DE3586313T2

DE3586313T2 - Konjugate von pharmazeutisch nuetzlichen proteinen.

Info

Publication number: DE3586313T2
Application number: DE8585308533T
Authority: DE
Inventors: Smithkline Beecham Garman
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Adprotech PLC
Priority date: 1984-11-30
Filing date: 1985-11-25
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2005-11-26
Also published as: GB8430252D0; PT81581B; DK552285A; AU5044585A; DK552285D0; JPH0717517B2; DE3586313D1; EP0183503A2; PT81581A; GR852877B; JP2545339B2; US4935465A; JPH06279318A; EP0183503B1; JPS61155333A; EP0183503A3

Description

Diese Erfindung betrifft Konjugate pharmazeutisch verwendbarer Proteine.
Konjugate aus Proteinen und wasserlöslichen Polymeren sind für eine große Auswahl an pharmazeutischen Zwecken hergestellt worden. Das Anheften von einem oder mehreren Polymermolekülen bewirkt normalerweise eine Störung der Wechselwirkungen zwischen dem Protein und anderen Makromolekülen oder Zellen. So ist die Antigenität oder Allergenität des Proteins vermindert oder seine Clearance aus dem Blutkreislauf ist verzögert. Zum Beispiel ist die Plasmaclearance von Urokinase durch irreversibles Anheften von Methoxypolyethylenglykol verzögert worden. Als Alternative kann das Konjugat neue Eigenschaften besitzen: zum Beispiel offenbart das europäische Patent Nr. 0038154 Konjugate aus Allergenen mit Polysarcosin, die immunsuppressive Eigenschaften besitzen.
Das Anheften von Polymeren an Proteine, um die Clearance zu verzögern oder die Antigenität zu verringern, wird am meisten bei Proteinen, normalerweise Enzymen, verwendet, die auf Substrate mit niedrigem Molekulargewicht wirken. Falls zur Erzeugung einer therapeutischen Wirkung erforderlich ist, daß das Protein auf ein makromolekulares oder zellgebundenes Substrat wirkt, dann kann erwartet werden, daß das Anheften von Polymeren diese Wechselwirkung stören wird, was zu einem Wirkungsverlust führt. Solch eine Wirkung ist mit Streptokinase und Polyethylenglykol gezeigt worden, wo verringerte Antigenität nur auf Kosten einer Abnahme in der fibrinolytischen Wirkung erreicht wurde. Selbst wenn das Protein auf Substrate mit niedrigem Holekulargewicht wirkt, wird häufig eine Wirkungsabnahme nach Polymeranheftung beobachet.
EP 0098110 offenbart irreversible Konjugate eines physiologisch wirksamen Polypeptids oder Glycoproteins, das an ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymer gekoppelt ist und in vivo über einen längeren Zeitraum wirksam ist.
FR-2515684 offenbart irreversible Konjugate eines Plasminogen- Aktivators, der mindestens an ein Polyalkylenglykol über mindestens ein Kopplungsmittel an die Aminosäureseitenketten des Plasminogen-Aktivators geheftet ist.
EP191772 (Priorität 29.08.84, eingereicht am 23.05.85) offenbart die Verwendung von reversiblen Verknüpfungsmitteln der nachfolgenden Formeln (A) und (B), die auf Maleinsäureanhydrid basieren, zur Verknüpfung des Aminostickstoffatoms eines aminogruppenhaltigen Stoffes, wie einem Peptid oder Protein, mit einer Sulfhydrylfunktion einer zweiten Verbindung, die ein Polymer sein kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat bereitgestellt, das ein über eine reversible Bindungsgruppe an mindestens ein wasserlösliches Polymer gebundenes pharmazeutisch verwendbares Protein umfaßt, mit der Maßgabe, daß die Bindungsgruppe nicht von einem Vernetzungsmittel der Formel (A):
abgeleitet ist, in der Ra und Rb unabhängig voneinander aus einem Wasserstoffatom und Alkylresten mit C&sub5; oder weniger ausgewählt sind, und A eine Brückengruppe umfaßt, oder der Formel (B):
in der Rb aus einem Wasserstoffatom und Alkylresten mit C&sub5; oder weniger ausgewählt ist, A eine Brückengruppe umfaßt und x = 2 - 5 ist.
Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch verwendbares Protein" bedeutet ein Protein, das eine therapeutische oder pharmakologische Wirkung im menschlichen oder Tierkörper erzeugt.
Der Begriff "reversible Bindungsgruppe" bedeutet eine Bindung, die unter in vivo Bedingungen mit einer klinisch verwendbaren Geschwindigkeit gebrochen wird. Geeigneterweise wird die Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung für den Bruch der Bindungsgruppe im Bereich von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;³ sec&supmin;¹ liegen.
Dieser Konjugattyp verursacht eine anhaltende Freigabe des wirksamen Proteins.
Die Konjugate können durch die allgemeine Formel (I) dargestellt werden:
P-L-X (I)
in der P ein wasserlösliches Polymer bedeutet;
L eine reversible Bindungsgruppe ist; und
X ein pharmazeutisch verwendbares Protein darstellt.
Die Zahl wasserlöslicher Polymermoleküle, die auf diese Weise an das Protein gebunden sein können und die die unerwünschte Eigenschaft (zum Beispiel Antigenität, schnelle Clearance) beseitigen werden, hängt von der Beschaffenheit des Proteins ab und kann durch Routineverfahren bestimmt werden. Jedoch ist der Grad der Modifikation des Proteins durch die reversible Bindung der Polymermoleküle (d.h. die Zahl der an das Protein gebundenen Polymermoleküle) weniger bedeutend als im Fall irreversibler Polymerproteinkonjugate.
Jedes Proteinmolekül kann mehr als eine daran angeheftete Bindungsgruppe besitzen und jede Bindungsgruppe kann mehr als ein daran angeheftetes wasserlösliches Polymer besitzen.
Die Molekulargewichte der wasserlöslichen Polymere (P) sollten vorzugsweise im Bereich von 500 bis 10&sup6; liegen, besonders bevorzugt im Bereich von 2000 bis 20000.
Beispiele eines geeigneten wasserlöslichen Polymers (P) schließen die Polyaminosäuren oder Polyiminosäuren, wie Polysarcosin, Poly-D,L-alanin, Polyhydroxyprolin, oder die Polysaccharide und ihre Derivate, zum Beispiel Dextran, Hydroxyethylstärke oder Ficoll, oder gegebenenfalls derivatisierte synthetische Polymere, wie Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, die Polyvinylpyrrolidone, die Polyvinylalkohole oder die Polyacrylamide ein.
Geeigneterweise ist das wasserlösliche Polymer (P) Methoxypolyethylenglykol.
Das pharmazeutisch verwendbare Protein (X) kann ein Enzym, ein Proenzym oder ein nicht-enzymatisches Protein sein.
Geeignete nicht-enzymatische Proteine schließen die Interferone, die Lymphokine, insbesondere Interleukin-2, Protein A aus Staphylococcus aureus oder Hormone, wie Insulin, Wachstumshormon, oder Proteine, die in Impfstoffen, wie Allergenextrakten, verwendet werdend oder Virushüllproteine ein.
