DE3438821A1 - Verwendung von 24,25-dihydroxycholecalciferol - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von 24,25-Dihydroxycholecalciferol zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit antiosteoporotischer Wirkung.

In den letzten Jahren hat sich die durchschnittliche Lebenserwartung der Japaner rapid vergrößert und dementsprechend ist der Bevölkerungsanteil im Alter von mehr als 65 Jahren heute größer als 10 Millionen.

Demzufolge wird angenommen, daß der Anteil der behandelten Patienten, die an Osteoporose leiden, 3 Millionen beträgt.

Deshalb sind die Klärung der krankhaften Erscheinungsform und die Aufstellung einer Therapie gegen Osteoporose sehr wichtige Probleme,und in die Entwicklung eines gefahrlosen Arzneimittels zur Behandlung der Osteoporose wurden große Erwartungen gesetzt.

Obwohl berücksichtigt wurde, daß das Auftreten der Osteoporose auf verschiedene Ursachen zurückzuführen ist, wie endokrinologische Ursachen, Ernährungsursachen, physische Ursachen, Vererbungsursachen usw., nehmen die Fälle der postmenopausalen Osteoporose den größten Prozentsatz aller Fälle der Osteoporose ein.

Ein aktiviertes Vitamin D₃, z. B. lCX-Hydroxycholecalciferol oder Ic*, 25-Dihydroxycholecalcif erol, wird als Wirkstoff einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Osteoporose benutzt, wobei dieses aktivierte Vitamin D₃ chemisch gleich mit der erfindungsgemäßen Substanz ist, jedoch gibt es Nebenwirkungsprobleme bei der

Anwendung eines solchen aktivierten Vitamin D₃, und folglich ist es erforderlich, bei der Verabreichung dieses aktivierten Vitamin D^ eine große Aufmerksam aufzuwenden.

Obwohl der Effekt des aktivierten Vitamin D₃ auf die Knochen des Patienten, dem dieses verabreicht wurde, bestimmt ist durch den Grad der Begünstigung der Absorption des Calciums durch den Darmtrakt des Patienten, ist so eine Bestimmung eine indirekte Bestimmung und es wurde nicht verdeutlicht, daß es irgendeinen direkten Zusammenhang zwischen dem Grad der Begünstigung der Absorption des Calciums und der krankhaften Veränderung der Knochen durch Osteoporose gibt.

Unter Berücksichtigung der oben genannten Situation wurde nach einer Substanz geforscht, die zur Behandlung der Osteoporose verwendbar ist, insbesondere unter den sicheren und endogenen Substanzen, die im gesunden menschlichen Körper vorhanden sind. Bei der Untersuchung der antiosteoporotischen Aktivität dieser Substanzen ergab sich, daß die Verbindungen des 24,25-Dihydroxycholecalciferols (hierin abgekürzt und als 24,25-(OH)₅-D, bezeichnet oder einfacher als erfindungsgemäße Substanz) die Wirkung haben, in einem bemerkenswerten Grad die krankhaften Veränderungen durch die Osteoporose direkt zu verbessern, ohne irgendeinen Nebeneffekt oder Toxizität aufzuweisen.

Die Osteoporose, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, umfaßt nicht nur Altersosteoporose und postmenopausale Osteoporose, sondern auch sekundäre Osteomalazie-Osteoporose, die die Osteomalazie begleitet, sekundäre Osteoporose, die die funktioneile Akzentuation der Nebenschilddrüse begleitet und örtliche Osteoporose und abnormale Knochen, beide auf Gelenkrheumatismus zurückzuführen.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Kontaktmikroradiographie des rechten Schienbeins einer Ratte der fünften Gruppe (die einer SHAM unterworfen wurde und der nur MCT verabreicht wurde);

Fig. 2 zeigt das einer Ratte der ersten Gruppe (die Ovarien wurden entfernt und es wurde nur MCT verabreicht); und

Fig. 3 zeigt das einer Ratte in der zweiten Gruppe (die Ovarien wurden entfernt und 24R,25-(OH)₂~^D ₃ *^{η MCT} wurde in einer Dosierungsrate von 1 μg/kg verabreicht).

