡的结果意味着，所述免疫原性产物具有诱导直接针对IFNα的中和其抗病毒活性的抗体的能力。
在一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中所述免疫原性产物能够在测试C的条件中中和至少50％的IFNα的抗病毒活性。在所述实施方案中，可计算NC50。若血清的稀释度并不能够在测试C的条件中中和至少50％的IFNα的抗病毒活性，则不能计算所述产物的NC50。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中IFNα/载体的重量比为0.06-0.6。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中IFNα/载体比率为0.1-0.5。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中IFNα/载体比率为0.3。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNα，其中IFNα/载体比率为0.05、0.1、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.5。
所述比率可依据基于如实施例10中所述的紫外光检测和荧光检测(测试E)的方法来计算。
[获得免疫原性产物的方法]
在本发明的一个实施方案中，依据以下方法获得IFNα kinoid：
a)将至少一种重组人IFNα亚型和至少一种载体蛋白分子与戊二醛混合并通过加入选自以下的淬灭化合物来阻断反应：(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物构成的组的氨基酸，
b)移除分子量小于10kDa或小于8kDa的化合物
c)加入甲醛；
d)通过加入选自以下的淬灭化合物来阻断与甲醛的反应：(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物构成的组的氨基酸，
e)收集所述免疫原性产物。
在步骤a)的一个实施方案中，首先将IFNα和载体蛋白分子例如KLH以合适的量混合，并接着加入戊二醛。
在一个实施方案中，在步骤a)中IFNα和KLH以10∶1-40∶1的IFNα∶亚基KLH摩尔比混合。在另一个实施方案中，在步骤a)中IFNα和KLH以15∶1-25∶1的IFNα∶亚基KLH摩尔比混合。在另一个实施方案中，在步骤a)中IFNα和KLH以20∶1-25∶1的IFNα∶亚基KLH摩尔比混合。
在步骤a)的一个实施方案中，在反应混合物中所用的戊二醛的终浓度为1mM-250mM、优选20mM-30mM、更优选22.5mM-25mM。在步骤a)的一个实施方案中，将戊二醛与IFNα和KLH孵育15分钟-120分钟的时间、优选约30、35、40、45、50、60、70、80、90分钟的时间。在一个实施方案中，在约45分钟期间以22.5mM加入戊二醛。有利的是，在18℃-37℃、优选在18℃-27℃的温度下，进行与戊二醛孵育的步骤a)。
根据实施方案，在移除分子量小于10kDa的化合物(步骤b)之前，与戊二醛的反应(步骤a)通过加入淬灭化合物、优选选自以下的淬灭化合物：(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物构成的组的氨基酸来终止。
还原剂可以由本领域中已知的任一种还原剂组成，由于其还原性，其具有还原醛处理期间产生的剩余的亚胺基(imine groupment)的能力。所述还原剂可选自由硼氢化钠和氰基硼氢钠构成的组。
根据实施方案，在其中所述淬灭化合物为氨基酸的实施方案中，所述氨基酸由甘氨酸组成。在步骤b)的一些实施方案中，当甘氨酸和/或赖氨酸用于阻断与戊二醛的反应时，所选氨基酸在反应混合物中所用终浓度为0.01M-1M、优选0.05M-0.5M，并最优选0.08M-0.2M，例如如本文的实施例中所示的0.1M。在一个实施方案中，用淬灭化合物孵育进行一段时间，所述时间范围为从1分钟-120分钟、优选5分钟-60分钟，例如如本文的实施例中所示的30分钟。在另一个实施方案中，该步骤在18℃-30℃、优选18℃-25℃的温度下进行。
在步骤b)中，移除了反应混合物中存在的小于10kDa的小化合物。这些小化合物主要包括未与IFNα也未与KLH反应的过量的戊二醛和过量的淬灭化合物分子。步骤b)可根据允许移除小于10kDa的化合物的任何已知的技术进行，该技术包括用10kDa截留的透析膜的透析或用10kDa截留的滤膜的过滤。说明性地，步骤b)可由利用10kDa截留的滤膜的切向流过滤的步骤组成，如本文实施例中所示。在步骤b)结束时收集不含非所需小化合物的过滤截留物。若需要，步骤b)可包含移除在步骤b)结束时获得的反应混合物中存在的最终化合物聚集物的预备步骤。所述预备步骤可由用于移除最后存在于液体溶液中的悬浮液中的聚集物的常规过滤步骤组成，例如使用适当的滤膜的过滤步骤，例如孔径为0.2μm的滤膜。
在所述方法的步骤c)的一个实施方案中，加入终浓度为6mM-650mM、优选25mM-250mM的甲醛。在所述方法的步骤c)的一个实施方案中，以从1小时-336小时、优选1小时-144小时的时间段加入甲醛。在一个实施方案中，在20-50小时期间、优选40小时期间应用终浓度为50-100mM、优选66mM的甲醛。
在步骤c)，如在本发明的实施例中所示，用甲醛孵育优选在30℃-40℃、例如37℃的温度下进行。
在所述方法的步骤d)，与甲醛的反应通过加入淬灭化合物来终止，淬灭化合物优选选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸。
所述还原剂可以由本领域中已知的任一种还原剂中组成，由于其还原性，其还原还原醛处理期间产生的残留亚胺基。所述还原剂可选自由硼氢化钠和氰基硼氢钠组成的组。根据实施方案，在其中所述淬灭化合物为氨基酸的实施方案中，所述氨基酸由甘氨酸组成。在步骤b)的一些实施方案中，当甘氨酸和/或赖氨酸用于阻断与甲醛的反应时，所选氨基酸在反应混合物中所用终浓度为0.01M-1.5M、优选0.05M-1M，并最优选0.1M-0.2M，例如如本文的实施例中所示的0.1M。在一个实施方案中，用淬灭化合物孵育进行一段时间，所述时间范围从5分钟-120分钟，优选10分钟-60分钟，例如如本文的实施例中所示的30分钟，如在本发明的实施例中所示。在另一个实施方案中，该步骤在18℃-30℃、优选18℃-25℃的温度下进行。
