DE3226232A1

DE3226232A1 - Einschlussverbindung von eicosapentaensaeure oder docosahexaensaeure mit cyclodextrin und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE3226232A1
Application number: DE19823226232
Authority: DE
Inventors: Shoichiro Hayashi; Kouichi Iwaki Fukushima Kodama; Masakatsu Wagu
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1981-07-16
Filing date: 1982-07-14
Publication date: 1983-02-03
Also published as: JPS5813541A; GB2104907A; US4438106A

Description

Die Erfindung betrifft Einschlußverbindungen von Cyclodextrin, in die mindestens eine Gastverbindung,ausgewählt aus der Gruppe von Eicosapentaensäure (im folgenden als EPA bezeichnet), Docosahexaensäure (im folgenden als DHA bezeichnet) und den Alkalimetallsalzen und Alk yL-estern davon, eingeschlossen ist, die geruchlos und stabil sind.

Es heißt, daß EPA und DHA, die in der Natur in LeberÖl, bzw. Körperöl von Blaufischen, wie Sardinen, Markrelen, Markrelen-Hechten usw. sowie in Seetieren, wie Kuttelfisch usw., enthalten sind, die Funktion haben, den Cholesteringehalt im menschlichen Serum sehr stark, wie das Vierfache von Linolsäure zu verringern (vgl. beispielsweise Journal of the Japan Oil Chemist's Soc, 12(5), 249-260, 1963).

In letzter Zeit wurde auch berichtet, daß EPA, die Ester, Metallsalze und Amide davon, eine Funktion bei der Unterdrückung der Blutplättchenaggregation aufweisen und dementsprechend zur Verhinderung und Behandlung von zerebraler Thrombose und des Myocardinfarkts verwendet werden können (vgl. beispielsweise Lancet 2, 117, 1978 und JA-OS 1544/

1980) und seit dieser Zeit wurden EPA und DHA, die derartige Funktionen aufweisen, als wichtige Substanzen angesehen.

Aus dem vorstehenden ist ersichtlich, daß zur Verhinderung und Behandlung der Erkrankungen der Kreislauforgane der Verzehr von Blaufischen und Seetieren, die EPA und DHA enthalten, pharmakologische Wirksamkeit aufweist. Jedoch ist auch in Japan mit der Verwestlichung des Ernährungswesens die Anzahl der Leute, die keine Blaufische verzehren, größer geworden, andererseits ist die Anzahl der Leute mit korpulentem Habitus und der Patienten, die an Erkrankungen der Kreislauforgane leiden aufgrund mangelnder Übung und zunehmender Energieauf-

15 nähme größer geworden.

Obwohl es günstig ist, EPA und DHA in jeglicher Form aufzunehmen, ist es, da das aus diesen Blaufischen gewonnene Fischöl, EPA und DHA, die aus dem Fischöl isoliert und gereinigt wurden, gereinigtes EPA und DHA sowie Alkalimetallsalze und Ester davon, nicht zu erwähnen die frischen Blaufische selbst, einen spezifischen Fischgeruch aufweisen, schwierig, nicht nur für solche Leute, die keine Blaufische mögen, sondern

25 auch für andere, EPA und DHA direkt aufzunehmen,

selbst wenn sie gereinigt sind, und die Leute verabscheuen derartiges EPA und DHA. Es wurde somit versucht, EPA und DHA in Arzneimittel und synthetische Nahrungsmittel aufzunehmen.

Jedoch weisen EPA und DHA nicht nur einen unangenehmen Geruch auf, sondern sie besitzen auch 5 oder 6 Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Doppelbindungen innerhalb ihres Moleküls und sind äußerst instabil. Dementsprechend absorbieren EPA und DHA leicht Sauerstoff an der Luft,

unter Bildung von schädlichen Peroxiden, die weiter zu verschiedenen Aldehyden und Ketonen zersetzt werden.

