BR112013025892B1 - produto imunogênico, forma de dosagem unitária, dispositivo médico e kit relacionados a ifna - Google Patents

produto imunogênico, forma de dosagem unitária, dispositivo médico e kit relacionados a ifna Download PDF

Info

Publication number
BR112013025892B1
BR112013025892B1 BR112013025892-6A BR112013025892A BR112013025892B1 BR 112013025892 B1 BR112013025892 B1 BR 112013025892B1 BR 112013025892 A BR112013025892 A BR 112013025892A BR 112013025892 B1 BR112013025892 B1 BR 112013025892B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
immunogenic product
mcg
ifnα
another embodiment
klh
Prior art date
Application number
BR112013025892-6A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112013025892A2 (pt
Inventor
Géraldine GROUARD-VOGEL
Olivier Dhellin
Bernard Fanget
Pierre VANDEPAPELIÈRE
Camille Roucairol
Original Assignee
Neovacs
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP11305408A external-priority patent/EP2508197A1/en
Application filed by Neovacs filed Critical Neovacs
Publication of BR112013025892A2 publication Critical patent/BR112013025892A2/pt
Publication of BR112013025892B1 publication Critical patent/BR112013025892B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

MÉTODO PARA TRATAR CONDIÇÕES RELACIONADAS COM IFN-alfa A presente invenção refere-se a um produto imunogênico, compreendendo IFNalfa acoplado a uma molécula de proteína carreadora, que é capaz de induzir anticorpos anti-IFNalfa in vivo e seu uso para tratar condições relacionadas com IFNalfa.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a uma vacina imunogênica e a seu uso para tratar condições relacionadas com IFNα, tais como lúpus eritematoso sistêmico.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] A família de IFN tipo I inclui IFNα, IFNβ, IFNδ, IFN1, IFNK, IFNT e IFNro. As formas predominantes são IFNα, das quais 13 proteínas estreitamente relacionadas são descritas em humanos, e a única IFNβ. Apesar do fato de que diferentes formas de IFN tipo I poderem promover diferentes respostas biológicas, todos IFN tipo I são estruturalmente relacionados (seus genes carecem de íntrons e são localizados no braço curto do cromossomo 9) e sinalizam através das mesmas subunidades receptoras (Van Boxel-Dezaire et al.. Immunity 2006; 25:361 372).
[0003] O interesse na relação entre IFN tipo I e distúrbios autoimunes está hoje em dia aumentando, uma vez que os sinais de sua indução, a chamada assinatura de interferon, foram recentemente relatados em pacientes sofrendo de diferentes distúrbios autoimunes (Baccala et al. Immunol Rev 2005: 204:9 26). De fato, devido a seus efeitos imune-moduladores, o IFN tipo I parece estar envolvido em diversos trajetos patogênicos de várias condições autoimunes.
[0004] O paradigma de relevância patogênica de IFN tipo I em autoimunidade é lúpus sistêmico eritematoso (SLE). O SLE é uma doença crônica, caracterizada por um envolvimento de multi-órgãos, devido a uma avaria paradoxal de órgãos causada por autoanticorpos direcionados para autoantígenos. A etiologia de SLE é complexa, envolvendo fatores tanto genéticos como ambientais. O nível de soro do IFNα no SLE tem mostrado correlacionar-se com a severidade da doença (Dall’era et al. Ann Rheum Dis 2005: 64;1692-7).
[0005] A síndrome de Sjogren (SS), também conhecida como síndrome seca, é uma condição autoimune crônica, sistêmica, que afeta as glândulas exócrinas, particularmente as glãndulas salivar e lacrimal. Elevada atividade IFNα tem também sido observada no soro de pacientes sofrendo desta doença. Finalmente, outras condições tais como diabetes, artrite reumatoide, escleroderma, vasculite e tiroidite autoimune foram também mostradas serem associadas com altos níveis de IFNα.
[0006] Sedaghat et al., também recentemente sugeriram que o IFN tipo 1 pode representar na depleção de células CD4+ T em pacientes com HIV+ quando eles mostraram que o IFN tipo 1 afeta o estado constante da dinâmica das células CD4+ T mudando o equilíbrio em relação aos efetores Th1 que são células de vida curta, em vez de células T de memória de vida longa (Sedaghat et al., J. Virol. 2008, 82(4): 1870 1883). Isto foi confirmado em Mandl et al., onde é sugerido diminuir a produção de IFNα por células dendríticas plasmacitoides, para melhorar a imune ativação patológica (Mandl et al.. Nat. Med. 2008).
[0007] Além disso, a administração de IFNα tem sido relatada exacerbar a doença subjacente em pacientes com psoríase, tiroidite autoimune e esclerose múltipla e induzir uma síndrome semelhante a SLE em pacientes sem uma história anterior de doença autoimune.
[0008] Portanto, há necessidade de um agente que iniba a atividade do IFNα.
[0009] A imunização passiva com anticorpos neutralizadores monoclonais está atualmente sendo testada em experimentos clínicos com rontalizumab e sifalimumb para o tratamento de SLE. Entretanto, dita terapia apresenta as desvantagens de alvejar somente um subconjunto dos 13 para IFNα e o uso de anticorpos monoclonais administrados passivamente pode ser limitado pela indução de anticorpos antimedicamento. Ditos anticorpos antimedicamento podem neutralizar ou de outro modo comprometer o efeito clínico dos medicamentos e podem também ser associados com sérios eventos adversos, relacionados com a reatividade cruzada com proteínas autólogas (De Groot et al. Trends. Immunol. 2007, 28 (11)).
[0010] A presente invenção assim provê um método para inibir a atividade do IFNα in vivo, administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um produto imunogênico, que permite uma imunização ativa que possa romper a tolerância imunológica da célula B e gerar altas titulações de anticorpos neutralizantes policlonais contra IFNα e seu uso para tratar condições relacionadas com IFNα.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] Um objetivo da invenção é um produto imunogênico, compreendendo IFNα acoplado com uma molécula de proteína carreadora, para uso em evitar ou tratar uma condição relacionada com IFNα em um indivíduo em necessidade, em que a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico a ser administrado ao indivíduo é mais do que 30 mcg de produto imunogênico por administração, preferivelmente pelo menos 60 mcg.
[0012] Em uma forma de realização da invenção, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico evita a ocorrência de sintomas de uma doença ligada a uma superprodução de IFNα.
[0013] Em outra forma de realização da invenção, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico evita o rubor de uma doença ligada a uma superprodução de IFNα.
[0014] Em outra forma de realização da invenção, as condições relacionadas com IFNα compreendem lupus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, escleroderma. síndrome de Sjogren, vasculite, HIV, diabetes tipo I, tiroidite autoimune e miosite.
[0015] Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico a ser administrado ao indivíduo é de 35 mcg a 1000 mcg de produto imunogênico por administração, preferivelmente de 60 mcg a 1000 mcg.
[0016] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico é administrado ao indivíduo pelo menos duas vezes em um mês.
[0017] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico é ainda administrado ao indivíduo pelo menos uma vez a cada três meses.
[0018] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico é ainda administrado ao indivíduo quando, em uma amostra de soro obtida do indivíduo, a quantidade de anticorpos anti-IFNα é indetectável.
[0019] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico é fortemente inativado, o que significa que o produto mostra menos do que 5% de atividade antiviral nas condições de TESTE B.
[0020] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico é capaz de neutralizar a atividade antiviral do IFNα nas condições de TESTE C.
[0021] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico compreende pelo menos um subtipo de IFNα.
[0022] Em outra forma de realização da invenção, o subtipo de IFNα é IFNα 2b e a molécula de proteína carreadora é KLH.
[0023] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico é uma vacina, preferivelmente na forma de uma emulsão.
[0024] Outro objetivo da invenção é uma forma de dosagem unitária, compreendendo mais do que 30 mcg de um produto imunogênico compreendendo IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora como definido acima.
[0025] Outro objetivo da invenção é um dispositivo médico compreendendo mais do que 30mcg de um produto imunogênico, compreendendo IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, como definido aqui acima.
[0026] Outro objetivo da invenção é um kit compreendendo pelo menos um frasco contendo mais do que 30 mcg, preferivelmente pelo menos 60 mcg, de um produto imunogênico compreendendo IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, como definido aqui acima, pelo menos um frasco contendo adjuvante, e meios para contatar dito produto imunogênico com o adjuvante, e para emulsificar a mistura da solução aquosa com o adjuvante.
[0027] Em uma forma de realização, o kit da invenção compreende
[0028] pelo menos um frasco contendo mais do que 30 mcg, preferivelmente pelo menos 60 mcg, de um produto imunogênico compreendendo IFNα acoplado com uma molécula de proteína carreadora de acordo com a presente invenção e meios para solubilizar dito produto imunogênico, preferivelmente em uma solução aquosa, ou
[0029] pelo menos um frasco contendo uma solução, preferivelmente uma solução aquosa compreendendo mais do que 30 mcg, preferivelmente pelo menos 60 mcg, de um produto imunogênico compreendendo IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora de acordo com a presente invenção, e
[0030] pelo menos um frasco contendo adjuvante e meios para contatar dita solução com o adjuvante e para emulsificar a mistura da solução com o adjuvante.
[0031] DEFINIÇÕES
[0032] Como aqui usado, o termo “interferon α” ou “IFNα” refere-se a proteínas IFN alfa codificadas por um gene funcional do local do gene interferon alfa com 75% ou mais de identidade de sequência para IFNα 1 (Genbank número NP_076918 ou proteína codificada por Genbank número NM_024013). Exemplos de subtipos de alfa IFN humano incluem IFN alfa 1 (Genbank número NP_076918), alfa 2a (Genbank número ITF_A), alfa 2b (Genbank número AAP20099), alfa 4 (Genbank número NP_066546), alfa 5 (Genbank número P01569), alfa 6 (P05013), alfa 7 (Genbank número P01567), alfa 8 (Genbank número P32881), alfa 10 (Genbank número P01566), alfa 14 (Genbank número P01570), alfa 16 (Genbank número NP_002164), alfa 17 (Genbank número P01571) e alfa 21 (Genbank número NP_002166). Exemplos de subtipo IFNa de mamífero não-humano podem ser encontrados no Genbank também conhecido pela pessoa hábil na arte (para recapitulação vide Pestka et al. Immunological reviews 2004, 202:8-32).
[0033] Como aqui usado, o termo “resposta imune” refere-se à ação, por exemplo, de linfócitos, células apresentando antígeno, células fagocíticas e macromoléculas produzidas pelas células acima ou o fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento).
[0034] Como aqui usado, um anticorpo que “inibe a atividade biológica” ou “neutraliza a atividade biológica” ou IFNα tem a finalidade de referir-se a um anticorpo que inibe a atividade daquela citocina em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% ou mais, em comparação com o nível de atividade da citocina na ausência do anticorpo, por exemplo, utilizando-se um ensaio funcional tal como aqueles descritos nos Exemplos.
[0035] Como aqui usada, a expressão “molécula de proteína carreadora” referese a uma proteína ou a um peptídeo de pelo menos 15 aminoácidos de comprimento que, quando parcial e covalentemente sendo associado com a molécula de IFNα para formar heterocomplexos, permite que um grande número de antígenos de IFNα seja apresentado aos linfócitos β.
[0036] Como aqui usado, o termo “indivíduo” inclui qualquer mamífero humano ou não-humano, tal como primatas, cães, gatos, cavalos, carneiros ...
[0037] Como aqui usado, o termo “paciente” refere-se a um indivíduo que esteja afetado por uma condição relacionada com IFNα.
[0038] Como aqui usado, a expressão “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade suficiente para provocar um resultado clínico benéfico ou desejado (p. ex., melhoria da condição clínica).
[0039] Como aqui usado, o termo “tratamento” ou “tratando” refere-se à intervenção clínica em uma tentativa para alterar o curso natural de uma doença do indivíduo ou paciente a ser tratado e pode ser realizada para profilaxia ou durante o curso de patologia clínica. Efeitos desejados incluem mas não são limitados a evitar a ocorrência ou recorrência de doença, aliviando sintomas, suprimindo, diminuindo ou inibindo quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, diminuindo a taxa de progressão da doença, melhorando ou suavizando o estado doentio e provocando remissão, mantendo o estado de remissão ou prognóstico melhorado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0040] Embora os reguladores do IFNα ocorram naturalmente no corpo, sua capacidade de regular os níveis de citocina em doenças tais como SLE e SS parece ser insuficiente. O objetivo da imunização terapêutica anti-IFNα da invenção é elevar os níveis de anticorpo contra a citocina, enquanto aumentando sua afinidade e atividade neutralizante, resultando na redução da citocina em excesso e inibindo seus efeitos patogênicos, sem interferir com outros processos metabólicos e fisiológicos.
[0041] Um objetivo da presente invenção é um método de tratar uma condição relacionada com IFNα em um indivíduo em necessidade dele, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um produto imunogênico compreendendo IFNα acoplado com uma molécula de proteína carreadora, em que dita quantidade terapeuticamente eficaz é mais do que 30 mcg (μg) de produto imunogênico por administração.
