JPS61155333A - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は製薬上有用な蛋白質の共役物 （ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）に関する。

〔従来の技術〕

蛋白質及び水溶性重合体の共役物は広い範囲の製薬上の
目的に製造されてきている。１個以上の重合体分子の付
着は通常蛋白質と他の巨大分子又は細胞との相互反応を
妨害する効果を有する。従って蛋白質の抗原性又はアレ
ルゲン性が消失するか又は血流からのそのフレアランス
が延長される。

例えばウロキナーゼのプラズマもフレアランスはメトキ
シポリエチレングリコールの不可逆性付着により延長さ
れる。又は共役物は新規な性質を有してもよく例えばヨ
ーロッパ特許オ０，０３８，１５４号は免疫抑制性を有
するポリザルコシンとアレルゲンとの共役物を開示して
いる。

〔発明が解決しようとしている問題点〕クリアランスを
遅延させるか又は抗原性を低下させる蛋白質への重合体
の付着は低分子量の基質に作用する蛋白質通常酵素にと
り最も用いられる。

もし治療上の効果をもたらすために蛋白質が巨大分子又
は細胞に結合した基質へ作用する必要があるならば重合
体の付着がこの相互反応を妨害して活性の損失をもたら
すことが予想されよう。

このような効果はストレプトキナーゼ及びポリエチレン
グリコールについて示されてき工おりその際減少した抗
原性がフィブリン溶解活性の低下によってのみ達成され
た。しばしばたとえもし蛋白質が低分子量の基質に作用
するならば重合体の付着による活性の低下圧出合う。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明によれば可逆的結合基により少くとも１種の水溶
性重合体に結合した製薬上有用な蛋白質よりなる共役物
が提供される。

本明細書に用いられるとき用語「製薬上有用な蛋白質（
ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ　ｕｓｅｆｕｌ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）　Ｊとはヒト又は動物の体に治療的又は
薬理学上の効果をもたらす蛋白質を意味する。

用語「可逆性結合基（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｌｉｎｋ
ｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）Ｊとは臨床上有用な速度で生体内
の条件下で崩壊される結合を意味する。適当には結合基
の崩壊の凝−次速度定数は１０−６〜１０１／秒の範囲
内にあるだろう。

このタイプの共役物は活性蛋白質の徐放性をもたらす。

共役物は一般式（１１ ％式％（１） （式中Ｐは水溶性重合体であり：Ｌは可逆性結合基であ
り：そしてＸは製薬上有用な蛋白質であ８により示され
よう。

こ、のやり方で蛋白質に結合しそして望ましくない性質
（例えば抗原性、早いクリアランス）を除く水溶性重合
体の分子の数は蛋白質の性質に依存しそして通常の方法
により求められうる。しかし重合体分子の可逆性結合に
よる蛋白質の変性の度（即ち蛋白質に結合した重合体分
子の数）は不可逆性重合体蛋白質共役物の場合よりも重
要ではな（・。

それぞれの蛋白質分子はそれ忙付着した１個よりも多い
結合基を有しそしてそれぞれの結合基はそれ罠付着した
１個より多い水溶性重合体を有しよう。

水溶性重合体口の分子量は好ましくは５００〜１０’の
範囲そして最も好ましく　２０００〜２００００の範囲
内罠なければならない。

適当な水溶性重合体口の例はポリアミノ酸又はポリイミ
ノ酸例えばポリサルコシン、ポリ−Ｄ、Ｌ　−アラニン
、ポリヒドロキシプロリン又は多糖類及びそれらの誘導
体例えばデキストラン、ヒドロキシエチルでん粉又はフ
ィブル（Ｆｉｃｏｌｌ）又は銹導されていてもよい合成
重合体例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレン
グリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール又はポリアクリルアミドを含む。

適当には水溶性重合体ヂ）はメトキシポリエチレングリ
コールである。

製薬上有用な蛋白質閃は酵素、前酵素又は非酵素性蛋白
質でよい。

適当な非酵素性蛋白質はインターフェロン、リンホキン
特にインターロイキン−２，スタヒロコツカス、アウレ
ウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）
からのプロティン（Ｐｒｏｔｅｉｎ）　Ａ　、又はホル
モン例えバインシュリン、成長ホルモン又はワクチン例
工ばアレルゲン抽出物で用いられる蛋白質又はウィルス
被覆蛋白質を含む。

製薬上有用な蛋白質（３）が酵素又は前酵素である例は
止血薬に含まれるプロテアーゼ（それらの前酵素ととも
に）、フィブリン分解酵素及びそれらの前酵素、アルギ
ナーゼ、ウリカーゼ、アスノくラギナーゼ、グルタミナ
ーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及び種々の酵素欠
乏疾患にかかつている患者に存在しない酵素例えばヘキ
ソサミニダーゼＡ及びグルコ七しブロシダーゼを含む。

特に好ましい態様において製薬上有用な蛋白質閃はフィ
ブリン溶解酵素（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙ
ｍｅ）又はその前酵素（ｐｒｏ−ｅｎｚｙｍｅ）である
０本明細書に用℃・られる用語「フィブリン溶解酵素」
とはヨーロッパ特許矛０．００９，８７９号（米国特許
矛４２８５９３２号）に規定されている生体内のフィブ
リン溶解活性を示す任意の酵素を意味する。

これらの＃素は組織培養、血液、尿又は組織からの抽出
により又は組み換えＤＮＡ法により製造されよう。

これら酵素の例は組織プラスミノーゲン活性剤例えばメ
ラノーマプラスミノーゲン活性剤を含むプラスミノーゲ
ン活性剤、ウロキナーゼ（高分子量及び低分子量の両者
及び単鎖の形）、そしてストレプトキナーゼとプラスミ
ンとの複合体である。

適当な前酵素は前ウロキナーゼ及び前組織プラスミノー
ゲン活性剤を含む。

フィブリン溶解酵素及びその前酵素として上記に規定さ
れた製薬上有用な蛋白質の群は又以下のものを含む。

（ａ）　　ヨーロッパ公開出願２０１５５３８７号に開
示されたフィブリン溶解活性ハイブリッド蛋白質； ｔｂｌ　　ヨーロッパ公開出願矛０１５５３８８号に開
示されたフィブリン溶解酵素の訪導体：そして（ｃ）　
　ヨーロッパ公開出願オ０１５２７３６号に開示された
蛋白質共役物。