Darüberhinaus sind EPA und DHA jeweils eine unstabile Fettsäure, die schädliche cyclische oder polymere Verbindungen unter Einwirkung von Licht, Wärme und Sauerstoff bilden, und darüberhinaus verschieben sich ihre Doppelbindungen. Im Falle der Herstellung von EPA und DHA, das in Arzneimitteln und Nahrungsmitteln enthalten ist, ist es daher notwendig, das natürliche Licht abzuschirmen und sie in einem Strom eines Inertgases, wie gasförmiger Stickstoff oder Kohlendioxid, zu behandeln. Für die langzeitige Lagerung von EPA und DHA ist es notwendig, sie bei niedriger Temperatur unter 0 C zu halten, wobei sie mit einem inerten Lösungsmittel, wie Hexan, verdünnt sind, und je nach den Umständen wird es notwendig, ein Antioxidationsmittel, wie Tocopherol und dgl. zuzusetzen.

Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Geruchsentfernung und Stabilisierung von EPA und DHA, wobei ihre vorstehend erwähnten günstigen Eigenschaften beibehalten werden.

Das vorstehende Ziel kann erfindungsgemäß erreicht werden durch Umwandlung von EPA oder DHA in die jeweilige Einschlußverbindung mit Cyclodextrin.

Die Einschlußverbindung gemäß der Erfindung wird wie folgt hergestellt:

1 bis 2 Gew.-Teile von mindestens einer Gastverbindung, ausgewählt aus der Gruppe von EPA, DHA, ihren Alkalimetallsalzen, wie dem Natriumsalz oder dem Kaliumsalz und ihren Alkylestern, wie den Methyl, Ethyl-, Propyl- oder Butylestern und 5 bis 10 Gew.-Teile Cyclodextrin, werden

in einem Lösungsmittel durch Erwärmen in einer Strömung eines Inertgases gelöst und die Lösung wird langsam unter Rühren zur Ausfällung einer Einschlußverbindung von Cyclodextrin, in die die Gastverbindung eingeschlossen ist (käfigförmig) als weißer Feststoff, gekühlt. Im Falle der Kühlung der Lösung ist es bevorzugt, eine Kühlgeschwindigkeit von 0,1 bis 0,5°C/min, besonders bevorzugt von 0,2 bis 0,3°C/min anzuwenden, um die Ausfällung von Cyclodextrin ohne Einschluß der Gastverbindung zu vermeiden. Als vorstehend erwähntes Lösungsmittel ist eine wässrig-alkoholische Lösung, die 40 bis80 Vol.-%, vorzugsweise 60 bis 70 Vol.-% Methanol oder Äthanol enthält, günstig anwendbar. Jedoch kann ein Lösungsmittel, das sowohl die Gastverbindung(EPA, DHA oder die Alkalimetallsalze und Alkylester davon)und Cyclodextrin löst und in dem die Löslichkeit von Cyclodextrin vorwiegend von der Temperatur abhängt, beispielsweise Aceton und Tetrahydrofuran anstelle der wässrig-alkoholischen Lösung verwendbar.

Anschließend wird das ausgefällte Produkt durch Filtrieren gewonnen, mit dem Lösungsmittel gewaschen und getrocknet, unter Bildung einer weißen, geruchlosen nichtklebrigen und pulverförmigen Substanz.

Das so erhaltene Produkt weist unterschiedliche Zusammensetzung, je nach den Reaktionsbedingungen auf, jedoch unter bevorzugten Bedingungen werden etwa 85 bis98 Gew.-% des Produkts von der Einschlußverbindung der Gastverbindung mit Cyclodextrin (d.h. der Einschlußverbindung gemäß der Erfindung) eingenommen, und der Rest besteht aus 1 bis 15 Gew.-% freiem Cyclodextrin, ohne Einschluß der Gastverbindung, und 0,1 bis 0,5 Gew.-% der Gastverbindung, die in einem an der Oberfläche des Cyclodextrins klebendem Zustand vorhanden ist. Der Gehalt an Gastverbindung, der in die Ein-Schlußverbindung eingeschlossen ist, beträgt 4 bi 15 Gew.-%.

Die wie vorstehend hergestellte weiße pulverförmige Substanz kann als solche zur Herstellung der Arzneimittel oder der Nahrungsmittel verwendet werden, falls jedoch die Verunreinigung mit freiem Cyclodeydrin nicht gewünscht ist, kann dieses leicht entfernt werden, da es in Wasser sehr gut löslich ist.