根据所述方法的一个实施方案，就在步骤e)收集前，技术人员可通过本领域已知的用于从液态溶液移除分子量小于100kDa的物质的任何技术，进行分子量小于100kDa的物质的移除。在第一实施方案中，所用技术为使用截留值为至少100kDa的滤膜来进行的过滤步骤，其包括超滤步骤或切向流过滤步骤。在第二实施方案中，所用技术由使用截留值为至少100kDa的滤膜的切向流过滤步骤组成。在另一个实施方案中，就在步骤e)收集前，可通过使用截留值为至少300kDa的滤膜来进行分子量小于300kDa的物质的移除。
[包含此类乳剂的组合物、乳剂和疫苗]
本发明涉及包含如本文上述的免疫原性产物的组合物。本发明还涉及本发明的产物的制剂，其中所述产物在乳剂内。有利的是，本发明的疫苗组合物包含所述乳剂或由所述乳剂组成。此类乳剂包含本发明的免疫原性产物，油和表面活性剂或至少一种油和至少一种表面活性剂的混合物。优选所述油或所述油/表面活性剂的混合物为药学上可接受的赋形剂。更优选地，油和表面活性剂的混合物为佐剂，甚至更优选为免疫佐剂。优选的佐剂是ISA51。可用的免疫佐剂的另一个实例是SWE(基于角鲨烯的水包油型乳剂)。可用的免疫佐剂的另一个实例是SWE-a(基于角鲨烷的水包油型乳剂)。本发明的乳剂可为油包水型乳剂或水包油型乳剂。
在另一个实施方案中，根据本发明的免疫原性产物的量为所述乳剂的总重量的高于0.01％(w/w)和低于1％(w/w)。
[佐剂]
本发明的乳剂或疫苗组合物可包含佐剂、特别是免疫佐剂。在一个实施方案中，所述佐剂的量为疫苗组合物的总重量的0.00001％(w/w)-1％，优选0.0001-0.1％，更优选0.001-0.01％(w/w)。
技术人员已知的任何合适的佐剂可用于以上的疫苗组合物，包括油基佐剂，例如如弗氏不完全佐剂、基于霉菌酸酯的佐剂(例如，海藻糖二霉菌酸酯)、细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(即胞壁质、粘肽或糖蛋白如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]、或者MDP类似物)、MPL(单磷酰脂A)、蛋白聚糖(例如从肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中提取的蛋白聚糖)、链球菌制剂(例如OK432)、必思添(Biostim).TM.(例如，01K2)、EP 109 942、EP 180 564和EP231 039的“Iscoms(免疫刺激复合物)”、氢氧化铝、皂甙、DEAE-葡聚糖、中性油(如miglyol(二辛酸/癸酸丙二醇酯))、植物油(如花生油)、脂质体、普朗尼克(Pluronic).RTM.多元醇、Ribi佐剂系统(见例如，GB-A-2 189 141)、或白介素，特别是刺激细胞介导的免疫的那些。美国专利第4,877,612号中已经描述了由放线菌目中的一个细菌属无枝酸菌属(Amycolata)的提取物构成的可选佐剂。另外，也可使用SWE(含角鲨烯3.9％、司盘(span)0.47％，吐温80 0.47％的柠檬酸盐缓冲液)和SWE-a(含角鲨烷3.9％、司盘0.47％，吐温800.47％的柠檬酸盐缓冲液)。此外，专属佐剂混合物是市售的。所用佐剂将部分取决于受体生物体。施用佐剂的量也将取决于动物的种类和大小。最佳剂量可很容易通过常规方法来容易确定。
适用于油包水型乳剂的油佐剂可包含矿物油和/或可代谢油。矿物油可选自Bayol、Marcol.和Drakeol，包括Drakeol6VR(SEPPIC，法国)。可代谢油可选自SP油(下文描述)、Emulsigen(MPV Laboratories，罗尔斯顿，新西兰(Ralston，NZ))、Montanide264，266，26(Seppic SA，巴黎，法国)以及植物油，例如花生油、大豆油、动物油例如鱼油、角鲨烷和角鲨烯、和生育酚及其衍生物。
此外，所述佐剂可包含所述佐剂体积的约0.1％-25％、更优选约1-10％、以及更优选约1-3％的量的一种或多种润湿剂或分散剂。特别优选的湿润剂或分散剂为非离子型表面活性剂。可用的非离子型表面活性剂包含聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物，特别以商标Pluronic(普朗尼克)出售并且可来自BASF公司(Mt.Olive，N.J)的那些。其他可用的非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯酯例如商标为吐温80的聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯或二缩甘露醇单油酸酯。所需的可以是佐剂中包含多于一种、例如至少2种润湿剂或分散剂作为本发明的疫苗组合物的一部分。
合适的佐剂可包括但不限于本领域的技术人员已知的表面活性剂，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵、N，N-双十八烷基-N′-N-双(2-羟乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六烷基-甘油和普朗尼克多元醇；聚阴离子(polanion)，如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸、聚羧乙烯；肽，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸(aimethylglycine)、促吞噬素、油乳剂、明矾、及其混合物。其他潜在的佐剂包括大肠杆菌不耐热毒素的B肽亚基或霍乱毒素的B肽亚基。McGhee，J.R.，等，″On vaccinedevelopment，″Sem.Hematol.，30：3-15(1993)。
[另外的表面活性剂]
在含乳剂的根据本发明的疫苗组合物的实施方案中，所述疫苗组合物除所述免疫原性产物和一种或多种油质免疫佐剂物质的组合之外，优选还包含一种或多种表面活性剂。表面活性剂的示例性实施方案包括二缩甘露醇单油酸酯例如由Arlacel(SEPPIC，France)出售的Montanide80。