[0042] Em uma forma de realização da invenção, a dita quantidade terapeuticamente eficaz é de mais do que 60 mcg (μg) de produto imunogênico por administração.
[0043] Em uma forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 1000 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 750 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 500 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 450 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 350 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 300 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 250 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 200 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 150 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de mais do que 30 mcg, preferivelmente mais do que 60 mcg a 100 mcg.
[0044] Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 1000 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 750 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 500 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 450 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 400 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 350 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 300 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 250 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 200 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 150 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 35 mcg a 100 mcg.
[0045] Em outra forma de realização da invenção a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 1000 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 750 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 500 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 450 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 400 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 350 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 300 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 250 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 240 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 200 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 150 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 120 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 100 mcg.
[0046] Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 mcg a 400 mcg.
[0047] Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 240 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 120 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 240 mcg.
[0048] Em uma forma de realização, a quantidade terapeuticamente eficaz corresponde a uma quantidade de proteínas totais determinada usando-se um ensaio de proteína Bradford como bem conhecido na arte.
[0049] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado pelo menos duas vezes em um mês com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico, como descrito aqui acima.
[0050] Em outra forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado duas vezes em 1 mês com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima. Nesta forma de realização, o indivíduo pode ser adminsitrado uma vez no dia 0 e a segunda vez entre o dia 7 e dia 28. Em outra forma de realização, o indivíduo pode ser administrado com uma vez no dia 0 e a segunda vez entre o dia 7 e dia 21. Em uma forma de realização, o indivíduo é administrado uma vez no dia 0 e a segunda vez no dia 28.
[0051] Em outra forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado três vezes em 1 mês com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico, como descrito aqui acima. Nesta forma de realização, o indivíduo a ser tratado pode ser administrado uma vez no dia 0, a segunda vez entre o dia 7 e o dia 14, e a terceira vez entre o dia 21 e dia 28. Em uma forma de realização, o individuo é administrado uma vez no dia 0, a segunda vez no dia 7 e a terceira vez no dia 28.
[0052] Em outra forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado quatro vezes em 3 meses com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima. Nesta forma de realização, o indivíduo a ser tratado pode ser administrado uma vez no dia 0, a segunda vez entre o dia 7 e o dia 14, a terceira vez entre o dia 21 e dia 28, e a quarta vez entre o dia 77 e dia 84. Em uma forma de realização, o indivíduo é administrado uma vez no dia 0, a segunda vez no dia 7, e a terceira vez no dia 28, e a quarta vez no dia 84.
[0053] Em outra forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado pode ser ainda administrado uma vez a cada três meses com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima.
[0054] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado três vezes em um mês como descrito aqui acima e então administrado ainda uma vez cada três meses com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico, como descrito aqui acima.
[0055] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado quatro vezes em três meses, como descrito aqui acima e em seguida ainda administrado uma vez cada três meses com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima.
[0056] Em outra forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado pode ser ainda administrado uma vez cada seis meses com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima.
[0057] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado três vezes em um mês ou quatro vezes em três meses, como descrito aqui acima, e então ainda administrado uma vez cada seis meses com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima.
[0058] Em outra forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado pode ser ainda administrado uma vez por ano com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito acima.
[0059] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado três vezes em um mês ou quatro vezes em três meses, como descrito aqui acima, e então administrado ainda uma vez por ano com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima.
[0060] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado pode ser ainda administrado uma vez cada 5 anos com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima.
[0061] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado três vezes em um mês ou quatro vezes em três meses como descrito aqui acima e então administrado ainda uma vez cada 5 anos com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima.
[0062] Em outra forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado pode ser ainda administrado uma vez cada 10 anos com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico, como descrito aqui acima.
[0063] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado três vezes em um mês ou quatro vezes em três meses, como descrito aqui acima e então ainda administrado uma vez cada 10 anos com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima.
[0064] Em outra forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado pode ser ainda administrado com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico como descrito aqui acima, quando a quantidade de anticorpos contra IFNα é indetectável em uma amostra de soro obtido do indivíduo.
[0065] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado é administrado três vezes em um mês ou quatro vezes em três meses, como descrito aqui acima, e então administrado ainda com a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico, como descrito aqui acima, quando a quantidade de anticorpos contra IFNα é indetectável em uma amostra de soro obtida do indivíduo.
[0066] A quantificação da quantidade de anticorpos contra IFNα em uma amostra de soro pode ser realizada por métodos convencionais conhecidos na arte, tais como um ELISA anti-IFN.
[0067] Um exemplo de realização de tal método é o seguinte:
[0068] revestir uma placa com 96 poços com 100 ng do subtipo de IFNα usado para preparar o produto imunogênico, tal como IFNα-2b e incubar a placa durante a noite à 2 °C a 8 °C.
[0069] bloquear a placa com um tampão de bloqueio durante 90 min a 37 °C.
[0070] incubar a placa com a amostra de soro e pool da amostra não-afetada durante 90 min a 37 °C: a amostra de soro é tipicamente diluída em uma série de diluição de duas vezes começando da diluição 200x a pelo menos 8 diluições.
[0071] incubar a placa com o anticorpo secundário rotulado, tal como um conjugado de imunoglobulina anti-humana de cabra para HRP.
[0072] desenvolver o complexo com uma solução de substrato de diidrocloreto de o-fenilenodiamina (OPD). Após parar a reação enzimática, a intensidade da cor resultante é determinada por métodos espectrofotométricos a 492 nm.
[0073] O título anti-IFN para cada amostra é expresso como a diluição mínima para a qual o valor de DO média é mais elevado do que o valor de corte:
[0074] valor de corte = DO média do pool de soro não afetado x 2,08
[0075] em que o valor de corte N é igual a 2,08.
[0076] Em seguida, o título anti-IFN para cada amostra será expresso como a diluição mínima para a qual o valor de DO média é mais elevado do que o valor de corte. A primeira diluição sendo 200, os pacientes são considerados negativos se seu valor DO a 1/200 for inferior ao valor de corte (Mire-Sluis et al. 2004 J. Immunol Meth. 289: 1 16).
[0077] Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado está sofrendo de uma condição relacionada com IFNα.
[0078] Em outra forma de realização da invenção, o indivíduo a ser tratado apresenta quantidade indetectável de anticorpos anti-IFNα no soro.
[0079] [Mecanismo de ação]
[0080] A presente invenção também refere-se a um produto imunogênico que é útil para incluir uma resposta imune em um mamífero, a quem dito produto imunogênico é administrado, incluindo uma resposta imune humoral, em que os anticorpos neutralizam as propriedades imunossupresivas, apoptóticas ou angiogênicas do IFNα da citocina endógena.
[0081] A presente invenção também refere-se a um método para induzir uma resposta imune em um mamífero em necessidade dele, dito método compreendendo a administração de um produto imunogênico como aqui acima descrito a dito mamífero. Em uma forma de realização, dita resposta imune inclui uma resposta imune humoral, em que anticorpos que neutralizam as propriedades imunossupressivas, apoptóticas ou angionênicas da citocina endógena são induzidos.
[0082] Em uma forma de realização da invenção, o produto imunogênico é um derivativo da citocina inativada porém imunogênica do IFNα quimicamente acoplado a um auxiliar-T estimulando a proteína carreadora estranha, tal como, por exemplo, KLH. Dito produto imunogênico tem a capacidade de romper a célula B, porém não a tolerância da célula T para IFNα. A tolerância da célula T auxiliar contra si é evitada ligando-se IFNα à proteína carreadora estranha.
[0083] As células B específicas para IFNα são ativadas em seguida à ligação antigênica e endocitose do produto imunogênico e peptídeos específicos carreadores são apresentados via as moléculas do maior complexo de histocompatibilidade (MHC) classe II. Este sinal de ativação não é suficiente para induzir a diferenciação da Célula B no caso de um antígeno dependente T, porém em razão de as células B processarem os próprios antígenos e o carreador, ajuda das células T pode ser dada pelas células T específicas para a própria proteína ou a proteína carreadora. Uma vez que a seleção de células T é muito rigorosa, não há ativação de células T específica para o autoantígeno.
[0084] As células dendríticas (DC) podem também absorver o autoantígeno e a molécula carreadora e apresentar peptídeos carreadores específicos, via suas moléculas MHC classe II. As DCs são assim capazes de ativar as células auxiliares T não afetadas específicas para o carreador. As células auxiliares T são, por sua vez, capazes de prover células auxiliares T específicas de carreador para as células B específicas para o autoantígeno e apresentar peptídeos carreadores em suas moléculas MHC classe II.
[0085] As células auxiliares T específicas para o carreador interagem com as células B específicas para o autoantígeno, eliciando uma resposta anticorpo normal contra o autoantígeno.
[0086] O produto imunogênico é principalmente usado em composições de vacina para tratar uma doença ligada a uma superprodução de IFNα.
[0087] Mais especificamente, esta invenção refere-se a um método para tratar uma doença ligada a uma superprodução de IFNα, compreendendo uma etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico da invenção.
[0088] Esta invenção também refere-se a um método para tratar uma doença ligada a uma superprodução de IFNα, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico, em que a administração do produto imunogênico evita a ocorrência de sintomas da doença.
[0089] A invenção também refere-se a um método para tratar uma doença ligada a uma superprodução de IFNα, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico, em que a administração do produto imunogênico evita o rubor da doença.
[0090] A invenção também refere-se a um método para tratar uma doença ligada a uma superprodução de IFNα, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico, em que a administração do produto imunogênico induz a produção de anticorpos que neutralizam a atividade do IFNα endógeno.
[0091] A invenção também refere-se a um método para tratar uma doença ligada a uma superprodução de IFNα, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico, em que a administração do produto imunogênico induz a neutralização da atividade do IFNα endógeno.
[0092] Exemplos de doença ligada a uma superprodução de IFNα incluem mas não são limitados a lupus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, escleroderma, síndrome de Sjogren, vasculite, HIV, diabete tipo I, tiroidite autoimune e miosite.
[0093] Um outro objetivo da invenção consiste de um método para induzir a produção de anticorpos que neutralizam a atividade do IFNα endógeno em um indivíduo, compreendendo uma etapa de administrar a dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico.
[Produto imunogênico]
[0094] O produto imunogênico como usado na invenção compreende IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, tal como KLH, em que o produto imunogênico é inativado.
[0095] O produto imunogênico como usado na invenção é um complexo entre pelo menos um subtipo de IFNα recombinante e pelo menos uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, obtida por conjugação com glutaraldeído e subsequente inativação com formaldeído.
[0096] Em uma forma de realização da invenção, a molécula de proteína carreadora pode ser qualquer molécula convencionalmente usada em imunologia, tal como KLH (hemocianina lapa californiana), ovalbumina, albumina de soro bovino (BSA), tétano toxoide, toxina da cólera B diftérica difoide, toxina de difteria não-tóxica mutante (CRM197), proteína da membrana externa de meningococo de vesículas de membrana externa, proteína da membrana externa de Haemophilus influenza (bacilo da influenza), toxina A de pseudomonas aeruginosa, partícula semelhante a vírus (VLP)... Em uma forma de realização preferida, dito carreador é KLH. Preferivelmente, o produto partindo de KLM consiste de uma KLH altamente purificada, extraída da linfa do molusco gastrópode marinho Megathura cremulata. A KLM naturalmente produzida geralmente consiste de uma estrutura di-decâmera, que é um conjunto tubular não-covalente de 20 subunidades.
[0097] Em outra forma de realização da invenção, o subtipo de IFNα recombinante pode ser qualquer subtipo entre IFN alfa 1, alfa 2a, alfa 2b, alfa 4, alfa 5, alfa 6, alfa 7, alfa 8, alfa 10, alfa 14, alfa 16, alfa 17 e alfa 21.
[0098] Os subtipos de IFNα recombinante podem ser obtidos por métodos convencionais conhecidos na arte, empregando-se as sequências do Genbank, como descrito aquiacima. por exemplo, a produção do subtipo de IFNα recombinante pode ser realizada cultivando-se células contendo um vetor de expressão compreendendo o gene do subtipo de IFNα e então colhendo-se os corpos de inclusão e finalmente purificando-se o subtipo de IFNα.
[0099] Em uma forma de realização da invenção, o subtipo IFNα recombinante é o subtipo IFNα 2b.
[00100] Em uma forma de realização da invenção, o produto imunogênico compreende pelo menos o IFNα subtipo 2b.
[00101] Em uma forma de realização da invenção, o subtipo de IFNα se encontra em uma solução líquida, preferivelmente uma solução tampão tendo um pH variando de 3,5, preferivelmente de 6 a 7,8.
[00102] Em uma forma de realização, quando o indivíduo a ser tratado é um humano, o IFNα recombinante usado é humano.