Die erfindungsgemäße Substanz, die durch die Forme.¹

24,25-(OH)₂-D₃

dargestellt wird, umfaßt die folgenden zwei bekannten Verbindungen 24R,25-Dihydroxycholecalciferol und 24S,25-Dihydroxycholecalciferol (im folgenden als 24R,25-(OH)2~^o bzw. 24S,25-(OH) -D, bezeichnet), die z. B. in "Pharmacia¹' 10, 319 bis 322 beschrieben sind.

OH

24R,25-(OH)₂-D₃ 24S,25-(OH)₂-D₃

Die erfindungsgemäße Substanz kann jede der oben genannten zwei Verbindungen sein und außerdem jede Mischung davon, jedoch 24R,25-(OH) )-D- ist die bevorzugte Verbindung.

Die antiosteoporotische pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäße Substanz als Wirkstoff enthält, kann in den folgenden verschiedenen Formulierungen verwendet werden, z. B. über einen parenteralen Weg, intraperitoneale Verabreichung oder kann oral verabreicht werden.

Als Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung, die die erfindungsgemäße Substanz als Wirkstoff enthält, können zur Verabreichung genannt werden: Tabletten, Puder, Granulat, Zäpfchen, Kapseln, Lösung in Ethanol, Lösung in einer öligen Substanz und wäßrige Suspension. Vorzugsweise werden als ölige Substanz verwendet: Triglyceride einer mittleren Fettsäure, Maisöl, Baumwollsamenöl, Erdnußöl, Lebertran, Kakaoöl, Glycerin und Ölester. Lactose, Stärke, Talkum, Magnesiumstearat, Sorbinsäure, Salze der Sorbinsäure, Zucker oder dessen Derivate, Ethanol, wäßrige physiologische Kochsalzlösungen,

oberflächenaktive Mittel, Antioxidantien können als andere Komponenten in Kombination mit der erfindungsgemäßen Substanz benutzt werden.

Der Gehalt der erfindungsgemäßen Substanz in einer Dosierungseinheit der pharmazeutischen Zusammensetzung kann 0,00002 bis 4 Gew.-% betragen, vorzugsweise 0,0002 bis 1 Gew.-%, und die tägliche Dosis der erfindungsgemäßen Substanz für einen Erwachsenen beträgt 0,1 bis 100000 μg, vorzugsweise 0,5 bis 10000 μg.

Die akute Säugetiertoxizität der erfindungsgemäßen Substanz wird als Ergebnis der folgenden Tierexperimente aufgezeigt.

Test der akuten Säugetiertoxizität

Es wurde eine Lösung hergestellt, indem die erfindungsgemäße Substanz 24R,25-(OH)₂-D₃ oder 24S,25-(OH)₂~D₃ in Ethanol aufgelöst wurde, die so erhaltene ethanolische Lösung wurde gelöst in einem Triglycerid einer C₀-C_{1 n}-Fettsäure, so daß die Konzentration des Ethanols in der so gebildeten öligen Lösung 2 Gew.-% beträgt. Diese Lösung wurde an jede von 10 männlichen ICR-Mäusen mit einem Körpergewicht von 25 + 3 g in einer Dosierungsrate von 150 mg/ kg verabreicht. Nachdem die Mäuse 2 Wochen nach der Verabreichung beobachtet wurden und keine Symptome einer Intoxikation durch die Verabreichung an jede der so behandelten Mäuse gefunden wurde, wurden die Mäuse getötet, um eine Autopsie, blutbiochemische Untersuchungen und histopathologische Untersuchungen durchzuführen. Die so gewonnenen Informationen waren genau dieselben wie jene, die bei den Mäusen beobachtet wurden, denen nur ein Triglycerid einer C_g-C,„-Fettsäure, das 2 Gew.-% Ethanol enthält, verabreicht wurde.

Demnach ist der LD,-₀-Wert (p.o.) der erfindungsgemäßen Substanz größer als 150 mg/kg und die erfindungsgemäße Substanz ist völlig sicher bei der Verabreichung.

Die vorliegende Erfindung wird detaillierter anhand der Aufführung der folgenden nicht begrenzenden Bespiele erklärt.