在一个实施方案中，表面活性剂的量为疫苗组合物的总重量的0.00001％(w/w)-1％、优选0.0001-0.1％、更优选0,001-0.01％(w/w)。
[冻干产品]
根据一个实施方案并出于储存的目的，本发明的产物或疫苗组合物可被冻干。因此疫苗组合物可呈冷冻干燥(冻干)的形式。在所述的实施方案中，根据本发明的免疫原性产物结合一种或多种冻干辅助物质。各种冻干辅助物质为本领域的技术人员所众所周知的。辅助物质的冻干包括糖例如乳糖和甘露糖醇。
在此类实施方案中，当疫苗组合物由冻干的组合物组成，用于以包含表面活性剂的液体乳剂来使用时，所述疫苗组合物优选包含所述疫苗组合物的总重量的高于0.1％(w/w)并小于10％(w/w)的量的根据本发明的免疫原性产物。
[稳定剂]
在一些实施方案中，所述疫苗可与稳定剂混合，例如以保护易发生降解的蛋白不被降解、以提高疫苗的保质期或提高冷干效率。可用的稳定剂是i.a，SPGA(Bovarnik等；J.Bacteriology 59：509(1950))、碳水化合物(例如：山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖)、蛋白质(例如白蛋白或酪蛋白或其降解产物)、氨基酸的混合物(所述氨基酸例如赖氨酸或甘氨酸)以及缓冲液(例如碱金属磷酸盐)。
[给药途径]
本发明的疫苗组合物可通过任何常规的方法施用于待免疫的受试对象，包括通过注射，例如皮内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射，或通过局部递送，例如通过经皮递送。所述治疗可由一段时间内的单一剂量或多个剂量来组成。
[剂型]
适于注射使用的形式可包括无菌溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。预防微生物污染可通过在所述疫苗组合物中添加例如各种抗细菌剂和抗真菌剂的防腐剂来实现，所述防腐剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等。在许多情况下，可优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠，以在注射过程中减轻疼痛。注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
根据一种实施方案，本发明的冻干的疫苗组合物溶解于注射用水中并轻轻混合；然后添加免疫佐剂优选ISA51；将混合物轻轻混合以乳化并装入合适的注射器中。因此，本发明还涉及一种医疗装置，包括装有或预装有本发明的疫苗组合物的注射器。理想地即时制备乳剂。然而，包含乳剂的注射器可在2-8℃下存储少于10个小时。在这种情况下，注射前应允许通过手之间的摩擦将乳剂温热。
[单位剂量范围]
本发明的另一个目标是包含范围在高于30mcg-1000mcg的免疫原性产物的量的剂量单位。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-1000mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-750mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-500mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-450mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-400mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-350mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-300mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-250mcg的免疫原性产物的量。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-1000mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-240mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-120mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-100mcg。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg、100mcg、110mcg、120mcg、130mcg、140mcg、150mcg、160mcg、170mcg、180mcg、190mcg、200mcg、210mcg、220mcg、230mcg、240mcg、250mcg、260mcg、270mcg、280mcg、290mcg、300mcg、310mcg、320mcg、330mcg、340mcg、350mcg、360mcg、370mcg、380mcg、390mcg至400mcg的免疫原性产物的量。
在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在60mcg-240mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在60mcg-120mcg的免疫原性产物的量。
在另一个实施方案中，所述剂量单位包含60mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含120mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含240mcg免疫原性产物的量。
[试剂盒和医疗装置]
本发明还涉及包含以下的试剂盒：
-1个小瓶(1号小瓶)，包含(典型地3mL)本发明的免疫原性产物；
-1个小瓶(2号小瓶)，包含佐剂，优选ISA51；该小瓶能够包含3mL佐剂并可为8mL的容器；
-1个注射器，典型地为1mL的Braun Injekt-F；
-1个针头(1号针头)，用于乳剂制备；该针头优选为20G针头；