フィブリン溶解酵素は任意にヨーロッパ特許矛０．００
９，８７９号（米国特許才４２８５９３２号）に記載さ
れたようにそれらの活性中心でブロックされていてもよ
い。

結合基山）はその結合が臨床上有用な速度で生体内の条
件下で破壊されるようなものである。

結合基■の開裂は加水分解くより又は分子間再配置によ
り生じよう。それは結合基（υそれ自体の中で又は重合
体と又は蛋白質との結合基−の境界で生じよう。

好ましくは開裂は未変性の蛋白質を生じさせなければな
らない。

適当な結合基（口は置換されたマレイン酸に基く。

形成された共役物は一般式（■） Ｒ，Ｒ。

〔式中Ｘは前記同様でありセしてＮＨ部分はＸの蛋白質
アミノ基から誘導され：そして （１）几及びＲ，はそれぞれ非重合性有機基又は式−Ｒ
９−Ｐ（式中Ｐは前記同様でありＲ８は橋かけ基である
）の基であるか：又は （ａｔ　Ｒｔ及びＲｔは一緒になってＣ３）ポリメチレ
ンであって５−〜７−員脂環族環を完成するか又は−緒
になって芳香族環を完成しその際脂環族又は芳香族の環
は基ル及びＲｓ（式中それぞれ非重合性有機基又は式−
Ｒ，−Ｐの基である）Ｋより置換され： そしてＲ３及びＲ１の少くとも１個又はＲ４及びＲ５の
少くとも１個は基−Ｒ，−Ｐである〕□により示されう
る。

ｐ　Ｈ７，４及び３７℃の生理学的な条件を含む中性及
び酸性溶液中で式（ＩＩ）の共役物中のＣｏ−ＮＨ結合
は隣接するカルボキシル基により促進される方法により
加水分解されそれにより未変性の蛋白質を生じさせる。

脱アシル化の速度は二重結合に近い原子に依存しその性
質は脱アシル化速度が劣ったように変化されないならば
重要ではない。

適当な橋かけ基几の例は直鎖又は枝分れ鎖のＣ３〜１゜
脂肪族炭化水素鎖を含みそれは任意にアミン又はエステ
ル部分により又は酸素、硫黄又は窒素から選ばれる少く
とも１個のへテロ原子により中断又は終了してもよく任
意に０１〜６アルキル基により置換されてもよい。

好ましくは凡は二重結合に隣接した電子供与部分例えば
メチレンを含む。

適当な基−Ｒ，−Ｐの例はＰ−（ＣＨ−一、ｐｏに９−
９ｎ　　　　　　　　　　　　　　ｎ ＰＯ−、Ｐ　（ＣＨ，）。Ｏ、ＰＣＨ（ＣＨＪ）、ＰＣ
（ＣＨｓ）２　。

ＰＯＣＣＨ（Ｃｌ−１３）−又はＰＯＣ（ＣＨｓ）ｚ　
　（式中ｎは１〜６の整数である）を含む。

Ｒｔ　、Ｒ１、Ｒ４及び馬に関する適当な非重合性有機
基は任意にＣ７〜、アルキル基により置換されていても
よくδ句素、硫黄又は窒素から選ばれたヘテロ原子によ
り中断又は末端におかれてもよい脂肪族Ｃ１〜、。炭化
水素基を含む。

好ましくは非重合性有機基は二重結合に隣接する電子供
与部分例えばメチレン又はメチルを含む。

Ｒ，、Ｒ，、Ｒ４及びＲｓに関するこれらの基の例は＆
。

Ｒ４−〇−又は（Ｒ，）、Ｎ−（式中＆は直鎖又は枝分
れ鎖のＣ３〜６　アルキルである）を含む。

特ＫＲ，，Ｒ，，Ｒ４又はＲｓはＣＨ，、ＣＨ，ＣＨ，
−。

（Ｃ）ＬＪ２ＣＨ−、ＣＨｓＣＨ，ＣＨ，−、（Ｃ職、
Ｃ−、ＣＨＪＯ−。

ＣＨｓＣＨ２０−又は（ｃｌｔＮ−であろう。

Ｒ，及びＲ１がそれぞれ非重合性有機基又は前述の式−
Ｒ，−Ｐの基であり少くとも１個のＲ８及び馬が基−Ｒ
，−Ｐである式（■Ａ）の式（ＩＩｌ内の共役物の下位
群がある。

式（ｆｆＡ）の共役物に好ましくはＲ１及びＲ１の１個
は基Ｐ−ＣＨ，−であって他はメチルである。

Ｒ７及びＲ７が一緒に結合している式（［Ｉ）の共役物
の例は式（ＪＩＢ） （式中ｊ、Ｓ及びｔはそれぞれ独立して０，１又　。

は２であってｒ　＋　ｓ　＋　Ｌは０より大きくセして
４より小さく即ち１〜３の整数でありル及びＲ５は前記
同様である） の環状構造を含む。

又Ｒ１及びＲ７は一緒に結合して芳香族構造を形成しよ
う。式（川のこのような共役物の例は式（ＩＩＣ）（式
中＆及びＲ３は式（ｆｆ）に関して規定した通りである
） の共役物を含む。

式（■Ｂ）及び（ＩＩｃ）の山又はＲ４１Ｃ関するこの
ような非重合性有機基は式（ＩＩ）　Ｋついて上述した
ものを含む。

さらに本発明によれば蛋白質アミノ基又はその誘導基と
反応して前述の可逆性結合基を形成しうる基よりなる水
溶性重合体含有試薬と製薬上有用な蛋白質とを反応させ
ることよりなる前記の共役物を製造する方法が提供され
る。

