CN101381728A

CN101381728A - 人干扰素α-2b重组卡介苗及其构建方法和鉴定方法

Info

Publication number: CN101381728A
Application number: CNA2008100626734A
Authority: CN
Inventors: 丁国庆; 沈周俊
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-07-01
Filing date: 2008-07-01
Publication date: 2009-03-11

Abstract

本发明涉及一种分泌人干扰素α－2b的重组卡介苗rBCG－IFNα－2b及其构建方法、鉴定方法，利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽片段和人IFNα－2b的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMV261－Ag85B－IFNα－2b，然后采用电转化技术将该载体导入BCG中，构建重组卡介苗rBCG－IFNα－2b，依靠pMV261－Ag85B－IFNα－2b在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌人IFNα－2b。本发明得到的重组卡介苗rBCG－IFNα－2b既保留了原有BCG的免疫原性，又能持续分泌细胞因子IFNα－2b，从而提高BCG的免疫活性；IFNα－2b能够直接作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化，具有更好的抗肿瘤作用，可以减少使用剂量，降低BCG引起的毒副作用；避免了使用外源IFNα－2b所带来的应用剂量大、副作用发生率高、作用时间短暂和费用高昂的问题。

Description

人干扰素α-2b重组卡介苗及其构建方法和鉴定方法

技术领域：

本发明涉及一种临床医学中的抗膀胱癌的药物，尤其是涉及一种人干扰素α-2b重组卡介苗及其构建方法和鉴定方法。

背景技术：

膀胱移行上皮癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，手术后容易复发与进展。因此，术后需定期用丝裂霉素、阿霉素、噻替哌、卡介苗(BCG)等药物进行膀胱灌注来预防肿瘤复发，而其中BCG是目前认为最有效的药物。但临床上，仍约有30％左右的患者BCG治疗和预防效果不理想，尤其对浸润性膀胱癌疗效更低。此外，BCG膀胱灌注具有较高的毒副作用发生率。近年来，有不少研究应用小剂量的BCG联合人干扰素α-2b(IFNα-2b)膀胱灌注来提高抗癌疗效、降低副作用，但是联合应用的远期疗效不佳，且外源性添加IFNα-2b存在应用剂量大、副作用发生率高、作用时间短暂的问题，且费用高昂。因此，目前有必要通过研究来改善BCG菌株，增强其抗膀胱癌作用，并减少应用剂量，降低副作用。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中所存在的上述不足，而提供一种人干扰素α-2b重组卡介苗及其构建方法、鉴定方法，能自动分泌人IFNα-2b的新型基因重组BCG，提高抗膀胱癌作用，降低应用剂量与副作用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：该人干扰素α-2b重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)获得人IFN α-2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因：

设计人IFN α-2b和BCGAg85B的扩增引物，分别从人外周血和BCG基因组中用聚合酶联反应方法提取、扩增人IFN α-2b基因和Ag85B信号肽基因片段，并对其筛选、鉴定，其中

人IFN α-2b的上游引物：5′-GACGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3′且含EcoRI酶切位点

下游引物：5′-CGCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3′且含Hind III酶切位点，

BCG-Ag85B信号肽基因的

上游引物：5′-GATGGATCCAATGACAGACGTGAGCCGAAAG-3′且含BamHI酶切位点

下游引物：5′-GTAGAATTCCGCGCCCGCGGTTGCCGCTCC-3′且含EcoRI酶切位点；

(2)构建卡介苗穿梭表达载体：

利用DNA重组技术将人IFN α-2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因片段插入质粒pMV261结核杆菌hsp60启动子下游，构建分泌型卡介苗穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFN α-2b并转化大肠杆菌、抽提和纯化，对pMV261-Ag85B-IFN α-2b进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴定；

(3)人IFN α-2b重组BCG的构建：利用电穿孔技术将已构建的重组载体pMV261-Ag85B-IFN α-2b导入BCG，构建重组卡介苗rBCG-IFN α-2b。

本发明所述获得人IFN α-2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因包括以下步骤：获取人IFNα-2b基因，信号肽基因BCG-Ag85B抽提、PCR扩增，所述获取人IFN α-2b基因包括人基因组DNA提取和纯化、人IFN α-2b基因的PCR扩增、人IFN α-2b的PCR产物电泳和半定量分析，所述信号肽基因BCG-Ag85B抽提、PCR扩增包括BCG基因组DNA抽提、BCG-Ag85B的PCR扩增、BCG-Ag85B的PCR产物纯化。

本发明所述构建卡介苗穿梭表达载体包括人IFN α-2b基因克隆到pMV261载体中、信号肽基因BCG-Ag85B克隆到pMV261-IFN α-2b载体中，所述人IFN α-2b基因克隆到pMV261载体中步骤通过人IFN α-2b DNA与pMV261分别用EcoRI和Hind III进行酶切连接，连接产物转化E.coli细胞，挑取克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，得到重组质粒pMV261-IFN α-2b，所述信号肽基因BCG-Ag85B克隆到pMV261-IFN α-2b载体中步骤将pMV261-IFN α-2b和BCG-Ag85B分别用EcoRI和BamHI进行酶切连接，连接产物转化E.coli细胞，挑取克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，得到重组质粒pMV261-Ag85B-IFN α-2b。