Beispiele, in denen das pharmazeutisch verwendbare Protein (X) ein Enzym oder Proenzym ist, schließen die Proteasen (zusammen mit ihren Proenzymen), die an der Hämostase beteiligt sind, fibrinolytische Enzyme und ihre Proenzyme, Arginase, Uricase, Asparaginase, Glutaminase, Superoxiddismutase und Enzyme, die an verschiedenen Enzymmangelkrankheiten leidenden Patienten fehlen, zum Beispiel Hexosaminidase A und Glucocerebrosidase, ein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das pharmazeutisch verwendbare Protein (X) ein fibrinolytisches Enzym oder Proenzym davon; in dem Fall kann die Bindungsgruppe auch von einem reversiblen Verknüpfungsmittel der Formel (A) oder (B) abgeleitet werden.
Der hier verwendete Begriff "fibrinolytisches Enzym" bedeutet ein beliebiges Enzym, das in-vivo fibrinolytische Wirkung zeigt, wie in dem europäischen Patent Nr. 0009879 (US4285932) definiert ist.
Diese Enzyme können durch Gewebekultur, Extraktion aus Blut, Urin oder Geweben, oder durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt werden.
Beispiele solcher Enzyme sind die Plasminogen-Aktivatoren einschließlich Gewebe-Plasminogen-Aktivator, wie Melanom-Plasminogen-Aktivator, Urokinase (sowohl hohes als auch niedriges Molekulargewicht und die Einzelkettenform) und Komplexe aus Streptokinase mit Plasmin.
Geeignete Proenzyme schließen Pro-Urokinase und Pro-Gewebe- Plasminogen-Aktivator ein.
Die Klasse pharmazeutisch verwendbarer Proteine, vorstehend als fibrinolytische Enzyme und Proenzyme davon definiert, schließt auch ein:
(a) die fibrinolytisch wirksamen Hybridproteine, wie in der europäischen veröffentlichten Anmeldung Nr. 0155387 offenbart;
(b) die Derivate der fibrinolytischen Enzyme, wie in der europäischen veröffentlichten Anmeldung Nr. 0155388 offenbart; und
(c) die Proteinkonjugate, wie in der europäischen veröffentlichten Anmeldung Nr. 0152736 offenbart.
Die fibrinolytischen Enzyme können gegebenenfalls an ihren aktiven Zentren blockiert sein, wie in dem europäischen Patent Nr. 0009879 (US 4285932) beschrieben.
Die Bindungsgruppe (L) ist derartig, daß die Bindung unter in vivo-Bedingungen mit einer klinisch verwendbaren Geschwindigkeit aufgebrochen wird.
Die Spaltung der Bindungsgruppe (L) kann durch Hydrolyse oder durch intramolekulare Umlagerung auftreten. Sie findet innerhalb der Bindungsgruppe (L) selbst statt oder an der Grenze der Bindungsgruppe (L) mit dem Polymeren oder mit dem Protein.
Vorzugsweise sollte die Spaltung unverändertes Protein ergeben.
Eine geeignete Bindungsgruppe (L) beruht auf substituierten Maleinsäuren. Die gebildeten Konjugate können durch die allgemeine Formel (II) dargestellt werden:
in der X wie vorstehend definiert ist und der NH-Rest von einer Proteinaminogruppe in X abgeleitet ist; und entweder:
(i) R&sub1; und R&sub2; jeweils einen nicht-polymeren organischen Rest oder einen Rest der Formel -R&sub3;-P bedeuten, in der P wie vorstehend definiert ist und R&sub3; eine Brückengruppe darstellt; oder
(ii) R&sub1; und R&sub2; zusammengenommen einen C&sub3;&submin;&sub5;-Polymethylenrest zur Vervollständigung eines 5- bis 7-gliedrigen alicyclischen Ringes bedeuten oder zusammengenommen einen aromatischen Ring bilden, wobei der alicyclische oder aromatische Ring mit den Resten R&sub4; und R&sub5; substituiert ist, die jeweils einen nichtpolymeren organischen Rest oder einen Rest der Formel -R&sub3;-P bedeuten; mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; oder der Reste R&sub4; und R&sub5; ein Rest -R&sub3;-P ist.
In neutralen und sauren Lösungen, einschließlich physiologischer Bedingungen von pH 7,4 und 37ºC, werden die CO-NH-Bindungen in dem Konjugat der Formel (II) durch ein Verfahren hydrolysiert, das durch die benachbarte Carboxylfunktion erleichtert wird, wobei ein unverändertes Protein erhalten wird. Die Geschwindigkeit der Entacylierung hängt von den Atomen in der Nähe der Doppelbindung ab, deren Beschaffenheit nicht bedeutend ist mit der Maßgabe, daß die Entacylierungsgeschwindigkeit nicht nachteilig verändert wird.
Beispiele geeigneter Brückenreste R&sub3; schließen gestreckte oder verzweigte aliphatische C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoffreste ein, die gegebenenfalls durch einen Amid- oder Esterteil oder durch mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus einem Sauerstoff-, Schwefel- oder gegebenenfalls mit einem C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest substituierten Stickstoffatom, unterbrochen oder beendet werden.
Vorzugsweise enthält R&sub3; benachbart zur Doppelbindung einen elektronenschiebenden Teil, wie eine Methylengruppe.
Beispiele geeigneter Reste -R&sub3;-P schließen P-(CH&sub2;)n-, PO(CH&sub2;)n-, PO-, P(CH&sub2;)nO-, PCH(CH&sub3;)-, PC(CH&sub3;)&sub2;-, POCH(CH&sub3;)- oder POC(CH&sub3;)&sub2;- ein, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist.
Geeignete nicht-polymere organische Reste für R&sub1;, R&sub2;, R&sub4; und R&sub5; schließen aliphatische C&sub1;&submin;&sub1;&sub0; Kohlenwasserstoffreste ein, gegebenenfalls unterbrochen oder beendet durch ein Heteroatom, ausgewählt aus einem Sauerstoff-, Schwefel- oder gegebenenfalls mit einem C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest substituierten Stickstoffatom.
Vorzugsweise enthält der nicht-polymere organische Rest benachbart zur Doppelbindung einen elektronenschiebenden Teil, wie eine Methylen- oder Methylgruppe.
Beispiele solcher Reste für R&sub1;, R&sub2;, R&sub4; und R&sub5; schließen R&sub6;, R&sub6;-O- oder (R&sub6;)&sub2;N- ein, wobei R&sub6; ein gestreckter oder verzweigter C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest ist.
Vor allem können R&sub1;, R&sub2;, R&sub4; und R&sub5; CH&sub3;-, CH&sub3;CH&sub2;-, (CH&sub3;)&sub2;CH-, CH&sub3;CH&sub2;CH&sub2;-, (CH&sub3;)&sub3;C-, CH&sub3;O-, CH&sub3;CH&sub2;O- oder (CH&sub3;)&sub2;N-Gruppen sein.
Es gibt eine Untergruppe von Konjugaten innerhalb Formel (II) mit der Formel (IIA), in der R&sub1; und R&sub2; jeweils einen nicht-polymeren organischen Rest oder einen Rest der Formel -R&sub3;-P, wie vorstehend definiert, bedeuten mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; ein Rest -R&sub3;-P ist.
In Konjugaten der Formel (IIA) ist vorzugsweise einer der Reste R&sub1; und R&sub2; ein Rest P-CH&sub2;- und der andere eine Methylgruppe.
Beispiele von Konjugaten der Formel (II), in der R&sub1; und R&sub2; miteinander verbunden sind, schließen cyclische Strukturen der Formel (IIB) ein:
in der r, s und t jeweils unabhängig voneinander Null, Eins oder Zwei bedeuten, mit der Maßgabe, daß r + s + t größer als 0 und kleiner als 4 ist, d.h. eine ganze Zahl von 1 bis 3, und R&sub4; und R&sub5; wie vorstehend definiert sind.
Als Alternative können R&sub1; und R&sub2; miteinander verbunden sein, wobei eine aromatische Struktur gebildet wird. Beispiele solcher Konjugate der Formel (11) schließen Konjugate der Formel (IIC) ein:
in der R&sub4; und R&sub5; wie vorstehend in bezug auf Formel (II) definiert sind.
Geeignete nicht-polymere organische Reste für R&sub4; und R&sub5; in den Formeln (IIB) und (IIC) schließen die vorstehend unter Formel (II) beschriebenen ein.