重合体含有試薬は式（ｍ Ｐ　−Ｌ’　　　　（２） （式中Ｐは前記同様でありそしてＬｌは前述の如く結合
基−を形成しうる基である） により示されよう。

共役物を製造するのに用いられる条件は重合性試薬及び
蛋白質の性質及び形成される結合の安定性に依存しそし
て当業者に明らかであろう。

適当には蛋白質は好ましくは中程度のアルカリ性ｐＨ例
えばｐ　Ｈ７，０〜９．５及び０〜４０℃の範囲内の温
度で水性緩衝液中に溶解される。ｐＨは反応中手動又は
自動の何れかでもし必賛ならば酸又は塩基の添加九より
コントロールされよう。

用いられる水溶性重合体含有試薬〔式（（２）〕の量は
蛋白質に付着するよ５になる重合体分子の数をきめる。

少くとも１モル過刺の試薬〔式（至）〕を加えなければ
ならない。

反応が完了した後過剰の試薬及び望ましくない反応生成
物は除去さねよう。適当な除去法は硫酸アンモニウム沈
でん、透析、透析濾過又は多数のクロマトグラフィ法例
えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相
互反応クロマトグラフィ又はアフイニテイクロマトグラ
フイを含む。

フィブリン溶解酵素及び他のセリンプロテアーゼについ
てベンズアミジンセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
のアフイニテイクロマトグラフイが特に好ましい方法で
ある。

フィブリン溶解酵素についてそれらの活性中心の任意の
ブロッキングが重合体共役反応の前又は後に行われよう
。

式（１１）の共役物に示された結合のタイプは適当には
式憫 Ｒ＋　　　　Ｒｔ （式中Ｒ３及びＲ７は前記同様である）の試薬と製薬上
有用な蛋白質のアミノ基との反応により得られる。

蛋白質アミノ基は原則として何れかのカルボニル基と反
応するので形成された式（［１の共役物がもしＲ＋　＝
　Ｒ１ならば結合で異性を示すことは理解されよう。

式（＠及び■の試薬は新規でありそしてそれ自体本発明
の一部を形成する。

〔式中Ａ１及びＡ２はそれぞれヒドロキシ基であるか又
は−緒になって一〇−でありＢ′及びＢ！は一緒になっ
て結合であるか又は結合を形成するため除去可能な基で
ありそして （＋＞　　Ｒ’、及びＲ２はそれぞれ前述の非重合性有
機基又は基Ｘであり：又は （ｉｔ　　ｐ、及び馬は一緒になってＣ１〜、ポリメチ
レンとなって５−〜７−員脂環族環を完成するか又は−
緒になって芳香族環を完成しその際脂環族又は芳香族の
環は基也及びＲ′、（それぞれ前述の非重合性有機基又
は基Ｘである）により置換され少くとも１個のＲ′、及
びＲ′、又は少くとも１個のＲ％及びＩ（′、は基Ｘで
ある〕 の化合物と化合物ＰＹＣ式■Ｂ）（式中Ｐは前記同様で
あり：基Ｘ及びＹは一緒に反応して橋かけ基Ｒ５を形成
し５る基である） とを反応させ： そして次にＡＩ及びＡ２がそれぞれヒドロキシのとき反
応の生成物を脱水する及び／又はＢ′及びＥＦが除去可
能な基のとき反応の生成物を除去することにより製造さ
れよう。

好ましくは式（ＩＶＡ）の化合物において基ＡＩ及びＡ
！は一緒罠なって一〇−でありそして基Ｂ′及びＢ２は
一緒になって結合である。

基Ｘ及びＹの性質及び従って用いられる反応条件はもた
らされる橋かけ基Ｒ１により決められる。

橋かけ基が前述のへテロ原子を含む脂肪族炭化水素鎖の
とき基Ｙ及びＸはそれぞれ適切な長さの炭化水素鎖であ
ってそれぞれ適切な求核性へテロ原子Ｏ１Ｓ又はＮ及び
適当な脱離基例えばハロゲン（好ましくは臭素又は沃素
）、メタンスルホニル又は４−トルエンスルホニルを末
端忙有する。

橋かけ基現が脂肪族炭化水素鎖のとき基Ｙは重合体Ｐ上
の末端求核性ヘテロ原子でありそして基Ｘは適当な脱離
基により誘導された対応する炭化水素鎖である。これら
の場合の脱離基の求核性置換の反応条件は従来性われて
いるものでありそして主として重合体により決定されよ
う。それ故求核基が一〇であるとき反応は反応が完了す
るまで乾燥窒素の雰囲気下任意の非極性溶媒中で行われ
よう。

橋かけ基がアミド又はエステル部分を含む脂肪族炭化水
素鎖のとき基Ｘ及びＹはそれぞれ適切な長さの炭化水素
鎖であり末端の一つはカルボキシル基であり他はヒドロ
キシル又□はアミノ基である。

反応条件はエステル又はアミド結合の形成に従来用℃・
られている条件であり例えば適当な活性剤例えばジシク
ロへキシルカルボジイミドにより非水性条件下で、酸を
活性化しセして次に適切なアルコール又はアミンと反応
させる。

式（ＩＶｎ）の化合物を得る重合体Ｐの誘導体化は式（
ＩＶＡ）の化合物の製造と同じ〈従来性われている方法
により行われよう。

式（ｒｖ）の特に適当な試薬は式（■ （式中Ｐは前記同様である） の無水物である。

結合基（Ｌ＋への水溶性重合体田）の付着の態様は重合
体の化学的な性質に依存しよう。従ってもしＰが式Ｍの
メトキシポリエチレングリコールナラば試薬は適当には
式（四 のものである。

もし重合体がポリザルコシンのとき適当な試薬のもので
ある。

式鏝及び（１においてｎ及びｍはそれぞれ重合体の分子
量が上述の範囲内に入るような整数である。

他の重合体は結合基への適当な接続がなされうる前に従
来性われている方法で誘導体化されねばならないだろう
。

式Ｍの他の適当な試薬は式（■） ＼Ｏ／ （式中Ｐは前記同様である） の無水物である。

Ｐ基の付着の態様は式（５）について前述した通りであ
ろう。

本発明の蛋白質共役物は好ましくは製薬組成物として投
与される。

従って本発明は又製薬上許容される担体と組み合わされ
た本発明の共役物よりなる製薬組成物を提供する。

組成物は一般に処方された蛋白質それ自体と同−又は同
様な方法で処方されよう。これは錠剤。

カプセル、クリーム、シロップ、懸濁液、溶液。

再生可能な粉末及び注射又は潅流に適した滅菌物を含む
だろう。このような組成物は従来行われている製薬上の
実際上のやり方に従って製薬上許容しうる物質例えば希
釈剤、結合剤１着色剤、香料。