本发明所述人IFN α-2b重组BCG的构建包括感受态BCG的制备、电穿孔法构建重组卡介苗与抗性筛选。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案还包括一种如上所述构建方法制得的人干扰素α-2b重组卡介苗，其特征在于人干扰素α-2b重组卡介苗具有人IFN α-2b基因片段和BCG-Ag85B信号肽基因片段。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案还包括一种如上所述构建方法制得的人干扰素α-2b重组卡介苗的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

从人干扰素α-2b重组卡介苗的构建方法得到的疫苗抽取质粒DNA后，通过PCR扩增和SDS-PAGE电泳方法得到IFN α-2b基因片段，通过Western blotting方法证实rBCG-IFN α-2b的培养上清中和菌体中有IFN α-2b蛋白的表达，采用酶联免疫吸附方法测定出rBCG-IFN α-2b培养上清中有高水平表达的IFN α-2b。其中人干扰素α-2b重组卡介苗PCR扩增的

上游引物：5′-GACGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3′且含EcoR I酶切位点

下游引物：5′-CGCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3′且含Hind III酶切位点。

本发明能自动分泌人IFN α-2b的新型基因重组BCG，提高抗膀胱癌作用，降低应用剂量与副作用。

附图说明：

图1为本发明实施例重组卡介苗染色后的光学显微镜镜检结果示意图。

图2为本发明实施例重组卡介苗质粒DNA PCR扩增结果示意图(以IFN α-2b为引物进行PCR扩增)。

图3为本发明实施例重组卡介苗分泌的IFN α-2b蛋白表达Western Blotting检测示意图。

图4为本发明实施例重组卡介苗对人外周血单核细胞(PBMC)的增殖活性示意图。

图5为本发明实施例不同效靶比效应细胞对T24肿瘤细胞的细胞毒活性MTT法测定示意图。

图6为本发明实施例不同效靶比效应细胞对T5637肿瘤细胞的细胞毒活性MTT法测定示意图。

具体实施方式：

1.本发明的原理：

研究认为BCG发挥抗膀胱癌作用是由于BCG灌注后机体对其的免疫反应有关，而其中细胞因子如白介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等在抗癌过程中起着重要作用。提高这些细胞因子的表达量，便可提高BCG的免疫作用和抗癌疗效。而IFN α-2b是目前临床应用最广的细胞因子之一，广泛应用于抗肿瘤与抗病毒治疗。它不但能够直接作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化，同时，研究也证明IFNα-2b与BCG联合膀胱灌注可提高局部IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子的表达，从而提高BCG的免疫活性和抗癌能力。但外源性应用IFN α-2b存在剂量大、副作用发生率高、作用时间短暂的问题，且费用高昂。

因此，如能将IFN α-2b基因重组入BCG，构建能自动表达IFN α-2b的基因重组BCG(rBCG)，使BCG在宿主体内复制的过程中，不断产生IFN α-2b，有望提高BCG抗膀胱癌疗效、降低BCG的应用剂量与毒副作用。

2.本发明实施例人干扰素α-2b重组卡介苗构建方法操作步骤如下：

2.1 获得目的基因人IFN α-2b基因和BCG—Ag85B信号肽基因：

该步骤设计人IFN α-2b和BCGAg85B的扩增引物，分别从人外周血和BCG基因组中用聚合酶联反应(PCR)方法提取、扩增人IFN α-2b基因和BCG—Ag85B信号肽基因片段，并对其筛选、鉴定。(人IFN α-2b基因和BCG—Ag85B信号肽基因的获取次序可互换，结果相同)。

2.1.1 获取人IFN α-2b基因

2.1.1.1 人基因组DNA提取和纯化

(1)取新鲜人外周静脉血5ml，以ACD(柠檬酸纳缓冲液)1/7体积抗凝；

(2)3500rpm离心15分钟，吸除上层血浆；

(3)加5倍体积双蒸水，摇匀，静置10分钟，3500rpm 15分钟离心，去上清；

(4)吸取沉淀(少许液体)放入1.5ml离心管，STE清洗2次；12000rpm离心8分钟；

(5)去上清后加0.5ml STE(Sodium Chloride-Tris-EDTA缓冲液)，10％SDS(Sodiumdodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)30ml，蛋白酶K 5μl(100μg/ml)37℃消化过夜，直至沉淀物溶解为止；

(6)加等体积饱和酚，倒转摇匀10分钟。12000rpm离心5分钟，吸上层入另一1.5ml离心管；

(7)上清液加等体积酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：10)，倒转混匀10分钟。12000rpm离心5分钟，吸上层入另一1.5ml离心管；

(8)上清液加等体积氯仿：异戊醇(体积比为24：1)，倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上清入另一管；