[00103] Em uma forma de realização, o produto imunogênico compreende IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, em que dito produto imunogênico é reconhecido por um anticorpo IFNα.
[00104] O reconhecimento do produto imunogênico por um anticorpo anti-IFNα pode ser realizado por métodos convencionais conhecidos na arte, tais como um ELISA sanduíche anti-IFNa/proteína carreadora. O ELISA (TESTE D) é desenvolvido por qualquer meio colorimétrico conhecido na arte, tal como, por exemplo, empregando-se anticorpo de detecção rotulado com biotina, um sistema de amplificação HRP de poli-estreptavidina e uma solução substrato diidrocloreto de ofenilenodiamina.
[00105] Um exemplo de dito método é o seguinte:
[00106] revestir uma placa com o anticorpo de captura, tal como, por exemplo, um anticorpo anti-KLH policlonal de coelho,
[00107] bloquear a placa com um tampão de bloqueio (tal como caseína 2% em PBS por exemplo) durante 90 min a 37 °C,
[00108] incubar durante 90 min a 37 °C a placa com uma série de diluição do produto imunogênico de 250 ng/ml a 8 diluições duplas ou com controles negativos, tais como KLH e IFNα,
[00109] incubar por 90 min a 37 °C a placa com o anticorpo de detecção, tal como, por exemplo, um anticorpo anti-IFNα biotinilado,
[00110] incubar a placa com estreptavidina-HRP durante 30 min a 37 °C e desenvolver o complexo com uma solução de substrato de diidrocloreto de ofenilenodiamina (OPD) amainando em 30 min. Após parar a reação enzimática, a intensidade da cor resultante é determinada por métodos espectrofotométricos a 490 nm.
[00111] Quando a densidade óptica de poços contendo o produto imunogênico é de pelo menos 10 vezes superior à densidade óptica dos poços contendo o controle negativo, a pessoa hábil na arte considera que o produto imunogênico é reconhecido por um anticorpo anti-IFNα e que IFNα do produto imunogênico está acoplado com KLH.
[00112] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico compreende IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, em que dito produto imunogênico é fortemente imunogênico, o que significa que o produto é capaz de induzir anticorpos anti-IFNα in vivo nas condições do TESTE A testado conforme abaixo.
[00113] O Teste A é realizado de acordo com o seguinte método:
[00114] 0,3 a 10 μg de proteínas totais (como determinado por um ensaio de proteína Bradford) do produto imunogênico são injetados em camundongos Balb/c de 6 8 semanas duas vezes em 30 dias, preferivelmente no dia 0 e dia 21. Uma amostra de soro é obtida antes da imunização (amostra de soro pré-imune) e entre o dia 30 e o dia 40 (amostra de soro de teste), preferivelmente no dia 31. Um ELISA anti-IFNα é realizado como explicado aqui acima.
[00115] Resumidamente, uma placa de 96 poços é revestida com 100 ng do subtipo de IFNα usado para preparar o produto imunogênico, tal como IFNα-2b e incubada durante a noite a 2 °C 8 °C. A placa é então bloqueada com um tampão de bloqueio durante 90 min a 37 °C. 100 μl de amostra pré-imune na diluição 1/2500 e uma série de diluição de 1/2500 até 8 duplas diluições das amostras de soro (pré-imune e teste) são adicionados aos poços. Um anticorpo secundário rotulado imunoglobulina anticamundongo, tal como um anticorpo conjugado HRP, é finalmente adicionado aos poços e o ELISA é desenvolvido usando-se qualquer meio colorimétrico conhecido na arte, tal como, por exemplo, uma solução de substrato de diidrocloreto de ofenilenediamina.
[00116] Quando a densidade óptica dos poços contendo a amostra de soro de teste for de pelo menos 2 vezes superior à densidade óptica dos poços contendo a amostra de soro pré-imune, a pessoa hábil na arte considera que o produto imunogênico é imunogênico. o que significa que ele induziu anticorpos anti-IFNα in vivo.
[00117] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico compreende IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, em que o IFNα é fortemente inativado, o que significa que o produto apresenta menos do que 5%, preferivelmente, menos do que 1% de atividade antiviral de IFNα nas condições do TESTE B abaixo citadas. Em uma forma de realização, o produto imunogênico da invenção, em uma concentração de 500 ng/ml ou mais, apresenta menos do que 5%, preferivelmente menos do que 1% de atividade antiviral de IFNα em uma concentração de 500 ng/ml ou mais nas condições do TESTE B.
[00118] Este ensaio é baseado no efeito protetor do IFNα sobre o efeito citopático (CPE) do vírus da estomatite vesicular (VSV) em células de rins bovinos Madin-Darby (MDBK). Este ensaio pode também ser realizado usando-se células humanas Hep-2C ou A549 e vírus EMCV. O teste B é realizado de acordo com o seguinte método:
[00119] O produto imunogênico e o subtipo de IFNα recombinante usado para preparar o produto imunogênico (controle positivo) são diluídos em pelo menos 500 ng/ml e pelo menos 1000 U/ml, respectivamente, em meio Basal (RPMI suplementado com glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, Hepes 1 mM). 50 μl do produto imunogênico e do controle positivo são disseminados em uma placa de 96 poços e diluídos em uma série de diluições duplas no meio Basal. 2 104 células MDBK são adicionadas em cada poço em 50 μl de meio celular (RPMI suplementado com 4% FBS, 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio e 1 mM Hepes) e a placa é incubada durante a noite a 37 °C, 5% CO2. O vírus é então diluído em meio Basal a pelo menos 10 TCID50 (infecção de cultura de tecido dose 50: 10 vezes a diluição para matar 50% de células infectadas). A placa é esvaziada e 100 μl do vírus diluído são adicionados. A placa é então incubada durante a noite a 37 °C, 5% CO2.
[00120] No final da cultura, a viabilidade das células MDBK é avaliada usando-se métodos bem conhecidos na arte. Um exemplo de ditos métodos é o seguinte: 20 μl/poço de uma solução de MTS/PMS (100 μl MTS/5 μl PMS; Promega G5430) são adicionados aos poços e a placa é incubada por outras 4 h a 37 °C, 5 % CO2. A placa é então lida a 490 nm em um espectrofotômetro.
[00121] A percentagem de atividade antiviral é calculada como segue: % atividade antiviral = (DOproduto-DOvírus)/DOcélulas média DOvírus)]*100
[00122] DOproduto representa a densidade óptica do poço com o produto imunogênico ou com o controle positivo (subtipo IFNα).
[00123] DOvírus significa a densidade óptica do poço de controle com somente o vírus.
[00124] DOcélulas representa a densidade óptica do poço de controle com IFNα e vírus.
[00125] O valor EC50, correspondendo à quantidade de produto imunogênico resultando em 50% de inibição de mortalidade mediada por vírus, é determinado interpolando-se o valor EC50 no eixo geométrico x em um gráfico de viabilidade/concentração.
[00126] Comparando-se o EC50 do produto imunogênico e o EC50 do controle positivo (o subtipo de IFNα recombinante usado para preparar o produto imunogênico) permite determinar se o produto imunogênico mostra menos do que 5%, preferivelmente menos do que 1% de atividade antiviral.
[00127] Um Fator de Inativação EC50 produto / EC50 IFNα pode ser calculado: quando o produto imunogênico mostrar menos do que 5%, preferivelmente menos do que 1% de atividade antiviral, o Fator de Inativação é de mais do que 20, preferivelmente mais do que 100.
[00128] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico compreende IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, em que o produto imunogênico é capaz de neutralizar a atividade antiviral do IFNα nas condições do TESTE C abaixo citado. De Acordo com a invenção, este ensaio é realizado para avaliar a capacidade de neutralização do soro obtido de camundongos imunizados com o produto imunogênico. A capacidade de neutralização pode ser estimada avaliando-se a viabilidade celular na presença do vírus da estomatite vesicular replicando em células MDBK. Este ensaio pode também ser realizado usando-se células humanas Hep-2c e vírus EMCV.
[00129] O teste C é realizado de acordo com o seguinte método:
[00130] 0,3 a 10 μg de proteínas totais (como determinado por um ensaio de proteína Bradford) do produto imunogênico são injetados em camundongos Balb/c de 6 8 semanas duas vezes em 30 dias, preferivelmente no dia 0 e dia 21. Uma amostra de soro é obtida antes da imunização (amostra de soro pré-imune) e entre o dia 30 e dia 40 (amostra de soro de teste), preferivelmente no dia 31.
[00131] 25 μl de amostras de soro de teste são disseminadas em uma placa de 96poços em uma diluição de 1/200 até 8 diluições de 1/200. O controle positivo (antiIFNα policlonal de PBL, Piscataway, NJ, ref. 31100-1) é tipicamente diluído para ser capaz de neutralizar a atividade IFNα de 3125 UI/poço para 100 UI/poço em meio Basal (RPMI suplementado com 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio e 1 mM hepes) e 25 μl foram também disseminados na placa.
[00132] 25 U/poço (concentração final) em 25 μl de meio basal de IFNα são adicionados em cada poço e a placa é incubada por 60 min em temperatura ambiente.
[00133] 20000 células MDBK em meio de Ensaio (RPMI suplementado com 4% FBS, 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 1 mM hepes) são adicionadas em cada poço e a placa é incubada durante a noite a 37 °C, 5% CO2.
[00134] O vírus é diluído em pelo menos 10 TCID50 (10 vezes a diluição para matar 50% de células infectadas) em meio de vírus (RPMI suplementado com glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, hepes 1 mM). A placa é esvaziada e 10 μl de vírus são adicionados a cada poço antes da incubação por 24 h a 37 °C, 5% CO2.
[00135] No final da cultura, a viabilidade das células MBDK é avaliada usando-se métodos bem conhecidos na arte. Um exemplo de ditos métodos é o seguinte: 20 μl/poço de uma solução de MTS/PMS (100 μl MTS/5 μl PMS; Promega G5430) são adicionados aos poços e a placa é incubada por outras 4 h a 37 °C 5% CO2. A placa é então lida a 490 nm em um espectrofotômetro.
[00136] A viabilidade relativa das células é calculada como segue:
Figure img0001
[00137] DOamostra representa a densidade óptica do poço com o soro obtido do camundongo imunizado com o produto imunogênico ou com o controle positivo (anticorpo anti-IFN policlonal).
[00138] DOvírus representa a densidade óptica do poço de controle com somente o vírus.
[00139] DOIFN+vírus representa a densidade óptica do poço de controle com IFNα e vírus.
[00140] O valor NC50, correspondendo à diluição do soro resultando em 50% de neutralização de mortalidade mediada por vírus, expresso como um fator de diluição ou unidade de neutralização/ml, é determinado por interpolação do valor NC50 no eixo geométrico x em um gráfico de viabilidade/concentração.
[00141] No TESTE C, um resultado mostrando que o soro obtido do camundongo imunizado com o produto imunogênico não protege as células MBDK da mortalidade significa que o produto imunogênico tem a capacidade de induzir anticorpos dirigidos contra IFNα que neutralizam sua atividade viral.
[00142] Em uma forma de realização, o produto imunogênico compreende IFNα acoplado com uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, em que o produto imunogênico é capaz de neutralizar pelo menos 50% da atividade antiviral do IFNα nas condições do TESTE C. Em dita forma de realização, o NC50 pode ser calculado. Se a diluição do soro não for capaz de neutralizar pelo menos 50% da atividade antiviral de IFNα nas condições do TESTE C, a NC50 do produto não pode ser calculada.
[00143] Em uma forma de realização da invenção, o produto imunogênico compreende IFNα acoplado com uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, em que a relação IFNα/carreador em peso está variando de 0,06 a 0,6.
[00144] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico compreende IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, em que a relação IFNα/carreadora é de 0,1 a 0,5.
[00145] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico compreende IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, em que a relação IFNα/carreadora é de 0,3.
[00146] Em outra forma de realização da invenção, o produto imunogênico compreende IFNα acoplado a uma molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, em que a relação IFNα/carreadora é de 0,05, 0,1, 0,2, 0,21,0,22, 0,23,0,24, 0,25,0,26,0,27, 0,28,0,29, 0,3, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,36,0,37, 0,38, 0,39, 0,4, 0,5.
[00147] Dita relação pode ser calculada de acordo com um método baseado em UV e detecção de fluorescência (Teste E), com descrito no Exemplo 10.
[00148] [Método para obter o produto imunogênico]
[00149] Em uma forma de realização da invenção, o IFNα kinóide é obtido de acordo com o seguinte método: i. misturar juntos Opcionalmente um subtipo de IFNα humano recombinante e a pelo menos uma molécula de proteína carreadora com glutaraldeído e bloquear a reação adicionando-se um composto de extinção selecionado de (i) um agente de redução e (ii) um aminoácido selecionado do grupo consistindo de lisina e glicina e suas misturas. ii. remover compostos tendo um peso molecular menor do que 10 kDa ou menor do que 8 kDa. iii. adicionar formaldeído; iv. bloquear a reação com formaldeído pela adição de um composto de extinção selecionado de (i) um agente redutor e (ii) um aminoácido selecionado do grupo consistindo de lisina e glicina e sua mistura, v. coletar dito produto imunogênico.