保存剤、崩壊剤などを含みうる。

本発明の組成物中の蛋白質は通常それが従来用いられる
量に近い量で投与されよう。Ｗ１ｋｇ投与量はそれに結
合した重合体分子及び共役物の能力及びファマーコキネ
テイツクスを考慮に入れて適切にそれより多く調節され
る。

製薬上有用な蛋白質■がフィブリン溶解酵素のとき本発
明による組成物はヒトへの静脈内投与に適した製薬組成
物と同じ〈従来行われ℃いる方法に従って処方される。

代表的には静脈内投与用の組成物は滅菌等優性水性緩衝
液中の滅菌誘導体の溶液である。必要ならば組成物は又
共役物を溶液として保つ溶解剤及び注射の部位の痛みを
和らげる局所麻酔剤例えばリグノカインを含んでもよい
。一般に共役物は単位投与物の形で投与されそして例え
ば遊離の蛋白質が遊離される時間を指示すると同時に活
性単位で蛋白質の量を示す熱的にシールされた容器例え
ばアンプル又はパック中の乾燥粉末又は水のない濃縮物
である。共役物が潅流により投与されるときそれは滅菌
の製薬上の品質「注射用水」又は生理食塩水を含む潅流
風により供給されよう。共役物が注射により投与される
ときそれは注射用の滅菌水のアンプルにより供給されよ
う。注射用又は潅流用の組成物は投与前に成分を混合す
ることにより作られよう。

投与の正確な量及び投与の態様は治療を行う医者による
ｉｓ’）−に従って必ず患者の状態に応じて決定されね
ばならない。しかし、一般にフィブリン溶解共役物によ
り血栓症を治療する患者は一般に止流罠より又は５回以
内の注射によりｏ、ｏｏｉ〜３、　Ｏｍｙ／に９体重の
蛋白質共役物等しい１日当りの投与量を得る。好ましい
投与量は５０〜１００■７日である。

どんな毒性も認められなかったし又は上述の投与範囲で
は示されない。

本発明の他の態様によれば患者に有効且非毒性の量の本
発明の蛋白質共役物を投与することよりなる前述の製薬
上有用な蛋白質を必要とする患者を治療する方法が提供
される。

特に患者に有効且非毒性量の前述のフィブリン溶解酵素
共役物を投与することよりなる血栓症疾患を治療する方
法が提供される。

本発明は又活性の治療物質として用いられる本発明の共
役物を提供する。本発明はさらに製薬上有用な蛋白質が
活性治療物質として用いられそして特に血栓症疾患の治
療に用いられるフィブリン溶解酵素又は前酵素である共
役物を提供する。

〔実施例〕

下記の実施例は本発明を説明する。

下記の実施例において結合基において蛋白質について２
個の潜在的な結合点（即ち無水マレイン酸誘導体の２個
のカルボキシル基）が存在することに注意すべきであり
、そして簡便のために２個の潜在的異性体の中１個のみ
が名指しされそして説明されているが両者の間を区別す
る試みはなされなかった。

添付書面において 矛１図：　Ｇ３０００　　ＳＷ　ＨＰＬＣ溶離プロフィ
ル（ＯＤ２Ｓ。） ａ　）　Ｉ　Ｓ　Ａ　（若干の二量体を含む）ｂ　）Ｐ
ＥＧ−Ｈ８Ａ反応混合物（実施例２）Ｃ）ｐＨ５，０，
３７℃、２時間の加水分解後のＰＥＧ−Ｈ８Ａビーク。

矛２図：　Ｇ３０００　　ＳＷ　ＨＰＬＣ溶離プロフィ
ルＣＯＤ２．、　”Ｉ　） ａ）ウロキナーゼ（高分子量） ｂ）ＰＥＧ−ＵＫ反応混合物（５ｉＩ！施例２）ｃ）３
日間ＲＴで加水分解後のＰＥＧ−ＵＫ。

−ｘ　−ｘは１２Ｓｉプロフイルを示す。

オ３図：下記の分析ｈｐｌｃゲル濾過溶離プロフィル： ａ）ｔＰＡ ｂ）ＰＥＧ−１ＰＡ共役物（実施例４）Ｃ）３７℃２１
時間後の共役物 ｄ）３７℃４４時間後の共役物。

見掛は上の分子量はバイオランド（Ｂｉｏｒａｄ）　　
標準物による較正曲線から求められる。

矛４図：ウロキナーゼー）及びＰＥＧ−ウロキナーゼ（
実施例３．・）による生体外のヒト血塊溶解の時間の経
過。

第５図：モルモットの血流からのフィブリン溶解活性の
クリアランス。ＯはＰＥＧ−ウロキナーゼ（実施例３）
（ＩＩ＝４）であり、Δはウロキナーゼ（ＩＩ＝４）で
ある。

実施例１ ２−（メトキシポリエチレン（５０００）グリコキシメ
チレン）−３−メチル無水マレイン酸の製造 （１）乾燥且再蒸留した四塩化炭素（３０ｍ　）中の２
．３−ジメチル無水マレイン酸（２，０，９，１５，９
ｍモル）ｔｃＮ−プロモサクシンイミド（５，７２，ｐ
。

３２ｍモル）及び過酸化ベンゾイル（５Ｉ９）を加えた
。撹拌した混合物を２２時間温和な還流上加熱した。溶
液を放置して冷却しそして濾過蒸発させて褐色の油（２
，９７９）を得た。これをバルク対バルクの蒸留（１ｍ
Ｈｇ、ｔ７ｏ℃）Ｋかけて淡緑色の油（ｔ４ｏ、９）を
得た。これはＩ　Ｈｎｍｒ　Ｋより〜８５％の所望のモ
ノブロモ誘導体であることが示された。少量の痕跡のジ
ブロモ化及び未ブロモ化物質が又存在していることが分
ったがこれらは容易に除去され得ないので物質は他の変
換において単離されて用いられた。