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorstehend beschriebenen Konjugates bereitgestellt, wobei das Verfahren die Umsetzung eines pharmazeutisch verwendbaren Proteins mit einem wasserlöslichen polymerhaltigen Reagens umfaßt, das eine Gruppe umfaßt, die in der Lage ist, sich mit einer Proteinaminogruppe oder einem Derivat davon umzusetzen, wobei eine wie vorstehend definierte reversible Bindungsgruppe gebildet wird.
Das polymerhaltige Reagens kann durch die Formel (III) dargestellt werden:
P - L¹ (III)
in der P wie vorstehend definiert ist und L¹ ein Rest ist, der in der Lage ist, eine Bindungsgruppe (L) zu bilden, wie vorstehend erwähnt.
Die Bedingungen, die verwendet werden, um die Konjugate herzustellen, werden von der Beschaffenheit des polymeren Reagens', dem Protein und der Stabilität der gebildeten Bindung abhängen und werden dem Fachmann bekannt sein.
Geeigneterweise wird das Protein in einem wäßrigen Puffer vorzugsweise bei einem mäßig alkalischen pH-Wert, z.B. pH 7,0 - 9,5, und bei einer Temperatur im Bereich von 0 - 40ºC aufgelöst. Der pH-Wert kann während der Umsetzung nötigenfalls durch Säure- oder Basenzugabe kontrolliert werden, entweder manuell oder automatisch.
Die Menge des verwendeten wasserlöslichen polymerhaltigen Reagens' (Formel (III)) bestimmt die Zahl der Polymermoleküle, die an das Protein angeheftet werden. Mindestens ein molarer Überschuß des Reagens' (Formel (III)) sollte zugefügt werden.
Nach Abschluß der Umsetzung können überschüssiges Reagens und unerwünschte Umsetzungsprodukte entfernt werden. Geeignete Entfernungsmethoden schließen Ammoniumsulfatfällung, Dialyse, Diafiltration oder eine Anzahl von chromatographischen Verfahren, zum Beispiel Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie oder Affinitätschromatographie ein.
Für fibrinolytische Enzyme und andere Serinproteasen ist die Affinitätschromatographie an Benzamidin-Sepharose ein besonders bevorzugtes Verfahren.
Bei fibrinolytischen Enzymen kann die Blockierung an ihren aktiven Zentren wahlweise entweder vor oder nach der Polymerkonjugationsumsetzung durchgeführt werden.
Der in dem Konjugat der Formel (II) veranschaulichte Bindungstyp wird geeigneterweise durch Umsetzung der Reagentien der Formel (IV):
in der R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert sind, mit einer Aminogruppe eines pharmazeutisch verwendbaren Proteins erhalten.
Selbstverständlich wird das so gebildete Konjugat der Formel (II) Isomerie an der Bindung zeigen, wenn R&sub1; = R&sub2; ist, da sich die Proteinaminogruppe prinzipiell mit jeder Carbonylgruppe umsetzen kann.
GB1390716 offenbart bestimmte Verbindungen der Formel (III) und (IV), die Polyalkylenetherpolyolester von Trimellitsäureanhydrid mit der Formel (C) sind:
in der Rc einen Polyalkylenetherrest darstellt und in der y eine ganze Zahl von 2 bis 6 bedeutet, hergestellt durch Erhitzen eines Gemisches aus einem Polyalkylenetherpolyol und Trimellitsäureanhydrid auf 200 - 300ºC, um das bei der Veresterung gebildete Wasser abzudestillieren, als Aushärtemittel für Epoxyharze.
Neue Reagentien der Formeln (III) und (IV) bilden einen Teil der Erfindung.
Ein Reagens der Formel (IV) kann durch Umsetzung einer Verbindung der Formel (IVA):
in der A¹ und A² jeweils Hydroxygruppen darstellen oder zusammengenommen -O- bedeuten, B¹ und B² zusammengenommen eine Bindung darstellen oder einer Eliminierung zugängliche Gruppen bedeuten, wobei eine Bindung gebildet wird, und entweder:
(i) R&sub1;' und R&sub2;' jeweils einen wie vorstehend definierten nicht-polymeren organischen Rest bedeuten oder einen Rest W; oder
(ii) R&sub1;' und R&sub2;' zusammengenommen einen C&sub3;&submin;&sub5;-Polymethylenrest zur Vervollständigung eines 5-bis 7-gliedrigen alicyclischen Ringes bedeuten oder zusammengenommen einen aromatischen Ring bilden, wobei der alicyclische oder aromatische Ring mit den Resten R&sub4;' und R&sub5;' substituiert ist, die jeweils einen wie vorstehend definierten nicht-polymeren organischen Rest oder einen Rest W bedeuten; mit der Maßgabe, daß mindestens einer
der Reste R&sub1;' und R&sub2;' oder der Reste R&sub4;' und R&sub5;' ein Rest W ist;
mit einer Verbindung PY (Formel IVB), in der P wie vorstehend definiert ist;
in der die Gruppen W und Y in der Lage sind, sich miteinander umzusetzen, wobei eine Brückengruppe R&sub3; geliefert wird;
und danach, wenn A¹ und A² jeweils Hydroxygruppen sind, durch Dehydratisierung des Umsetzungsprodukts und/oder, wenn B¹ und B² einer Eliminierung zugängliche Gruppen bedeuten, indem das Umsetzungsprodukt einer Eliminierung unterworfen wird, hergestellt werden.
Vorzugsweise bedeuten in der Verbindung der Formel (IVA) die Reste A¹ und A² zusammengenommen -O- und die Reste B¹ und B² bedeuten zusammengenommen eine Bindung.
Die Beschaffenheit der Reste W und Y und folglich die angewandten Umsetzungsbedingungen werden durch die zu liefernde Brückengruppe R&sub3; bestimmt.
Wenn die Brückengruppe eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette, die ein wie vorstehend erwähntes Heteroatom enthält, bedeutet, stellen die Reste Y und W jeweils Kohlenwasserstoffketten geeigneter Länge dar, die durch das geeignete nucleophile Heteroatom O, S oder N beendet sind, und eine geeignete Abgangsgruppe, wie Halogenide (vorzugsweise eine Brom- oder Jodgruppe), eine Methansulfonyl- oder 4-Toluolsulfonylgruppe. Wenn die Brückengruppe R&sub3; eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette darstellt, bedeutet der Rest Y ein endständiges nucleophiles Heteroatom an dem Polymeren P und der Rest W stellt die entsprechende durch eine geeignete Abgangsgruppe derivatisierte Kohlenwasserstoffkette dar. Die Umsetzungsbedingungen für den nucleophilen Ersatz der Abgangsgruppe in diesen Fällen sind herkömmlich und werden hauptsächlich durch das Polymer bestimmt werden. So kann, wenn das Nucleophil -O&supmin; darstellt, die Umsetzung in einem beliebigen zum Rückfluß erhitzten nicht-polaren Lösungsmittel unter einer Atmosphäre von trockenem Stickstoff ausgeführt werden, bis die Umsetzung abgeschlossen ist.
Wenn-die Brückengruppe eine einen Amid- oder Esterteil enthaltende aliphatische Kohlenwasserstoffkette darstellt, bedeuten die Reste W und Y jeweils Kohlenwasserstoffketten geeigneter Länge, eine durch eine Carboxylfunktion und die andere durch eine Hydroxyl- oder eine Aminofunktion beendet. Die Umsetzungsbedingungen sind herkömmliche Bedingungen für die Bildung einer Ester- oder Amidbindung, wie Aktivierung der Säure unter nicht-wäßrigen Bedingungen mit einem geeigneten Aktivator, zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid, und anschließende Umsetzung mit dem geeigneten Alkohol oder Amin.