[00150] Em uma forma de realização da etapa a), o IFNα e a molécula de proteína carreadora, tal como, por exemplo, KLH, são primeiramente misturados juntos nas quantidades apropriadas, antes de adicionar glutaraldeído.
[00151] Em uma forma de realização, IFNα e KLH são misturados na etapa a) em uma relação molar de IFNα:subunidadeKLH variando de 10:1 a 40:1. Em outra forma de realização, IFNα e KLH são misturados na etapa a) em uma relação molar de IFNα:subunidadeKLH variando de 15:1 a 25:1. Em outra forma de realização, IFNα e KLH são misturados na etapa a) em uma relação molar de IFNα:subunidadeKLH variando de 20:1 a 25:1.
[00152] Em uma forma de realização da etapa a), o glutaraldeído é usado em uma concentração final na mistura de reação variando de 1 mM a 250 mM, preferivelmente de 20 mM a 30 mM, membro pino de 22,5 mM a 25 mM. Em uma forma de realização da etapa a), o glutaraldeído é incubado com IFNα e KLH por um período de tempo variando de 15 min a 120 min, preferivelmente de cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 minutos. Em uma forma de realização, o glutaraldeído é adicionado a 22,5 mM durante cerca de 45 minutos. Vantajosamente, a etapa a) de incubação com glutaraldeído é realizada em uma temperatura variando de 18 °C a 37 °C, preferivelmente de 18 °C a 27 °C.
[00153] De acordo com uma forma de realização, a reação com glutaraldeído (etapa a) é parada antes de remover compostos tendo um peso molecular menor do que 10 kDa (etapa b) adicionando-se um composto de extinção, preferivelmente um composto de extinção que é selecionado de (i) um agente redutor e (ii) um aminoácido selecionado do grupo consistindo de lisina e glicina e suas misturas.
[00154] O agente redutor pode consistir de qualquer um dos agentes redutores conhecidos na arte que, devido a suas propriedades de redução, têm a capacidade reduzir os agrupamentos imina remanescentes gerados durante o tratamento com aldeído. O agente redutor pode ser selecionado do grupo consistindo de boroidreto de sódio, cianoboroidreto de sódio.
[00155] De acordo com uma forma de realização, nas formas de realização em que dito composto de extinção é um aminoácido, o dito aminoácido consiste de glicina. Em algumas formas de realização da etapa b), em que glicina e/ou lisina são usados para bloquear a reação com glutaraldeído, o aminoácido selecionado é usado em uma concentração final na mistura variando de 0,01 M a 1M, preferivelmente de 0,05 M a 0,5 M e, muitíssimo preferivelmente de 0,08 M a 0,2 M, p.ex., a 0,1 M como mostrado nos exemplos aqui. Em uma forma de realização, a incubação com o composto de extinção é realizada por um período de tempo variando de 1 minuto a 120 minutos, preferivelmente de 5 minutos a 60 minutos, p. ex., por 30 minutos como mostrado nos exemplos aqui. Em outra forma de realização, esta etapa é realizada em uma temperatura variando de 18 °C a 30 °C, preferivelmente de 18 °C a 25 °C.
[00156] Na etapa b), os pequenos compostos menores do que 10 kDa, que estão presentes na mistura de reação, são removidos. Estes pequenos compostos abrangem principalmente o glutaraldeído em excesso e as moléculas do composto de extinção em excesso, que não reagiram com IFNα nem KLH. A etapa b) pode ser realizada de acordo com qualquer técnica conhecida, que permita a remoção de compostos menores do que 10 kDa, técnicas estas incluindo diálise com uma membrana de diálise tendo um corte de 10 kDa ou filtragem, empregando-se uma membrana de filtragem tendo um corte de 10 kDa. Ilustrativamente, a etapa b) pode consistir de uma etapa de filtragem de fluxo tangencial, empregando-se uma membrana de filtragem tendo um corte de 10 kDa, como é mostrado nos exemplos aqui. O retentado de filtragem, que é desprovido dos pequenos compostos indesejáveis, é coletado no final da etapa b). Se desejado, a etapa b) pode compreender uma etapa preliminar de remover os agregados compostos eventuais presentes na mistura de reação obtida no final da etapa b). A dita etapa preliminar pode consistir de uma etapa de filtragem convencional para remover agregados eventualmente presentes na suspensão em uma solução líquida, p. ex., uma etapa de filtragem empregando uma apropriada membrana de filtragem, p. ex., uma membrana de filtragem tendo um tamanho de poro de 0,2 μm.
[00157] Em uma forma de realização da etapa c) do método, formaldeído é adicionado em uma concentração final de 6 mM a 650mM, preferivelmente de 25 mM a 250 MM. Em uma forma de realização da etapa c) do método, formaldeído é adicionado por um período de tempo de 1 h a 336 horas, preferivelmente de 1 h a 144 horas. Em uma forma de realização, o formaldeído é aplicado em uma concentração final de 50 a 100 mM, preferivelmente 66 mM durante 20 a 50 horas, preferivelmente 40 horas.
[00158] Na etapa c), a incubação com formaldeído é realizada preferivelmente em uma temperatura variando de 30 °C a 40 °C, p. ex., a 37 °C, como é mostrado nos exemplos aqui.
[00159] Na etapa d) do método, a reação com formaldeído é parada adicionandose um composto de extinção, preferivelmente um composto de extinção que é selecionado de (i) um agente redutor e (ii) um aminoácido selecionado do grupo consistindo de lisina e glicina.
[00160] O agente redutor pode consistir de qualquer um dos agentes redutores conhecidos na arte que, devido a suas propriedades de redução, reduzem os grupamentos de imina remanescentes, gerados durante o tratamento com aldeído. O agente redutor pode ser selecionado do grupo consistindo de boroidreto de sódio, cianoboroidreto de sódio. De acordo com uma forma de realização, das formas de realização aqui, o dito composto de extinção é um aminoácido, dito aminoácido consiste de glicina. Em algumas formas de realização da etapa b), onde glicina e/ou lisina são usados para bloquear a reação com formaldeído, o aminoácido selecionado é usado em uma concentração final na mistura de reação variando de 0,01 M a 1,5 M, preferivelmente de 0,05 M a 1 M e, muitíssimo preferivelmente, de 0,1 M a 0,2 M, p. ex., a 0,1 M como mostrado nos exemplos aqui. Em uma forma de realização, a incubação com o composto de extinção é realizada por um período de tempo variando de 5 minutos a 120 minutos, preferivelmente de 10 minutos a 60 minutos, p. ex., por 30 minutos como mostrado nos exemplos aqui. Em outra forma de realização, esta etapa é realizada em uma temperatura variando de 18 °C a 30 °C, preferivelmente de 18 °C a 25 °C.
[00161] De acordo com uma forma de realização do método, logo antes da coleta na etapa e), a remoção de substâncias tendo um peso molecular menor do que 100 kDa pode ser realizada pelo artífice hábil por qualquer técnica conhecida na arte para remover substâncias tendo um peso molecular de mais do que 100 kDa de uma solução líquida. Em uma primeira forma de realização, a técnica usada é uma etapa de filtragem que é realizada utilizando-se uma membrana de filtragem tendo um valor de corte de pelo menos 100 kDa, que engloba uma etapa de ultrafiltragem ou uma etapa de filtragem tangencial. Em uma segunda forma de realização, a técnica usada consiste de uma etapa de filtragem tangencial, empregando-se uma membrana de filtragem tendo um valor de corte de pelo menos 100 kDa. Em outra forma de realização, logo antes da coleta na etapa e), a remoção de substâncias tendo um peso molecular menor do que 300 kDa pode ser realizada utilizando-se uma membrana de filtragem tendo um valor de corte de pelo menos 300 kDa.
[Composição, Emulsão e vacina contendo tal emulsão)
[00162] Esta invenção refere-se a uma composição compreendendo o produto imunogênico como descrito aqui acima. Esta invenção também refere-se a uma formulação do produto da invenção, em que o produto está dentro de uma emulsão. Vantajosamente, a composição de vacina da invenção compreende ou consiste de dita emulsão. Tal emulsão compreende o produto imunogênico da invenção, um óleo e um surfactante ou uma mistura de pelo menos um óleo e pelo menos um surfactante. Preferivelmente, o óleo ou a mistura de óleo/surfactante é um excipiente farmaceuticamente aceitável. Mais preferivelmente, a mistura de óleo e surfactante é um adjuvante, mesmo mais preferivelmente um imunoadjuvante. Adjuvante preferido é ISA 51. Outro exemplo de imunoadjuvante que pode ser usado é SWE (emulsão de óleo-em-água baseado em esqualeno). Outro exemplo de imunoadjuvante que pode ser usado é SWE-a (emulsão de água-em-óleo baseada em esqualeno). A emulsão da invenção pode ser uma emulsão de água-em-óleo ou uma emulsão de óleo-emágua.
[00163] Em outra forma de realização, a quantidade do produto imunogênico de acordo com a presente invenção é de mais do que 0,01% (p/p) e menos do que 1% (p/p) do peso total de dita emulsão.
[Adjuvantes]
[00164] A emulsão ou a composição de vacina da invenção pode compreender adjuvante, especialmente imunoadjuvantes. Em uma forma de realização, a quantidade de faixas de adjuvantes de 0,00001% (p/p) a 1%, preferivelmente 0,0001 a 0,1%, membro pino de 0,001 a 0,01% (p/p do peso total da composição de vacina.
[00165] Qualquer adjuvante adequado conhecido pelo artífice hábil pode ser usado na composição de vacina acima, incluindo adjuvantes baseados em óleo,tais como, por exemplo, Adjuvante Incompleto de Freund, adjuvantes baseados em micolato (p. ex., dimicolato de trealose), lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), peptidoglicanos (isto é mureínas, mucopeptídeos ou glicoproteínas, tais como N-Opaca, dipeptídeo de muramila [MDP] ou análogos de MDP), MPL (monofosforil lipídeo A), proteoglicanos (p. ex., extraídos de Klebisiella pneumoniae), preparações estreptocócicas (p. ex., OK432), Biostim.TM (p.ex., 01 K2), os “Iscoms” de EP 109 942, EP 180 564 e EP 232 039, hidróxido de alumínio, sqponina, DEAE-dextrano, óleos neutros (tais como migliol), óleos vegetais (tais como óleo araquídeo), lipossomas, poliois Pluronic.RTM., o sistema adjuvante Ribi (vide, por exemplo, GB-A-2 189 141) ou interleucinas, particularmente aqueles que estimulam a imunidade mediada por célula. Um adjuvante alternativo, consistindo de extratos de Amycolata, um gênero bacteriano da ordem Actinomycetales, foi descrito na Patente U.S. No. 4.877.612. Alternativamente, SWE (squaleno 3,9%, extensão 0,47%, tween 80 0,47% em tampão de citrato) e SWEa (esquaieno 3,9%, vão 0,47%, tween 80 0,47% em tampão de citrato) podem também ser usados. Adicionalmente, misturas de adjuvantes patenteadas são comercialmente disponíveis. O adjuvante usado dependerá, em parte, do organismo recipiente. A quantidade de adjuvante a administrar dependerá do tipo e tamanho do animal. Dosagens ótimas podem ser prontamente determinadas por métodos de rotina.
[00166] Adjuvantes de óleo adequados para uso em emulsões de água em óleo podem incluir óleos minerais e/ou óleos metabolizáveis. Os óleos minerais podem ser selecionados de Bayol®, Marcol® e Drakeol, incluindo Drakeol® 6VR (SEPPIC, France) ®. Óleos metabolizáveis podem ser selecionados de óleo SP (a seguir descrito), Emulsigen (MPV Laboratories, Ralsto, NZ), Montanide 264.266.26 (Seppic SA, Paris, França), bem como óleos vegetais, tais como óleo de amendoim e óleo de soja, óleos animais como os óleos de peixe esqualano e esqualeno, e tocoferol e seus derivativos.
[00167] Além disso, o adjuvante pode incluir um ou mais agentes umectantes ou dispersantes, em quantidades de cerca de 0,1 a 25%, membro pino cerca de 1 a 10% e, mesmo mais preferivelmente 1 a 3 % em volume do adjuvante. Particularmente preferido como agentes umectante ou dispersante são os surfactantes não-iônicos. Surfactantes não-iônicos úteis incluem copolímeros em bloco de polioxietileno/polioxipropileno, especialmente aqueles comercializados sob a marca comercial Pluronic® e disponíveis na BASF Corporation (Mt. Olive, N.J.). Outros surfactantes não-iônicos úteis incluem ésteres de polioxietileno, tais como monooleato de polioxietileno sorbitano, disponíveis sob a marca comercial Tween 80®, ou monooleato de manide. Pode ser desejável incluir mais do que um, p. ex., pelo menos dois, agentes umectantes ou dispersantes no adjuvante como parte da composição de vacina da invenção.
