DE3438821C2

DE3438821C2 -

Info

Publication number: DE3438821C2
Application number: DE3438821A
Authority: DE
Inventors: Yuji Nagareyama Chiba Jp Maeda; Hideyuki Yamato; Takayoshi Fujii; Yasuhiko Kobayashi; Kenichi Saito; Tadaaki Tokio/Tokyo Jp Kato; Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1983-10-24
Filing date: 1984-10-23
Publication date: 1989-06-29
Also published as: DE3438821A1; JPS6089422A; US4590184A; JPH0132208B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von 24R,25-Dihydroxycholecalciferol bei der Behandlung von Osteoporose.

In den letzten Jahren hat sich die durchschnittliche Lebenserwartung der Japaner rapid vergrößert und dementsprechend ist der Bevölkerungsanteil im Alter von mehr als 65 Jahren heute größer als 10 Millionen.

Demzufolge wird angenommen, daß der Anteil der behandelten Patienten, die an Osteoporose leiden, 3 Millionen be trägt.

Deshalb sind die Klärung der krankhaften Erscheinungsform und die Aufstellung einer Therapie gegen Osteoporose sehr wichtige Probleme, und in die Entwicklung eines gefahrlosen Arzneimittels zur Behandlung der Osteoporose wurden große Erwartungen gesetzt.

Obwohl berücksichtigt wurde, daß das Auftreten der Osteoporose auf verschiedene Ursachen zurückzuführen ist, wie endokrinologische Ursachen, Ernährungsursachen, physische Ursachen, Vererbungsursachen usw., nehmen die Fälle der postmenopausalen Osteoporose den größten Prozentsatz aller Fälle der Osteoporose ein.

Ein aktiviertes Vitamin D₃, z. B. 1α-Hydroxycholecalciferol oder 1α,25-Dihydroxycholecalciferol, wird als Wirkstoff einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Osteoporose benutzt, wobei dieses aktivierte Vitamin D₃ chemisch gleich mit der erfindungsgemäßen Substanz ist, jedoch gibt es Nebenwirkungsprobleme bei der Anwendung eines solchen aktivierten Vitamin D₃, und folglich ist es erforderlich, bei der Verabreichung dieses aktivierten Vitamin D₃ eine große Aufmerksamkeit aufzuwenden.

Obwohl der Effekt des aktivierten Vitamin D₃ auf die Knochen des Patienten, dem dieses verabreicht wurde, bestimmt ist durch den Grad der Begünstigung der Absorption des Calciums durch den Darmtrakt des Patienten, ist so eine Bestimmung eine indirekte Bestimmung und es wurde nicht verdeutlicht, daß es irgendeinen direkten Zusammenhang zwischen dem Grad der Begünstigung der Absorption des Calciums und der krankhaften Veränderung der Knochen durch Osteoporose gibt.

Aus der DE-OS 30 13 632 ist ein Verfahren zur Regulierung des Knochenmetabolismus warmblütiger Tiere bekannt. Bei diesem Verfahren wird 1,24-Dihydroxycholecalciferol und 24R,25-Dihydroxycholecalciferol miteinander an warmblütige Tiere verabreicht.

Im British Medical Journal 1978, Seiten 1382 bis 1386 beschreibt J. A. Kanis et al, daß 24R,25-Dihydroxycholecalciferol als mögliches therapeutisches Mittel zu verwenden ist, um die Retention von Kalzium bei Patienten mit knochenschwindendem Zustand zu för dern.

Unter Berücksichtigung der oben genannten Situation wurde nach einer Substanz geforscht, die zur Behandlung der Osteoporose verwendbar ist, insbesondere unter den sicheren und endogenen Substanzen, die im gesunden menschlichen Körper vorhanden sind. Bei der Untersuchung der antiosteoporotischen Aktivität dieser Substanzen ergab sich, daß die Verbindung 24R,25-Dihydroxycholecalciferol (hierin abgekürzt und als 24R,25-(OH)₂-D₃ bezeichnet) die Wirkung hat, in einem bemerkenswerten Grad die krankhaften Veränderungen durch die Osteoporose direkt zu verbessern, ohne irgendeinen Nebeneffekt oder Toxizität aufzuweisen.