Die Derivatisierung des Polymeren P, wobei eine Verbindung der Formel (IVB) erhalten wird, kann wie die Herstellung einer Verbindung der Formel (IVA) durch herkömmliche Verfahren ausgeführt werden.
Ein besonders geeignetes Reagens der Formel (IV) ist das Anhydrid der Formel (V):
in dem P wie vorstehend definiert ist.
Die Anheftungsart des wasserlöslichen Polymeren (P) an die Bindungsgruppe (L) wird von der chemischen Beschaffenheit des Polymeren abhängen. So besitzt, wenn P Methoxypolyethylenglykol in Formel (V) bedeutet, das Reagens geeigneterweise die Formel (VI):
Wenn das Polymer Polysarcosin ist, besitzt ein geeignetes Reagens die Formel (VII):
In den Formeln (VI) und (VII) sind p und m jeweils solche ganze Zahlen, daß das Molekulargewicht des Polymeren in den vorstehend beschriebenen Bereich fällt.
Andere Polymere müssen in herkömmlicher Weise derivatisiert werden, bevor eine geeignete Verbindung an die Bindungsgruppe hergestellt werden kann.
Ein weiteres geeignetes Reagens der Formel (IV) ist das Anhydrid der Formel (VIII):
in dem P wie vorstehend definiert ist.
Die Anheftungsart der Reste P wird wie vorstehend unter Formel (IV) beschrieben sein.
Das Proteinkonjugat dieser Erfindung wird vorzugsweise als Arzneimittel verabreicht.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel bereit, das das Konjugat der Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Die Zusammensetzungen werden im allgemeinen in der gleichen oder ähnlichen Weise wie die formulierten Proteine per se formuliert werden. Dies kann Tabletten, Kapseln, Cremes, Sirups, Suspensionen, Lösungen, wiederherstellbare Pulver und sterile Formen, die zur Injektion oder Infusion geeignet sind, einschließen. Solche Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Stoffe, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel, Farbstoffe, Aromastoffe, Konservierungsmittel, Auflockerungsmittel und dergleichen gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Verfahrensweisen enthalten.
Das Protein in der Zusammensetzung der Erfindung wird normalerweise in ungefähr der Menge verabreicht werden, in der es herkömmlicherweise verwendet wird. Die mg/kg-Dosierung wird geeigneterweise nach oben eingestellt, um die daran gebundenen Polymermoleküle und die Wirksamkeit und Pharmakokinetik des Konjugats zu berücksichtigen.
Wenn das pharmazeutisch verwendbare Protein (X) ein fibrinolytisches Enzym ist, werden die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung nach Routineverfahren als Arzneimittel formuliert, die zur intravenösen Verabreichung bei Menschen verwendet werden.
Typische Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung sind Lösungen des sterilen Derivates in einem sterilen isotonischen wäßrigen Puffer. Nötigenfalls kann die Zusammensetzung auch einen Lösungsvermittler, um das Konjugat in Lösung zu halten, und ein Lokalanästhetikum, wie Lignocain, einschließen, um den Schmerz am Injektionsort zu lindern. Im allgemeinen wird das Konjugat in einer Einheitsdosierungsform, zum Beispiel als ein trockenes Pulver oder wasserfreies Konzentrat, in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie einer Ampulle oder einem Beutel, geliefert werden, der die Proteinmenge in Wirkeinheiten und auch einen Hinweis auf die Zeit, innerhalb der das freie Protein freigesetzt werden wird, anzeigt. Wenn das Konjugat durch Infusion verabreicht werden muß, wird es mit einer Infusionsflasche abgegeben werden, die steriles 'Wasser zur Injektion' pharmazeutischer Güte oder Kochsalzlösung enthält. Wenn das Konjugat durch Injektion verabreicht werden muß, wird es mit einer Ampulle sterilen Wassers zur Injektion abgegeben. Die injizierbare oder infundierbare Zusammensetzung wird durch Vermischen der Bestandteile vor der Verabreichung zubereitet werden.
Die genaue zu verwendende Dosis und die Art der Verabreichung muß notgedrungen angesichts der Beschaffenheit der Beschwerden gemäß den Umständen durch den die Behandlung überwachenden Arzt entschieden werden. Jedoch wird üblicherweise ein Patient, der wegen eines Thrombus mit einem fibrinolytischen Konjugat behandelt wird, im allgemeinen eine tägliche Dosis äquivalent zu einer Proteindosis von 0,001 bis 3,0 mg/kg des Körpergewichtes entweder durch Injektion in bis zu fünf Dosen oder durch Infusion erhalten. Eine bevorzugte Dosierung ist 50 - 100 mg pro Tag.
Bis jetzt wurde keine Toxizität beobachtet oder innerhalb der vorstehend beschriebenen Dosisbereiche angezeigt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines Leidenden, der ein wie vorstehend definiertes pharmazeutisch verwendbares Protein braucht, bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen nicht-toxischen Menge an Proteinkonjugat der Erfindung an den Leidenden umfaßt.
Vor allem wird ein Verfahren zur Behandlung thrombotischer Erkrankungen bereitgestellt, das eine Verabreichung einer wirksamen nicht-toxischen Menge eines wie vorstehend beschriebenen fibrinolytischen Enzymkonjugats an den Leidenden umfaßt.
Die Erfindung stellt auch ein Konjugat der Erfindung zur Verwendung als therapeutisch wirksamen Stoff bereit. Die Erfindung stellt ferner ein Konjugat bereit, in dem das pharmazeutisch verwendbare Protein ein fibrinolytisches Enzym oder Proenzym zur Verwendung als therapeutisch wirksamer Stoff und vor allem zur Verwendung bei der Behandlung thrombotischer Erkrankungen ist.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
In den folgenden Beispielen ist zu bemerken, daß es zwei mögliche Bindungspunkte für das Protein an der Bindungsgruppe (d.h. die zwei Carboxylfunktionen des Maleinsäureanhydridderivates) gibt und kein Versuch unternommen worden ist, zwischen ihnen zu unterscheiden, obwohl aus praktischen Gründen nur eines der zwei möglichen Isomeren benannt und veranschaulicht worden ist.
In den Figuren:
Figur 1: G3000 SW HPLC-Elutionsprofile (OD&sub2;&sub8;&sub0;)
a) HSA (etwas Dimeres enthaltend)
b) Das PEG-HSA-Umsetzungsgemisch (Beispiel 2)
c) Der PEG-HSA-Peak nach Hydrolyse bei pH 5,0, 37ºC, 2h.
Figur 2: G3000 SW HPLC-Elutionsprofile (OD&sub2;&sub8;&sub0;, ¹²&sup5;J)
a) Urokinase (hohes Molekulargewicht)
b) Das PEG-UK-Umsetzungsgemisch (Beispiel 2)
c) PEG-UK nach 3 tägiger Hydrolyse bei RT - x - x - zeigt das ¹²&sup5;J-Profil.
Figur 3: Analytische HPLC-Gelfiltrationselutionsprofile von:
a) tPA,
b) dem PEG-tPA Konjugat (Beispiel 4),
c) dem Konjugat nach 21 h bei 37ºC und
d) dem Konjugat nach 44 h bei 37ºC.
Die gezeigten, offensichtlichen Molekulargewichte werden aus einer Eichkurve mit Biorad-Standards erhalten.
Figur 4:Zeitverlauf der in vitro-Lyse menschlicher Blutgerinnsel durch Urokinase ( ) und PEG-Urokinase (Beispiel 3. ).
Figur 5: Entfernung der fibrinolytischen Wirkung aus dem Meerschweinchenblutkreislauf.