Außerdem wurde der Beweis der Struktur des optischen Isomers 24R,25-(OH) -D^, das in den Beispielen benutzt wurde, entsprechend der Beschreibung in"Tetrahedron Letters "Nr. 26, 2203 bis 2206 (1975) ausgeführt.

Beispiel 1

Test der antiosteoporotischen Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz

Nach einer Woche der Akklimatisation von 60 weiblichen Ratten des Stammes Sprague-Dawley 5 Wochen nach ihrer Geburt wurden von 48 Ratten dieser 60 Ratten unter Anästhesie mit Pentobarbital beide Ovarien zusammen mit den Eileitern vom Rücken her entfernt (diese Operation wird als OVX bezeichnet). Eine Woche nach der Operation wurden die 48 Ratten in vier Gruppen unterteilt und jeder Ratte der ersten Gruppe wurde ein Triglycerid einer C_g-C,„-Fettsäure jeden Tag 6 Monate lang verabreicht (das Triglycerid wurde hergestellt durch Nihon Yushi Co., Ltd. unter dem registrierten Warenzeichen PANASATE - 810, im folgenden als MCT bezeichnet). In der gleichen Weise wie oben wurde jeder Ratte der zweiten, dritten und vierten Gruppe eine Lösung von 24R,25-(OH) -D-. in MCT in einer jeweiligen Dosierungsrate, die in der folgenden Tabelle gezeigt ist, verabreicht.

Die verbleibenden 12 Ratten, die die fünfte Gruppe als

eine Kontrollgruppe bilden, wurden ebenfalls einer Operation unterzogen (im folgenden als SHAM bezeichnet), ihnen wurde danach ein Triglycerid in der gleichen Weise wie oben verabreicht.

TABELLE

Gruppe	Operation	Verabreichung	MCT	in	MCT	Dosierungsrate	Mg/kg
1	OVX	nur	,25-(OH)2-D3	in	MCT		Mg/kg
2	OVX	24R	,25-(OH)2-D3	in	MCT	1	μg/kg
3	OVX	24R	,25-(OH)2-D3			10
4	OVX	24R	MCT			100
5 (Kon	SHAM	nur
trolle)

Jeweils 20 Tage und 10 Tage vor dem Töten wurde einigen Ratten jeder Gruppe Oxytetracyclin in einer Dosierungsrate von 15 mg/kg/Verabreichung intraperitoneal gegeben (insgesamt zweimal), nach dem Töten der Ratten wurde das rechte Schienbein von jeder Ratte entfernt, das Schienbein wurde mit einer wäßrigen 70 gew.-%-igen Ethanollösung fixiert, Proben wurden durch Einbetten des fixierten Schienbeins in einem Polyesterharz (Ligorac) hergestellt und 10 mm von seinem Ende quer geschnitten. Der Abstand zwischen den zwei Markierungen, die durch das Oxytetracyclin auf den Proben entstanden sind, wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Dieser Abstand wurde durch die zwei Zeiträume zwischen den zwei Verabreichungen des Tetracyclins geteilt, dabei wurde die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Osteogenese (Bildung der Knochen) pro Zeiteinheit festgestellt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Nach Beendigung der Verabreichung wurden alle Ratten getötet, die rechten Schienbeine jedes getöteten Tieres wurden

gesammelt und Proben des Schienbeins entsprechend der oben genannten Technik wurden präpariert. Jede der so hergestellten Proben wurde 60 bis 7 0 μΐη von ihrem Ende entsprechend einer herkömmlichen Methode vertikal durchgeschnitten und die geschnittenen Proben wurden der Kontaktmikroradiographie ausgesetzt, um eine morphologische Auswertung des Schienbeins vorzunehmen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 bis 3 gezeigt. Aus den Fig. 1 bis 3 ist klar ersichtlich, daß das Osteotrabekel, das durch die OVX verschwunden war, bei den Ratten der Gruppe, denen die erfindungsgemäße Substanz in einer Dosismenge von 1 μg/kg verabreicht worden war, wieder gebildet worden war.