１Ｈｎｍｒ（ＣＤＣＩｓ　）　Ｊ　４．２　（ＣＨ１Ｂ
ｒジ置換物質）。

４、１　（ＣＨｙ　Ｂｒモノ置換物質）、λｚ（Ｃｆｉ
、　　モノ置換物質）、１２（ＣＨＪ未置換）。

（ｌｌ）乾燥したメトキシポリエチレングリコール（５
０００）（１１，７９，１３４ｍモル）をベンゼン（Ｉ
ｓｏｍｔ）中のナトリウムアミド（９１１９゜２３４ｍ
モル〕の撹拌した混合物に加えた。フ゛ロモメチル無水
物（４８０ｍ９．７−３４ｍモル）を加えた。反応物を
２２時間還流下撹拌した。冷却して溶液を濾過し石油エ
ーテル（６ｏｏｍ）を加えた。沈でんした固体を濾過し
減圧乾燥してワックス（１ｏｊｉ　）を得た。これは位
相差赤外線分光分析により所望の化合物を含有すること
が示された。

少しの又は全く開環は検知されなかった。構造の他の特
徴はＮａＯＨによる加水分解されたサンプルの滴定によ
り求められた。１．０８モル無水物１モルＰＥＧが検知
された。

実施例２ ２−〔ω−メトキシポリエチレングリコキシメチレン〕
、３−メチルマレイル−ヒト血清アルブミンの製造 室温において０．１　Ｍピロ燐酸ナトリウムアミドＩ。

０．０１％ツウイー７　（Ｔｗｅｅｎ）　８０　、　ｐ
　Ｈ７，４緩衝液（ｚｏｄ）中のＨＳＡ（ジグ−ｖ　（
Ｓｉｇｍａ）、２０１Ｑ〕の撹拌した溶液に：２−（メ
トキシポリエチレン（ｓｏｏｏ）グリコキシメチレン）
−３−メチル無水マレイン酸（４０ｏ＊）を加え０．１
　Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＨの添加によりｐＨを＆０に保った。

塩基の吸収が終った後に一部をＨＰＬＣゲル濾過により
分析した。変性したＨＳＡがアルプミンニ量体の見掛は
上の分子量即ち１３０，０００　　に相当する広（・ピ
ークとして溶離した（矛１ｂ図）。

関係のある画分を集めた。

脱アシル化がｐ　Ｈ５，０で一層早いので可逆性をｐ　
Ｈｓ、　ｏで調べた。共役物の集りの一部を希ＨＣＩＫ
よりｐＨ５：　、０・に調節し３′７℃に置いた。２時
間後一部なＨＰＬＣにより分析した。矛１ｃ図は殆んど
完全な可逆性が達成されたことを示す。

実施例３ ２−〔ω−メトキシポリエチレングリコキシメチレン〕
、３−メチルマレイル−ウロキナーゼの（＋）　　Ｏ″
Ｃにおいてｏ、ＩＭＭｏａ燐酸ｆ　ト！Ｊ　ウム／ＨＣ
１，ｏ、ｏ１％ツウィーン８０＊ｐＨ＆Ｏ緩衝液（０，
５＊　）中のウロキナーゼ〔七ロノ（Ｓｅｔｏｎｏ）　
ｅ高分子量、　１．８　ｑ／ｌｄ　）及び［”Ｉｌウロ
キナニゼ（０，２μＣｉ）の撹拌した溶液ＶＣ２−（メ
トキシポリエチレン（５００Ｇ）グリコキシメチレン）
−３−メチル無水マレイン酸（１００〜）を加え０．１
ＭＮａＯＨの添加によりｐＨを８．　Ｏ［保った。反応
後プラスミノーゲン活性化定量の活性は元の活性の約４
４％であることが分った。発色基質活性は殆んど変化し
なかった。反応混合物を４℃でセファロ−ス（５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　）　６　Ｂ　ＣＬのカラム（５，１１／　
）　Ｋ適用しセしてα２　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１＋　０．０
５Ｍ　　ＮａＨＩＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、０，０１％
ツウイーン８０゜ｐ　Ｈ７，４により平衡化した。共役
物はカラムの容量後溶離する広いピークとし【溶離した
。関連のある画分な集めそして共役物を一４０℃で凍結
保存した。

共役物の一部をＨＰＬＣゲル濾過により分析した。放射
能プロフィルは約１６０，０００　　の見掛は上の分子
量で溶離する広いピークを示した（矛２ｂ図）。３日間
室温く置かれた共役物の一部は平均分子量が殆んど遊離
のウロキナーゼのそれに！ｉ！質的に低下したが（才２
Ｃ図）明らかにこれらの条件下では１００％の可逆性が
得られなかった。

変性の可逆性は又プラスミノーゲン活性定量を用いても
定量された。共役物の一部に２０％になるようにグリセ
ロールを加えそして溶液を３７℃に置いた。一部ずつを
間隔を置いて定量した。活性の回収は３　Ｘ　１０”’
／秒の凝第−次速度定数の大略オー次速度論に従った。

（ＭＩ　　二番目の製造は次の如く行われた。

ウロキナーゼ（七ロノ、５■）を室温でピロ燐酸塩緩衝
液（１，２ｍ１）Ｋ溶解させそして試薬を撹拌しつつ約
２分間にわたって３ｘｚｓｏａｐずつ加えたｏ　ｐＨを
０．５Ｍ　ＮａＯＨの添加により＆Ｏに保った。塩基の
吸収が終った後に溶液なｏ、ｏｓＭＮａＨｔＰＯａ　／
ＮａｖＨＰ　０４．０．１　Ｍ　ＮａＣ１、０，０１％
ツウイーン８０　ｐ　Ｈ７，４Ｋより平衡されたベンズ
アミジンセファロースのカラム（９，５１＋１Ｘ１１ｃ
ＩＴＬベッド重量）に適用した。過剰（加水分解された
）の試薬を溶離した後緩衝液を０．５Ｍアルギニン。