BEISPIEL 1

Herstellung von 2-(Methoxypolyethylen(5000)glycoxymethylen)-3- methylmaleinsäureanhydrid
(i) Zu 2,3-Dimethylmaleinsäureanhydrid (2,0 g, 15,9 mmol) in wasserfreiem, wiederholt destilliertem Tetrachlorkohlenstoff (30 ml) wurden N-Bromsuccinimid (5,72 g, 32 mmol) und Benzoylperoxid (5 mg) hinzugefügt. Das Gemisch wurde unter Rühren 22 h unter leichtem Rückfluß erhitzt. Die Lösung durfte abkühlen und wurde filtriert und eingedampft, wobei ein braunes Öl (2,97 g) erhalten wurde. Dieses wurde einer Kugelrohr-Destillation (170ºC bei etwa 0,1333 kPa (1 mm Hg)) unterworfen, wobei ein blaßgrünes Öl (1,40 g) erhalten wurde. Durch ¹H-NMR wurde gezeigt, daß dieses zu 85% das gewünschte Monobromderivat ist. Es wurde gefunden, daß auch geringe Spuren dibromierten und nicht bromierten Materials vorliegen, aber da diese nicht sauber entfernt werden konnten, wurde das Material bei weiteren Umwandlungen verwendet, wie es isoliert wurde.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 4,2 (C &sub2; Br-disubstituiertes Material), 4,1 (C &sub2; Br-monosubstituiertes Material), 2,2 (C &sub3;, monosubstituiertes Material), 2,2 (C &sub3; unsubstituiert).
(ii) Getrocknetes Methoxypolyethylenglykol (5000) (11,7 g, 2,34 mmol) wurde unter Rühren zu einem Gemisch von Natriumamid (91 mg, 2,34 mmol) in Benzol (150 ml) hinzugefügt. Das Brommethylanhydrid (480 mg, 2,34 mmol) wurde hinzugefügt. Man ließ die Umsetzung 22 h unter Rückfluß rühren. Nach Abkühlen wurde die Lösung filtriert und Petrolether (600 ml) wurde hinzugefügt. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein Wachs (10 g) erhalten wurde. Durch Differenz-Infrarotspektroskopie wurde gezeigt, daß dieses die gewünschte Verbindung enthält. Es konnte nur wenig oder keine Ringöffnung festgestellt werden. Ein weiterer Strukturbeweis wurde durch Titration einer hydrolysierten Probe mit NaOH erhalten: 1,08 mol Anhydrid/mol PEG wurden festgestellt.

BEISPIEL 2

Herstellung of 2-[ω-Methoxypolyethylenglycoxymethylen]-3- methylmaleyl-Humanserumalbumin

Zu einer Lösung von HSA (Sigma, 20 mg) in 0,1 M Natriumpyrophosphat/HCl, 0,01% Tween 80, pH 7,4 Puffer (2,0 ml) wurde unter Rühren bei Raumtemperatur 2-(Methoxypolyethylen(5000)- glycoxymethylen)-3-methylmaleinsäureanhydrid (400 mg) hinzugefügt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 0,1 H NaOH bei 8,0 gehalten wurde. Nach Beendigung der Basenaufnahme wurde ein Teil durch HPLC-Gelfiltration analysiert. Das veränderte HSA eluierte als breiter Peak, in dem offensichtlichen Molekulargewicht dem Albumin-Dimeren, nämlich 130000, entsprechend (Fig. 1b). Die relevanten Fraktionen wurden vereint.
Die Reversibilität wurde bei pH 5,0 untersucht, da die Entacylierung bei diesem pH-Wert schneller ist. Ein Teil des vereinten Konjugates wurde mit verdünnter HCl auf pH 5,0 eingestellt und bei 37ºC inkubiert. Nach 2 h wurde ein Teil durch HPLC analysiert. Fig. 1c zeigt, daß im wesentlichen eine vollständige Umkehrung erzielt worden ist.