Zusätzlich kann, obwohl die Gastverbindungen, wie EPA und DHA gewöhnlich aus dem Fettsäurengemisch erhalten werden, die durch Verseifen des natürlichen Fischöls hergestellt werden, beispielsweise Sardinenöl, gefolgt vom Isolieren und von der Reinigung, das Gemisch der Fettsäuren alssolches in eine Einschlußverbindung eingebracht werden. In einem derartigen Falle ist das Zusammensetzungsverhältnis des Gemische der Fettsäuren, wie es ist, in der Einschlußverbindung erhalten. Das Produkt, das hergestellt wird, unter Anwendung des natürlichen Gemische von Fettsäuren, ist ebenfalls eine weiße pulverförmige Substanz ohne Geruch und kann als Rohmaterial zur Herstellung von Arzneimitteln und Nahrungsmitteln verwendet werden. Dementsprechend ist es bei der Herstellung der Einschlußverbindung nicht immer notwendig, die Gastverbindung von dem natürlichen Fettsäurengemisch, das durch Verseifung von Sardinenöl und dgl. erhalten wurde, zu

25 isolieren und zu reinigen.

Obwohl, wie festgestellt, EPA und DHA gegenüber Luftsauerstoff instabil sind und mit dem Sauerstoff Peroxide bilden, absorbiert die Gastverbindung, wie EPA und DHA, die in Cyclodextrin eingeschlossen ist, kaum gasförmigen Sauerstoff, und ist extrem stabilisiert. Im Falle der Reduktion durch gasförmigen Wasserstoff in Anwesenheit eines Wilkinson-Katalysators wurde die Einschlußverbindung der Gastverbindung Cyclodextrin unter den gleichen Bedingungen wie im Falle der freien Gastverbindung,

bei der sämtliche Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Doppelbindungen reduziert wurden, nicht reduziert. Dies besagt, daß die Doppelbindungen der Gastverbindung, die in Cyclodextrin eingeschlossen (käfigförmig) wurde, völlig durch das Cyclodextrin geschützt werden.

Auf diese Weise wurde erfindungsgemäß das Stabilitätsproblem, das durch Doppelbindungen in dem Molekül von EPA und DHA bewirkt wird, durch Klathratbildung gelöst, und die Einschlußverbindung (Klathrat) kann an der Luft bei Raumtemperatur, wie im Falle üblicher Substanzen, gehalten und behandelt werden. Während ihrer Lagerung besteht nicht die Gefahr der Exudation und der Isolierung der freien und öligen EPA oder DHA aus der Einschlußverbindung. Da zusätzlich die Einschlußverbindung gemäß der Erfindung reinweiß und geruchlos ist, können ihr leicht die gewünschte Farbe, der gewünschte Geruch und Geschmack gegeben werden, auch kann sie leicht zu verschiedenen Formen geformt werden.

Darüberhinaus können die eingeschlossene Gastverbindung d.h. EPA, DHA oder Alkalimetallsalz und Ester davon in der Einschlußverbindung gemäß der Erfindung leicht als ursprüngliche Gastverbindung nach folgender Methode wiedergewonnen werden. Die Einschlußverbindung wird in einem Gemisch von Wasser und einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel gelöst, und die Lösung wird einer Extraktion mit einem nichtpolaren organischen Lösungsmittel, wie Hexan, Benzol, Toluol, und dgl. unterzogen. Nach dem Abdestillieren des organischen Lösungsmittels von der organischen Schicht des Extrakts kann die ursprüngliche Gastverbindung leicht gewonnen werden. Als wasserlösliches organisches Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol, Aceton, Tetrahydrofuran bevorzugt, und das 1:1 Vol.-Gemisch von Wasser und Tetrahydrofuran ist besonders bevorzugt.

Obwohl es bekannt ist, daß Cyclodextren Einschlußverbindungen mit verschiedenen Verbindungen bildet, beispielsweise einer medizinischen Verbindung iwie Prostaglandin, (Prostagrandin), Vitamin A, Chloramphenicol usw., und einer landwirtschaftlichen Chemikalie, wie Dichlorvos, Pyrethrin usw., und Einschlußverbindungen von Cyclodextrin, in dem geradkettig strukturierte Fettsäuren oder ungesättigte Fettsäuren, die weniger als 3 Doppelbindungen eingeschlossen sind, ebenfalls bekannt waren, waren Einschlußverbindungen von Cyclodextren, in denen eine Fettsäure mit mehr als 20 Kohlenstoffatomen mit mehr als 5 Doppolbindungen, wie E]PA und DHA, eingeschlossen sind, nicht bekannt.