-1个针头(2号针头)，用于注射，优选肌内注射；该针头优选为23G针头。
本发明还涉及用于从所述试剂盒制备疫苗的方法，所述方法包括：
(1)从2号小瓶中吸取0.4ml佐剂。将该注射器内容物放入含0.4ml免疫原性产物的1号小瓶中。
(4)将总的小瓶内容物向上向下抽动足够多次(典型地30次)，用于乳化所述内容物，并最终抽取全部的乳剂。
注射之前，优选用2号针头换掉1号针头，并且从注射器中清除空气。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含：
-1个小瓶(1号小瓶)，包含0.4mL本发明的免疫原性产物；
-1个小瓶(2号小瓶)，包含至少0.4mL佐剂，优选ISA51；
-1个注射器，典型地为1mL的Braun Injekt-F；
-1个针头(1号针头)，用于乳剂制备；该针头优选为20G针头；
-1个针头(2号针头)，用于注射，该针头优选为23G针头。
在另一个实施方案中，所述免疫原性产物呈冻干形式。因此，所述试剂盒包含：
-1个小瓶(1号小瓶)，包含(典型地3mL)本发明的冻干产物；
-1个小瓶(2号小瓶)，包含(典型地2mL)注射用水；
-1个小瓶(3号小瓶)，包含佐剂，优选ISA51；该小瓶能够包含3mL佐剂并可为8mL的容器；
-1个注射器，典型地为1mL的Braun Injekt-F；
-1个针头(1号针头)，用于乳剂制备；该针优选为20G针头；
-1个针头(2号针头)，用于注射，优选肌内注射；该针优选为23G针头。
本发明还涉及用于从所述试剂盒制备疫苗的方法，所述方法包括：
(1)将2号小瓶中的注射用水通过利用与1号针头连接的注射器注入1号小瓶中；
(2)轻轻旋转1号小瓶1-5分钟直至制剂完全溶解；
(3)用同一个注射器和针头，抽取3号小瓶的佐剂。将该注射器内容物放入1号小瓶中；
(4)将总的小瓶内容物向上向下抽动足够多次(典型地30次)，用于乳化所述内容物，并最终抽取总乳剂。
本发明还涉及一种医疗装置，其为包含装有或预装有本发明的组合物、乳剂或疫苗的注射器。
在一个实施方案中，所述注射器为双室注射器，其中一室包含含本发明的免疫原性产物的溶液而另一室包含佐剂。
本发明还涉及一种医疗装置，其包含预装有本发明的产物或本发明的疫苗组合物的小瓶或卡普耳瓶(carpule)。
在一个实施方案中，所述医疗装置包含高于35mcg-1000mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-1000mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-750mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-500mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-450mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-400mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-350mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-360mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-250mcg免疫原性产物的量。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-1000mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-240mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-120mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-100mcg。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg、100mcg、110mcg、120mcg、130mcg、140mcg、150mcg、160mcg、170mcg、180mcg、190mcg、200mcg、210mcg、220mcg、230mcg、240mcg、250mcg、260mcg、270mcg、280mcg、290mcg、300mcg、310mcg、320mcg、330mcg、340mcg、350mcg、360mcg、370mcg、380mcg、390mcg-400mcg的免疫原性产物的量。
在另一个实施方案中，所述医疗装置包含60mcg-240mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含60mcg-120mcg的免疫原性产物的量。
在另一个实施方案中，所述医疗装置包含60mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含120mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含240mcg的免疫原性产物的量。
附图说明
图1：中期报告期间显示IFNα中和活性的已免疫患者血清样品的百分比。
图2：在治疗患者对比安慰剂患者中IFN-诱导基因的差分进化。在基线显示出升高水平的IFN-诱导基因表达的11名患者中，8名用免疫原性产物治疗而3名接受安慰剂注射。在SLE患者中显示出过表达的最高水平的250种IFN-诱导基因的水平用高密度微阵列评价。结果描述为log2(在V1的表达水平)-log2(在V6的表达水平)的平均值。p值用学生t检验计算。
图3：对比接受安慰剂患者，在基线处具有阳性IFN-标记或阴性IFN-标记的治疗患者中IFN-结合抗体的滴度。星号表示p值＜0.05。
图4：对比接受安慰剂患者，在基线处具有阳性IFN-标记或阴性IFN-标记的治疗患者中，在V10和V0之间或V11和V0之间，IFN-诱导基因的差分进化。结果描述为Delta Log(表达水平)的平均值。星号表示p值＜0.05。
图5：在基线处具有阳性IFN-标记的治疗患者中和在接受安慰剂患者中，血清C3值的进化算法。星号表示p值＜0.05。
实施例