(9)加1/12体积3M醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4℃无水乙醇，轻柔振摇，出现白色絮状物(DNA)。于-20℃放置30分钟，12000rpm低温(4℃)离心10分钟，沉淀DNA，去上清；

(10)加1ml 70％乙醇洗涤，12000rpm低温(4℃)离心10分钟，去上清，重复1次；

(11)自然干燥后，用pH8.0 TE(Tris-EDTA缓冲液)溶解，并以TE液作空白对照，用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280nm时的0D值，测得OD260/OD280为1.8，证明没有蛋白质残余，置于4℃冰箱备用。

2.1.1.2 人IFN α-2b基因的PCR扩增

2.1.1.2.1 人IFN α-2b基因的PCR引物设计

本部分共设计2套PCR引物(上游引物和下游引物，具体见下)。IFN α-2b PCR引物采用计算机辅助设计，并登陆Genebank对照无误。IFN α-2b扩增产物为519bp。

上游引物：5′-GACGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3′Tm＝69.5且含EcoR I酶切位点

下游引物：5′-CGCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3′Tm＝62.6且含Hind III酶切位点。

2.1.1.2.2 人IFN α-2b基因的PCR扩增反应体系和循环条件

建立40μl人IFN α-2b基因的PCR扩增反应体系见表1。

人IFN α-2b的PCR扩增的循环条件：

a.在95℃环境条件下预变性5分钟；

b.在94℃环境条件下变性40秒；

c.在58℃环境条件下退火40秒；

d.在72℃环境条件下延伸40秒；

e.步骤b～d循环36遍；

f.在72℃环境条件下延伸10分钟。

2.1.1.3 人IFN α-2b的PCR产物电泳和半定量分析

取10μl人IFN α-2b的PCR产物加3μl加样缓冲液，混匀，于1.0％琼脂糖电泳，电压为100V，电泳至条带位置合适后(约30min)于紫外灯下观察。1％琼脂糖凝胶电泳，2kb DNAmarker证实片断大小为519bp。

2.1.2 信号肽基因BCG-Ag85B抽提、PCR扩增

2.1.2.1 BCG基因组DNA抽提

液体培养基配制：4.7克Middlebrook 7H9粉剂溶解在900ml三蒸水中，再加入0.5克Tween80(吐温80)混匀。90ml分装于10个250ml三角烧瓶中，121℃高压灭菌10分钟。待温度冷却至45℃，无菌条件下分别加入10mlADC(偶氮二甲酰胺)，使培养基中的ADC浓度为10％，完全冷却后置4℃冰箱保存。

BCG的培养：将冻干BCG制剂用生理盐水融化，加入2ml细菌溶液，纱布封口后轻轻摇匀，三角烧瓶置于37℃，转速为150rpm的恒温摇床中培养。因BCG生长缓慢，摇床时间长，为避免污染一般在培养过程中不换液。培养3周，取培养后菌液1ml，离心15分钟(14000rpm)弃上清，重复一次，再加溶液(0.1％SDS，1％NP-40，1％Tween20)150μl，充分混匀，沸水100℃煮20分钟，离心15分钟(14000rpm)，其上清为BCG-Ag85B的PCR扩增的DNA模板。

2.1.2.2 BCG-Ag85B的PCR扩增

2.1.2.2.1 BCG-Ag85B的引物设计

BCG-Ag85B的PCR引物采用计算机辅助设计，并登陆Genebank对照无误，产物长度为139bp。

上游引物：5′-GATGGATCCAATGACAGACGTGAGCCGAAAG-3′Tm＝73且含BamHI酶切位点，

下游引物：5′-GTAGAATTCCGCGCCCGCGGTTGCCGCTCC-3′Tm＝83且含EcoR I酶切位点。

2.1.2.2.2 BCG-Ag85B的PCR扩增反应体系和循环条件建立20μl BCG-Ag85B的PCR扩增反应体系，见表2。

BCG-Ag85B的PCR扩增的循环条件：

h.在95℃环境条件下预变性4分钟；

i.在94℃环境条件下变性30秒；

j.在58℃环境条件下退火30秒；

k.在72℃环境条件下延伸30秒；

1.步骤i～k循环36遍；

m.在72℃环境条件下延伸5分钟。

2.1.2.2.3 BCG-Ag85B的PCR产物电泳和半定量分析

取10μl BCG-Ag85B的PCR产物加3μl加样缓冲液，混匀，于1.0％琼脂糖电泳，电压为100V，电泳至条带位置合适后(约30min)于紫外灯下观察。1kb DNA marker证实片断大小为139bp。