Im folgenden-'Wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Beispiele näher erläutert, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.

In den Beispielen bedeutet das Wort " Fettsäure oder Ester davon" EPA, DHA, oder Ester davon, auch wenn gereinigtes EPA, DHA oder Ester davon für die Herstellung der Einschlußverbindung verwendet werden, und im Falle des Gemischs von Fettsäuren, das hauptsächlich EPA, DHA oder Ester davon enthält, wird das gesamte Gemisch gemeint.

Im folgenden wird die Verfahrensweise zum Analysieren der Einschlußverbindung gemäß der Erfindung erläutert, die in den folgenden Beispielen praktisch angewendet wurde.

30

Die rohe Einschlußverbindung, die in vorstehend erwähnter Weise hergestellt wurde, enthält die Fettsäure oder die Ester davon, anhaftend an der Oberfläche von Cyclodextrin (bezeichnet als "A" in den Beispielen) und freies Cyclodextrin (bezeichnet als "B" in den Beispielen)

zusammen mit der gesamten Fettsäure oder dem Ester davon (bezeeichnet als "C" in dem Beispiel). Die Gew.-% von A, B und C und die Fettsäure oder Ester davon, die tatsächlich in die Einschlußverbindung eingeschlossen sind, (in den Beispielen als "D" bezeichnet) werden nach der folgenden Methode bestimmt.

A) Methode zur Bestimmung von "A"

Nach dem Rühren von 2 g einer genau gewogenen Probe in 30 ml η-Hexan zur Auflösung der anhaftenden Fettsäure und des Esters davon, wurde der Rückstand durch Filtrieren gesammelt und mit η-Hexan gewaschen, und das η-Hexan wurde unter verringertem Druck in dem vereinten Filtrat und den Waschlösungen abdestilliert. Anschließend wurde im Falle der Fettsäure , die als freie Säure als Ausgangsmaterial verwendet wurde, der Rückstand in 50 ml wässriger 50 Vol.-% äthanolischer Lösung gelöst, und die freie Säure wurde mit wässriger n/10-Lösung Natriumhydroxid titriert. Außerdem wurde in dem Fall der Verwendung eines Esters derFettsäure als Ausgangsmaterial der vorstehend erwähnte Rückstand in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung wurde einer Gaschromatographie unter folgenden Bedin-

25 gungen unterzogen:

Innere Standardverbindung: 4,5,6,7-Tetrachlorphthalid Säule: Glassäule von 3 mm Innendurchmesser und 2m Länge, gefüllt mit DEGS-10 %, 0,250 bis 0,177 mm (60 bis 80 mesh)
Temperatur: 200°C
Trägergas: Helium
Detektor: FID-Detektor

B) Methode zur Bestimmung von "B"

Nach dem Rühren von 2 g einer genau gewogenen Probe in 30 bis 100 ml Wasser zur Auflösung von freiem Cyclodextrin in der Probe in Wasser, wird der nichtgelöste Rückstand durch Filtrieren gewonnen, und mit etwa 10 ml Wasser gewaschen. Das vereinte Filtrat und die Waschlösungen werden unter verringertem Druck kondensiert und unter verringertem Druck bei 70 bis 80°C auf konstantes Gewicht getrocknet. Die Menge an getrocknetem Rückstand wird gewögen, wodurch man den Gehalt an freiem Cyclodextrin findet.

C) Methode zur Bestimmung von "C"

Nach dem Auflösen von 1 g einer genau gewogenen Probe in 150 ml eines 1:1-Gemischs von Wasser und Tetrahydrofuran in vollständiger Weise, werden 30 ml n-Hexan zu der Lösung unter gutem Rühren gefügt, und anschließend werden 100 ml Wasser weiter zu dem Gemisch unter Rühren gefügt, um die Fettsäure und den Ester davon in η-Hexan zu extrahieren. Die Extraktion mit jeweils ml η-Hexan wird zwei weitere Male wiederholt. Nach dem Abdestillieren des η-Hexans von der n-Hexanschicht unter verringertem Druck werden die gleichen Vorgänge, wie unter A beschrieben, durchgeführt, um die Menge des n-Hexanextrakts zu bestimmen.