实施例1：免疫原性产物的制备
将钥孔戚血蓝蛋白(KLH)从海洋腹足软体动物大锁孔帽贝的淋巴中提取出来并接着在GMP条件下纯化。在2-8℃的温度下，在储存条件下进行的稳定性测定的结果显示，在2-8℃下纯化的KLH的保质期为36个月。
重组人IFNα2b在GMP条件下在大肠肝菌中产生。
本发明产品在350mcg IFNα级别的批次用以下开发的生产工艺产生。
a)用戊二醛偶联
将过滤的KLH基于紫外浓度以20∶1的IFNα∶KLH比率(相应于20个单体的IFNα对1个亚基的KLH的摩尔比)加入到IFNα2b溶液(含IFNα2b的70mM磷酸氢二钠pH7.8)中。偶联用戊二醛(添加以在反应介质达到22.5mM的终浓度)和pH9的硼酸(添加以在反应介质达到28.5mM的终浓度)进行，以获得8.5的pH。
接着在23+2℃下，45分钟期间混合pH8.5的该溶液。
b)用甘氨酸淬灭
在30分钟期间用0.1M的甘氨酸淬灭反应。
c)第一切向流过滤(TFF1)
第一TFF用Pall Minim II TFF系统和用0.5M NaOH消毒并用工作缓冲液(70mM磷酸氢二钠pH7.8)平衡的截留分子量为10kDa的0.02μm2的聚醚砜膜进行。
接着将溶液通过0.22μm过滤来澄清。中间体用工作缓冲液两倍稀释并接着通过切向流过滤(TFF)和12体积的工作缓冲液来渗滤。收获渗余物并存储少于20小时。
d)用甲醛灭活
用蠕动泵将甲醛加入渗余物中以达到66.6mM的终浓度。灭活反应在设定在37±2℃的恒温箱中在40小时期间进行，每天用磁力搅拌器搅拌溶液。
e)用甘氨酸淬灭
在30分钟期间用0.1M的甘氨酸淬灭反应。
f)第二切向流过滤(TFF2)
第二TFF用Pall Minim II TFF系统和用0.5M NaOH消毒并用配制缓冲液(formulation buffer)(70mM磷酸氢二钠pH7.8)平衡的截留分子量为100kDa的0.02m2的聚醚砜膜进行。
将溶液通过0.22μm过滤来澄清。浓缩中间体至具有约900mL的起始切向体积并接着用12体积的配制缓冲液(70mM磷酸盐缓冲液)通过TFF过滤以消除IFNα的低分子量均聚物和非反应性试剂。收获渗余物并接着稀释至基于通过Bradford蛋白测定的浓度确定的300μg/mL的理论浓度并接着0.2μm过滤以得到本发明的免疫原性产物。
实施例2：产物的抗原性
如下进行夹心ELISA抗IFNα/KLH。简言之，用捕获抗体：兔多克隆抗-KLH抗体包被96孔板，并在37℃下90分钟期间用封闭缓冲液(例如含2％酪蛋白的PBS)封闭板。在37℃下90分钟期间用从250ng/ml至8次两倍稀释的系列稀释的免疫原性产物或用阴性对照例如KLH和IFNα孵育板。接着加入检测抗体例如生物素化的抗-IFNα抗体持续90分钟。最后在37℃下30分钟期间用链霉亲和素-HRP孵育板并在30分钟期间将复合物用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物显色。酶反应终止后，所得颜色的强度通过分光光度法于490nm处确定。
该测定证实产物包含有抗原性的IFNα，即被抗-IFNα抗体识别并且所述IFNα与KLH偶联。
实施例3：产物的免疫原性(测试A)
将总蛋白为4μg的产物(通过Bradford蛋白测定确定的)在第0天和第21天注射至7只6-8周的Balb/c小鼠中。
在第31天，将小鼠放血并收获血清。
对免疫前血清和收获血清如下进行抗IFNαELISA：
-用100ng IFNα-2b包被96孔板并在2℃-8℃孵育过夜，
-在37℃下90分钟期间加入封闭缓冲液，
-将免疫原性产物以1/2500稀释至8次两倍稀释加入并将板在37℃下孵育90分钟；
-在37℃下90分钟期间将板用抗小鼠免疫球蛋白的标记抗体例如HRP结合的抗体孵育；
-将ELISA用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物溶液显色。酶反应终止后，所得颜色的强度通过分光光度法于490nm处确定。
该测定证明在这7只小鼠中用免疫原性产物免疫导致抗IFNα抗体滴度的出现。
实施例4：产物的残留活性(测试B)
该测试是基于IFNα对水泡性口炎病毒(VSV)之于马-达氏牛肾(MDBK)细胞的细胞病变效应(CPE)的保护作用。
将所述免疫原性产物和用于制备所述免疫原性产物的重组IFNα2b(阳性对照)各自以至少500ng/ml和至少1000U/ml稀释于基础培养基(补充了2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1mM Hepes的RPMI)中。将50μl的免疫原性产物和阳性对照置于96孔板中并以两倍稀释连续稀释于基础培养基中。将含2 104的MDBK细胞的50μl细胞培养基(补充有4％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM Hepes的RPMI)加入各孔中并将板在37℃，5％CO2下孵育过夜。接着将病毒稀释于基础培养基至至少10倍TCID50(组织培养感染剂量50：杀死50％感染细胞的稀释度的10倍)。倾空板并加入100μl稀释的病毒。接着将板于37℃，5％CO2下孵育过夜。
在培养结束时，将20μl/孔的MTS/PMS溶液(100μl MTS/5μl PMS；Promega G5430)加入孔中并将板在37℃，5％CO2下再孵育4小时。接着将板在分光光度计上于490nm处读数。
计算免疫原性产物的抗病毒活性百分比并且对于测试的两批产物，抗病毒活性小于IFNα抗病毒活性的1％。
实施例5：产物的中和能力(测试C)
产物的中和能力通过存在在MDBK细胞中复制的水疱性口炎病毒的存在情况评价细胞生活力来评估。
将总蛋白为4μg的产物(通过Bradford蛋白测定确定的)在第0天和第21天注射至6-8周的Balb/c小鼠中。在免疫前获得血清样品(免疫前血清样品)和第31天获得血清样品(测试血清样品)。
将25μl的免疫前血清样品和测试血清样品以1/200稀释从1/200至8次稀释接种于96孔板中。将阳性对照(来自PBL，Piscataway，NJ，ref.31100-1的多克隆抗-IFNα)以3125UI/孔-100UI/孔稀释于基础培养基(补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM hepes的RPMI)中并将25μl也接种于板中。