2.1.2.3 BCG-Ag85B的PCR产物纯化

PCR产物应用QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化。

(1)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得目的条带；

(2)紫外灯下切割目的条带凝胶于Eppendorf管中，使它尽可能小，称重；

(3)按照100mg凝胶加入300μlQG的比例加入QG；

(4)50℃下10min，期间不断震荡使凝胶充分溶解，此时溶解物呈黄色；

(5)按照100mg溶解物加入300μl异丙醇的比例加入异丙醇，混匀；

(6)将QIAquick spin柱放置于收集管上，再将样品液倒入柱中，13000rpm离心1min

(7)弃去滤过液，加入0.75mlPE洗柱，13000rpm离心1min；

(8)弃去滤过液，再13000rpm离心1min；

(9)将QIAquick spin柱放置于1.5ml消毒Eppendorf管上；

(10)于柱底膜中心加30μl ddH₂0，13000rpm离心1min，洗脱液即含目的DNA；

(11)取2μl洗脱液进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察。

2.2 构建卡介苗穿梭表达载体：

该步骤利用DNA重组技术将以上人IFN α-2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因片段插入质粒pMV261结核杆菌hsp60启动子下游，构建分泌型卡介苗穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFNα-2b并转化大肠杆菌、抽提和纯化，对pMV261-Ag85B-IFN α-2b进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴定。

2.2.1 将人IFNα -2b基因克隆到pMV261载体中

人IFN α-2b DNA与pMV261分别用EcoRI和Hind III进行酶切连接，连接产物转化大肠杆菌(E.coli)细胞，挑取克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，此重组质粒命名为pMV261-IFNα-2b。

2.2.1.1 分别酶切IFN α-2b DNA和pMV261载体

酶切体系：

10×M 2μL 10×M 2μL

IFNα-2b DNA 16μL pMV261 16μL

EcoR I 1μL EcoR I 1μL

Hind III 1μL Hind III 1μL

37℃作用3hr，1％琼脂糖凝胶电泳。

2.2.1.2 回收IFN α-2b DNA片段和酶切后的pMV261载体(QIAquick Gel ExtractionKit)，步骤如下：

①割下含DNA的琼脂糖块，使它尽可能小，称重。放入1.5ml离心管中。

②按每100mg琼脂糖加入300ul QG液的比例加入QG液，置50℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化。每2分钟颠倒混匀一次。

③当目的片段<500bp时，加入1/3QG液体积的异丙醇，混匀。50℃温浴1分钟后，混匀。当目的片段>500bp时，可省略此步骤，直接进行步骤④。

④将溶化后的琼脂糖移入吸附柱，离心60秒。倒掉收集管中液体，再吸附柱放入收集管。

⑤在吸附柱中加入750ul PE液，静置2-5分钟后，离心13000rpm 60秒。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管，离心1分钟。

⑥将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入50ul EB液或20ulddH₂O，静置1分钟后，离心1分钟。将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。

2.2.1.3 连接IFN α-2b DNA和pMV261

连接体系：连接buffer 1μL

pMV261载体 5μL

IFN α-2b DNA片段 3μL

连接酶 1μL

16℃连接过夜，得到pMV261-IFN α-2b连接产物。

2.2.1.4 大肠杆菌化学感受态菌E.coli DH5 α的制备

(1)受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5 α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1：100～1：50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右；

(2)将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下4000rpm离心10分钟；

(3)弃去上清，用预冷的0.01mol/L的CaCl₂溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30分钟后，4℃下4000rpm离心10分钟；

(4)弃去上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.075mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；

(5)感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于-70℃保存。

2.2.1.5 转化

将pMV261-IFN α-2b连接产物转化感受态细菌E.coli DH5 α，步骤如下：

(1)从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；

(2)取5μL连接液加入菌液中，轻轻混匀，冰浴30min；

(3)42℃热休克90sec，冰浴2min；

(4)向管中加入800μl LB液体培养基(不含Kan)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Kan^r)；

(5)将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Kan的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿；

(6)37℃倒置培养过夜，至菌落长出；

(7)挑取单克隆至3ml含有Kan抗性的LB培养基中，于37℃摇床培养，250rpm培养过夜。同时做两个对照：

对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2：其它操作与上面相同，但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

2.2.1.6 抽提pMV261-IFN α-2b质粒DNA

挑选没有突变的菌落，抽提质粒。按照质粒抽提试剂盒实验步骤如下：

(1)将培养过夜的2ml菌液移至离心管中，9000rpm离心5min，弃尽上清；

(2)在细菌沉淀中加入250ul P1液，振荡至彻底悬浮；

(3)加入250ul P2液，立即温和颠倒离心管4-6次以混匀。使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液，此步骤应在5min内完成；

(4)加入350ul N3液，立即温和颠倒离心管4-6次以混匀。13000rpm离心10分钟；

(5)将上清液小心移入吸附柱，离心60sec。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管；

(6)在吸附柱中加入750ul PB液，离心60sec。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管，离心1分钟；

(7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入50ul EB液或20ulddH₂O，静置1分钟后，离心1分钟。将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。

2.2.1.7 人IFN α-2b的PCR扩增及电泳：

以抽提质粒DNA为模板，用合成的IFN α-2b两端引物进行PCR扩增，扩增反应体系和条件同前(获取目的基因人IFN α-2b部分)。将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，1kbDNAmarker证实片断大小为519bp。