Außerdem wurde das rechte Schienbein, das von den getöteten Ratten entfernt worden war, entfettet, indem das Schienbein in Aceton getaucht wurde. Nach dem Trocknen während 2 Tagen bei 110⁰C wurde das Gewicht des entfetteten und getrockneten rechten Schienbeins bestimmt. Dazu wurde das Schienbein in einem Porzellanschmelztiegel während 5 Stunden bei 900⁰C ausgeglüht und nach dem Lösen der so gewonnenen Asche des Schienbeins in einer wäßrigen 6n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde die Konzentration des Calciums in der Lösung entsprechend der OCPC-Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

TABELLE 1

Gruppe	Ausbreitungsgeschwindigkeit der Osteogenese ( μΐη/Tag) 1)
1	1,11 + 0,34
2	1,43 + 0,42
3	1,63 + 0,38
4	1,92 + 0,28
5	2,10 + 0,36

I)X+ S.D.

TABELLE 2

Gruppe	Anteil des Calciums im getrockneten Knochen (%)
1	19,9 + 0,5
2	20,9 + 0,3
3	22,2 + 0,6
4	22,8 + 0,4
5	23,5 + 0,4

Beispiel 2

Biologische Effekte der erfindunqsqemäßen Substanz

Eine Lösung von 24R,25-(OH)_)-D₃ in einem Triglycerid einer C₀-C₁„-Fettsäure, die 1 Gew.-% Ethanol enthält, wurden jeder von 10 männlichen ICR-Mäusen oder jeder von 10 weiblichen ICR-Mäusen zwangsweise und oral täglich 30 Tage lang in einer täglichen Dosierungsrate von 10, 100 oder 1000 μg/kg verabreicht. Die Ergebnisse der Prüfung der physiologischen Beschaffenheit wurden verglichen mit jenen von den Mäusen, denen nur die Lösung verabreicht worden war.

Die Ergebnisse des Vergleichs sind unten gezeigt.

Entsprechend der Wachstumskurve, die durch Wiegen des Körpergewichts jeder Maus während der Testperiode aufgestellt wurde, wurden keine signifikanten Differenzen bei der Änderung des Körpergewichts zwischen diesen beiden Gruppen beobachtet.

TABELLE 3

Testergebnisse der generellen Blutuntersuchung

Gruppe	Geschlecht	Dosie rungs- rate (MgAg)	Anzahl Erythro zyten	von Leuko zyten	Hämoglobin	Hämatokrit- wert
2	itiännl.	10	keine	keine	keine	keine
3	männl.	100	keine	keine	keine	keine
4	itännl.	1000	keine	keine	keine	keine
2	weibl.	10	keine	keine	keine	keine
3	weibl.	100	keine	keine	keine	keine
4	weibl.	1000	keine	keine	keine	keine

Keine: Bedeutet, daß keine Differenz festgestellt wurde zwischen der Gruppe, der die erfindungsgemäße Substanz verabreicht wurde und der Gruppe, die einer Operation (SHAM) unterzogen wurde und der nur die Lösung verabreicht wurde.

TABELLE 4

Ergebnisse der blutbiochemischen Untersuchungen

Gruppe

Geschl.

Dosie rungs- rate ^g/kg)

GOT

GPT

LDH

CA

Ι-Ρ

W ALP

e T-P

r t A/G

AIb

T-BiI

GIu

T-CHO

BUN

2

männl.

10

n1J

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

3

männl.

100

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

4

männl.

1000

η

η

r2)

η

η

η

η

η

η

r

r

η

r

2

weibl.

10

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

3

weibl.

100

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

4

weibl.

. 1000

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

1) "η" bedeutet, daß keine Differenz festgestellt wurde zwischen der Gruppe, der die erfindungsgemäße Substanz verabreicht wurde und der Gruppe, die einer Operation (SHAM)
unterzogen wurde und der nur MCT verabreicht wurde.

2) "r" bedeutet, daß die Größe der Gruppe, der die erfindungsgemäße Substanz verabreicht
wurde, kleiner ist als die jener Gruppe, die einer Operation (SHAM) unterzogen wurde
und der nur MCT verabreicht wurde.

