JPH037359B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 (1) 技術分野 本発明は、ウロキナーゼと血液成分を結合させ
た新規なウロキナーゼ複合体の製造方法に関す
る。 (2) 先行技術およびその問題点 ウロキナーゼは尿中で発見されたプラスミノー
ゲン活性化因子の１つで腎臓で生合成され尿中に
排泄される。作用はプラスミノーゲンに特異的で
アルギニン−バリンの結合を切断してプラスミン
にする活性がある。このウロキナーゼは血栓溶解
剤として脳血管閉塞、心筋梗塞、肺栓塞等の血栓
症の治療および制癌剤（マイトマイシンＣ（商品
名）など）との併用療法に広く用いられている。 従来ウロキナーゼは胃腸管からの吸収が悪いた
め静脈内注射又は静脈内点滴注射することにより
投与されてきた。生体に投与されたウロキナーゼ
は血中阻害物質（α₂−プラスミンインヒビター
等）により急速に阻害を受け、またウロキナーゼ
自体の血中半減期が約15分と短いため薬効の持続
性に欠けた。 更にウロキナーゼはフイブリン（血栓）に対す
る親和性が弱く、生体内に投与された時に線溶活
性（血中に形成されたフイブリン塊を溶解させ
る）持続時間が短いため血栓溶解能を発現させる
ためには、血中濃度をある閾値以上に上げる必要
があり、大量投与する必要があつた。 発明の目的 本発明の目的は、上記先行技術の問題点を解決
し、生体内に投与それた時に線溶活性持続時間が
長く、フイブリンに対する親和性の強いウロキナ
ーゼ複合体を製造する方法を提供するものであ
る。 このような目的は下記の本発明によつて達成さ
れる。 すなわち本発明は、採取された全血、血漿、血
清、血漿タンパク質または血清タンパク質とウキ
ロナーゼを混合して反応せしめ、その反応液から
分子量が80000〜120000の、物質を分離精製する
ことを特徴とする精製されたウロキナーゼ複合体
の製造方法である。 発明の具体的説明 以下、本発明を更に詳細に説明する。 従来ウロキナーゼは注射により投与されていた
が、医師、患者の煩雑さ、苦痛等を軽減するた
め、経口投与用ウロキナーゼの開発が進められて
きた。本発明者等は、経口投与されたウロキナー
ゼは静脈内投与された場合と異なり、薬効が持続
することを見出した。 この効果の原因を調べるため投与ウロキナーゼ
の血中動態をスラブ電気泳動法とフイブリン平板
法を組合せたザイモグラフイーにより調べたとこ
ろ吸収されたウロキナーゼは、分子量約94000の
高分子体に変換し、その高分子体が長時間血中に
存在することにより薬効が持続することを見出し
た。 また、この高分子体は、インビトロ（invitro）
においてウロキナーゼと血液、血漿あるいは血清
を混合し、適当に温度に加温することによつても
生成することを見出した。これらの新知見に基づ
いて本発明を完成するに至つた。 本発明に係るウロキナーゼ複合体は、ウロキナ
ーゼを生体に静注した後、採血して得られた血液
からは、検出することができなかつた。 これは生体にウロキナーゼを投与することによ
り、ウロキナーゼの血中阻害物質（α₂−プラスミ
ンインヒビター等）が大量に産生され、ウロキナ
ーゼ複合体が生成される前に前記阻害物質の影響
によつてウロキナーゼが失活される為であると考
えられる。 これに対して採取された血液は、生体の影響を
受けない為、本発明に係るウロキナーゼ複合体の
生成反応が行われると考えられる。 本発明の一方の原料であるウロキナーゼは医薬
用として精製されたものであれば人尿又は組織腎
培養のいずれの由来のものでもよく、分子量
30000〜60000の範囲から選んで使用できる。 さらに従来のウロキナーゼよりフイブリン親和
性の強い一本鎖ウロキナーゼ、若しくは組織プラ