[00168] Adjuvantes adequados podem incluir mas não são limitados a surfactantes conhecidos por uma pessoa hábil na arte, tal como, por exemplo, hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamônio, N,N-dioctadecil-N’N-bis(2-hidroxetilpropano di-amina), metoxiexadecil-glicerol e poliois plurônicos; poliânions, p. ex., pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol; peptídeos, p. ex., muramil dipeptídeo, aimetilglicina, tuftsina, emulsões oleosas, alume e suas misturas. Outros adjuvantes potenciais incluem as subunidades de peptídeo B de toxina lábil ao calor de E.coli ou da toxina da cólera. McGhee, J. R., et al., “On vaccine development”, Sem. Hematol., 30:3 15 (1993).
[Outros surfactantes]
[00169] Nas formas de realização de uma composição de vacina de acordo com a presente invenção, compreendendo uma emulsão, a composição de vacina preferivelmente contém, em adição à combinação do produto imunogênico e à uma ou mais substâncias imunoadjuvantes oleosas, também um ou mais agentes surfactantes. Formas de realização ilustrativas dos agentes surfatantes incluem monoleato de manide, tal como Montanide® 80, comercializado por Arlacel (SEPPIC, França).
[00170] Em uma forma de realização, a quantidade de agente surfactante varia de 0,00001% (p/p) a 1%, preferivelmente 0,0001 a 0,1%, mais preferivelmente de 0,001 a 0,01% (p/p) do peso total da composição de vacina.
[Produtos liofilizados]
[00171] De acordo com uma forma de realização e para fins de armazenagem, o produto ou a composição de vacina da invenção podem ser liofilizados. As composições de vacina podem, assim, ser apresentadas em uma forma secada por congelamento (liofilizada). Em dita forma de realização, o produto imunogênico de acordo com a presente invenção é combinado com uma ou mais substâncias auxiliares da liofilização. Várias substâncias auxiliares da liofilização são bem conhecidas por uma pessoa hábil na arte. A liofilização das substâncias auxiliares abrange açúcares como lactose e manitol.
[00172] Em tal forma de realização, em que a composição de vacina consiste de uma composição liofilizada para uso como uma emulsão líquida compreendendo um agente surtactante, a composição de vacina preferivelmente compreende uma quantidade do produto imunogênico de acordo com a presente invenção de mais do que 0,1% (p/p) e menos do que 10% (p/p) do peso total de dita composição de vacina. [Estabilizadores]
[00173] Em algumas formas de realização, a vacina pode ser misturada com estabilizadores, p. ex., para proteger as proteínas tendentes a degradação de serem degradadas, para aumentar a vida em prateleira da vacina ou para melhorar a eficiência da secagem por congelamento. Estabilizadores úteis são i.a, SPGA (Bovarnik et al.; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), carboidratos, p. ex., sorbitol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas tais como albumina ou caseína ou produtos de sua degradação, misturas de aminoácidos tais como lisina ou glicina, e tampões, tais como fosfatos de metal alcalino.
[Rota de administração]
[00174] As composições de vacina de acordo com a presente invenção podem ser administradas ao indivíduo a ser imunizado por qualquer método convencional, incluindo, p. ex., injeção intradérmica, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea; ou por suprimento tópico, tal como, por exemplo, transdérmico. O tratamento pode consistir de uma única dose ou uma pluralidade de doses durante um período de tempo.
[Forma de dosagem]
[00175] As formas adequadas para uso injetável podem incluir soluções estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A prevenção contra contaminação por microorganismos pode ser realizada adicionando-se na composição de vacina preservativos, tais como vários agente antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, pode ser preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio, para reduzir a dor durante a injeção. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso nas composições de agentes de retardo da absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00176] De acordo com uma forma de realização, uma composição de vacina liofilizada da invenção é solubilizada em água para injeção e suavemente misturada; em seguida um imunoadjuvante, preferivelmente ISA 51, é adicionado; a mistura é suavemente misturada para emulsificação e carregada em uma seringa adequada. Esta invenção assim também refere-se a um dispositivo médico, incluindo uma seringa enchida ou pré-enchida com uma composição de vacina da invenção. A emulsão é idealmente preparada extemporaneamente. Entretanto, a seringa contendo a emulsão pode ser armazenada por menos do que 10 horas a 2 8 °C. Neste caso, a emulsão deve ser permitida aquecer antes da injeção por fricção entre as mãos.
[Faixa de dosagem unitária]
[00177] Outro objetivo da invenção é uma unidade de dosagem compreendendo uma quantidade do produto imunogênico variando de mais do que 30 mcg a 1000 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 1000 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 750 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 500 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 450 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 400 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 350 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 300 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 250 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 1000 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 750 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 500 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 450 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 400 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 350 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 300 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 250 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 240 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 200 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 150 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 120 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 100 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 150, 160, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350,360, 370, 380, 390 a 400 mcg.
[00178] Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 60 mcg a 240 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 60 mcg a 120 mcg.
[00179] Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 60 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 120 mcg. Em outra forma de realização, a unidade de dosagem compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 240 mcg. [Kit e dispositivo médico]
[00180] Esta invenção também diz respeito a um kit compreendendo:
[00181] 1 frasco (Frasco Número 1) contendo o produto imunogênico da invenção, tipicamente de 3 mL;
[00182] 1 frasco (Frasco Número 2) contendo adjuvante, preferivelmente, ISA51; este frasco é capaz de conter 3 mL de adjuvante e pode ser um recipiente de 8 mL;
[00183] 1 seringa, tipicamente, uma Braun Injekt-F® de 1mL;
[00184] -1 agulha (Agulha Número 1) para preparação de emulsão; esta agulha é, preferivelmente, uma agulha 20G;
[00185] -1 agulha (Agulha Número 2) para injeção, preferivelmente, injeção intramuscular; esta agulha é, preferivelmente, uma agulha 23G.
[00186] Esta invenção também diz respeito a um método para preparar uma vacina do kit, compreendendo: 1. obter 0,4 ml de adjuvante do Frasco Número 2. Descarregar este conteúdo da seringa dentro do Frasco Número 1 contendo 0,4 ml de produto imunogênico.
[00187] (4) bombear para cima e para baixo o conteúdo total do frasco um número suficiente de vezes para emulsificar o conteúdo, tipicamente 30 vezes, e, finalmente, obter a emulsão inteira.
[00188] Antes da injeção, a Agulha Número 1 é, preferivelmente, trocada pela Agulha Número 2 e ar é purgado da seringa.
[00189] Em uma forma de realização, dito kit compreende:
[00190] 1 frasco (Frasco Número 1) contendo 0,4 ml do produto imunogênico da invenção;
[00191] 1 frasco (Frasco Número 2) contendo pelo menos 0,4 ml de adjuvante, preferivelmente, ISA51;
[00192] 1 seringa, tipicamente, uma Braun Injekt-F® de 1mL;
[00193] 1 agulha (Agulha Número 1) para preparação de emulsão; esta agulha é, preferivelmente, uma agulha 20G;
[00194] 1 agulha (Agulha Número 2) para injeção, esta agulha é, preferivelmente, uma agulha 23G.
[00195] Em outra forma de realização, o produto imunogênico está em uma forma liofilizada. Portanto, o kit compreende:
[00196] 1 frasco (Frasco Número 1) contendo produto liofilizado da invenção, tipicamente de 3 mL;
[00197] 1 frasco (Frasco Número 2) contendo água para injeção, tipicamente, de 2 mL;
[00198] 1 frasco (Frasco Número 3) contendo adjuvante, preferivelmente, ISA51; este frasco é capaz de conter 3 mL de adjuvante e pode ser um recipiente de 8 mL;
[00199] 1 seringa, tipicamente, uma Braun Injekt-F® de 1mL;
[00200] 1 agulha (Agulha Número 1) para preparação de emulsão; esta agulha é, preferivelmente, uma agulha 20G;
[00201] 1 agulha (Agulha Número 2) para injeção, preferivelmente, injeção intramuscular; esta agulha é, preferivelmente, uma agulha 23G.
[00202] Esta invenção também diz respeito a um método para preparar uma vacina do kit, compreendendo: 2. injetar água para injeção do Frasco Número 2 para o Frasco Número 1, usando a seringa conectada à Agulha Número 1; 3. girar gentilmente o Frasco Número 1 durante 1-5 minutos, até solubilização completa da preparação; 4. com a mesma seringa e agulha, puxar para cima o adjuvante do Frasco Número 5. Descarregar este conteúdo da seringa dentro do Frasco Número 1. 6. bombear para cima e para baixo o conteúdo total do frasco um número suficiente de vezes para emulsificar o conteúdo, tipicamente 30 vezes, e finalmente obter a emulsão inteira.
[00203] Esta invenção também se refere ao dispositivo médico que é a seringa carregada ou pré-carregada com a composição, emulsão ou vacina da invenção.
[00204] Em uma forma de realização, dita seringa é uma seringa de câmara dupla, em que uma câmara compreende uma solução com o produto imunogênico da invenção e a outra câmara compreende o adjuvante.
[00205] A invenção também se refere a um dispositivo médico compreendendo um frasco ou um tubo anestésico pré-carregado com o produto da invenção ou com a composição de vacina da invenção.
[00206] Em uma forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de mais do que 30 mcg a 1000 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 1000 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 750 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 500 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 450 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 400 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 350 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 360 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35 mcg a 250 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 1000 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 750 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 500 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 450 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 400 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 350 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 300 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 250 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 240 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 200 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 150 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 120 mcg. Em outra forma de realização da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz do produto imunogênico por administração é de 60 mcg a 100 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 to 400 mcg.
[00207] Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 60 mcg a 240 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico variando de 60 mcg a 120 mcg.
[00208] Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico de 60 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico de 120 mcg. Em outra forma de realização, o dispositivo médico compreende uma quantidade do produto imunogênico de 240 mcg.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00209] Figura 1: Porcentagem de amostras de soro de paciente imunizadas mostrando atividade neutralizante IFNα durante parecer interino.
[00210] Figura 2: Evolução diferencial de genes induzidos por IFN em pacientes tratados versus placebo. Dos 11 pacientes exibindo níveis aumentados de expressão de gene induzido por IFN em valor padrão, 8 foram tratados com o produto imunogênico e 3 receberam injeções de placebo. Os níveis de 250 genes induzidos por IFN mostrando os níveis mais elevados de superexpressão em pacientes SLE foram avaliados empregando-se microssistemas de densidade elevada. Os resultados são representados como o log2(nível de expressão em V1) log2(nível de expressão em V6) médios. O valor p foi calculado empregando-se um teste-t de Student.
[00211] Figura 3: Títulos de anticorpos aglutinando-se por IFN em pacientes tratados com assinatura-IFN positiva ou negativa em pacientes recebendo valor padrão versus placebo. Asteriscos indicam valores p < 0,05.
[00212] Figura 4: Evolução diferencial de genes induzidos por IFN em pacientes tratados com assinatura-IFN positiva ou negativa em valor padrão versus pacientes placebo, entre V10 e V0 ou entre V11 e V0. Os resultados são representados como o Log Delta médio (Expressão de Gene). Asteriscos indicam valores p < 0,05.
[00213] Figura 5: Evolução de valores C3 de soro em pacientes tratados com assinatura-IFN positiva em valor padrão e em pacientes recebendo placebo. Asteriscos indicam valores p < 0,04.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Preparação do produto imunogênico
[00214] Hemocianina Lapa californiana (KLH) foi extraída da linfa do molusco gastrópode marinho Megathura cremulata e, em seguida, purificada sob condições GMP. Os resultados dos ensaios de estabilidade realizados em condições de armazenagem em uma temperatura de 2-8 °C mostraram que a vida em prateleira da KLH purificada é de 36 meses a 2-8 °C. O IFNα 2b humano recombinante foi produzido em E. Coli sob condições GMP. Bateladas do produto da invenção em escala IFNα 350 mg foram produzidos empregando-se o processo de manufatura desenvolvido abaixo. i. Conjugação com Glutaraldeído
[00215] A KLH filtrada é adicionada à solução de IFNα 2b (IFNα 2b em 70 mM de fosfato hidrogenado dissódico pH 7,8) com uma relação IFNα:KLH de 20:1, (correspondendo a uma relação molar de 20 monômeros de IFNα por 1 subunidade de KLH) com base na concentração UV. A conjugação é realizada com glutaraldeído (adicionado até obter-se 22,5 mM de concentração final no meio de reação) e borato pH 9 (adicionado até obter-se 28,5 mM de concentração final no meio de reação), para obter-se um pH de 8,5. Esta solução em pH 8,5 é em seguida misturada durante 45 min a 23 ± 2 °C.
[00216] b) Extinção com glicina
[00217] A reação é extinta com Glicina 0,1 M durante 30 min.