D) Methode zur Bestimmung von"D"

Die Gew.-%-Menge an "D" wird nach folgender Formel berechnet:

D (Gew.-%) =

Herstellung der Einschlußverbindung

Bei spiel

In 5 1 einer wassr . 60 Vol-% methanolischen Lösung, bestehend aus 2,4 1 Methanol und 1,6 1 Wasser, werden 10,0 g Eicosapentaensäure mit einer Reinheit von 99,3 Gew.-% und 57 g ß-Cyclodextrin gefügt, und das Gemisch wurde unter einem Rückflußkühler unter Rühren während etwa 60 min erwärmt. Beim Kühlen des Reaktionsgemisch in einer Kühlgeschwindigkeit von 0,2°C/min unter Rühren schied sich eine Einschlußverbindung von Eicosapentaensäure mit ß-Cyclodextrin aus. Nach dem Kühlen auf 15°C und Rühren während 2 h bei der gleichen Temperatur wurde die Ausfällung durch Filtrieren gesammelt, mit etwa 100 ml wässriger Vol-% methanolischer Lösung gewaschen und unter einem Vakuum auf einem Wasserbad bei 60 bis 80°C auf konstantes Gewicht getrocknet. Man erhielt so 58,4 g der Einschlußverbindung, die folgende analytische Daten zeigte

20 nach der vorstehenden Analysenmethode:

A 0,3 Gew.-%

B 5,4 Gew.-%

C 9,0 Gew.-%

25 D 9,2 Gew.-%

Beispiel 2

In 4 1 wässriger 70 Vol.-% äthanolischer Lösung, bestehend aus 2,8 1 Ethanol und 1,2 1 Wasser wurden 15 g Methyl-eicosapentaenoat mit einer Reinheit von 92,5 Gew.-% und 100 g 0 -Cyclodextrin gefügt, und das Gemisch wurde unter einem Rückflußkühler unter Rühren während etwa 60 min gerührt.

Beim Kühlen des Reaktionsgemische mit einer Kühlgeschwindigkeit von 0,3 C/min unter Rühren wurde eine Einschlußverbindung von Methyl-eicosapentaenoat mit | -Cyclodextrin abgeschieden. Nach dem Kühlen auf 15 C und Rühren während 3 h der gleichen Temperatur wurde die Ausfällung durch Filtrieren gesammelt, mit 150 ml wässriger 70 Vol-% äthanolischer Lösung gewaschen unter einem Vakuum am Wasserbad bei 60 bis 80 C auf konstantes Gewicht getrocknet. Man erhielt so 107 g der Einschlußverbindung mit folgenden analytischen

10 Daten:

A 0,2 Gew.

B 8,5 Gew.

C 9,3 Gew.

15 D 10,0 Gew.

Beispiel 3

In 4 1 wässrige 70 Vol-% ethanolische Lösung, bestehend aus 2,8 1 Ethanol und 1,2 1 Wasser, wurden 15 g Ethyldocosahexaenoat in einer Reinheit von 95,8 Gew.-% und 100 g cc -Cyclodextrin gefügt, und das Gemisch wurde unter einem Rückflußkühler unter Rühren während etwa 60 min erwärmt. Beim Kühlen des Reaktionsgemische mit einer Kühlgeschwindigkeit von 0,2 C/min unter Rühren schied sich eine Einschlußverbindung von Ethyl-docosahexaenoat mit oi- -Cyclodextrin aus. Nach dem Kühlen auf 1 5°C und Rühren während etwa 3 h bei der gleichen Temperatur wurde die Ausfällung durch Filtrieren gesammelt, mit etwa 150 ml wässriger 70 Vol-% ethanolischer Lösung gewaschen und unter einem Vakuum am Wasserbad bei 60 bis 80 C auf konstantes Gewicht getrocknet. Man erhielt so 105,2 g der Einschlußverbindung mit folgenden analytischen Daten:

A	0,3	Gew.-%
B	7,7	Gew.-%
C	7,3	Gew.-%
D	7,6	Gew.-%

Beispiel 4

In 4 1 einer wässrigen 70 Vol.-% ethanolischen Lösung, bestehend aus 2,8 1 Ethanol und 1,2 1 Wasser, wurden 20 g eines Gemischs von Fettsäuren, erhalten durch Verseifen eines natürlichen Sardinenöls, enthaltend 12,8 Gew.-% Eicosapentaensäure und 7,6 Gew.-% Docosahexaensäure und 1OO g ß-Cyclodetrin, gefügt, und das Gemisch wurde unter einem Rückflußkühler unter Rühren während etwa 60 min erwärmt. Beim Kühlen des Reaktionsgemische in einer Kühlgeschwindigkeit von 0,2°C/min unter Rühren schied sich eine rohe Einschlußverbindung ab. Nach dem Kühlen auf 15 C und Rühren während etwa 3 h bei der gleichen Temperatur wurde die erhaltene Ausfällung durch Filtrieren gewonnen, mit 150 ml wässriger 70 Vol-% ethanolischer Lösung gewaschen und unter Vakuum am Wasserbad bei 50 bis 60 C auf konstantes Gewicht getrocknet. Man erhielt so 102,8 g der Einschlußverbindung mit folgenden analytischen Daten:

A	0,6	Gew
B	5,5	Gew
C	11,7	Gew
D	11,8	Gew

In 2 1 eines 2:3-Gewichts-Gemischs Tetrahydrofuran und Wasser wurden 20 g der so erhaltenen Einschlußverbindung zur Auflösung durch Rühren gefügt. Nach dem Auflösen der Einschlußverbindung wurden 300 ml Hexan zu der Lösung

gefügt, und das Gemisch wurde gut gerührt und anschließend wurden 2 1 Wasser zu dem Gemisch gefügt und es wurde gerührt. Schließlich wurde die überstehende Hexanschicht entfernt, und die wässrige Phase wurde mit jeweils 300 ml Hexan zweimal extrahiert. Die Hexanextrakte wurden vereint, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Durch Abdestillieren des Hexans von dem gewünschten Extrakt unter verringertem Druck erhielt man 2,3 g einer öligen blaßgelben Substanz. Nach dem Methylieren der öligen Substanz durch Einbringen in 100 ml Methanol und Zusatz einiger Tropfen konzentrierter Schwefelsäure unter Erwärmen unter einem Rückflußkühler während 2 h wurden 30 ml Wasser zu dem Reaktionsgemisch gefügt und das Gemisch wurde dreimal mit jeweils 50 ml Hexan extrahiert. Die Hexanextrakte wurden vereint, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und einer Destillation unter verringertem Druck unterzogen, unter Bildung von 1,8 g des Methylesters des Gemischs der Fettsäuren. Durch Unterziehen des Reaktionsprodukts einer Gaschromatographie wie vorstehend erwähnt wurde gefunden, daß das Zusammensetzungsverhältnis der erhaltenen Fettsäureester das gleiche war, wie das des Sardinenöls, das zur Herstellung des Methylesters verwendet wurde.

Beispiel 5

In 4 1 wässrige 70 Vol.-% ethanolische Lösung, bestehend aus 2,8 1 Ethanol und 1,2 1 Wasser, wurden 20 g des Methylesters von Sardinenölfettsäure, enthaltend 13,5 Gew.-% Methyl-eicosapentaenoat und 6,4 Gew.-% Methyl-docosahexaenoat (ein Gemisch der Methylester, erhalten durch Verestern von natürlichem Sardinenöl mit Methanol) gefügt und 100 g ß-Cyclodextrin wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde

unter einem Rückflußkühler unter Rühren während etwa 60 min erwärmt. Beim Kühlen des Reaktionsgemischs mit einerKühlgeschwindigkeit von 0,2 C/min unter Rühren schied sich die rohe Ein Schlußverbindung aus. Nach dem Kühlen auf 15 C und Rühren während etwa 3 h bei der gleichen Temperatur wurde die Ausfällung durch Filtrieren gesammelt, mit wässriger 70 Vol.-% ethanolischer Lösung gewaschen und unter einem Vakuum am Wasserbad bei 50 bis 60 C auf konstantes Gewicht getrocknet. Man erhielt so 104,2 g der Einschluß-

10 verbindung mit folgenden analytischen Daten:

A	0,2	Gew
B	6,4	Gew
C	12,5	Gew
D	13,2	Gew

In 2 1 eines 2:3-Vol-Gemischs von Tetrahydrofuran und Wasser wurden 20 g der so erhaltenen Einschlußverbindung gefügt und nach dem Zusatz von 300 ml Hexan zu der Lösung unter Rühren wurden weiter 2 1 Wasser zu dem Gemisch zur Durchführung der Extraktion gefügt. Die Extraktion wurde zweimal mit jeweils 300 ml Hexan wiederholt und die Hexanextrakte wurden vereint, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Durch Abdestillieren des Hexans von dem getrockneten Extrakt unter verringertem Druck erhielt man 2,5 g blaßgelbe ölige Substanz. Unterzog man die ölige Substanz der vorstehend erwähnten gaschromatographischen Analyse, so zeigte sich, daß das Gew.-Verhältnis der Fettsäuren, die in der Einschl'ußverbindung enthalten waren, identisch den der Zusammensetzung der Fettsäuren des Sardinenöls war, das in diesem Beispiel verwendet wurde.

Beispiel 6

In 100 ml Ethanol und 60 ml Wasser wurden 4,0 g Natriumeicosapentaenoat mit einer Reinheit von 99,2 Gew.-% und 10 g ß-Cyclodextrin gefügt, und das Gemisch wurde unter einem Rückflußkühler unter Rühren während etwa 60 min erwärmt. Beim Kühlen des Reaktionsgemische in einer Kühlgeschwindigkeit von 0,2 C/min unter Rühren schied sich eine Einschlußverbindung ab. Nach dem Kühlen auf 15 C und Rühren bei der gleichen Temperatur während etwa 3 h wurde die Ausfällung durch Filtrieren gewonnen, mit 30 ml wässriger 67 Vol.-% ethanolischer Lösung gewaschen und unter einem Vakuum im Wasserbad bei 50 bis 60°C auf konstantes Gewicht getrocknet. Man erhielt so 10,0 g einer Einschlußverbindung. Beim Zusatz von 28 ml Tetrahydrofuran und 42 ml Wasser zu 2,2432 g der so erhaltenen Einschlußverbindung und Durchführen der Titration mit wässriger n/10-Chlorwasserstoffsäurelösung wurde gefunden, daß die Menge an in der Einschlußverbindung erhaltenem Natrium-

20 eicosapentaenoat 4,4 Gew.-% betrug.

Stabilitätstest
25

Versuch

Die durch die jeweiligen Einschlußverbindungen gemäß der Verbindung bei 35°C absorbierte Sauerstoffmenge wurde unter Verwendung eines Warburg-Manometers im Verlauf der Zeit bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I aufgeführt.

Aus der Tabelle I ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Einschlußverbindung nicht wesentlich Sauerstoff absorbierte, mit anderen Worten, sie wurde kaum oxidiert.

Tabelle

Einheit: Mikroliter

Probe

Menge (mg) Menge an absorbiertem Sauerstoff nach h
72 120 168

Eicosapentaensäure 120

Einschlußverbindung von

Beispiel 1 (als Eicosapen- 1333,3

taensäure) (120)

Methyleicosapentaenoat 120

Einschlußverbindung von Beispiel 2 (als Methyleicosa- 1290,3 pentaenoat) (120)

Ethyl-docosahexaenoat 120

Einschlußverbindung von Bei- 1643,8 spiel 3 (als Ethyldocosahexaenoat) (120)

Fettsäure von Sardinenöl 250

Einschlußverbindung von Beispiel 4 (als Fettsäure von 2136,8 Sardinenöl) (250)

Methylester der Fettsäure von Sardinenöl 250

Einschlußverbindung von Beispiel 5 (als Methylester der 2000,0 Fettsäure von Sardinenöl) (250)

7,2	13,0	16,1	17,5
0,2	0,4	0,4	0,4
7,5	13,9	16,6	18,0
0	0,2	0,4	0,4
7,4	14,0	16,5	17,7
0,2	0,2	0,2	0,2
5,5	8,8	10,0	11 ,7
0	0,2	0,3	0,4
5,7	9,3	10,3	12,2
0	0,2	0,2	0,4

co

K) K)

cn ro

CO K)

Versuch

Die jeweiligen erfindungsgemäßen Einschlußverbindungen wurden einer Hydrierung bei 24 C durch gasförmigen Wasserstoff in Anwesenheit eines Wilkinson-Katalysators {_ Rh-P (C^-H₁.) _ 7.