将含25U/孔(终浓度)IFNα的25μl基础培养基加入各孔中并将板在室温下孵育60分钟。
将含20000MDBK细胞的检测培养基(补充有4％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM Hepes的RPMI)加入各孔中并将板在37℃，5％CO2下孵育过夜。
将病毒稀释于病毒培养基(补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM hepes的RPMI)中至至少10倍TCID50(杀死50％感染细胞的稀释度的10倍)。倾空板并将100μl病毒加入各孔中，接着将板于37℃、5％CO2下孵育24小时。
在培养结束时，将20μl/孔的MTS/PMS溶液(100μl MTS/5μl PMS；Promega G5430)加入孔中并在37℃，5％CO2下将板再孵育4小时。接着将板在分光光度计上在490nm处读数。
计算所有7种测试样品的NC：平均NC＝253789IU/ml(SEM＝172526)，证明所有血清包含能够中和IFNα的抗病毒活性的抗-IFNα抗体。
实施例6：包含免疫原性产物的组合物和疫苗的实例
包含免疫原性产物的一种示例性组合物描述于表1中。
表1
成分 量
本发明的产物 160μg
磷酸氢二钠 8.95mg
磷酸二氢二钠 805μg
总体积 0.4ml
包含免疫原性产物的一个示例性疫苗描述于表2中。
表2
实施例7：临床试验
临床试验使用表2中所述的疫苗组合物进行。
研究设计：
在第0天、第7天和第28天，或在第0天、第7天、第28天和第84天在患有SLE的成人中进行产物的3或4次施用。
测试以下剂量的产物：30mcg、60mcg、120mcg和240mcg。
研究人群：
28名男性或女性患者年龄在18-50岁、患有轻度至中度SLE(SLEDAI4-10)、接受治疗但患有活动性疾病。在48名健康志愿者中建立了正常的对照干扰素基因标记。在体外用I型干扰素刺激这48名健康志愿者中18名的PBMC以在高密度阵列上鉴定干扰素标记。SLE标记通过对比健康志愿者和SLE患者在基线处的标记来建立。
在登记在前三组(即已接受了30mcg、60mcg或120mcg的剂量或安慰剂)的患者中进行中期分析。
表3：登记患者的人口统计(中期分析)
表4：登记患者的人口统计(终期分析)
结果
疫苗的安全性和耐受性
已报道两次狼疮爆发为相关的SAE。第一次是在安慰剂组。另一次发生在首次注射IFN-K 240mcg的患者中，所述患者在注射后两天自发终止她的皮质类固醇治疗。该皮质类固醇治疗的突然停止很可能参与了爆发的发生。由独立的安全机构进行定期的中期安全性分析。没有发现实验室参数的临床显著变化(血液学、生物化学、尿)。
疫苗的免疫原性
抗-IFNα抗体的滴度通过ELISA从患者获得的血清样品来检测。
如上文所述进行抗-IFNαELISA。
结果显示，用免疫原性产物治疗的所有组从第28天起均检测到抗-IFNα抗体滴度。
疫苗的中和活性
利用以下方法在体外评价中和活性。
将从患者血清获得的血清样品50μl以1/200稀释从1/200至8次稀释接种于96孔板中。
将阳性对照(来自PBL Piscataway，NJ，31100-1的多克隆抗-IFNα)从100ng/孔稀释至3.125ng/孔并取50μl加入板中。稀释在基础培养基(补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM hepes的RPMI)中进行。
将10U/孔(终浓度)的IFNα2b加入各孔中并将板在室温下孵育60分钟。
将含30000个MDBK细胞的测定培养基(补充有4％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM hepes的RPMI)加入各孔中并在37℃、5％CO2下孵育过夜。
将病毒稀释于病毒培养基(补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM hepes的RPMI)中至至少10倍TCID50(杀死50％感染细胞的稀释度的10倍)。倾空板并加入100μl病毒到各孔中，接着于37℃、5％CO2下孵育24小时。
在培养结束时，将20μl/孔的MTS/PMS溶液(100μl MTS/5μl PMS；Promega G5430)加入孔中并将板在37℃、5％CO2下再孵育4小时。接着将板在分光光度计上于490nm处读数。
中期报告的结果表明用30mcg免疫原性产物治疗的患者的血清无一在免疫后第168天存在具有中和能力的抗-IFNα抗体，而用60mcg免疫原性产物治疗的患者的血清在第168天存在具有中和能力的抗-IFNα抗体(图1)。
此外，终期报告的结果表明在50％的用60μg或120μg免疫原性产物治疗的受试对象中检测到中和活性，且在80％的用240μg免疫原性产物治疗的受试对象中检测到中和活性(表5)
表5
剂量(mcg) 响应者的人数(％) 峰处的NC50中值(Dil-1)
30 0 0
60 50 390
120 50 733
240 80 316
这些结果表明，高于30mcg的免疫原性产物的治疗对于具有体内的IFNα中和是必需的。
实施例8：转录组分析
在免疫原性产物注射前后几个时间点收集PBMC。对于该中期分析，在V1(第0天)和V6(第一次注射后第38天)的样品中提取总RNA，依据标准的Affymetrix方案标记，并在Genechip HGU133 Plus 2.0阵列上杂交。样品的RMA(鲁棒微阵列分析)归一化后在GeneSpring上进行统计分析。
对基线的样品进行无监督聚类算法，并将患者分组为两类：在基线处存在“干扰素标记”即在基线处存在由I型干扰素诱导的基因的自发过表达(IFN-诱导的基因是基于IFN-刺激的对照PBMC的微阵列分析被实验确定的)的患者(n＝11)和在基线处不存在“干扰素标记”的患者(n＝7)。不出意料地，dsDNA滴度在具有标记的患者中(平均值+/-SEM：131.1+/-50.1UI/ml)相比于无标记的患者(平均值+/-SEM：44.7+/-33.3，通过Mann-Whitney检验的p＝0.006)显著更高。在接受了免疫原性产物的、在基线处具有IFN标记的8名患者的8份跟踪样品中发现了可检测的抗-IFNα抗体，而在接受了免疫原性产物的、无IFN标记的6名患者中仅有2名有此情况，4名安慰剂治疗的个体中无一存在此情况(卡方检验p＝0.002)。在基线处具有IFN标记的11名患者中，2名接受了30mcg剂量，1名接受了60mcg剂量，5名接受了120mcg剂量而3名由安慰剂注射治疗。用免疫原性产物治疗的患者中V1和V6之间IFN-诱导基因的表达中观察到的变化与用安慰剂治疗的患者相比显著不同(图2)。