TABELLE 5

Testergebnisse der Urinanalyse

Gruppe	Geschlecht	Dosie	pH	Zucker	W e	r t	Ketonkörper	Urobilinogen
		rungs- rate (MgAg)	n1}	η	Protein	Okkultes Blut	η	η
2	männl.	10	η	η	η	η	η	η
3	männl.	100	η	η	η	η	η	η
4	männl.	1000	η	η	η	η	η	η
2	weibl.	10	η	η	η	η	η	η
3	weibl.	100	η	η	η	η	η	η
4	weibl.	1000		η	η

"η" bedeutet, daß keine Differenz beobachtet wurde zwischen der Gruppe, der die erfindungsgemäße Substanz verabreicht wurde und der Gruppe, die einer Operation (SHAM) unterzogen wurde und der nur MCT verabreicht wurde.

CO OO OO

TABELLE 6

Gewicht der inneren Organe

Gruppe

Geschlecht

Dosie

B

P

H

L

O r

g

S

a

η

Ad

1)

Th

T

O

U

rungs- rate

Li

K

(ug/kg)

n2)

η

η

η

η

η

η

η

2

männl.

10

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

3

männl.

100

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

4

männl.

1000

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

2

weibl.

10

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

3

weibl.

100

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

η

4

weibl.

1000

η

η

1) Namen der Organe: B: Gehirn, P: Hypophyse, H: Herz, L: Lunge, Li: Leber, S: Milz,

K: Niere, Ad: Nebenniere, Th: Thymus, T:Testis, O: Ovarien, U: Uterus

2) "n" bedeutet dasselbe wie in Tabelle 5.

CO CXD CX)

Die folgenden inneren Organe und Gewebe, die aus jeder der Mäuse herausgenommen wurden, wurden in einer wäßrigen 10 %-igen Formaldehydlösung fixiert und dann mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, das bei histopathologischen Untersuchungen bevorzugt wird. Keine abnormalen Ergebnisse wurden beobachtet.

Die Organe und Gewebe, die untersucht wurden, waren folgende: Gehirn, Herz, Lungen, Leber, Nieren, Nebenniere, Milz, Pankreas, Schilddrüse, Hypophyse, Mesenteriallymph- knoten,Testis, Ovarien, Uterus, Magen, Dünndarm (Jejunum, Ileum und Duodenum), Dickdarm (Colon und Caecum), Augäpfel, Ohrspeicheldrüse (submaxillary qland), Harnblase, Haut auf dem Rücken, Muskeln, Brustbein, Knochenmark des Brustbeins und des Oberschenkelknochens und Oberschenkelknochen .
Beispiel 3

Herstellung der Weichkapseln

In 1 kg eines Triglycerids einer C₀-C₁„-Fettsäure, die einem ultravioletten Licht einer 400 W-Hochdruckquecksilberlampe ausgesetzt worden war, wobei Argon eingeblasen wurde, um die unreinen reaktiven Peroxide zu eliminieren, wurden 5 mg 2 4R,25-(OH)₂-D-. gelöst und in die so gewonnene Lösung wurden die folgenden Komponenten für die Wandmembran der Kapseln gelöst, um eine Kapsel herzustellen, die 0,5 μg 24R,25-(OH) -D₃ enthält, die so hergestellte Lösung wurde in eine Weichkapseln bildende Maschine eingegeben, um nach einer konventionellen Methode Weichkapseln zu erhalten.

Rezeptur der Wandmembran der Weichkapseln: 10 Teile Gelatine, 2 Teile Glycerin,

0,05 Teile eines Antiseptikums (Ethyl-p-oxybenzoat), 0,2 Teile Titanweiß und 0,2 Teile Wasser.

In der gleichen Weise wurden Kapseln hergestellt, die 1, 2, 5 bzw. 10 μg enthalten.

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Claims (2)

KADOR- KLUNKER -SCHMnT-NILSON- HIRSCH RVTENT4VKÄLTE KiR(H1HW Rvrevr atturnkys K 22 009/ho KÜREHA KAGAKU KOGYO KABUSHIKI KAISHA 9-11 Horidome-cho 1-chome, Nihonbashi Chuo-ku, Tokyo, Japan Verwendung von 24,25-Dihydroxycholecalciferol Patentansprüche

1. Verwendung von 24,25-Dihydroxycholecalciferol zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit antiosteoporotischer Wirkung.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das 24,25-Dihydroxycholecalcif erol 24R,25-Dihydroxycholecalciferol ist.