[00218] c) Primeira filtração de fluxo tangencial (TFF 1)
[00219] A primeira TFF é realizada com um sistema TFF Pall Minim II e uma membrana de polietersulfona de 0,02 m2 com um corte de peso molecular de 10 kDa esterilizado com 0,5 M NaOH e equilibrado com o tampão de trabalho (70 mM de fosfato hidrogenado dissódico pH 7,8). A solução extinta é, em seguida, purificada por filtração-0,22 μm. O intermediário é diluído duas vezes no tampão de trabalho e, em seguida, bifiltrado por filtração de fluxo tangencial (TFF) e 12 volumes de tampão de trabalho. O retentado é colhido e armazenado por menos do que 20 horas.
[00220] d) Inativação com Formaldeído
[00221] Formaldeído é adicionado ao retentado para obter-se uma concentração final de 66,6 mM empregando-se uma bomba peristáltica. A reação de inativação é realizada durante 40 horas em uma incubadora ajustada a 37±2 °C com uma mistura diária da solução com um agitador magnético.
[00222] e) Extinção com glicina
[00223] A reação é em seguida extinta com 0,1 M de Glicina durante 30 min.
[00224] f) Segunda Filtração tangencial (TFF 2)
[00225] A segunda TFF é realizada com um sistema TFF Pall Minim II e uma membrana de polietersulfona de 0,02 m2 com um corte de peso molecular de 100 kDa esterilizado com 0,5 M NaOH e equilibrado com o tampão de formulação (70 mM de fosfato hidrogenado dissódico pH 7,8).
[00226] A solução extinta é purificada por filtração-0,2 μm. O intermediário é concentrado para ter um volume tangencial de partida de aproximadamente 900 mL e, em seguida, filtrado por TFF com 12 volumes de tampão de formulação (70 nM de tampão de fosfato), para eliminar os homopolímeros de peso molecular baixo de IFNα e os reagentes não-reativos. O retentado é colhido e, em seguida, diluído em uma concentração teórica de 300 μg/mL com base na determinação de concentração por teste de proteína Bradford e, em seguida, filtrado-0,2 μm, para obter-se o produto imunogênico da invenção.
EXEMPLO 2: Antigenicidade do produto
[00227] Um ELISA sanduíche anti IFNα/KLH foi realizado como a seguir. Resumidamente, uma placa de 96 poços foi revestida com o anticorpo de captura: anticorpo anti-KLH policlonal de coelho, e bloqueada com um tampão de bloqueio (tal como caseína 2 % em PBS, por exemplo) durante 90 minutos a 37 °C. A placa foi incubada durante 90 min a 37 °C, a placa com uma série de diluições do produto imunogênico de 250 ng/ml em 8 duplas diluições ou com controles negativos, tais como KLH e IFNα. Um anticorpo de detecção, tal como, por exemplo, um anticorpo anti-IFNα biotinilado, foi em seguida adicionado por 90 min. Finalmente a placa foi incubada com streptavidin-HRP durante 30 min a 37 °C e o complexo desenvolvido com uma solução do substrato diidrocloreto de o-fenilenodiamina (OPD) durante 30 min. Após parar a reação enzimática, a intensidade da cor resultante é avaliada por métodos espectrofotométricos a 490 nm.
[00228] O teste confirmou que o produto compreende IFNα, que é antigênico, isto é, reconhecido por anticorpo anti-IFNα, e que dito IFNα é acoplado a KLH.
EXEMPLO 3: Imunogenicidade do produto (TESTE A)
[00229] 4 μg de proteínas totais do produto, como determinado pelo teste de proteína Bradford, foram injetados em 7 camundongos Balb/c de 6-8 semanas no dia 0 e dia 21. No dia 31, os camundongos foram sangrados e os soros foram colhidos. Um ELISA anti-IFNα foi realizado em soros pré-imunes e colhidos como a seguir:
[00230] uma placa de 96 poços foi revestida com 100 ng de IFNα-2b e incubada durante a noite a 2°C-8°C,
[00231] um tampão de bloqueio foi adicionado durante 90 min a 37 °C,
[00232] o produto imunogênico foi adicionado em uma diluição de 1/2500 até pelo menos 8 duplas diluições, e a placa foi incubada durante 90 min a 37 °C,
[00233] a placa foi incubada com uma imunoglobulina anticamundongo rotulada anticorpo, tal como um anticorpo conjugado HRP durante 90 min a 37 °C,
[00234] o ELISA foi desenvolvido com uma solução de substrato diidrocloreto de o-fenilenodiamina (OPD). Após parar a reação enzimática, a intensidade da cor resultante foi avaliada por métodos espectrofotométricos a 490 nm.
[00235] Este teste demonstrou que nos 7 camundongos, a imunização com o produto imunogênico resultou na presença de tituladores de anticorpos anti-IFNα.
EXEMPLO 4: Atividade Residual do produto (Teste B)
[00236] Este teste foi baseado no efeito protetor de IFNα sobre o efeito citopático (CPE) do Vírus Estomatite Vesicular (VSV) em células de Rim Bovino Madin-Darby (MDBK) (Madin-Darby Bovine Kidney). O produto imunogênico e o IFNα 2b recombinante usados para preparar o produto imunogênico (controle positivo) foram diluídos em pelo menos 500 ng/ml e pelo menos 1000 U/ml, respectivamente, em meio Basal (RPMI suplementado com 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 1 mM Hepes). 50 μl do produto imunogênico e o controle positivo foram disseminados em uma placa de 96 poços e diluídos em uma série de duplas diluições no meio Basal. 2 104 células MDBK foram adicionadas em cada poço em 50 μl de meio Celular (RPMI suplementado com 4 % FBS, 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio e 1 mM Hepes) e a placa foi incubada durante a noite a 37 °C, 5 % CO2. O vírus foi então diluído em meio Basal em pelo menos 10 TCID50 (Dose de Infecção de Cultura de Tecido 50: 10 vezes a diluição para matar 50 % de células infectadas). A placa foi esvaziada e 100 μl do vírus diluído foram adicionados. A placa foi então incubada durante a noite a 37 °C, 5 % CO2. No fim da cultura, 20 μl/poço de uma solução de MTS/PMS (100 μl MTS/5 μl PMS; Promega G5430) foram adicionados aos poços e a placa foi incubada por outras 4 h a 37 °C 5 % CO2. A placa foi então lida a 490 nm em um espectrofotômetro.
[00237] A porcentagem de atividade antiviral do produto imunogênico foi calculada e para as duas bateladas de produto testado, a atividade antiviral foi menor do que 1 % da atividade antiviral de IFNα.
EXEMPLO 5: Capacidade de neutralização do produto (TESTE C)
[00238] A capacidade de neutralização do produto foi avaliada estimando-se a viabilidade celular na presença do vírus estomatite vesicular replicando em células MDBK.
[00239] 4 μg de proteínas totais (como determinado por um teste de proteína Bradford) do produto imunogênico foram injetadas em camundongos Balb/c de 6-8 semanas no dia 0 e dia 21. Uma amostra de soro foi obtida antes da imunização (amostra de soro pré-imune) e no dia 31 (amostra de soro teste).
[00240] 25 μl de amostras de soro pré-imune e de teste foram disseminadas em uma placa de 96 poços em uma diluição de 1/200 até 8 diluições de 1/200. O controle positivo (anti-IFNα policlonal de PBL, Piscataway, NJ, ref. 31100-1) foi diluído de 3125 UI/poço a 100 UI/poço em meio Basal (RPMI suplementado com 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio, e 1 mM Hepes) e 25 μl foram também disseminados na placa.
[00241] 25 U/poço (concentração final) em 25 μl de meio basal de IFNα foram adicionados a cada poço e a placa é incubada por 60 min em temperatura ambiente.
[00242] 2000 células MDBK em meio de ensaio (RPMI suplementado com 4 % FBS, 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 1 mM hepes) foram adicionadas a cada poço e a placa foi incubada durante a noite a 37 °C, 5 % CO2.
[00243] O vírus foi diluído em pelo menos 10 TCID50 (10 vezes a diluição para matar 50 % de células infectadas) em meio de vírus (RPMI suplementado com 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 1 mM Hepes). A placa foi esvaziada e 100 μl de vírus foram adicionados a cada poço antes da incubação por 24 horas a 37 °C, 5 % CO2.
[00244] No fim da cultura, 20 μl/poço de uma solução de MTS/PMS (100 μl MTS/5 μl PMS; Promega G5430) foram adicionados aos poços e a placa foi incubada por outras 4 h a 37 °C, 5 % CO2. A placa foi então lida a 490 nm em um espectrofotômetro.
[00245] O NC foi calculado para todas as 7 amostras de teste: NC médio = 253789 IU/ml (SEM=172526), demonstrando que todo o soro compreendeu anticorpos antiIFNα capaz de neutralizar a atividade antiviral de IFNα.
EXEMPLO 6: Exemplos de composições e vacina compreendendo o produto imunogênico
[00246] Uma composição ilustrativa compreendendo o produto imunogênico é descrita na Tabela 1. Tabela 1
Figure img0002
[00247] Uma vacina ilustrativa compreendendo o produto imunogênico é descrita na Tabela 2. Tabela 2
Figure img0003
EXEMPLO 7: Experimento Clínico
[00248] Um experimento clínico foi realizado usando-se a composição de vacina, como descrito na Tabela 2.
[00249] Design de estudo:
[00250] 3 ou 4 administrações do produto foram realizadas no dia 0, dia 7 e dia 28 ou no dia 0, dia 7, dia 28, e dia 84 em adultos submetidos a SLE.
[00251] As seguintes doses do produto foram testadas: 30 mcg, 60 mcg, 120 mcg e 240 mcg.
[00252] População de estudo:
[00253] 28 pacientes machos ou fêmeas entre 18 e 50 anos de idade, com SLE brando a moderado (SLEDAI 4-10), doença ativa a despeito de receber tratamento. Uma assinatura de gene interferon de controle normal foi estabelecida em 48 voluntários sadios. 18 PBMC de fora dos 48 voluntários sadios foram estimulados in vitro com interferons tipo I, a fim de identificar uma assinatura de interferon nas formações de elevada densidade. Uma assinatura SLE foi estabelecida comparandose as assinaturas entre voluntários saudáveis e pacientes SLE de linha de referência.
[00254] Uma análise interina foi realizada nos pacientes envolvidos nos três primeiros grupos, isto é, tendo recebido as doses ou placebos de 30, 60 ou 120 mcg.
[00255] Tabela 3: Demográficos para pacientes envolvidos (análise interina)
Figure img0004
Tabela 4: Demográficos para pacientes envolvidos (análise final)
Figure img0005
Resultados Segurança e tolerabilidade da vacina
[00257] Dois rubores de lúpus foram relatados como relacionados em SAEs. O primeiro foi no grupo placebo. O outro ocorreu após a primeira injeção de 240 mcg de IFN-K em um paciente que tinha espontaneamente parado sua terapia de corticosteroide dois dias após injeção. Esta parada abrupta de tratamento com corticosteroides provavelmente fez parte da ocorrência de rubor. Análises de segurança interina regulares foram realizadas por uma placa de segurança independente. Nenhuma mudança clinicamente significativa em parâmetros de laboratório foi detectada (hematologia, bioquímica, urina).
[00258] Imunogenicidade da vacina
[00259] Títulos de anticorpo Anti-IFNα foram medidos por ELISA de amostras de soro obtidas dos pacientes.
[00260] Um ELISA anti-IFNα foi realizado, como descrito aqui acima. Os resultados mostram que títulos de anticorpo anti-IFNα foram detectados em todos os grupos tratados com o produto imunogênico iniciando no dia 28.
Atividade Neutralizante da vacina
[00261] A atividade neutralizante foi avaliada in vitro empregando-se o seguinte método:
[00262] 50 μl de amostras de soro obtidas dos soros de pacientes foram disseminadas em uma placa de 96 poços em uma diluição de 1/200 até 8 diluições de 1/200.
[00263] O controle positivo (anti-IFN policlinal de PBL, Piscataway, Nj, 31100-1) foi diluído de 100 ng/poço a 3,125 ng/poço e 50 μl foram adicionados à placa. Diluições foram realizadas em meio Basal (RPMI suplementado com 2 mM glutamina, 1 mM de piruvato de sódio e 1 mM hepes).
[00264] 10 U/poço (concentração final) de IFNα 2b foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada por 60 min em temperatura ambiente.
[00265] 3000 células MDBK em meio de ensaio (RPMI suplementado com 4 % FBS, 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 1 mM hepes) foram adicionadas em cada poço e a placa foi incubada durante a noite a 37 °C, 5 % CO2.
[00266] O vírus foi diluído em pelo menos 10 TCID50 (10 vezes a diluição para matar 50 % de células infectadas) em meio de vírus (RPMI suplementado com 2 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 1mM hepes). A placa foi esvaziada e 100 μl de vírus foram adicionados em cada poço antes da incubação por 24 h a 37 °C, 5 % CO2.