2.2.2 将信号肽基因BCG-Ag85B克隆到pMV261-IFN α-2b载体中

将pMV261-IFN α-2b和BCG-Ag85B分别用EcoRI和BamHI进行酶切连接，连接产物转化E.coli细胞，挑取克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，此重组质粒命名为pMV261-Ag85B-IFNα-2b。

2.2.2.1 分别酶切信号肽基因BCG-Ag85B和pMV261-IFN α-2b载体

酶切体系：

去离子水 4μL 去离子水 3μL

10×K 2μL buffer 2μL

Ag85B 12μL pMV261-IFN α-2b 13μL

EcoR I 1μL EcoR I 1μL

BamHI 1μL BamHI 1μL

37℃作用2hr，1％琼脂糖凝胶电泳。

2.2.2.2 回收信号肽基因BCG-Ag85B片段和切后的pMV261-IFN α-2b载体(凝胶回收试剂盒)。

2.2.2.3 连接信号肽基因BCG-Ag85B和pMV261-IFN α-2b

连接体系：

连接buffer 1μL

pMV261-IFN α-2b载体 4μL

信号肽基因BCG-Ag85B片段 2μL

连接酶 2μL

ddH₂O 1μL

16℃连接过夜，得到含有信号肽基因BCG-Ag85B的质粒pMV261-Ag85B-IFN α-2b。

2.2.2.4 pMV261-Ag85B-IFN α-2b质粒转化感受态细菌E.col iDH5 α(转化步骤同2.2.1.5，菌液的抗性为卡那霉素)。

2.2.2.5 抽提pMV261-Ag85B-IFN α-2b质粒DNA(步骤同2.2.1.6)

2.2.2.6 酶切验证穿梭表达载体

酶切体系：

water 2μL water 2μL

buffer 2μL buffer 2μL

穿梭表达质粒 15μL 穿梭表达质粒 15μL

EcoR I 0.5μL EcoR I 0.5μL

BamHI 0.5μL Hind III 0.5μL

37℃作用2hr，1％琼脂糖凝胶电泳。

2.2.2.7 测序验证构建的穿梭表达载体

用IFN α-2b和BCG-Ag85B的正向引物和反向引物对抽提的穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFN α-2b进行测序验证。

2.3 人IFN α-2b重组BCG(rBCG-IFN α-2b)的构建：

该步骤利用电穿孔技术将已构建的重组载体pMV261-Ag85B-IFN α-2b导入BCG，构建重组卡介苗rBCG-IFN α-2b。

2.3.1 感受态BCG的制备

(1)BCG在Middlebrook 7H9培养基37℃摇床培养(转速为150rpm)；

(2)待培养液OD600值约0.6时将BCG菌液加入离心管中，冰浴2hr；

(3)将BCG菌液加入离心管中，在冰盒中预冷2hr；

(4)4℃离心：8000rpm×15min，丢弃上清；用原始体积的1/10、预冷浓度为10％的甘油重悬菌体；重复上述操作共五次；

(5)弃上清，加入原始体积1/50的10％甘油重悬菌体即得到感受态细菌，放置室温下备用。

2.3.2 电穿孔法构建重组卡介苗与抗性筛选

(1)在一微量离心管中温和混匀200μL感受态BCG(约1×10⁸cfu/ml)和10μL穿梭表达质粒(约2μg)；

(2)冰浴10min后，转入预冷的0.2CM的电击转化杯中，置于基因脉冲仪中进行电转，电转参数Voltage：1250V，Capacitance：25μF，Resistance：600Ω；

(3)质粒pMV261-Ag85B-IFN α-2b，pMV261及单纯BCG的作用时间分别为13.4、14.5、13毫秒；

(4)电转完成后，迅速加Middlebrook7H9培养基800μL入电转化杯中混匀，再转入离心管37℃200rpm/min×3hr培养；

(5)取100μL涂布在含30mg/L卡那霉素的Middlebrook7H10固体培养基的离心试管内斜面上，37℃继续培养直至发现克隆；

(6)3～4周后挑选阳性克隆，先进行抗酸染色初步鉴定，明确后在含20ml液体培养基的离心试管里摇床生长。

注：此处感受态BCG在转化时各做一阳性对照pBCG(BCG中只含有空白质粒pMV261)及阴性对照(BCG)。

3.本发明实施结果(rBCG-IFN α-2b)的鉴定方法：

重组菌株rBCG-IFN α-2b经抗酸染色证实为抗酸杆菌，从rBCG-IFN α-2b抽取质粒DNA后，PCR扩增和SDS-PAGE电泳得到IFN α-2b基因片段，Western blotting证实rBCG-IFNα-2b的培养上清中和菌体中有IFN α-2b蛋白的表达，采用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定出rBCG-IFN α-2b培养上清中有高水平表达的IFN α-2b。详细步骤如下：

3.1 重组卡介苗(rBCG-IFN α-2b)的抗酸染色(初步鉴定)

3.1.1 试剂：

碱性复红乙醇染色液：10ml碱性复红储存液与90ml 5％石碳酸水溶液混合；

3％盐酸乙醇脱色液：3ml浓盐酸与95ml 95％乙醇混合；

0.3％亚甲兰复染储存液：0.3克亚甲兰溶于50ml 95％乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml；