０、５Ｍ　　ＮａＣ１，２０ｍＭ　）　Ｕｘｔ：　）−
ｏ＊シメｆルアミノメタン、　ｐ　Ｈ７，４に変えると
変性したウロキナーゼが単一のピークとして溶離した。

分析用ＨＰＬＣは見掛は上の平均分子量１４０．０００
を有する広い共役されたピーク（画分の発色基質定量に
よる）を示した。

実施例４ ２−〔ω−メトキシポリエチレングリコキシメチレン〕
、３−メチルマレイル−組織プラスミノーゲン活性剤ｏ
、　０２　Ｍ　ＮａＨｔＰＯｉ／ＮａｔＨＰＯ＜　、　
０．３Ｍ　ＮａＣ１，０，１Ｍ　４−グアニジノ酪酸、
　０．０１％ツウイーン８０．ｐＨ７，４中の組織プラ
スミノーゲン活性剤（ｔ−ＰＡ）の溶液を亜鉛キレート
クロマトグラフィ、リジン・セファロース上のアフイニ
テイ・クロマトグラフィ、セファデックスＧ２５のゲル
濾過、再びリジン・セファロースクロマトグラフィ、Ｐ
ＥＧ透析、七７アデツクスＧ２５のゲル濾過そして再び
ＰＥＧ透析により培養されたヒトメラノーマ細胞上澄み
液から濃度１２０，０００ＳＵ／Ｒ／（約１　ｒｎｇ／
ｍｌ　）で得た。この溶液（１ｒｎｌ　）を次にセファ
デックス０２５Ｍ（ＦＤ−１０，７アーマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）］でゲル濾過して０．１　Ｍ　４−グア
ニジノ酪酸及び０．Ｏ１％ツウイーン８０を含む０．１
Ｍピロ燐酸ナトリウム緩衝液ｐｉ（ａ、０（１，５ｍ）
へ落した。溶液を室温で充分に撹拌しセして２−（メト
キシポリエチレン（ｓｏｏｏ）グリコキシメチレン）−
３−メチル無水マレイン酸を２５０ダずつ３回約２分間
の間隔で加えその間オートビューレット〔ラジオメータ
（Ｒａｄ　１ｏ−ｒｎｅｔｅｒ）：１から０．２　Ｍ　
ＮａＯＨの添加によりｐ）ｉを＆０に保った。塩基の吸
収が終った後に溶液をセファデックス０２５Ｍ（２本の
ＰＤ−１０カラム）を用いて４℃でゲル濾過して０．０
５　Ｍ　ＮａＨｔＰＯｉ／ＮａｔＨＰＯｉ　。

０、１　Ｍ　ＮａＣ１，α０１％ツウイーｙ　８０　、
　ｐ　Ｈ７，４に入れ次に同じ緩衝液により平衡にした
ベンズアミジン七７アロースのカラム（９，５ｍＸ　１
１ＧＫベツド）に適用した。

過剰の（加水分解されたン試薬を溶離した後緩衝液を０
．５Ｍアルギニｙ　、　０．５Ｍ　ＮａＣ１，２０ｒｒ
Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタンｐ　Ｈ７，４へ
変えると変性した蛋白質が単一のピークとして溶離した
。関連のある両分を集めそして４本のＦＤ−１０カラム
を用いて１００　ｍＭ　ＮＨ４ＲｅＯ４、０，２％Ｄ−
マニトールヘ脱塩した。この溶液を次Ｋｇ結乾燥した。

変性の程度及び可逆性はｈｐｌｃ　Ｖｃより定量した（
才３図）。ＰＥＧ−ｔ−ＦＡ共役物が広いピークとして
溶離しその見掛は上の分子量は１３０，０００であった
。０．１　Ｍ　）リスヒドロキシメチルアミノメタン、
０．９％ＮａＣＪ　、　ｐ　Ｈ７，４（９，９００ＳＵ
／ｌｊ）中で３７℃で２１時間後共役物は高度に脱アシ
ル化されて見掛は上の分子量は７５．０００となった。

４４時間後脱アシル化は完了した。

方法 （ａ）　　発色基質定量 ウロキナーゼは２５℃で０．１　Ｍ　）リエタノールア
ミンＨＣＩ　　Ｅ）ＨｌＯ中の１ｍＭｆ）濃度で発色基
質Ｓ−２４４４（カビビト、ラム（Ｋａｂ　ｉＶｉ　ｔ
ｒｕｍ）　。

スウェーデン〕について定量された。ＳＵはｌα路長セ
ル中で１ｄの基質中の０．００１７分の４０５ｎｍでの
ＯＤ増大をもたらす活性の量とし、て規定される。

（ｂ）　　プラスミノーゲン活性 キュベツト忙０．　Ｉ　Ｍ　トリエタノールアミン緩衝
液ｐＨ７，０（２５ＪＪ）中の１０ｍＭＳ−２２５１（
カビビトラム、スウェーデン）、１０９／ｄのリス（ｌ
ｙｓ）−プラスミノーゲン（カビビトラム、スウェーデ
ンそしエアプロチニン・アガロースにより処理）及び適
当な濃度（５μ））のテスト活性剤を入れた。これらを
溶液を混合させることなくキュベツトに加えた。ブラン
クのキュベツトに活性剤以外の上記の溶液を加えた。両
方のキュベツトに０．１　Ｍ　）リエタノールアミン緩
衝液りＨ８，０（１１１Ｌｔ）の添加により定量を開始
しセしてＯＤ４゜、（テスト対プ２ンク）を調べた。（
時間）２に対するＯＤのプロットの最初のスロープはプ
ラスミノーゲン活性の速度の目安として取られた。