BEISPIEL 3

Herstellung von 2-[ω-Methoxypolyethylenglycoxymethylen]-3- methylmaleyl-Urokinase

(i) Zu einer Lösung von Urokinase (Serono, hohes MG, 1,8 mg/ml) und [¹²&sup5;J]Urokinase (0,2 µCi) in 0,1 M Natriumpyrophosphat/HCl, 0,01% Tween 80, pH 8,0 Puffer (0,5 ml) wurde bei 0ºC unter Rühren 2-(Methoxypolyethylen(5000)glycoxymethylen)- 3-methylmaleinsäureanhydrid (100 mg) hinzugefügt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 0,1 M NaOH bei 8,0 gehalten wurde. In der Plasminogen-Aktivierungsuntersuchung wurde gefunden, daß die Wirkung nach der Umsetzung ca. 44% der ursprünglichen Wirkung beträgt. Die chromogene Substratwirkung war im wesentlichen unverändert. Das Umsetzungsgemisch wurde auf eine Säule (5,1 ml) aus Sepharose 6B CL bei 4ºC aufgetragen und mit 0,1 M NaCl, 0,05 M NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, 0,01% Tween 80, pH 7,4 äquilibriert. Das Konjugat eluierte als breiter nach dem Säulenvolumen eluierender Peak. Die relevanten Fraktionen wurden vereint und das Konjugat wurde tiefgekühlt bei -40ºC gelagert.
Ein Teil des Konjugates wurde durch HPLC-Gelfiltration analysiert. Das Radioaktivitätsprofil zeigte einen breiten mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von ca. 160000 eluierenden Peak (Fig. 2b). Ein Teil des Konjugates, der 3 Tage bei Raumtemperatur inkubiert worden war, zeigte, daß das durchschnittliche Molekulargewicht erheblich abgenommen hatte, beinahe auf das freier Urokinase (Fig. 2c), obwohl eindeutig unter diesen Bedingungen keine 100%ige Umkehrung erhalten wurde.
Eine Umkehrung der Modifikation wurde auch unter Verwendung der Plasminogen-Aktivierungsuntersuchung abgeschätzt. Zu einem Teil des Konjugates wurde Glycerin zu 20% hinzugefügt und die Lösung wurde bei 37ºC inkubiert. Teilmengen wurden in Intervallen untersucht. Die Wiedererlangung der Wirkung folgte ungefähr einer Kinetik erster Ordnung mit einer Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung von 3 x 10&supmin;&sup5; sec&supmin;¹.
(ii) Eine zweite Herstellung wurde wie folgt durchgeführt:
Urokinase (Serono, 5 mg) wurde in dem Pyrophosphatpuffer (1,2 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst und das Reagens in 3 x 250 mg Portionen in ca. 2 Minuten unter Rühren hinzugefügt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 0,5 M NaOH aus einem pH- Stat bei 8,0 gehalten. Nach Beendigung der Basenaufnahme wurde die Lösung auf eine Säule aus Benzamidin-Sepharose (9,5 mm x 11 cm Füllgewicht) äquilibriert mit 0,05 M NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, 0,1 M NaCl, 0,01% Tween 80, pH 7,4 aufgetragen. Nachdem überschüssiges (hydrolysiertes) Reagens eluiert war, wurde der Puffer gegen 0,5 M Arginin, 0,5 M NaCl, 20 mM Trishydroxymethylaminomethan, pH 7,4 ausgetauscht, woraufhin die veränderte Urokinase als ein einzelner Peak eluierte.
Die analytische HPLC zeigte einen breiten Konjugatpeak (durch chromogene Substratuntersuchung der Fraktionen), mit einem offensichtlichen durchschnittlichen Molekulargewicht von 140000.

BEISPIEL 4

Herstellung von 2-[ω-Methoxypolyethylenglycoxymethylen]-3- methylmaleyl-Gewebe-Plasminogen-Aktivator

Eine Lösung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) in 0,02 M NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3 M NaCl, 0,1 M 4-Guanidinobuttersäure, 0,01% Tween 80, pH 7,4 wurde aus kultiviertem menschlichen Melanomzellüberstand durch Zinkchelatchromatographie, Affinitätschromatographie an Lysin-Sepharose, Gelfiltration an Sephadex G25, wiederholte Lysin-Sepharose-Chromatographie, PEG- Dialyse, Gelfiltration an Sephadex G25 und wiederholte PEG- Dialyse auf eine Konzentration von 120000 SU/ml (ca. 1 mg/ml) erhalten. Diese Lösung (1 ml) wurde dann an Sephadex G25M (PD-10, Pharmacia) in 0,1 M Natriumpyrophosphatpuffer, pH 8,0,
der 0,1 M 4-Guanidinobuttersäure und 0,01% Tween 80 (1,5 ml) enthielt, gelfiltriert. Die Lösung wurde kräftig bei Raumtemperatur gerührt und drei 250 mg Portionen von 2-(Methoxypolyethylen(5000)glycoxymethylen)-3-methylmaleinsäureanhydrid wurden in ca. 2 minütigen Intervallen hinzugefügt, wobei der pH- Wert durch Zugabe von 0,2 M NaOH aus einer Autobürette (Radiometer) bei 8,0 gehalten wurde. Nach Beendigung der Basenaufnahme wurde die Lösung bei 4ºC in 0,05 M NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, 0,1 M NaCl, 0,01% Tween 80, pH 7,4 unter Verwendung von Sephadex G25M (2 PD-10-Säulen) gelfiltriert und dann auf eine Säule (9,5 mm x 11 cm Bett) aus Benzamidin-Sepharose, äquilibriert mit dem gleichen Puffer, aufgetragen.
Nachdem überschüssiges (hydrolysiertes) Reagens eluiert war, wurde der Puffer gegen 0,5 M Arginin, 0,5 M Nacl, 20mM Trishydroxymethylaminomethan, pH 7,4 ausgetauscht, woraufhin das veränderte Protein als einzelner Peak eluierte. Die relevanten Fraktionen wurden vereint und in 100 mM NH&sub4;HCO&sub3;, 0 ,2%igem D-Mannit unter Verwendung von 4 PD-10 Säulen entsalzt. Diese Lösung wurde dann gefriergetrocknet.
Das Ausmaß und die Reversibilität der Modifikation wurde durch HPLC abgeschätzt (Fig. 3). Das PEG-t-PA Konjugat eluierte als breiter Peak mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 130000. Nach 21 Stunden bei 37ºC in 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan, 0,9% Nacl, pH 7,4 (9,900 SU/ml) war das Konjugat in großem Ausmaß zu einem offensichtlichen Molekulargewicht von 75000 entacyliert. Nach 44 Stunden war die Entacylierung vollständig.