スミノーゲンアクチベーター（TPA）でも良い。 また、本発明の他方の原料である血液成分は、
全血、血漿、血清、血漿タンパク質または血清タ
ンパク質である。 本発明において、 なお、本発明におけるウロキナーゼ複合体の形
成反応には、少なくとも赤血球及び血球は関与し
ない。 「ウロキナーゼ複合体」とはウロキナーゼと血
液成分が結合して一体になつている状態を意味す
る。 本発明のウロキナーゼ複合体を製造するには、
ウロキナーゼと血液または血液成分（血漿、血
清、血漿タンパク質または血清タンパク質）を混
合し、適当な温度４〜40℃で数分〜数十分、好ま
しくは15〜30分間インキユベーシヨン（恒温培
養）する。これは撹拌しても静置して行つてもよ
い。反応終了後、公知の方法、例えばゲル濾過、
アフイニテイークロマトグラフイー、電気泳動、
限外濾過等の方法を単独もしくは組合せて用いる
ことにより分離精製する。 分離精製したウロキナーゼ複合体の組成は、明
らかではないが、分子量80000〜120000の新規な
高分子複合体となつている。 なお、製造した新規ウロキナーゼ複合体は、−
20℃以下にて凍結して保存するか、もしくは凍結
乾燥して保存することができる。 本発明の新規ウロキナーゼ複合体あるいはこれ
を含有する血栓溶解剤は、ウロキナーゼと同様に
能血管閉塞、心筋梗塞、肺栓塞等の血栓症の治療
に使用されるが、投与方法としては静脈内注射、
静脈内点滴注射、経口投与等で用いることができ
る。 このようにして得られたウロキナーゼ複合体は
これを適当量含有する血栓溶解剤とすることがで
きる。 この場合、ウロキナーゼ複合体の安定化のため
に市販ウロキナーゼ製剤に加えられているアルブ
ミン、ゼラチンその他公知の賦形剤を添加するこ
とは何ら差し支えない。 実施例 以下に実施例をあげて本発明を詳細に説明す
る。それぞれのウロキナーゼ複合体の製法を第１
表に示す。 実施例 １ ラツト血漿１mlと、ウロキナーゼ（分子量
54000、100000単位／ml、リン酸緩衡液PH7.2）
0.1mlを混合し、20℃にて30分間加温し反応させ
た。反応終了後、反応液をセフアデツクスＧ−
100カラム（2.6φ×100cm）にかけ、未反応ウロキ
ナーゼとウロキナーゼ複合体を分離した。ゲル濾
過法で測定したウロキナーゼ複合体の分子量は約
93000であつた。得られたウロキナーゼ複合体は
−81℃にて凍結保存した。ウロキナーゼ複合体は
フイブリン平板法によるウロキナーゼ活性測定で
総活性として6300単位であつた。 実施例 ２ ウサギ血清１mlと、ウロキナーゼ（分子量
54000、200000単位／ml、リン酸緩衡液、PH7.2）
0.1mlを混合し、30℃にて15分間加温し反応させ
た。反応終了後、反応液をSDS−ポリアクリルア
ミドゲルスラブ電気泳動法（サイズ14×14×0.2
cm）にて８ｍＡで約16時間、４℃条件で電気泳動
し、未反応ウロキナーゼとウロキナーゼ複合体を
分離した。電気泳動後、ゲルのウロキナーゼ複合
体に相当する位置を切り出し、蛋白回収装置（商
品名：AE−3590マツクスイールドーGP、アトー
(株)製）にかけ、ウロキナーゼ複合体を回収した。
電気泳動法で測定したウロキナーゼ複合体の分子
量は約89000であつた。得られたウロキナーゼ複
合体は−80℃にて凍結後、凍結乾燥して保存し
た。ウロキナーゼ複合体は、フイブリン平板法に
よるウロキナーゼ活性測定で総活性として7500単
位であつた。 実施例 ３ ビーグル犬のクエン酸採血した全血１mlと、ウ
ロキナーゼ（分子量54000、500000単位／ml、リ
ン酸緩衝液、PH7.2）0.1mlを混合し、25℃にて20
分間加温し反応させた。反応終了後、４℃条件
下、3000rpmで遠心分離を行い、血漿を分離し
た。得られた血漿を分離用ゲル電気泳動装置（プ