亚甲兰复染液：以蒸馏水10倍稀释0.3％亚甲兰复染储存液即亚甲兰复染液。

3.1.2 染色步骤：

●取BCG涂片(用接种环从含培养基的试管里蘸取少许菌液平铺于载玻片上)；

●37℃培养箱干燥数分钟；

●火焰固定涂片(酒精灯上来回3次)；

●滴加碱性复红乙醇染色液，盖满菌液。小心火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色3min。染色期间应始终保持菌液被染色液覆盖，必要时可续加染色液；或碱性复红乙醇染色液染10min后水洗；

●流水自玻片背面上端轻洗，洗清染色液；

●自菌液上端外缘滴加3％盐酸酒精脱色液，流过菌液，需脱至菌液无可视红色为止，脱色应单片进行；

●流水自玻片背面上端轻洗，去脱色液；

●滴加亚甲兰复染液，染色60sec；

●流水自玻片背面上端轻洗，去复染液；

●用吸水纸吸干标本，然后在油镜下观察结核杆菌的形态、排列及染色性。

3.2 重组卡介苗(rBCG-IFN α-2b)DNA的PCR扩增和电泳鉴定

3.2.1 rBCG-IFN α-2b的引物设计

采用Genamics Expression软件设计引物，引物设计同2.1.1.2部分，即：

3.2.2 重组卡介苗质粒DNA抽提

●rBCG质粒DNA的提取：将在三角烧瓶内培养四周的rBCG分瓶至15ml试管中，再在试管里摇床培养3周后使OD600约为0.6，收获前加入甘氨酸至20mg/ml以干扰胞壁的合成，继续培养一定时间后收集菌体；移至离心管中，9000rpm离心5min，弃尽上清；

●在细菌沉淀中加入250ul P1液，振荡至彻底悬浮；

●加入250ul P2液，立即温和颠倒离心管4-6次以混匀。使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液，此步骤应在5min内完成；

●加入350ul N3液，立即温和颠倒离心管4-6次以混匀。13000rpm离心10min；

●将上清液小心移入吸附柱，离心60sec。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管；

●在吸附柱中加入500ul PB液，离心60sec。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管；

●在吸附柱中加入750ul PB液，离心60sec。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管，离心1min；

●将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入50ul EB液或20ulddH₂O，静置1min后，离心1min。将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。

3.2.3 重组卡介苗的PCR扩增反应及电泳鉴定：(PCR扩增条件与方法同2.1.1.2人IFN α-2b基因的PCR扩增部分，电泳鉴定的条件与方法同2.1.1.3人IFN α-2b的PCR产物电泳和半定量分析部分)

3.3 重组卡介苗蛋白水平鉴定(Western blotting检测)

3.3.1 重组卡介苗的诱导表达

升温诱导表达：重组卡介苗(rBCG-IFN α-2b)于37℃摇床培养至对数生长中期，迅速转到45℃摇床(200rpm/min)培养。3hr后收集培养上清。提取上清进行SDS-PAGE和Westernblotting检测。

H₂O₂诱导表达：重组卡介苗于37℃摇床培养至对数生长中期，加入100mL的H₂O₂继续培养1-2hr，提取上清进行SDS-PAGE和Western blotting检测。

3.3.2 重组卡介苗蛋白质的样品制备

3.3.2.1 细胞培养蛋白质样品的制备：

在液体培养基中培养至对数生长中期，先诱导rBCG-IFN α-2b分泌表达细胞因子，4000rpm/min×10min，离心2次，收获菌体及上清后，菌体先用超声裂解法破碎，再加入裂解液(2％SDS，0.1M DT，0.01％浪甲酚绿，0.06MTris-Cl，10％甘油)煮沸5min提取蛋白。分别将样品用1×PBS洗涤三遍，以去除培养液中的白蛋白。收集第一遍洗涤液和最终的沉淀进行Western blotting鉴定。

3.3.2.2 蛋白变性：

处理后的样品加入样品缓冲液(按样品浓度1：1或1：2的比例)混匀，样品置100℃的水浴箱加热3-5min，10000rpm/min离心10min，取上清液。(样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃可稳定保持数月。)

3.3.3 蛋白含量的测定

(1)制作标准曲线：

●从—20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

●取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。

●按表3在各管中加入各种试剂。

●混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计(Bio—Photometer，Eppendoff)上比色分析。

(2)检测样品蛋白含量

●取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。

●取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

●弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5ml)，再用无菌水洗一次。

●取一管考马斯亮蓝加95μl 0.15mol/LNaCl溶液和5μl待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

3.3.4SDS-PAGE分离总蛋白

(1)制胶(参见表4)：①按比例配制分离胶(单体：双体＝29：1)，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置90min。②同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90min以上以保证完全聚合。

表4制胶

(2)预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。(目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通)。