Jeweils 1 g der Einschlußverbindungen der Beispiele 1 bis 5 wurden zu 300 ml Benzol gefügt, und nach Zusatz von 0,1 g Wilkinson-Katalysator zu dem Gemisch wurde gasförmiger Wasserstoff durch das Gemisch während etwa 4 h zur Durchführung der Hydrierung geleitet. Anschließend wurde das Benzol unter verringertem Druck von dem Reaktionsgemisch abdestilliert, und nach Auflösen des Rückstands in 150 ml eines 1:1 Vol.-Gemischs von Tetrahydrofuran und Wasser und Zusatz von 50 ml Hexan und 100 ml Wasser zu der Lösung wurde die Extraktion durchgeführt. Im Falle der Einschlußverbindungen der Beispiele 2, 3 und 5 wurde der Extrakt kondensiert und einer gaschromatographischen Analyse unter den gleichen Bedingungen wie vorher unterzogen, und im Falle der Einschlußverbindungen der Beispiele 1 und 4 wurde der Extrakt nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels von dem Extrakt unter verringertem Druck, in Methanol, gefügt, durch Zusatz von Schwefelsäure verestert und anschließend der gaschromatographischen Analyse unterzogen.

Es zeigte sich, daß die Zusammensetzung der Fettsäure in dem ursprünglichen Fettsäuregemisch unverändert in den Einschlußverbindungen beibehalten wurde und daß bei der Hydrierungsstufe keine Reduktion auftrat.

Außerdem wurden jeweils Eicosapentaensäure, ihr Methylester, Ethyldocosahexaenoat, Fettsäure von Sardinenöl und ihr Methylester einer Hydrierung unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend unterzogen und anschließend der gaschromatographischen Analyse unterzogen, wobei sich zeigte, daß

sämtliche Kohlenstoff-zu-Kohlenstoff-Doppelbindungen in jeder hydrierten Verbindung reduziert wurden, unter Bildung der gesättigten Fettsäure oder des Esters davon .

Claims

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Nihonbashi, Chuo-ku

Tokio, Japan 22 050

Einschlußverbindung von Eicosapentaensäure oder Docosahexaensäure mit Cyclodextrin und Verfahren zu deren Herstellung

Patentansprüche

. Einschlußverbindung von Cyclodextrin, in der mindestens eine Gastverbindung, ausgewählt aus der Gruppe von Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure und Alkalimetallsalzen oder Alkylestern davon, eingeschlossen ist.
2. Einschlußverbindung nach Anspruch 1, in die 4 bis 15 Gew.-% der Gastverbindung eingeschlossen sind.
3. Exnschlußverbindung nach Anspruch 1, in der das Alkalimetallsalz Natrium- oder Kaliumsalz ist.
4. Einschlußverbindung nach Anspruch 1, in der der

Alkylester Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylester ist.
5. Einschlußverbindung nach Anspruch 1, in der das 5 Cyclodextrin al-, ß- oder 0-Cyclodextrin ist.
6. Verfahren zur Herstellung einer Einschlußverbindung von Cyclodextrin, in der mindestens eine Gastverbindung, ausgewählt aus der Gruppe von Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure und Alkalimetallsalzen und Alkylestern davon eingeschlossen ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein bis vier Gew.-Teile der Gastverbindung und 5 bis 10 Gew.-Teile Cyclodextrin in einem Lösungsmittel durch Erwärmen in einem Strom eines inerten Gases auflöst und anschließend langsam eine so erhaltene Lösung unter Rühren zur Ausfällung abkühlt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel eine wässrig-alkoholische

Lösung, Aceton oder Tetrahydrofuran einsetzt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrig-alkoholische Lösung einsetzt, die 40 bis 80 Vol.-%, vorzugsweise 60 bis 70 Vol.-%, Alkohol enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung mit einer Kühlungsrate von

0,1 bi,

kühlt.

0,1 bis 0,5°C/min, vorzugsweise von 0,2 bis 0,3°C/min
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkalimetallsalz Natrium- oder Kaliumsalz einsetzt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylester Methyl-, Ethyl-Propyl- oder Butylester einsetzt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cyclodextrin <*£--, β- oder 0 -Cyclodextrin einsetzt.