VERFAHREN

(a) Chromogene Substratuntersuchung

Urokinase wurde gegenüber dem chromogenen Substrat 5-2444 (KabiVitrum, Schweden) bei einer Konzentration von 1 mM in 0,1 M Triethanolamin HCl, pH 8,0 bei 25ºC untersucht. Ein SU ist als die Wirkungsmenge definiert, die bei 405 nm einen ODAnstieg von 0,001/min in 1 ml des Substrates in einer Zelle mit 1 cm Weglänge liefert.

(b) Plasminogen-Aktivierungsuntersuchung

In eine Küvette wurden 10 mM 5-2251 (KabiVitrum, Schweden) in 0,1 M Triethanolamin-Puffer, pH 7,0 (25 µl), 10 mg/ml lys- Plasminogen (KabiVitrum, Schweden und behandelt mit Aprotinin- Agarose) und der Testaktivator in einer geeigneten Konzentration (5 µl) eingebracht. Diese wurden in die Küvette gegeben, ohne daß sich die Lösungen mischen durften. In eine Leerküvette wurden die vorstehenden Lösungen mit Ausnahme des Aktivators gegeben. Die Untersuchung wurde durch Zugabe von 0,1 M Triethanolamin-Puffer, pH 8,0 (1 ml) zu beiden Küvetten eingeleitet und der OD&sub4;&sub0;&sub5;-Wert (Test vs. Blindprobe) überwacht. Die Anfangsneigung eines OD-Plots gegen die Zeit² wurde als ein willkürliches Geschwindigkeitsmaß der Plasminogen-Aktivierung genommen.

(c) γ-Zählung

Dies wurde unter Verwendung eines Packard Auto-gamma-Szintillationsspektrometers ausgeführt.

(d) HPLC

Die analytische Gelfiltrations-HPLC wurde ausgeführt an einer Säule (SW 60 CM) mit TSK G3000 SW, äquilibriert mit 0,08 M Na&sub2;HPO&sub4;/ NaH&sub2;PO&sub4;, 0,32 M NaCl Puffer, pH 7,0, der 20% Ethanol enthielt, unter Verwendung einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,75 ml/min. Die Molekulargewichtseichung wurde mit Standardproteinen von Biorad erreicht.

(e) Untersuchung der Lyse von Humanplasmagerinnseln

Blut (40 ml) wurde freiwilligen Versuchspersonen entnommen und mit 0,1 Volumina 129 mM Trinatriumcitrat gemischt. Plasma wurde durch 15 minütige Zentrifugation bei 1700 g bei 4º hergestellt und das Plasma von 4-6 Versuchspersonen wurde vereint.
Eine Teilmenge (0,5 ml) des Plasmas wurde unter Verwendung von CaCl&sub2; auf eine Endkonzentration von 25 mM recalcifiziert und mit ca. 3,7 x 10³ Bq (0,1 µCi) [¹²&sup5;J]-Fibrinogen ergänzt (doppelt gereinigt durch Ammoniumsulfatfällung aus Material geliefert vom Radiochemical Centre, Amersham; spezifische Radioaktivität 3,7.x 10&sup6; Bq/mg (100 µCi/mg). Das ergänzte Plasma wurde auf einer Nickel-Chrom-Drahtspirale unter Verwendung von 50 µl Rinderthrombin (50 NIH-Einheiten/ml in 0,9%igem NaCl) zum Gerinnen gebracht. Die Blutgerinnsel wurden 30 Minuten bei 25º wachsen gelassen und dann in 6 Volumina 0,1 M Phosphatpuffers, pH 7,6, 1 Stunde bei 4 gewaschen.
Die Blutgerinnsel wurden nach ¹²&sup5;J ausgezählt und dann in 3 - 5 ml homologem Plasma unter Zugabe von Plasminogen-Aktivator, wo angemessen, bis zu 5 Stunden bei 37º inkubiert. Die Lyse wurde durch Zählung von ¹²&sup5;J überwacht, freigesetzt als Fibrinabbauprodukte. Die Ergebnisse werden als die prozentuale Freisetzung radioaktiver Markierung unter Berücksichtigung der Wirkung der Entnahme sequentieller Teilmengen (50 µl) aus dem Inkubationsvolumen ausgedrückt.

(f) Untersuchung der fibrinolytischen Wirkung im Blutkreislauf von Meerschweinchen

Männliche Dunkin-Hartley-Meerschweinchen (350-450 g) wurden mit Urethan (25% w/v Lösung; 6 ml/kg i.p.) anästhetisiert. In eine Halsschlagader wurde zur Blutprobensammlung eine Kanüle eingeführt. In eine Oberschenkelvene wurde zur Injektion von Heparin (50 U/kg i.v.) und der Testverbindung eine Kanüle eingeführt. Etwa 5 min nach der Heparinisierung wurde eine Vor- Dosis-Blutprobe (2 ml) genommen und mit 0,1 Volumina 129 mM Trinatriumcitrat gemischt. Die Testverbindung wurde dann (1 ml/kg) in 10 s injiziert. Weitere Blutproben wurden genau 2, 4, 8, 16, 30, 60 und 90 min später genommen. Die Heparinbehandlung (50 U/kg i.v.) wurde nach der Probe nach 30 min wiederholt, um die Kanülendurchgängigkeit zu erhalten. Alle mit Citrat versetzten Blutproben wurden bis zum Ende jeden Versuchs auf Eis gehalten, dann 15 Minuten bei 4º bei 1700 g zentrifugiert, wobei das Plasma erhalten wurde. Jede Plasmaprobe wurde 200-fach in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, die 0,01% (v/v) Tween 80 enthielt, verdünnt. Teilmengen (30 µl) wurden dann in vierfacher Ausfertigung auf Fibrinplättchen aufgebracht. Die Fibrinplättchen wurden aus 0,4%igem (w/v) menschlichen Fibrinogen (Kabi, Qualität L, Flow Laboratories, Scotland), gelöst in 0,029 M Barbital in 125 mM NaCl, pH 7,4, pipettiert (10 ml) in 10 x 10 cm große, quadratische Plastikschalen (Sterilin) und zur Gerinnung gebracht durch schnelles Mischen mit 0,3 ml Rinderthrombin (50 NIH-Einheiten/ml, Parke-Davis, U.K.), hergestellt. Die Plättchen wurden normalerweise 18-24 h, aber falls erforderlich länger, bei 37º inkubiert und mit wäßrigem Bromphenolblau eingefärbt. Für jede Lysezone wurden zwei zueinander senkrechte Durchmesser unter Verwendung von Vernier-Tastzirkeln gemessen. Der Durchschnitt aller Durchmesser für jede Probe wurde ermittelt und dieser Mittelwert wurde auf die fibrinolytische Wirkung unter Bezug auf eine Eichkurve umgerechnet. Letztere wurde durch Zugabe bekannter Mengen der Testverbindung zu dem Vor- Dosis-Plasma jeden Tieres erhalten. Diese Standards wurden unter Verwendung der gleichen Verfahren und zur gleichen Zeit wie die experimentellen Proben bearbeitet. Zum Aufbau der Eichkurve wurden die Durchmesser (mm) gegen log&sub1;&sub0; der Konzentration der Verbindung aufgezeichnet. Die Plasmakonzentration der Verbindung in jeder experimentellen Probe wurde als ein Prozentsatz der auf Grundlage der gegebenen Dosis und der Annahme von 50 ml Plasma/kg Körpergewicht für jedes Meerschweinchen erwarteten ausgedrückt.