(3)加样：预电泳后依次加入标准品和待分析样品，待分析样品包括rBCG-IFN α-2b分泌的上清、收获的菌体、阳性对照pBCG(BCG中只含有空白质粒pMV261)及阴性对照(BCG)。样品一般在1.0mm厚的胶加样50-100ug/lane。

(4)电泳：加样完毕，选择适当的电压进行电泳可。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶100～150V，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。

3.3.5转膜：

蛋白质经SDS-PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放三块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜、凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，按照(-)夹板-海棉-滤纸-胶块-NC膜-滤纸-海绵-夹板(+)装好，除尽气泡，夹好电转印夹。电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极，4℃，100V，350mA，，转印60min。

3.3.6 膜的封闭：

漂洗转印膜，室温，3次×10min，以尽量洗去转印膜上的SDS(以免影响抗体的结合)，放入5％脱脂奶封闭液内，摇床震动，室温封闭2h或4℃过夜。1×TBS-T，PH7.6洗液，室温漂洗10min。

3.3.7 抗体杂交：

(1)封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入适当稀释的一抗(鼠抗人IFN α-2b单抗)，4℃孵育过夜或37℃孵育2h，1×TBS-T，PH7.6洗液洗膜3次x10min。

(2)滴加过氧化物酶标记羊抗鼠(HRP-羊抗鼠IgG)，4℃过夜，1×TBS-T洗膜3×10min。

3.3.8 显色(ECM)，显影，定影：

(1)将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X光片夹中。

(2)在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)；打开X光片夹，把X光片放在膜上，关上X光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min；曝光完成后，打开X光片夹，取出X光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1-2min(20-25℃)；显影结束后，马上把X光片浸入定影液中，定影时间一般为5-10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

3.3.9 凝胶图象分析：

将胶片进行扫描或拍照。

3.4 重组卡介苗自分泌细胞因子的测定

rBCG-IFN α-2b及pBCG和BCG分别在试管中摇床培养15天，OD600值约为0.5时，装入离心管中，离心2000rpm×10min，仔细吸取上清。按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤检测培养上清中IFN α-2b的水平。

结果计算与判断：

(1)所有OD值都应减除空白值后再行计算。

(2)以标准品1000、500、250、125、62、31、15.6、0PG/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。

(3)根据样品OD值在该曲线图上查出相应sIFN α-2b含量。

4.本发明产品的实验结果和技术效果：

4.1 实验结果：

4.1.1 重组卡介苗的抗酸染色结果

BCG是一种减毒的结核菌，细长略带弯曲，细胞壁脂质含量较高，抗酸染色阳性。构建的rBCG同样具有BCG的基本特点，如图1所示，染色后光学显微镜镜检(目镜10×，油镜100×)。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色。即rBCG抗酸染色阳性，初步表明构建的rBCG是抗酸杆菌，而不是其他细菌污染。可以继续摇床培养，并作进一步的鉴定。

4.1.2 重组卡介苗质粒DNA PCR扩增结果

以抽提的rBCG质粒DNA为模板，分别以IFN α-2b引物(同2.1.1.2部分的引物)进行PCR扩增，得到结果如图2所示。图2中：左为DNA Marker；1-4为PCR扩增条带，与分子质量标记比较显示约519bp，与理论上所得的扩增片段大小相同。

4.1.3 重组卡介苗分泌蛋白Western Blotting结果

参见图3，Western Blotting显示，rBCG-IFN α-2b的培养上清和菌体中分别均可检测到IFN α-2b蛋白的表达，而pBCG和BCG的培养上清和菌体中未检测到上述蛋白的表达。其中培养上清中蛋白的表达量明显多于菌体，说明rBCG-IFN α-2b具有较强的蛋白分泌功能。图3中：4、5分别为rBCG-IFN α-2b中的菌体和培养上清，均可见19KD的IFN α-2b蛋白表达；1、2为pBCG的菌体和培养上清，未见蛋白表达；3为标准IFN α-2b蛋白；6、7为BCG的菌体和培养上清，未见蛋白表达。

4.1.4 重组卡介苗自分泌细胞因子的测定结果

ELISA法测定培养上清中IFN α-2b的水平。只在rBCG-IFN α-2b培养上清中检测到高表达的IFN α-2b为301.45pg/ml，而pBCG和BCG的培养上清中均未检测到IFN α-2b的表达。

4.2 技术效果和初步结论：

4.2.1 rBCG-IFN α-2b对人外周血单核细胞(PBMC)增殖活性：

rBCG-IFN α-2b可明显刺激人外周血单核细胞(PBMC)增殖，并随刺激浓度的增加，PBMC的增殖水平也增加，且这种刺激作用迅速，在刺激的第1天，PBMC即有明显增殖，并在刺激后3天PBMC增殖达到高峰，参见表5。

表5：重组卡介苗对人PBMC的增殖活性(OD570)