Die Osteoporose, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, umfaßt nicht nur Altersosteoporose und postmenopausale Osteoporose, sondern auch sekundäre Osteo malazie-Osteoporose, die die Osteomalazie begleitet, sekundäre Osteoporose, die die funktionelle Akzentuation der Nebenschilddrüse begleitet und örtliche Osteoporose und abnormale Knochen, beide auf Gelenkrheumatismus zurückzu führen.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Kontaktmikroradiographie des rechten Schienbeins einer Ratte der fünften Gruppe (die einer SHAM unterworfen wurde und der nur MCT verabreicht wurde);

Fig. 2 zeigt das einer Ratte der ersten Gruppe (die Ovarien wurden entfernt und es wurde nur MCT verabreicht);

Fig. 3 zeigt das einer Ratte in der zweiten Gruppe (die Ovarien wurden entfernt und 24R,25-(OH)₂-D₃ in MCT wurde in einer Dosierungsrate von 1 µg/kg verabreicht).

Das erfindungsgemäß zur Behandlung von Osteoporose verwendete 24R,25-Dihydroxycholecalciferol zeigt folgende Strukturformel

und ist z. B., in "Pharmacia", 10, 319-322 beschrieben.

Die antiosteoporotische pharmazeutische Zusammensetzung, die die 24R,25-(OH)₂-D₃ als Wirkstoff enthält, kann in den folgenden verschiedenen Formulierungen verwendet werden, z. B. über einen parenteralen Weg, intraperitoneale Verabreichung oder kann oral verabreicht wer den.

Als Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzung, die das 24R,25-(OH)₂-D₃ als Wirkstoff enthält, können zur Verabreichung genannt werden: Tabletten, Puder, Granulat, Zäpfchen, Kapseln, Lösung in Ethanol, Lösung in einer öligen Substanz und wäßrige Suspension. Vorzugsweise werden als ölige Substanz verwendet: Triglyceride einer mittleren Fettsäure, Maisöl, Baumwollsamenöl, Erdnußöl, Lebertran, Kakaoöl, Glycerin und Ölester. Lactose, Stärke, Talkum, Magnesiumstearat, Sorbinsäure, Salze der Sorbinsäure, Zucker oder dessen Derivate, Ethanol, wäßrige physiologische Kochsalzlösungen, oberflächenaktive Mittel, Antioxidantien können als andere Komponenten in Kombination mit der erfindungsgemäßen Substanz benutzt werden.

Der Gehalt an 24R,25-(OH)₂-D₃ in einer Dosierungseinheit der pharmazeutischen Zusammensetzung kann 0,00002 bis 4 Gew.-% betragen, vorzugsweise 0,0002 bis 1 Gew.-%, und die tägliche Dosis der Substanz für einen Erwachsenen beträgt 0,1 bis 100 000 µg, vorzugsweise 0,5 bis 10 000 µg.

Die akute Säugetiertoxizität des 24R,25-(OH)₂-D₃ wird als Ergebnis der folgenden Tierexperimente auf gezeigt.

Test der akuten Säugetiertoxizität

Es wurde eine Lösung hergestellt, indem 24R,25-(OH)₂-D₃ in Ethanol aufgelöst wurde, die so erhaltene ethanolische Lösung wurde gelöst in einem Triglycerid einer C₈-C₁₀-Fettsäure, so daß die Konzentration des Ethanols in der so gebildeten öligen Lösung 2 Gew.-% beträgt. Diese Lösung wurde an jede von 10 männlichen ICR-Mäusen mit einem Körpergewicht von 25±3 g in einer Dosierungsrate von 150 mg/kg verabreicht. Nachdem die Mäuse 2 Wochen nach der Verabreichung beobachtet wurden und keine Symptome einer Intoxikation durch die Verabreichung an jede der so behandelten Mäuse gefunden wurde, wurden die Mäuse getötet, um eine Autopsie, blutbiochemische Untersuchungen und histopathologische Untersuchungen durchzuführen. Die so gewonnenen Informationen waren genau dieselben wie jene, die bei den Mäusen beobachtet wurden, denen nur ein Triglycerid einer C₈-C₁₀-Fettsäure, das 2 Gew.-% Ethanol enthält, verabreicht wurde.