（ｃ）　　ｒ−カウント これはパラカード（Ｐａｃｋａｒｄ）自動ガンマシンチ
レーションスペクトロメーターを用いて行われた。

（ｄ）ＨＰＬＣ 分析用ゲル濾過ＨＰＬＣは０．７５　ｄ　７分の流速ヲ
用いて２０％エタノールを含む０．０８ＭＮａＪＰＯ＜
／ＮａＨ！ＰＯ＊　０．３２　Ｍ　　ＮａＣ１緩衝液ｐ
Ｈ７，０により平衡にされたＴＳＫＧ　３ｏｏＯＳＷの
カラム（５Ｗ６０Ｃ’Ｍ）Ｋより行われた。分子量の測
定はバイオランドからの標準蛋白質について行った。

（ｅｌ　　ヒトプラズマ血塊溶解 血液（４０ｙｔｌ　）をヒト志願者から採りそして０．
１容量のｔｚｓｍＭ＜えん酸三ナトリウムと混合した。

プラズマは４℃で１５分間１７００ｇでの遠心分離によ
り作成しそしｃ４〜６人の志願者からのプラズマを集め
た。

プラズマの一部（０，５ｘｉ　）をＣａＣ１１を用いて
再びカルシウム化してｚｓｍＭの最終濃度としそして約
０．１μＣｉ（’″工〕−フィブリノーゲン〔ザ・ラジ
オケミカル１１センター（ｔｈｅ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌＣｅｎｔｒｅ）　＋エムステルダムにより供給
される材料の硫酸アンモニウム沈、でんにより再Ｍａ：
比放射能ＺｏｏμＣｉ／ダ〕を加えた。補足されたプラ
ズマを５０１ＬｅのオウシトＱ７ピｙ　（０，９％Ｎａ
ＣＪ中５ＯＮＩＨ単位／ｍ）を用いてニッケル・クロム
ワイヤーコイルへ塊まらせた。血塊を３０分間２５℃に
置き次に１時間４°で６容量の０．１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐ
　Ｈ７，６中で洗った。

血塊なｌ”■についてカウントし次に適当にプラスミノ
ーゲン活性剤を加えて５時間以内３７°で３〜５ｄの均
質なプラズマをインキュベートした。

溶解はフィブリン劣化生成物として放出される１！″Ｉ
をカウントすることにより調べた。インキュベーション
容量から一連の部分（ｓｏｎ）を採る効果を差し引いて
ラジオレベルの放出％として表示される。

げ）　モルモットの血流中のフィブリン溶解活性の定量 オスのダンキン・ハートレイ（Ｄｕｎｋｉｎ　Ｈａｒｔ
ｌｅｙ）モルモット（３５０〜４ｓｏ、９）をウレタン
（２５％Ｗ／　Ｖ　１ｇ液；　６　ｄｌ　ｋｇ　ｉ、ｐ
、）　Ｋ　ヨリ麻ｅした。１本の頚動脈を血液サンプル
の採取のためにカニュレートした。１本の大褪靜脈をヘ
パリン（５０Ｕ　／　ｋｌ　、　ｉ、ｖ、）及びテスト
下の化合物の注射のためにカニエレートした。ヘパリン
処理約５分後に投与前の血液サンプル（ｚｙＬｔ）を採
りそして０、１容蓋のｔｚｓｍＭ＜えん酸三ナトリウム
と混合した。テスト下の化合物を次に１０秒かけて注射
（１ｍ／に９）した。さらに血液サンプルを正確に２．
４．８．１６，３０．６０及び９０分後に採った。ヘパ
リン処理（５０Ｕ　／　ｋｇ　、　ｉ、ｖ、）を３０分
のサンプルの後で繰返してカニューラの開通性を保った
。すべてのくえん酸塩処理サンプルをそれぞれの実験の
終りまで氷中に保ち次に４°で１５分間１７００．９で
遠心分離してプラズマを得た。

それぞれのグツズｉのサンプルな０，０１％（Ｖ／Ｖ　
）ツクイーン８０を含む燐酸塩緩衝生理食塩水ｐＨ７，
４で２００倍に希釈した。一部（３０ＡＪ）を次に４枚
のフィブリンプレートに適用した。フィブリンプレート
は０．４％（Ｗ／Ｖ）ヒトフィブリノーゲン〔カビ（ｋ
ａｂｔ）、グレードＬ、′フロウ、ラボラトリーズ（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、　ス：ｒット
ランド〕を１２５　ｍＭ　ＮａＣ１１）Ｈ７，４中の０
．０２９Ｍバルビトンに溶解しｌ０ＸＩＯＣＸ平方のプ
ラスチック皿〔ステリリン（ＳＬｅｒｉｌｉｎ）］　Ｋ
ピペット（１０ａｕ）しそして０，３ｄのオウシトロン
ビン（ｓ　ｏ　ＮＩＨ単位／ｍ、パーク、デービス（Ｐ
ａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）　、英国〕と急速に混合するこ
とＫより塊まらせることＫより製造した。プレートを通
常１８〜２４時間３７℃でインキエペートしたがもし必
要ならば長くしそして水性ブロモフェノール青で染めた
。それぞれの溶解帯について互に直角の２本の直径なベ
ルニエル（Ｖｅｒｎｉｅｒ）コンパスを用いて測定シタ
。

それぞれのサンプルの全直径を平均しそしてこの平均を
較正曲線を参照してフィブリン分解活性に転換した。較
正曲線はテスト中の化合物の一定量を各動物の投与前の
プラズマに加えることにより得られた。これらの標準は
実験サンプルと同じ方法及び同時に処理された。較正曲
線を作るために直径（−を化合物のＪｏｇ、。濃度に対
してプロットした。それぞれの実験サンプル中の化合物
のプラズマ濃度は与えられた投与に基いて予想されるの
と各モルモットの体重ｌｋｌ？当りの５０ｄプラズマの
推定とのパーセントとして表示された。

〔効果〕

結果 （ａ）　　生体外のフィブリン溶解活性実施例３（１）
Ｋ記載された如く製造されたウロキナーゼ共役物を前述
の生体外血塊溶解システムでウロキナーゼと比べた。矛
４図はテストされた濃度のそれぞれで共役物は最初は本
来のウロキナーゼよりも活性が低いが（約２倍）、実験
中忙恐らく重合体鎖の放出によりその活性が増大したこ
とを示す。５時間後溶解の程度は変性及び未変性のウロ
キナーゼと殆んど同じであった。