ΔP<0.001 vs 0ug/ml

4.2.2 重组卡介苗激活的杀伤性细胞对膀胱肿瘤细胞的细胞毒作用

用rBCG-IFN α-2b、BCG+IFN α-2b、BCG、IFN α-2b和PBS刺激培养PBMC3d，收获效应细胞，分别命名为RAK、BIAK、BAK、IAK和PAK细胞，按不同的效靶比10:1、20:1、40:1分别作用于人膀胱癌细胞株T24、T5637，12h后MTT法测定细胞毒活性。参加图5、图6，结果表明，与普通BCG相比，rBCG-IFN α-2b激活的人PBMC对人膀胱肿瘤细胞株T24、T5637具有更强的杀伤作用，差异有显著性意义(P<0.01)。

4.2.3 rBCG-IFN α-2b的优越性：

rBCG-IFN α-2b既保留了原有BCG的免疫原性，又能持续分泌细胞因子IFN α-2b，从而提高BCG的免疫活性；IFN α-2b能够直接作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化，而普通BCG对肿瘤细胞的直接杀伤作用不明显，因此，rBCG-IFN α-2b可对部分普通BCG疗效不佳的患者起到治疗作用；由于rBCG-IFN α-2b具有更强的抗肿瘤作用，因此可以减少使用剂量，从而降低BCG引起的毒副作用；rBCG-IFN α-2b能够直接在局部高效分泌IFN α-2b，避免了使用外源IFN α-2b所带来的应用剂量大、副作用发生率高、作用时间短暂和费用高昂的问题。

Claims

1、一种人干扰素α-2b重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)获得人IFN α-2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因：

设计人IFN α-2b和BCGAg85B的扩增引物，分别从人外周血和BCG基因组中用聚合酶联反应方法提取、扩增人IFN α-2b基因和Ag85B信号肽基因片段，并对其筛选、鉴定，其中人IFN α-2b的上游引物：5′-GACGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3′且含EcoR I酶切位点

下游引物：5′-CGCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3′且含Hind III酶切位点，BCG-Ag85B信号肽基因的

上游引物：5′-GATGGATCCAATGACAGACGTGAGCCGAAAG-3′且含BamHI酶切位点

下游引物：5′-GTAGAATTCCGCGCCCGCGGTTGCCGCTCC-3′且含EcoR I酶切位点；

(2)构建卡介苗穿梭表达载体：

利用DNA重组技术将人IFN α-2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因片段插入质粒pMV261结核杆菌hsp60启动子下游，构建分泌型卡介苗穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFNα-2b并转化大肠杆菌、抽提和纯化，对pMV261-Ag85B-IFN α-2b进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴定；

2、根据权利要求1所述人干扰素α-2b重组卡介苗的构建方法，其特征在于：所述获得人IFNα-2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因包括以下步骤：获取人IFNα-2b基因，信号肽基因BCG-Ag85B抽提、PCR扩增，所述获取人IFNα-2b基因包括人基因组DNA提取和纯化、人IFNα-2b基因的PCR扩增、人IFN α-2b的PCR产物电泳和半定量分析，所述信号肽基因BCG-Ag85B抽提、PCR扩增包括BCG基因组DNA抽提、BCG-Ag85B的PCR扩增、BCG-Ag85B的PCR产物纯化。

3、根据权利要求1所述人干扰素α-2b重组卡介苗的构建方法，其特征在于：所述构建卡介苗穿梭表达载体包括人IFN α-2b基因克隆到pMV261载体中、信号肽基因BCG-Ag85B克隆到pMV261-IFN α-2b载体中，所述人IFN α-2b基因克隆到pMV261载体中步骤通过人IFNα-2b DNA与pMV261分别用EcoRI和Hind III进行酶切连接，连接产物转化E.coli细胞，挑取克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，得到重组质粒pMV261-IFN α-2b，所述信号肽基因BCG-Ag85B克隆到pMV261-IFN α-2b载体中步骤将pMV261-IFN α-2b和BCG-Ag85B分别用EcoRI和BamHI进行酶切连接，连接产物转化E.coli细胞，挑取克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，得到重组质粒pMV261-Ag85B-IFNα-2b。

4、根据权利要求1所述人干扰素α-2b重组卡介苗的构建方法，其特征在于：所述人IFNα-2b重组BCG的构建包括感受态BCG的制备、电穿孔法构建重组卡介苗与抗性筛选。

5、一种权利要求1所述构建方法制得的人干扰素α-2b重组卡介苗，其特征在于：人干扰素α-2b重组卡介苗具有人IFN α-2b基因片段和BCG-Ag85B信号肽基因片段。

6、一种权利要求1所述构建方法制得的人干扰素α-2b重组卡介苗的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

从人干扰素α-2b重组卡介苗的构建方法得到的疫苗抽取质粒DNA后，通过PCR扩增和SDS-PAGE电泳方法得到IFN α-2b基因片段，通过Western blotting方法证实rBCG-IFN α-2b的培养上清中和菌体中有IFN α-2b蛋白的表达，采用酶联免疫吸附方法测定出rBCG-IFN α-2b培养上清中有高水平表达的IFN α-2b，其中人干扰素α-2b重组卡介苗PCR扩增的

上游引物：5′-GACGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3′且含EcoR I酶切位点