ERGEBNISSE

(a) Fibrinolytische Wirkung in vitro

Ein wie in Beispiel 3 (ii) beschrieben hergestelltes Urokinasekonjugat wurde mit Urokinase in dem vorstehend beschriebenen in vitro Blutgerinnsellysesystem verglichen. Fig. 4 zeigt, daß bei jeder der getesteten Konzentrationen das Konjugat anfänglich weniger wirksam war (etwa 2-fach) als die ursprüngliche Urokinase, aber daß seine Wirkung während des Verlaufs des Experimentes zunahm, vermutlich aufgrund der Freisetzung der Polymerketten. Nach 5 Stunden war das Ausmaß der Lyse im wesentlichen das gleiche für veränderte und unveränderte Urokinase.

(b) Entfernung des Urokinase-PEG-Konjugates in Meerschweinchen

Fig. 5 zeigt die Entfernung von Urokinase und dem in Beispiel 3 (ii) beschriebenen Konjugat aus dem Blutkreislauf von Meerschweinchen. Eindeutig hat die Zugabe von Polyethylenglykol zu der Urokinase eine merklich verzögerte Entfernung verursacht.

Claims

1. Konjugat, umfassend ein über eine reversible Bindungsgruppe an mindestens ein wasserlösliches Polymer gebundenes pharmazeutisch verwendbares Protein, mit der Maßgabe, daß die Bindungsgruppe nicht abgeleitet ist von einem Vernetzungsmittel der Formel (A):

in der Ra und Rb unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einem Wasserstoffatom und Alkylresten mit C&sub5; oder weniger, und A eine Brückengruppe umfaßt,

oder der Formel (B)

in der Rb ausgewählt ist aus einem Wasserstoffatom und Alkylresten mit C&sub5; oder weniger, A eine Brückengruppe umfaßt und x den Wert 2 bis 5 bedeutet.

2. Konjugat, umfassend ein pharmazeutisch verwendbares Protein, nämlich ein fibrinolytisches Enzym oder Proenzym davon, an mindestens ein wasserlösliches Polymer über eine reversible Bindungsgruppe gebunden. 3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2 der Formel (II):

in der X ein pharmazeutisch verwendbares Protein darstellt und der NH-Rest abgeleitet ist von einer proteinischen Aminogruppe in X, und entweder:

(i) R&sub1; und R&sub2; jeweils einen nicht-polymeren organischen Rest oder einen Rest der Formel -R&sub3;-P bedeuten, in der P ein wasserlösliches Polymerisat bedeutet und R&sub3; eine Brückengruppe darstellt; oder

(ii) R&sub1; und R&sub2; zusammengenommen einen C&sub3;&submin;&sub5;-Polymethylenrest zur Vervollständigung eines 5- bis 7- gliedrigen alicyclischen Rings bedeuten oder zusammengenommen einen aromatischen Ring herstellen, wobei der alicyclische oder aromatische Ring mit den Resten R&sub4; und R&sub5; substituiert ist, die jeweils einen nicht-polymeren organischen Rest oder eine Gruppe der Formel -R&sub3;-P bedeuten;

mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; oder der Reste R&sub4; und R&sub5; eine Gruppe -R&sub3;-P ist.

4. Konjugat nach Anspruch 3, wobei einer der Reste R&sub1; und R&sub2; eine Gruppe P-CH&sub2;- bedeutet und der andere eine Methylgruppe ist.

5. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei das wasserlösliche Polymer Methoxypolyethylenglykol ist.

6. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei das pharmazeutisch verwendbare Protein Gewebeplasminogenaktivator oder Urokinase ist.

7. 2-[ω-Methoxypolyethylenglycoxymethylen]-3-methylmaleyl- Humanserumalbumin,

2-Methyl-3- [ω-methoxypolyethylenglycoxymethylen]-maleyl- Humanserumalbumin,

2-[ω-Methoxypolyethylenglycoxymethylen]-3-methylmaleyl- Urokinase,

2-Methyl-3-[ω-methoxypolyethylenglycoxymethylen)-maleyl- Urokinase,

2-[ω-Methoxypolyethylenglycoxymethylen]-3-methylmaleyl- Gewebeplasminogenaktivator oder

2-Methyl-3-[ω-methoxypolyethylenglycoxymethylen]-maleyl- Gewebeplasminogenaktivator.

8. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren die Umsetzung eines pharmazeutisch verwendbaren Proteins mit einem wasserlöslichen polymerhaltigen Reagenz umfaßt, das eine Gruppe umfaßt, die in der Lage ist, sich mit einer Proteinaminogruppe oder einem Derivat davon unter Herstellung einer reversiblen Bindungsgruppe umzusetzen.

9. Arzneimittel, umfassend ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

10. Wasserlösliches polymerhaltiges Reagenz, umfassend eine Gruppe, die in der Lage ist, unter Herstellung einer reversiblen Bindungsgruppe sich mit einer Proteinaminogruppe oder einem Derivat davon umzusetzen, ausgenommen ein Polyalkylenetherpolyolester von Trimellitsäureanhydrid mit der Formel (C):

in der Rc einen Polyalkylenetherrest bedeutet und y eine ganze Zahl von 2 bis 6 darstellt, hergestellt durch Erhitzen eines Gemisches aus Polyalkylenetherpolyol und Trimellitsäureanhydrid auf 200 bis 300ºC, um das bei der Veresterung anfallende Wasser abzudestillieren, und Reagenzien abgeleitet von einem Vernetzungsmittel der Formel (A):

oder der Formel (B):

11. Reagenz nach Anspruch 10 mit der Formel (IV):

in der R&sub1; und R&sub2; gemäß Anspruch 3 definiert sind.

12. 2-[Methoxypolyethylen(5000)glycoxymethylen]-3-methylmaleinsäureanhydrid.

13. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung als therapeutisch wirksamer Stoff.

14. Konjugat nach Anspruch 2 oder einem sich daran anschließenden Anspruch zur Verwendung bei der Behandlung von thrombotischen Erkrankungen.