Demnach ist der LD₅₀-Wert (p. o.) des 24R,25-(OH)₂-D₃ größer als 150 mg/kg und die Substanz ist völlig sicher bei der Verabreichung.

Die vorliegende Erfindung wird detaillierter anhand der Aufführung der folgenden nicht begrenzenden Beispiele er klärt.

Außerdem wurde der Beweis der Struktur des optischen Isomers 24R,25-(OH)₂-D₃, das in den Beispielen benutzt wurde, entsprechend der Beschreibung in "Tetrahedron Letters" Nr. 26, 2203 bis 2206 (1975) ausgeführt.

Beispiel 1 Test der antiosteoporotischen Wirkung des 24R,25-Dihydroxycholecalciferol

Nach einer Woche der Akklimatisation von 60 weiblichen Ratten des Stammes Sprague-Dawley 5 Wochen nach ihrer Geburt wurden von 48 Ratten dieser 60 Ratten unter Anästhesie mit Pentobarbital beide Ovarien zusammen mit den Eileitern vom Rücken her entfernt (diese Operation wird als OVX bezeichnet). Eine Woche nach der Operation wurden die 48 Ratten in vier Gruppen unterteilt und jeder Ratte der erste Gruppe wurde ein Triglycerid einer C₈-C₁₀-Fettsäure jeden Tag 6 Monate lang verabreicht (das Triglycerid wurde hergestellt durch Nihon Yushi Co., Ltd. unter dem registrierten Warenzeichen PANASATE-810, im folgenden als MCT bezeichnet). In der gleichen Weise wie oben wurde jeder Ratte der zweiten, dritten und vierten Gruppe eine Lösung von 24R,25-(OH)₂-D₃ in MCT in einer jeweiligen Dosierungsrate, die in der folgenden Tabelle gezeigt ist, verabreicht.

Die verbleibenden 12 Ratten, die die fünfte Gruppe als eine Kontrollgruppe bilden, wurden ebenfalls einer Operation unterzogen (im folgenden als SHAM bezeichnet), ihnen wurde danach ein Triglycerid in der gleichen Weise wie oben verabreicht.

Tabelle

Jeweils 20 Tage und 10 Tage vor dem Töten wurde einigen Ratten jeder Gruppe Oxytetracyclin in einer Dosierungsrate von 15 mg/kg/Verabreichung intraperitoneal gegeben (insgesamt zweimal), nach dem Töten der Ratten wurde das rechte Schienbein von jeder Ratte entfernt, das Schienbein wurde mit einer wäßrigen 70 gew.-%igen Ethanollösung fixiert, Proben wurden durch Einbetten des fixierten Schienbeins in einem Polyesterharz (Ligorac) hergestellt und 10 mm von seinem Ende quer geschnitten. Der Abstand zwischen den zwei Markierungen, die durch das Oxytetracyclin auf den Proben entstanden sind, wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Dieser Abstand wurde durch die zwei Zeiträume zwischen den zwei Verabreichungen des Tetracyclins geteilt, dabei wurde die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Osteogenese (Bildung der Knochen) pro Zeiteinheit festgestellt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Nach Beendigung der Verabreichung wurden alle Ratten getötet, die rechten Schienbeine jedes getöteten Tieres wurden gesammelt und Proben des Schienbeins entsprechend der oben genannten Technik wurden präpariert. Jede der so hergestellten Proben wurde 60 bis 70 µm von ihrem Ende entsprechend einer herkömmlichen Methode vertikal durchgeschnitten und die geschnittenen Proben wurden der Kontakt mikroradiographie ausgesetzt, um eine morphologische Auswertung des Schienbeins vorzunehmen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 bis 3 gezeigt. Aus den Fig. 1 bis 3 ist klar ersichtlich, daß das Osteotrabekel, das durch die OVX verschwunden war, bei den Ratten der Gruppe, denen die erfindungsgemäße Substanz in einer Dosismenge von 1 µg/kg verabreicht worden war, wieder gebildet worden war.