レパラテイブゲルエレクトロホレシスシステム、
丸善石油バイオケミカル(株)）にかけ未反応ウロキ
ナーゼとウロキナーゼ複合体を分離した。電気泳
動法で測定したウロキナーゼ複合体の分子量は約
93000であつた。得られたウロキナーゼ複合体−
80℃にて凍結後、凍結乾燥して保存した。ウロキ
ナーゼ複合体はフイブリン平板法によるウロキナ
ーゼ活性測定で総活性として21000単位であつた。 実施例 ４ ヒト血漿１mlにウロキナーゼ（分子量54000、
1000000単位／ml、リン酸緩衡液、PH7.2）0.1ml
を混合し、30℃にて30分間加温し反応させた。反
応終了後、反応液をベンザミジン・サクシニル・
セフアロースを担体としたアフイニテイーカラム
にかけ、未反応ウロキナーゼとウロキナーゼ複合
体を分離した。ウキロナーゼ複合体はアフイニテ
イーカラムの非吸着分画から回収した、電気泳動
法で測定したウロキナーゼ複合体の分子量は約
91000であつた。得られたウキロネーゼ複合体は
−80℃にて凍結して保存した。ウキロナーゼ複合
体はフイブリン平板法によるウロキナーゼ活性測
定で総活性として39000単位であつた。 実施例 ５ ラツト血漿と ¹⁴C−無水酢酸により標識化した
¹⁴C−標識ウロキナーゼ（分子量54000、
37.7μCi／176000単位／ml、0.2％塩化ナトリウム
溶液）0.1mlを混合し、35℃にて15分間加温し反
応させた。反応終了後、反応液をセフアデツクス
Ｇ−100カラム0.9φ×60cm）にかけ、未反応 ¹⁴C
−標識ウロキナーゼと ¹⁴C−標識ウロキナーゼ複
合体を分離した。 得られた ¹⁴C−標識ウロキナーゼ複合体のゲル
濾過法で測定したウロキナーゼ複合体の分子量は
約94000であつた。得られたウロキナーゼ複合体
は−80℃にて凍結して保存した。 ¹⁴C−標識ウロ
キナーゼ複合体は一部にエマルジヨン系シンチレ
ーターを加え放射能を測定したところ、総放射能
として、1.24μCiであつた。 以上のようにして得られたウロキナーゼ複合体
について、以下に述べる実験を行つてその効果を
確認した。 （実験１）：フイブリンに対する親和性 ¹⁴C−標識ウロキナーゼおよび実施例５で調整
した ¹⁴C−標識ウロキナーゼ複合体を用い、フイ
ブリンに体する親和性を比較した。 ¹⁴C−標識ウロキナーゼおよび ¹⁴C−標識ウロ
キナーゼ複合体の、それぞれ0.002および
0.004μCi／ml（ ¹⁴C−標識ウロキナーゼの10およ
び20単位／ml相当量）の溶液を10μずつ、フイ
ブリン平板に添着し、37℃にて16時間インキユベ
ーシヨンし、その溶解窓を比較した。対照として
ウロキナーゼ標準品（国立衛生試験所国内標準
品）の10および20単位／mlの溶液もそれぞれ10μ
ずつ添着した。結果を第２表に示す。 ¹⁴C−標識ウロキナーゼとウロキナーゼ標準品
はほぼ同程度の溶解窓を示したが、本発明の ¹⁴C
−標識ウロキナーゼ複合体は ¹⁴C−標識ウロキナ
ーゼおよびウロキナーゼ標準品よりも大きな溶解
窓を示した。すなわち、ウロキナーゼ活性として
同量添着したにもかかわらず、本発明のウロキナ
ーゼ複合体のフイブリン平板溶解窓が大きいこと
から、ウロキナーゼ複合体はフイブリンに対する
親和性が強いことが確認された。 （実験２）：血中における持続性 ウロキナーゼおよび実施例１でえられたウロキ
ナーゼ複合体を用い、ラツトへ静脈注射後の血中
半減期を比較した。 ウロキナーゼおよびウロキナーゼ複合体をそれ
ぞれ50000単位／0.5ml（生理食塩水）ずつ、体重
200〜250ｇのウイスター系雄性ラツトの尾静脈内
へ投与した。投与後下大静脈よりアプロチニン
（500KIE／ml）加3.8％クエン酸（1/10量）にて
採血し、４℃下、3000rpmにて10分間遠心分離し