[00267] No final da cultura, 20 μl/poço de uma solução de MTS/PMS (100 μl MTS/5 μl PMS; Promega G5430) foram adicionados aos poços e a placa foi incubada por outras 4 h a 37 C, 5 % CO2. A placa foi em seguida lida a 490 nm em um espectrofotômetro.
[00268] Os resultados do relatório interino mostraram que nenhum dos soros dos pacientes tratados com 30 mcg do produto imunogênico apresentou anticorpos antiIFNα tendo capacidade neutralizante no dia 168 após imunização, enquanto os soros dos pacientes tratados com 60 mcg do produto imunológico apresentaram anticorpos anti-IFNα tendo capacidade neutralizante no dia 168 (Figura 1).
[00269] Além disso, os resultados do relatório final mostraram que uma atividade neutralizante foi detectada em 50 % dos indivíduos tratados com 60 μg ou 120 μg do produto imunogênico, e em 80 % dos indivíduos tratados com 240 μg do produto imunogênico (Tabela 5). Tabela 5
Figure img0006
[00270] Estes resultados demonstraram que o tratamento com mais do que 30 mcg do produto imunogênico é necessário para ter-se uma neutralização in vivo de IFNα. EXEMPLO 8: Análise Transcriptômica
[00271] PBMC foram colhidos em vários pontos de tempo antes e após injeção do produto imunogênico. Para esta análise interina, RNA total foi extraído em amostras V1 (dia 0) e V6 (dia 38 após a primeira injeção), rotuladas de acordo com o protocolo padrão Affymetrix, e hibridizadas em sistemas Genechip HGU133 Plus 2.0. Análises estatísticas foram realizadas em GeneSpring após normalização RMA (Análise Robusta de Microssistema) das amostras.
[00272] Algoritmos de cluster não supervisionados foram executados em amostras de valor padrão, e os pacientes agrupados em duas categorias: aqueles com (n=11), e aqueles sem (n=7), a presença de uma ‘assinatura de Interferon” em valor padrão, isto é, a superexpressão espontânea dos genes induzidos por interferon tipo I (os genes induzidos-IFN foram identificados experimentalmente com base na análise de microssistemas de controle PBMC estimulado por IFN). Não surpreendentemente, títulos dsDNA eram significativamente mais elevados nos pacientes com a assinatura (média +/SEM: 131,1. +/50,1 Ul/ml), em comparação com os pacientes sem (média +/SEM: 44,7 +/33,3, p = 0,006 por teste Mann-Whitney). Anticorpos anti-IFNα mensuráveis foram encontrados em 8 amostras complementares dos 8 pacientes com uma assinatura IFN no valor padrão que recebeu o produto imunogênico, enquanto este foi somente o caso em 2 dos 6 pacientes sem assinatura IFN tratados com o produto imunogênico, e nenhum dos 4 placebos-tratados individuais (p = 0,002 por teste do x ao quadrado). Como resultado de 11 pacientes com uma assinatura IFN de valor padrão, 2 receberam a dose de 30 mcg, 1 recebeu a dose de 60 mcg, 5 receberam a dose de 120 mcg e 3 foram tratados com uma injeção de placebo. As mudanças observadas na expressão dos genes induzidos-IFN VI e V6 foram significativamente diferentes nos pacientes tratados com o produto imunogênico, quando comparadas com os pacientes tratados com o placebo (Figura 2).
[00273] Este resultado sugere que o produto imunogênico tem um efeito sobre a expressão dos genes induzidos-IFN em vivo.
EXEMPLO 9: assinatura e resposta IFN para tratamento de produto imunogênico
[00274] A “assinatura de Interferon” em valor padrão foi medida nos 28 pacientes com brando a moderado SLE do Exemplo 7. A assinatura de Interferon (assinaturaIFN) corresponde a um resultado calculado usando-se 21 genes induzidos-IFN, e foi descrita em Yao et al, Arthritis & Rheumatism, 2009, 60 (6): 1785-1796. A medição da assinatura de Interferon foi feita como descrita no Exemplo 8.
[00275] Nos 28 pacientes SLE do Exemplo 7, 19 mostraram uma assinatura de Interferon positiva e 9 uma assinatura de Interferon negativa em valor padrão.
[00276] Assinatura de Interferon e atividade da doença SLE
[00277] Títulos de anticorpo dsDNA e níveis de soro de C3 foram medidos como índices de atividade de doença em ambos grupos de pacientes.
[00278] Títulos de anticorpo dsDNA foram determinados empregando-se kit antiDNA DPC (PIKADD-4) da Diagnostic Products Corporation (Corporação de Produtos de Diagnóstico).
[00279] Os níveis de soro C3 foram determinados empregando-se o kit C3 complementar (kit # 446450) da Coulter Beckman. Tabela 6: Índices de atividade da doença SLE
Figure img0007
[00280] Como mostrado na Tabela 6 acima, pacientes SLE com assinaturaInterferon positiva em valor padrão têm índices biológicos de atividade de doença mais elevados.
Assinatura de Interferon e resposta ao tratamento com o produto imunogênico da invenção
[00281] Os efeitos do tratamento com o produto imunogênico da invenção, como descrito no Exemplo 7, foram comparados em pacientes SLE com assinatura-IFN positiva e negativa em valor padrão.
Resposta anti-IFN-α
[00282] Títulos de anticorpo de ligação-IFN foram medidos, como descrito no Exemplo 7, em V6 (dia 38), V10 (dia 112), e V11 (dia 168 após imunização).
[00283] Os resultados mostraram que pacientes SLE com assinatura de Interferon positiva produzem dez vezes mais anticorpos de ligação-IFN em resposta ao produto imunogênico da invenção do que os pacientes SLE com assinatura de Interferon negativa em valor padrão (Figura 3).
Genes IFN-induzidos
[00284] A evolução da expressão de genes induzidos-IFN V0 e V10 ou V11 foi medida em pacientes tratados com assinatura-IFN positiva ou negativa em valor padrão e em pacientes tratados com placebo.
[00285] Os resultados mostraram que, em comparação com o placebo e pacientes de assinatura-IFN negativa, os efeitos da terapia com o produto imunológico da invenção em genes induzidos-IFN foram forte e significativamente diferentes em V10 e V11 em pacientes SLE de assinatura-IFN positiva (Figura 4).
Complemento C3
[00286] Valores C3 do soro foram medidos em pacientes tratados e em pacientes recebendo placebo em V-1 (30 dias antes da imunização), V0 (dia de imunização), V7 (dia 56), V10 (dia 112) e V11 (dia 138 após imunização), como descrito aqui acima.
[00287] Os resultados mostraram que há um aumento significativo em níveis C3 em pacientes tratados-versus-placebo. Além disso, há um aumento significativo em níveis C3 em pacientes SLE de assinatura-IFN positiva tratados com o produto imunogênico da invenção (Figura 5).
EXEMPLO 10: determinação da relação IFNα/KLH no produto da invenção
[00288] A fim de estimar a quantidade de IFN e KLH do produto da invenção, foi desenvolvido um método de quantificação baseado em detecção UV e fluorescência. Os produtos da invenção foram manufaturados com dois rótulos fluorescentes, cada um específico de IFNα ou KLH. Após análise, por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (Size Exclusion Chromatography) (SEC), foi determinada a quantificação de IFNα e KLH por integração do sinal UV a 220 nm e sinal fluorescente (FLD) específico para rótulo IFNα ou rótulo KLH. Este método permitiu calcular a relação em peso de IFNα/KLH. i. Rotulação de materiais brutos:
[00289] Marcadores fluorescentes foram acoplados em grupos sulfidrila a fim de preservar grupos amino usados durante a manufatura de produto.
[00290] A rotulação foi conduzida em 70 mM de tampão de fosfato de sódio pH 7 em temperatura ambiente durante 3 hs. KLH foi rotulada com 200 equivalentes molares de Atto565-maleimide (18507, Sigma) e IFNα com 100 equivalentes molares de fluoresceína maleimida (46130, Pierce). As proteínas rotuladas (KLH-atto565 e IFN-Fluoresceína) foram, em seguida, filtradas em coluna Zeba (corte 7kDa, Termo Científico, 89893) condicionadas com 70 mM de tampão de fostato pH 7,8, a fim de eliminar marcadores não reagidos.
[00291] b) Manufatura de Produto:
[00292] Os materiais brutos rotulados foram, em seguida, usados para manufaturar produtos rotulados com o mesmo processo que no Exemplo 1, com filtração de diálise em vez de filtração de fluxo tangencial.
[00293] c) Manufatura de padrões de homopolímeros de KLH e IFNα
[00294] Para o método analítico quantitativo, homopolímeros padrões foram manufaturados. Os homopolímeros de IFNα rotulados padrão foram manufaturados com o mesmo processo que no Exemplo 1, porém com 70 mM de tampão de fosfato pH 7,8 em vez de KLH, e filtração de diálise em vez de filtração de fluxo tangencial.
[00295] Os homopolímeros de KLH rotulados padrão foram manufaturados com o mesmo processo que no Exemplo 1, porém com 70 mM de tampão de fosfato pH 7,8 em vez de IFNα, e filtração de diálise em vez de filtração de fluxo tangencial.
[00296] d) Análise de Método por Cromatografia de Exclusão de Tamanho
[00297] Bateladas foram, em seguida, analisadas por SEC com detecção UV e fluorescente específica. 60 μL de amostra foram injetados em colunas SEC5 (1000A°) SEC3 (300A°) conectadas em série (Agilent, 5190-2536, 5190-2511), eluição foi realizada com PBS durante 35 min com detecção UV a 220 nm e detecção fluorescente específica (para Fluoresceína-IFNa ou KLH-Atto565), como descrito na Tabela 7. Tabela 7: Comprimento de onda de excitação e emissão usado para FluoresceínaIFNα ou KLH-Atto-565.
Figure img0008
[00298] Sinais UV e fluorescentes (FLD) foram calculados integrando-se a área sob os picos de cromatograma entre 0 e 20 minutos.
[00299] Para validar este método, experimentos preliminares foram conduzidos para demonstrar:
[00300] a especificidade do sinal fluorescente (nenhum sinal sobrepondo-se foi observado entre as duas proteínas rotuladas),
[00301] para cada batelada manufaturada (produto da invenção, homopolímeros rotulados de KLH e IFNα), foram obtidos perfis UV similares por SE-HPLC,
[00302] nenhuma extinção do sinal fluorescente devido à manufatura foi observada,
[00303] Sinais FLD eram lineares e proporcionais aos sinais UV.
[00304] Contribuição UV IFNα rotulado no quinoide rotulado manufaturado foi medida de acordo com a Área curva por FLDFluoresceína-IFNa= f(Área por UV) de padrão de homopolímeros de IFNα rotulados.
[00305] Contribuição KLH UV rotulada no quinoide rotulado manufaturado foi medida de acordo com a Área curva por FLDKLH-Atto565= f(Área por UV) de padrão de homopolímeros de KLH rotulados.
[00306] Quando a área UV foi verificada ser uma função linear de concentração de proteína, este método permitiu estimar a porcentagem em peso de IFNα rotulado no quinoide rotulado manufaturado total.
[00307] e) Análise em Bateladas
[00308] 3 bateladas de quinoides rotulados foram manufaturadas e analisadas por este método. Baseado na proporcionalidade do sinal e concentração UV, e de sinal FLD e UV, a relação entre a quantidade de IFNα e KLH (mIFNα/mKLH) foi calculada para as três bateladas (Tabela 8). Tabela 8: Relação em peso de IFNα/KLH nos três quinoides rotulados manufaturados
Figure img0009
[00310] Uma relação média mIFNα/mKLH de 0,28 foi encontrada com um desvio padrão relativo <15 %.
[00311] EXEMPLO 11: Títulos de anticorpos anti-IFNα produzidos e capacidades neutralizantes quando o produto imunogênico da invenção é injetado como uma emulsão com SWE ou SWE-a
[00312] Manufatura de muIFN-K:
[00313] Resumidamente, IFNαA murina (Laboratórios Biomédicos PBL) e KLH nativa (Sigma) foram misturados em uma relação 50:1 e tratados com 22,5 mM glutaraldeído por 45 minutos. Após diálise contra salina tamponada por fosfato (PBS), para eliminar glutaraldeído em excesso, a solução foi incubada com 66 mM de formaldeído por 48 horas a 37 °C. Após extinção com glicina (0,1 M final) e subsequente diálise contra PBS, usando uma membrana de corte de 10kDa, a preparação foi esterilizada por filtro, usando uma membrana de 0,22-μm, e armazenada a 4 °C.
[00314] Protocolo de Imunização:
[00315] Camundongos foram imunizados i.m. duas vezes no dia 0 e dia 21 com mIFN-K (10 μg por injeção) como uma emulsão 1 para 1 com adjuvante SE ou SE-a (volume final de 100 μl).