Außerdem wurde das rechte Schienbein, das von den getöteten Ratten entfernt worden war, entfettet, indem das Schienbein in Aceton getaucht wurde. Nach dem Trocknen während 2 Tagen bei 110°C wurde das Gewicht des entfetteten und getrockneten rechten Schienbeins bestimmt. Dazu wurde das Schienbein in einem Porzellanschmelztiegel während 5 Stunden bei 900°C ausgeglüht und nach dem Lösen der so gewonnenen Asche des Schienbeins in einer wäßrigen 6n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde die Konzentration des Calciums in der Lösung entsprechend der OCPC-Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 1

Tabelle 2

Beispiel 2 Biologische Effekte des 24R,25-Dihydroxycholecalciferols

Eine Lösung von 24R,25-(OH)₂-D₃ in einem Triglycerid einer C₈-C₁₀-Fettsäure, die 1 Gew.-% Ethanol enthält, wurden jeder von 10 männlichen ICR-Mäusen oder jeder von 10 weiblichen ICR-Mäusen zwangsweise und oral täglich 30 Tage lang in einer täglichen Dosierungsrate von 10, 100 oder 1000 µg/kg verabreicht. Die Ergebnisse der Prüfung der physiologischen Beschaffenheit wurden verglichen mit jenen von den Mäusen, denen nur die Lösung verabreicht worden war.

Die Ergebnisse des Vergleichs sind unten gezeigt.

Entsprechend der Wachstumskurve, die durch Wiegen des Körpergewichts jeder Maus während der Testperiode aufgestellt wurde, wurden keine signifikanten Differenzen bei der Änderung des Körpergewichts zwischen diesen beiden Gruppen beobachet.

Tabelle 3

Testergebnisse der generellen Blutuntersuchung

Tabelle 5

Testergebnisse der Urinanalyse

Tabelle 6

Gewicht der inneren Organe

Die folgenden inneren Organe und Gewebe, die aus jeder der Mäuse herausgenommen wurden, wurden in einer wäßrigen 10%-igen Formaldehydlösung fixiert und dann mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, das bei histopathologischen Untersuchungen bevorzugt wird. Keine abnormalen Ergebnisse wurden beob achtet.

Die Organe und Gewebe, die untersucht wurden, waren folgende: Gehirn, Herz, Lungen, Leber, Nieren, Nebenniere, Milz, Pankreas, Schilddrüse, Hypophyse, Mesenteriallymphknoten, Testis, Ovarien, Uterus, Magen, Dünndarm (Jejunum, Ileum und Duodenum), Dickdarm (Colon und Caecum), Augäpfel, Ohrspeicheldrüse (submaxillary gland), Harnblase, Haut auf dem Rücken, Muskeln, Brustbein, Knochenmark des Brustbeins und des Oberschenkelknochens und Oberschenkel knochen.

Beispiel 3 Herstellung der Weichkapseln

In 1 kg eines Triglycerids einer C₈-C₁₀-Fettsäure, die einem ultravioletten Licht einer 400 W-Hochdruckquecksilberlampe ausgesetzt worden war, wobei Argon eingeblasen wurde, um die unreinen reaktiven Peroxide zu eliminieren, wurden 5 mg 24R,25-(OH)₂-D₃ gelöst und in die so gewonnene Lösung wurden die folgenden Komponenten für die Wandmembran der Kapseln gelöst, um eine Kapsel herzustellen, die 0,5 µg 24R,25-(OH)₂-D₃ enthält, die so hergestellte Lösung wurde in eine Weichkapseln bildende Maschine eingegeben, um nach einer konventionellen Methode Weichkapseln zu erhalten.