、！−５図はモルモットの血流からの実施例３　（１）
　Ｋ記載された共役物とウロキナーゼとのクリアランス
を示す。明らかにウロキナーゼへのポリエチレングリコ
ールの添加が顕著な長期間のクリアランスを生じさせる
。

【図面の簡単な説明】

才１図はＧ３０００　　ＳＷ　ＨＰＬＣ溶離プロフィル
（Ｈ８Ａ）を示し１．？２図はＧ３０００　　ＳＷ　Ｈ
ＰＬＣ溶ｌｌプロフィル（ウロキナーゼ）を示し、矛３
ａ図〜７３ｄ図は分析用ｈｐｌｃゲル濾過溶離プロフィ
ル（ｔＰＡ）　　を示し１才４図はウロキナーゼ（−）
及びＰＥＧ−ウロキナーゼ（実施例３．・）による生体
外ヒト血塊溶解の時間の経過を示し、、１−５図はモル
モットの血流からのフィブリン溶解活性のクリアランス
を示す。 ！′Ｉ’ｌｌ　　　　　　　　　　　　昭ＩＬＩ　ｆｉ
ｌ　年１１１３日特許庁　長　官　殿　　　　　　　　
【す１゛１ν注の表示 ＃！ｉＦ鴨昭６０−第　２ｆ！９２（ｌｆ１号２　発明
の名称　新規化合物、その染法及び千ねを含む医薬組成
物 ３　補正をする者 π件との関係　串願人 部所（居所）イギリス国・ミ１゛セック３州・ブ′ハフ
オード・グレートリニス（０−ド、ビーチャムハウス（
検地なし）Ｌｔ　名（名称）　　ビーチャム醤グループ
・ビーエルシー４、代　　埋　　ｋ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）可逆性結合基により少くとも１種の水溶性重合体
   に結合した製薬上有用な蛋白質よりなる共役物。 （２）製薬上有用な蛋白質がフィブリン溶解酵素又はそ
   の前酵素である特許請求の範囲第（１）項記載の共役物
   。 （３）式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中Ｘは製薬上有用な蛋白質でありＮＨ部分はＸの蛋
   白質アミノ基から誘導され；そして （ｉ）Ｒ＿１及びＲ＿２はそれぞれ非重合性有機基又は
   式−Ｒ＿３−Ｐ（式中Ｐは水溶性重合体でありＲ＿３は
   橋かけ基である）の基であるか；又は （ｉｉ）Ｒ＿１及びＲ＿２は一緒になつてＣ＿３＿〜＿
   ５ポリメチレンであつて５−〜７−員脂環族環を完成す
   るか又は一緒になつて芳香族環を完成し、その際脂環族
   又は芳香族の環は基Ｒ＿４及びＲ＿５（それらはそれぞ
   れ非重合性有機基又は式−Ｒ＿３−Ｐの基である）によ
   り置換され； そしてＲ＿１及びＲ＿２の少くとも１個又はＲ＿４及び
   Ｒ＿５の少くとも１個は基−Ｒ＿３−Ｐである〕 の特許請求の範囲第（１）又は（２）項記載の共役物。 （４）Ｒ＿１及びＲ＿２の１個が基Ｐ−ＣＨ＿２−であ
   つて他がメチルである特許請求の範囲第（３）項記載の
   共役物。 （５）水溶性重合体がメトキシポリエチレングリコール
   である特許請求の範囲す（１）〜（４）項の何れか１つ
   の項記載の共役物。 （６）製薬上有用な蛋白質が組織プラスミノーゲン活性
   剤又はウロキナーゼである特許請求の範囲す（１）〜（
   ５）項の何れか１つの項記載の共役物。 （７）共役物が２−〔ω−メトキシポリエチレングリコ
   キシメチレン〕−３−メチルマレイル−ヒト血清アルブ
   ミンである特許請求の範囲第（１）項記載の共役物。 （８）共役物が２−メチル−３−〔ω−メトキシポリエ
   チレングリコキシメチレン〕−マレイル−ヒト血清アル
   ブミンである特許請求の範囲第（１）項記載の共役物。 （９）共役物が２−〔ω−メトキシポリエチレングリコ
   キシメチレン〕３−メチルマレイル−ウロキナーゼであ
   る特許請求の範囲第（１）項記載の共役物。 （１０）共役物が２−メチル−３−〔ω−メトキシポリ
   エチレングリコキシメチレン〕−マレイル−ウロキナー
   ゼである特許請求の範囲第（１）項記載の共役物。 （１１）共役物が２−〔ω−メトキシポリエチレングリ
   コキシメチレン〕−３−メチル−マレイル−組織プラス
   ミノーゲン活性剤である特許請求の範囲第（１）項記載
   の共役物。 （１２）共役物が２−メチル−３−〔ω−メトキシポリ
   エチレングリコキシメチレン〕−マレイル−組織プラス
   ミノーゲン活性剤である特許請求の範囲第（１）項記載
   の共役物。 （１８）蛋白質アミノ基又はその誘導体と反応しうる基
   よりなる水溶性重合体含有試薬と製薬上有用な蛋白質と
   を反応させて可逆性結合基を形成することよりなる特許
   請求の範囲第（１）〜（１２）項の何れか１つの項記載
   の共役物を製造する方法。 （１４）製薬上許容しうる担体と組み合わされた特許請
   求の範囲第（１）〜（１２）項の何れか１つの項記載の
   共役物よりなる製薬組成物。 （１６）蛋白質アミノ基又はその誘導体と反応して可逆
   性結合基を形成しうる基よりなる水溶性重合体含有試薬
   。 （１６）式（IV） ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中Ｒ＿１及びＲ＿２は特許請求の範囲第（３）項に
   規定したのと同じである） の特許請求の範囲第（１５）項記載の試薬。 （１７）試薬が２−〔メトキシポリエチレン（５０００
   ）グリコキシメチレン〕−３−メチル無水マレイン酸で
   ある特許請求の範囲第（１５）項記載の試薬。