该结果提示免疫原性产物对于体内IFN-诱导基因的表达有作用。
实施例9：免疫原性产物治疗的IFN标记和响应情况
在实施例7的具有轻度至中度SLE的28名患者中检测了基线处的“干扰素标记”。干扰素标记(IFN-标记)对应于利用21种干扰素诱导基因计算的得分，并描述于Yao等，Arthritis & Rheumatism，2009，60(6)：1785-1796中。如实施例8中所述完成干扰素标记的测量。
对于实施例7的28名SLE患者，19名表现出在基线处阳性的干扰素标记而9名显示出在基线处阴性的干扰素标记。
干扰素标记和SLE疾病活动
检测dsDNA抗体滴度和C3的血清水平作为两组患者中疾病活动的指征。
dsDNA抗体滴度用Diagnostic Products Corporation的DPC抗-DNA试剂盒(PIKADD-4)来确定。
C3的血清水平用Beckman Coulter的补体C3试剂盒(试剂盒#446450)来确定。
表6：SLE疾病活动指征
如上表6所示，在基线处具有阳性干扰素标记的SLE患者具有更高的疾病活动的生物学指征。
干扰素标记和对用本发明的免疫原性产物治疗的响应情况
在基线处具有阳性IFN标记的SLE患者和在基线处具有阴性IFN标记的SLE患者中比较如实施例7中所述的用本发明的免疫原性产物治疗的效果。
抗IFN-α的响应
如实施例7中所述在V6(第38天)、V10(第112天)和V11(免疫后第168天)检测IFN-结合抗体的滴度。
结果表明，具有阳性干扰素标记的SLE患者响应于本发明的免疫原性产物所产生的IFN-结合抗体是基线处具有阴性干扰素-标记的SLE患者的十倍(图3)。
IFN-诱导基因
在基线处具有阳性或阴性IFN标记的治疗患者和用安慰剂治疗的患者中测量V0和V10之间或V0和V11之间IFN-诱导基因的表达的演变。
结果表明，相对于安慰剂患者和IFN-标记阴性的患者，在IFN-标记阳性的SLE患者中，使用本发明的免疫原性产物的疗法对IFN-诱导基因的作用在V10和V11是强烈且显著不同的(图4)。
补体C3
如上文所述在V-1(免疫前30天)、V0(免疫当天)、V7(免疫后第56天)、V10(免疫后第112天)和V11(免疫后第138天)在治疗患者和接受了安慰剂的患者中测定血清C3值。
结果表明，在治疗患者对比安慰剂患者中C3水平有显著的增加。此外，在用本发明的免疫原性产物治疗的IFN-标记阳性的SLE患者中C3水平有显著的增加(图5)。
实施例10：本发明的产物中IFNα/KLH比率的测定
为了评估本发明的产物中IFNα和KLH的量，开发了基于UV检测和荧光检测的定量方法。将本发明的产物用两种荧光标记制备，各个特异性针对IFNα或KLH。通过尺寸排阻色谱(SEC)分析后，通过220nm处UV信号和特异性针对IFNα标记和KLH标记的荧光信号(FLD)的整合来确定IFNα和KLH的量。此方法允许计算IFNα/KLH的质量比率。
a)原料标记：
荧光标记偶联在巯基上以便保留在产物制备期间使用的氨基。
标记在室温下3小时期间在70mM pH7的磷酸钠缓冲液中进行。KLH用200摩尔当量的Atto565-马来酰亚胺(18507，Sigma)标记，IFNα用100摩尔当量的荧光素马来酰亚胺(46130，Pierce)标记。接着将已标记的蛋白(KLH-atto565和IFN-荧光素)在用70mM pH7.8磷酸钠缓冲液调节的Zeba柱(截留7kDa，Thermo Scientific，89893)上过滤以消除未反应的标签。
b)产物制备：
接着将标记的原料用如实施例1中的相同工艺制备已标记的产物，其中用透析过滤而非切向流过滤。
c)KLH和IFNα均聚物标准品制备
对于定量分析方法，制备均聚物标准品。
已标记的IFNα均聚物标准品用如实施例1中的相同工艺制备，但其中使用70mM磷酸盐缓冲液pH7.8而非KLH，并使用透析过滤而非切向流过滤。
已标记的KLH的均聚物标准品用如实施例1中的相同工艺制备，但其中使用70mM磷酸盐缓冲液pH7.8而非IFNα，并使用透析过滤而非切向流过滤。
d)尺寸排阻色谱的方法分析
接着通过SEC利用UV和特异性荧光检测来分析批次。
将60μL样品注入串联柱SEC5(1000A°)SEC3(300A°)(Agilent，5190-2536，5190-2511)，在35分钟期间用PBS来洗脱，并进行220nm的紫外检测和特异性荧光检测(针对IFNα-荧光素或针对KLH-Atto565)，如表7所述。
表7：用于IFNα-荧光素或KLH-Atto-565的激发波长和发射波长
通过对0-20分钟之间的色谱峰下面积进行积分计算UV信号和荧光(FLD)信号。
为了验证该方法，进行了初步实验以证明：
-荧光信号的特异性(两种标记的蛋白间未观察到信号重叠)，
-对于各制备的批次(本发明的产物，KLH的标记均聚物和IFNα的标记均聚物)，通过SE-HPLC得到相似的UV谱，
-未观察到由于制备导致的荧光信号的淬灭，
-FLD信号是线性的且与UV信号成正比。
在制备的已标记kinoid中标记IFNα的紫外线贡献是根据曲线面积通过FLDIFNα-荧光素＝标记IFNα均聚物标准品的f(UV面积)来测量。
在制备的已标记kinoid中标记KLH的紫外线贡献是根据FLDKLH-Atto565＝标记KLH均聚物标准品的f(UV面积)来测量。
由于紫外面积被检测为蛋白浓度的线性函数，该方法允许评估在总的制备的已标记kinoid中标记IFNα的重量百分比。
e)批次分析
制备了3批标记kinoid，并通过该方法进行分析。
基于UV信号和浓度的比例性，以及FLD信号和UV信号的比例性，计算三批样品中IFNα和KLH的量的比率(mIFNα/mKLH)(表8)。
表8：所制备的三批标记kinoid中IFN-α/KLH的重量比率
发现mIFNo/mKLH的平均比率为0.28，相对标准偏差＜15％。