Rezeptur der Wandmembran der Weichkapseln:
10 Teile Gelatine,
2 Teile Glycerin,
0,05 Teile eines Antiseptikums (Ethyl-p-oxybenzoat),
0,2 Teile Titanweiß und
0,2 Teile Wasser.

In der gleichen Weise wurden Kapseln hergestellt, die 1, 2, 5 bzw. 10 µg enthalten.

Nach einer Woche der Akklimatisation von 72 weiblichen Ratten vom Stamm Sprague-Dawley 5 Wochen nach ihrer Geburt wurden von 60 Ratten dieser 72 Ratten unter Anästhesie mit Pentobarbital beide Ovarien zusammen mit den Eileitern vom Rücken her entfernt (diese Operation wird als OVX bezeichnet).

Eine Woche nach dieser Operation wurden die 60 Ratten in fünf Gruppen eingeteilt und jeder Ratte der ersten Gruppe wurde ein Triglycerid einer C₈-C₁₀-Fettsäure täglich sechs Monate lang verabreicht (das Triglycerid wird von Nihon Yushi Co., Ltd. unter dem registrierten Warenzeichen PANASATE-810 hergestellt, im Folgenden als MCT bezeichnet).

Jeder Ratte der zweiten und dritten Gruppe wurde eine Lösung von 24R,25-Dihydroxycholecalciferol in MCT verabreicht und jeder Ratte der vierten und fünften Gruppe wurde eine Lösung von 24(R, S),25-Dihydroxycholecalciferol in MCT in den entsprechenden Dosierungsraten in der gleichen Weise wie oben gezeigt, verabreicht, wobei die Dosierungsraten in der folgenden Tabelle 7 gezeigt sind.

Die verbleibenden 12 Ratten, die die sechste Gruppe bilden, wurden einer Pseudooperation unterzogen (hier weiter als SHAM bezeichnet) und danach wurde ihnen das Triglycerid in der gleichen Weise wie oben verabreicht. Diese sechste Gruppe bildet die Kontrollgruppe. Vor dem Ablauf von zwanzig Tagen und zehn Tage vor dem Töten wurde einigen Ratten von jeder Gruppe Oxytetracyclin intraperitoneal verabreicht, bei einer Dosierungsrate von 15 mg/kg/Verabreichung (insgesamt zweimal) und nach dem Töten der Ratten wurde das rechte Schienbein jeder Ratte entfernt und nach dem Fixieren des Schienbeins mit einer wäßrigen 70-Gew.-%-igen Ethanollösung wurde eine Probe hergestellt, indem das fixierte Schienbein in einem Polyesterharz (Ligorac) eingebettet wurde und an einer Stelle 10 mm von seinem Ende quergeschnitten wurde. Der Abstand zwischen den zwei Markierungen, die durch Oxytetracyclin auf den Proben hergestellt wurden, was unter einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt wurde, wurde durch den Zeitraum zwischen den zwei Verabreichungen des Tetracyclins geteilt, wodurch die Geschwindigkeit der Osteogenese (Knochenbildung) pro Zeiteinheit festgestellt wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 gezeigt.

Zusätzlich wurde das rechte Schienbein von der getöteten Ratte entnommen und durch Tauchen des Schienbeins in Aceton entfettet und nach dem Trocknen zwei Tage lang bei 110°C wurde das entfettete und getrocknete Gewicht des rechten Schienbeins bestimmt. Danach wurde das Schienbein in ein Porzellantiegel 5 Stunden lang bei 900°C kalziniert und nach dem Auflösen der so erhaltenen Asche des Schienbeins in einer wäßrigen 6n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde die Konzentration des Calciums in der Lösung entsprechend dem OCPC-Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Claims

Verwendung von 24R,25-Dihydroxycholecalciferol bei der Behandlung von Osteoporose.