[00316] Determinação de títulos de anticorpo anti-muIFNα e anti-KLH por ELISA
[00317] Soros foram analisados para anticorpos contra muIFNα ou KLH por ELISA. Resumidamente, placas Maxisorp de 96 poços (Nunc) foram revestidas com 100 ng/poço de muIFNαA (Laboratórios Biomédicos PBL) para detectar anticorpos antimuIFNα ou KLH nativa (Sigma) para detectar anticorpos anti-KLH.
[00318] Diluição de amostras de soro seriais duplas (de 1:100 a 1:51,200) foram adicionadas aos poços. Os poços em branco receberam 100 μL de tampão de diluição. Após 1,5 horas a 37 °C, anticorpos foram detectados com 100 μL de imunoglobulina G (IgG) anti-camundongo conjugada com peroxidase de rábano silvestre e O-fenilenodiamina, um substrato colorimétrico para peroxidase de rábano silvestre. Um pool de soros de camundongos Balb/c imunizados por muIFN-K foi usado como um controle positivo. A densidade óptica (OD) foi registrada em um comprimento de onda de 490 nm. Ensaios ELISA foram realizados em duplicata. Em cada placa, dois poços foram reservados para espaço em branco; seu valor médio foi subtraído de todos os poços.
[00319] Títulos de anticorpos foram calculados interpolando-se a DO máxima (DOmáx)/2 sobre o eixo geométrico-x. A equação usada foi y = ax + b, para uma linha reta passando através de dois pontos circundando a DOmáx/2.
[00320] Determinação de capacidade neutralizante de anticorpos anti-muIFNα induzidos após imunizações IFN-K
[00321] A capacidade neutralizante foi determinada empregando-se o ensaio citopático antiviral clássico (EMCV/L929). Neste ensaio, o título de atividade antiviral de muIFNα é determinado referente a sua capacidade para inibir o efeito letal do vírus de encefalomiocardite (EMCV) sobre células L-929 de murina (ATCC).
[00322] Resumidamente, 25 μL de amostras de soro diluídas (ou anticorpo de controle) foram adicionadas em placas de cultura de 96 poços (Nunc) em diluições seriais duplas (de 1:200 a 1:6400). Um anticorpo policlonal de coelho comercial antimuIFNα (de PBL, ref: 32100-1) foi usado como um controle positivo. Após incubação com 25 IU/poço de muIFNα por 1 hora em temperatura ambiente, células L-929 20x103 foram disseminadas por poço e incubadas a 37 °C. Após crescimento durante a noite, as placas foram lavadas com PBS e 100 μL/poço de solução EMCV (100 vezes a dose necessária para matar 50 % das células) foram adicionados em cada poço. As placas foram incubadas durante 48 horas a 37 °C. Finalmente, 20 μL por poço de MTS/PMS, (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)2H-tetrazolio, solução de (sal/metossulfato de fenazina) interna (Promega), foram adicionados e as placas foram incubadas por 4 h a 37 °C, 5 % CO2 em uma incubadora umidificada (protegida da luz). Em seguida, a DO a 490 nm foi medida para cada poço. A DO do espaço a ser preenchido (poços com 100 μL de meio de cultura somente) foi subtraída da DO da amostra.
[00323] A capacidade neutralizante de cada amostra foi calculada como a seguir:
[00324] Capacidade neutralizante (%) = 100 x [(DO teste DOvírus)/OD céls)], onde:
[00325] DOteste é a DO para a amostra testada (céls + IFNα + soro + vírus)
[00326] DOvírus é a DO para o controle de vírus (céls + vírus)
[00327] DOcels é a DO para 20.000 céls/poço (céls + IFNα + vírus).
[00328] As capacidades neutralizantes foram plotadas como uma função de diluição de soro. O título (número de diluições de soro), neutralizando 50 % dos valores da atividade IFNα, foi determinado por interpolação sobre a parte linear da curva.
[00329] Os resultados mostraram que os títulos anti-muIFNα e títulos anti-KLH estavam presentes em soros de camundongos coletados no dia 31, após a primeira injeção de muIFN-K emulsificado em SWE ou SWE-a; e que os anticorpos antimuIFNα tinham capacidades neutralizantes (NC50>200).

Claims (9)

1. Produto imunogênico, que compreende IFNα humano acoplado a uma hemocianina de lapa californiana (KLH), caracterizado pelo fato de que o produto imunogênico compreende de 60 a 450 mcg de IFNα humano acoplado a KLH, e em que a relação IFNα/KLH em peso está variando de 0,06 a 0,6.
2. Produto imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto imunogênico é fortemente inativado, o que significa que o produto mostra menos do que 5 % de atividade antiviral nas condições de TESTE B.
3. Produto imunogênico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o produto imunogênico é capaz de neutralizar a atividade antiviral de IFNα nas condições de TESTE C.
4. Produto imunogênico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um subtipo de IFNα.
5. Produto imunogênico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o subtipo de IFNα é IFNα 2b.
6. Produto imunogênico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o produto imunogênico é uma vacina, preferivelmente, na forma de uma emulsão.
7. Forma de dosagem unitária compreendendo de 60 a 450 mcg de um produto imunogênico compreendendo IFNα humano acoplado a KLH, caracterizada pelo fato de que a relação IFNα/KLH em peso está variando de 0,06 a 0,6.
8. Dispositivo médico compreendendo de 60 a 450 mcg de um produto imunogênico compreendendo IFNα humano acoplado a um KLH, caracterizado pelo fato de que a relação IFNα/KLH em peso está variando de 0,06 a 0,6.
9. Kit compreendendo pelo menos um frasco contendo de 60 a 450 mcg de um produto imunogênico compreendendo IFNα humano acoplado a KLH, caracterizado pelo fato de que a relação IFNα/KLH em peso está variando de 0,06 a 0,6, pelo menos um frasco contendo adjuvante, e meios para contatar dito produto imunogênico ao adjuvante e para emulsificar a mistura com o adjuvante.
BR112013025892-6A 2011-04-07 2012-04-04 produto imunogênico, forma de dosagem unitária, dispositivo médico e kit relacionados a ifna BR112013025892B1 (pt)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161472854P 2011-04-07 2011-04-07
EP11305408.4 2011-04-07
US61/472,854 2011-04-07
EP11305408A EP2508197A1 (en) 2011-04-07 2011-04-07 Method for treating IFNalpha related conditions
EP11188125.6 2011-11-07
EP11188125 2011-11-07
PCT/EP2012/056238 WO2012136739A1 (en) 2011-04-07 2012-04-04 Method for treating ifnalpha related conditions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112013025892A2 BR112013025892A2 (pt) 2016-09-06
BR112013025892B1 true BR112013025892B1 (pt) 2021-01-19

Family

ID=46968636

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112013025892-6A BR112013025892B1 (pt) 2011-04-07 2012-04-04 produto imunogênico, forma de dosagem unitária, dispositivo médico e kit relacionados a ifna

Country Status (16)

Country Link
US (2) US9993565B2 (pt)
EP (2) EP2694094B1 (pt)
JP (2) JP6335778B2 (pt)
KR (1) KR102017905B1 (pt)
CN (1) CN103608031B (pt)
AU (1) AU2012238643B2 (pt)
BR (1) BR112013025892B1 (pt)
CA (1) CA2832260C (pt)
DK (1) DK2694094T3 (pt)
ES (1) ES2644824T3 (pt)
IL (1) IL228744A0 (pt)
MX (1) MX348380B (pt)
PL (1) PL2694094T3 (pt)
PT (1) PT2694094T (pt)
RU (1) RU2639135C2 (pt)
WO (1) WO2012136739A1 (pt)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2644824T3 (es) * 2011-04-07 2017-11-30 Neovacs Método para tratar afecciones relacionadas con IFNalfa
WO2017009863A1 (en) * 2015-07-14 2017-01-19 Indian Immunologicals Limited A scalable, low variation and efficient method for purification of diphtheria toxoid and uses thereof
EP3574915A1 (en) * 2018-05-29 2019-12-04 Neovacs Immunogenic product comprising il-4 and/or il-13 for treating disorders associated with aberrant il-4 and/or il 13 expression or activity

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
SE8405493D0 (sv) 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
US4877612A (en) 1985-05-20 1989-10-31 Frank M. Berger Immunological adjuvant and process for preparing the same, pharmaceutical compositions, and process
ATE71303T1 (de) 1986-01-14 1992-01-15 Nederlanden Staat Verfahren zur herstellung immunologischer komplexe und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzung.
US4806352A (en) 1986-04-15 1989-02-21 Ribi Immunochem Research Inc. Immunological lipid emulsion adjuvant
US6277828B1 (en) 1993-08-20 2001-08-21 Syntex (U.S.A.) Inc. Pharmaceutical formulations of nerve growth factor
FR2812813B1 (fr) 2000-08-09 2004-11-26 Neovacs Utilisation d'immunogenes pour traiter ou prevenir au sein des tumeurs malignes les dereglements immunitaires induits par des facteurs extracellulaires
FR2844514B1 (fr) 2002-09-16 2007-10-19 Neovacs Produit immunogene stable comprenant des heterocomplexes antigeniques, compositions les contenant et procede de preparation
FR2859725B1 (fr) * 2003-09-16 2006-03-10 Neovacs Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine
CN101381728A (zh) * 2008-07-01 2009-03-11 丁国庆 人干扰素α-2b重组卡介苗及其构建方法和鉴定方法
ES2644824T3 (es) * 2011-04-07 2017-11-30 Neovacs Método para tratar afecciones relacionadas con IFNalfa

Also Published As

Publication number Publication date
US20180207288A1 (en) 2018-07-26
KR20140053879A (ko) 2014-05-08
AU2012238643A1 (en) 2013-10-24
JP2017105812A (ja) 2017-06-15
JP6335778B2 (ja) 2018-05-30
PT2694094T (pt) 2017-11-06
CN103608031B (zh) 2016-08-17
JP2014510126A (ja) 2014-04-24
MX348380B (es) 2017-06-09
CA2832260C (en) 2021-06-22
RU2639135C2 (ru) 2017-12-19
WO2012136739A1 (en) 2012-10-11
PL2694094T3 (pl) 2018-01-31
MX2013011675A (es) 2014-01-31
DK2694094T3 (da) 2017-11-13
US9993565B2 (en) 2018-06-12
CA2832260A1 (en) 2012-10-11
IL228744A0 (en) 2013-12-31
EP3272355A1 (en) 2018-01-24
ES2644824T3 (es) 2017-11-30
CN103608031A (zh) 2014-02-26
KR102017905B1 (ko) 2019-09-03
BR112013025892A2 (pt) 2016-09-06
EP2694094A1 (en) 2014-02-12
AU2012238643B2 (en) 2017-04-13
EP2694094B1 (en) 2017-08-16
RU2013144441A (ru) 2015-05-20
US20140023617A1 (en) 2014-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stevenson et al. The immunogenicity of intracerebral virus infection depends on anatomical site
Hunter et al. Production of gamma interferon by natural killer cells from Toxoplasma gondii-infected SCID mice: regulation by interleukin-10, interleukin-12, and tumor necrosis factor alpha
CA2169635C (en) Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides
JP2019116481A (ja) Ｍｙｃの修飾物質、該ｍｙｃの修飾物質を使用する方法、およびｍｙｃを調節する薬剤を同定する方法
Bates et al. Mucosal adjuvant activity of flagellin in aged mice
US20020107210A1 (en) Compositions and methods for the treatment of autoimmune diabetes
JPH04506663A (ja) インターロイキン含有安定ワクチン組成物
Donnelly et al. Whole-cell but not acellular pertussis vaccines induce convulsive activity in mice: evidence of a role for toxin-induced interleukin-1β in a new murine model for analysis of neuronal side effects of vaccination
Beignon et al. Immunization onto bare skin with heat‐labile enterotoxin of Escherichia coli enhances immune responses to coadministered protein and peptide antigens and protects mice against lethal toxin challenge
US20180207288A1 (en) Method for treating ifnalpha related conditions
US20010044418A1 (en) Treatment of allergies
EP1198246B1 (en) Methods for preventing or attenuating pathoangiogenic conditions by using the gbs-toxin (cm101) receptor as a vaccine
EP2508197A1 (en) Method for treating IFNalpha related conditions
US20090221804A1 (en) GBS Toxin Receptor Compositions and Methods of Use
US20150147355A1 (en) Compositions and Methods of Vaccination
US20230310591A1 (en) Vaccine Boost Methods and Compositions
US10525127B2 (en) P14.7 protein and uses thereof as vaccine adjuvant
WO2021207303A1 (en) Immune stimulation against coronavirus infections
CN114560917A (zh) SARS-CoV-2编码蛋白来源的T细胞表位多肽TFKVSIWNL及其应用
AU2005202898A1 (en) Compositions and methods for the treatment or prevention of autoimmune disorders
LINKED et al. PATENT ABSTRACTS 511 5114710 M-CSF AS A THERAPEUTIC AGENT FOR THROMBOCYTOPENIA
WO2012076668A1 (en) Strongly inactivated and still highly immunogenic vaccine and process of manufacturing thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 04/04/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.