实施例11：当本发明的免疫原性产物作为含SWE或SWE-a的乳剂注射时，所产生的抗-mIFNα抗体的滴度以及中和能力
制备muIFN-K：
简言之，小鼠IFNαA(PBL Biomedical Laboratories)和天然KLH(Sigma)以50∶1的比率混合并用22.5mM戊二醛处理45分钟。用磷酸盐缓冲液(PBS)透析以消除过量的戊二醛之后，将溶液在37℃下与66mM甲醛孵育48小时。用甘氨酸(终浓度0.1M)淬灭并随后利用10-kDa的截留膜用PBS透析之后，将制剂用0.22μM的膜过滤除菌并储存于4℃。
免疫方案：
将小鼠在第0天和第21天两次肌内注射含1∶1比的mIFN-K(每次注射10μg)和SE或SE-a佐剂的乳剂(100μl终体积)来免疫。
用ELISA的抗-muIFNα和抗-KLH抗体滴度测定
通过ELISA针对muIFNα或KLH的抗体分析血清。简言之，用100ng/孔的muIFNαA(PBLBiomedical Laboratories)包被96孔Maxisorp板(Nunc)以检测抗-muIFNα抗体或用天然KLH(Sigma)包被以检测抗-KLH抗体。
将两倍系列稀释的血清样品(1∶100-1∶51200)加入孔中。空白孔加入100μl稀释缓冲液。在37℃下1.5小时后，抗体用100μl结合了辣根过氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)和邻苯二胺(针对辣根过氧化物酶的显色底物)来检测。muIFN-K免疫的Balb/c小鼠的血清库用作阳性对照。在490nm的波长处记录光密度(OD)。ELISA测定以双复孔进行。在各板中，保留两孔作为空白；从所有孔中减去其平均值。
通过在x轴上插入最大OD(OD最大)/2来计算抗体滴度。对于穿过OD最大/2周围两点的直线所用公式为y＝ax+b。
IFN-K免疫后诱导的抗muIFNα抗体的中和能力的测定
中和能力利用经典的抗病毒致细胞病变测定(EMCV/L929)来确定。在该测定中，muIFNα的抗病毒活性滴度是关于其抑制脑心肌炎病毒(EMCV)对小鼠L-929细胞(ATCC)的致死效应的能力来确定的。
简言之，将25μL稀释的血清样品(或对照抗体)以2倍系列稀释液(从1∶200-1∶6400)加入96孔培养板(Nunc)中。市售的兔多克隆抗muIFNα抗体(来自PBL，ref：32100-1)用作阳性对照。在室温下用25IU/孔的muIFNα孵育1小时后，每孔接种20x103的L-929细胞并在37℃下孵育。生长过夜后，用PBS洗涤板并将100μL/孔的EMCV溶液(杀死50％细胞所需剂量的100倍)加入各孔中。将板在37℃下孵育48小时。最后，加入20μL/孔的MTS/PMS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑，内盐/吩嗪硫酸甲酯)溶液(Promega)溶液并将板在37℃、5％CO2下在加湿培养箱(避光)中孵育4小时。接着，测量各孔在490nm处的OD。将空白的OD(仅含100μL培养基的孔)从样品的OD中减去。
如下计算各样品的中和能力：
中和能力(％)＝100×[(OD测试-OD病毒)/(OD细胞)]，其中
OD测试为所测试样品的OD(细胞+IFNα+血清+病毒)
OD病毒为病毒对照的OD(细胞+病毒)
OD细胞为20,000个细胞/孔的OD(细胞+IFNα+病毒)。
中和能力以血清稀释度的函数作图。中和50％IFNα活性值的滴度(血清稀释数)通过在曲线的线性部分插入来确定。
结果表明，在第一次注射于SWE或SWE-a中乳化的muIFN-K后的第31天收集的小鼠血清中存在抗-muIFNα滴度和抗-KLH滴度；并且所述抗-muIFNα抗体具有中和能力(NC50＞200)。

Claims (12)

1.包含与载体蛋白分子偶联的IFNα2a和/或IFNα2b的一种免疫原性产物在制备用于治疗需要其的受试对象中的IFNα相关病况的药物中的用途，其中待施用给所述受试对象的所述免疫原性产物的治疗有效量为每次施用至少60mcg的免疫原性产物，其中所述IFNα相关病况包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、脉管炎、HIV、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎和肌炎。
2.权利要求1的用途，其中所述治疗有效量的所述免疫原性产物的施用防止与IFNα的过量产生相关的疾病的症状的发生。
3.权利要求1的用途，其中所述治疗有效量的所述免疫原性产物的施用防止与IFNα的过量产生相关的疾病的爆发。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中待施用给所述受试对象的所述免疫原性产物的治疗有效量为每次施用60mcg-1000mcg的免疫原性产物。
5.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述免疫原性产物在一个月内被施用给所述受试对象至少两次。
6.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述免疫原性产物每三个月另外被施用给所述受试对象至少一次。
7.权利要求1-3中任一项的用途，其中当在从所述受试对象获得的血清样品中检不出抗-IFNα抗体的量时，将所述免疫原性产物另外施用给所述受试对象。
8.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述免疫原性产物是强烈失活的，其意味着所述产物在测试B的条件中显示低于5％的抗病毒活性。
9.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述免疫原性产物在测试C的条件中能够中和IFNα的抗病毒活性。
10.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述载体蛋白分子为KLH。
11.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述免疫原性产物为疫苗。
12.权利要求11的用途，其中所述疫苗呈乳剂的形式。
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