血漿を得た。血漿中のウロキナーゼ活性は合成基
質Ｓ−2444法にて測定した。その結果を第１図に
示す。 従来のウロキナーゼは血中半減基が約３分であ
るのに対して、本発明のウロキナーゼ複合体は、
約18分であり、血中での持続性に優れていること
が確認された。 それぞれの値は５匹の平均値で示した。 （実験３）：血中における持続性 ウロキナーゼおよび実施例２で得られたウロキ
ナーゼ複合体を用い、ウサギへ静脈注射後の血中
半減期を比較した。 ウロキナーゼおよびウロキナーゼ複合体をそれ
ぞれ30000単位／４ml（生理食塩水）ずつ、体重
約２Kgのウサギ（雄）の耳介静脈内へ投与した。
投与後、右大腿静脈に留置した採血針より実施例
２と同様に、アプロチニン加クエン酸にて採血
し、血漿中のウロキナーゼ活性を、合成基質Ｓ−
2444法にて測定した。 その結果を第２図に示す。ウロキナーゼは血中
半減期が約5.5分であるのに対し、本発明のウロ
キナーゼ複合対は約25分であり、血中での持続性
に優れていることが確認された。 それぞれの値は３頭の平均値で示した。 （実験４）：血中における持続性 ウロキナーゼおよび実施例３で得られたウロキ
ナーゼ複合体を用い、ビーグル犬へ静脈注射後の
血中半減期を比較した。 ウロキナーゼおよびウロキナーゼ複合体をそれ
ぞれ60000単位／５ml（生理食塩水）ずつ体重約
10Kgのビーグル犬（雌）の右後肢静脈内へ投与し
た。投与後、前腕静脈より実験例２と同様にアプ
ロチニン加クエン酸にて採血し、血漿中のウロキ
ナーゼ活性を合成基質Ｓ−2444法にて測定した。
その結果を第３図に示す。 ウロキナーゼは血中半減期が約13分であるのに
対し、本発明のウロキナーゼ複合体は約45分であ
り、血中での持続性に優れていることが確認され
た。それぞれの値は３頭の平均値で示した。

【表】

【表】 発明の効果 以上の実施例および実験例から明らかなよう
に、本発明の方法により得られるウロキナーゼ複
合体はフイブリンに対する親和性が強く、血中半
減期が長く、血中の持続性がウロキナーゼ単独の
場合より３倍強と非常に長い。 しかもこのウロキナーゼ複合体の製造方法はウ
ロキナーゼと全血または血漿または血清、あるい
は血漿タンパク質または血清タンパク質を用いて
簡単に行なうことができる。 また、上記ウロキナーゼ複合体はこれを含有す
る血栓溶解剤とすることができ、この血栓溶解剤
は生体内に投与された時に線溶活性時間が長くフ
イブリンに対する親和性が強いので小量の薬効を
有する血栓溶解剤として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明ウロキナーゼ複合体とウロキナ
ーゼをラツトに静脈注射した場合の血中半減期を
示すグラフである。●印線は、本発明によるウロ
キナーゼ複合体の場合のもので、○印線はウロキ
ナーゼの場合のものである。第２図は、本発明に
よるウロキナーゼ複合体とウロキナーゼをウサギ
に静脈注射した場合の血中半減期を示すグラフで
ある。▲印線は本発明によるウロキナーゼ複合体
の場合のもので、△印線はウロキナーゼの場合の
ものである。第３図は本発明によるウロキナーゼ
複合体とウロキナーゼをビーグル犬に静脈注射し
た場合の血中半減期を示すグラフである。■印線
は本発明によるウロキナーゼ複合体の場合のもの
で、□印線はウロキナーゼの場合のものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 採取された全血、血漿、血清、血漿タンパク
   質または血清タンパク質とウロキナーゼを混合し
   て反応せしめ、その反応液から分子量が80000〜
   120000の物質を分離精製することを特徴とする精
   製されたウロキナーゼ複合体の製造方法。