DE2719704A1

DE2719704A1 - Verfahren zur bestimmung der lipase-aktivitaet, fuer die bestimmung zu verwendendes reagenz und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2719704A1
Application number: DE19772719704
Authority: DE
Inventors: Earl Browning Huntley; Warren Keene Miller
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1976-05-04
Filing date: 1977-05-03
Publication date: 1977-11-24
Also published as: LU77256A1; IE44834L; IT1114613B; DK194577A; BE854219A; NL7704782A; JPS52134499A; FR2350604B1; GB1530238A; CH628929A5; CA1109373A; IE44834B1; FR2350604A1

Description

VON KREISLER SCHÖNWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING

PATENTANWÄLTE

Dr.-Ing. von Kreisler ~t~ 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Iny. G. Sellincj, Köln

5 KÖLN 1

OtlUli.'.ANNii,>lJj AM HAUI¹ILAhNHOt

28. April 1977 ΔνΚ/Λχ

E.I. Du Pont de Nemours and Company
Viilmington, Del. ,USA

Verfahren zur Bestimmung der Lipase-^ktivität, für die Bestimmung zu verwendendes Reagenz und Verfahren zu seiner Herstellung

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Telefon : (02 211 23 45 41 - 4 ■ Tt It» . S ί 7107 dopa J Γ.·., ._:rj,i-,r. .

Verfahren zur Bestimmung der Lipase-Aktivität,

für die Bestimmung zu verwendendes Reagenz und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Lipaseaktivitnt einer Probe durch Umsetzung der Probe mit einer Triglyceridemulsion und ein Verfahren zur Herstellung des zur Bildung der Emulsion verwendeten Triglycerid-Reagenz.

Lipase ist ein durch die Bauchspeicheldrüse gebildetes Enzym. Die Lipase-Aktivität im Blut oder im Blutserum wird durch Pankreatitis und andere Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse erhöht. Ein Maß der Lipase-Aktivität im Blut oder Blutserum ist daher ein wertvolles diagnostisches Hilfsmittel für den Arzt.

Eine traditionelle Methode zur Messung der Lipase-Aktivität ist die von Shihabi und Bishop in Clinical Chemistry 17 (1971) 1150-1153 beschriebene turbidimetrische Methode, bei der die Verringerung der Extinktion einer Olivenöl-Wasser-Emulsion zur Lipase-Aktivität in Beziehung gebracht wird. Olivenöl ist ein Gemisch von Substanzen, die mit dem Sammelbegriff Triglycerid bezeichnet v/erden. Wenn es in wäßriger Lösung gemischt wird, bildet Triglycerid eine Emulsion. Auf diese Emulsion fallendes Licht wird durch die öltröpfchen zerstreut, so daß sehr wenig Licht durch die Emulsion durchgelassen wird. Lipase hydrolysiert das Triglycerid zu Fragmenten, die im Reaktionsgemisch löslich sind. Während das Triglycerid hydrolysiert wird, wird die Lichtstreuung durch die Emulsion geringer, und die Lichtdurchlässigkeit des Mediums steigt.

Zur Zeit wird angenommen, daß die Lipase das Triglycerid an der Flüssigkeits-Öl-Grenzflache angreift, so daß der emulgierte Zustand des Triglycerids für die Reaktion wichtig ist. Angesichts dieser Wichtigkeit sind die heutigen Verfahren zur Bildung der Triglyceridemulsion

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unzureichend. Triglyceridemulsionen, die in einem Homogenisator, z.B. einem Mischer, oder durch ein Lösungsmittel-Wasser-Gemisch gebildet werden, haben begrenzte Haltbarkeit (4 bis 8 Wochen). Außerdem sind sie schwierig herzustellen und im allgemeinen nicht reproduzierbar.

Beide Nachteile begrenzen die Brauchbarkeit der Bestimmung in automatischen Analysatoren.

Gegenstand der Erfindung ist eine Methode zur Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Probe durch Umsetzung der Probe mit einer Emulsion eines Triglycerids in einer wäßrigen Reaktionslösung und Messung der Geschwindigkeit, mit der das Triglycerid zu löslichen Fragmenten hydrolysiert wird. Die Emulsion wird gebildet, indem man al? Triglycerid-Reagenz eine feste Matrix aus einem in der wäßrigen Reaktionslösung löslichen Hilfsstoff , der gleichmäßig mit dem Triglycerid imprägniert ist, auflöst und hierdurch das Triglycerid als Emulsion in die wäßrige Reaktionslösung freigibt.

Bei der bevorzugten Ausführungsform wird als Hilfsstoff Polyäthylengiykol und ein Zucker oder Zuckeralkohol, z.B. Mannit, Inosit, Sorbit, Maltose, Dextrose, Lactose, Dextran oder deren Gemisch, verwendet. Dieser Hilfsstoff wird mit Triolein, einem der hauptsächlichen Triglyceride, imprägniert.

Die Erfindung umfasst ferner die Herstellung eines Reagenz für die Verwendung in Verbindung mit einer wäßrigen Reaktionslösung zur Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Probe nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) eine flüssige Lösung wenigstens eines Triglycerids (z.B. Triolein) mit einem Lösungsmittel für dieses Triglycerid bildet,

b) die flüssige Lösung mit einer vorbestimmten Menge eines in der wäßrigen Reaktionslösung löslichen Hilfsstoffs

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mischt, wobei man das Volumen des zur Bildung der flüssigen Lösung verwendeten Lösungsmittels so wählt, daß der Hilfsstoff im wesentlichen gesättigt ist, und

c) das Lösungsmittel abdampft, so daß eine feste Matrix aus dem mit dem Triglycerid imprägnierten Hilfsstoff zurückbleibt, wobei man die zur Bildung der flüssigen Lösung verwendete Menge des Triglycerids so wählt, daß die gewünschte Konzentration an Triglycerid pro Gewichtseinheit der festen Matrix erhalten wird.

Die erste Stufe beim Verfahren zur Herstellung des Triglycerid-Reagenz für die Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Probe, insbesondere einer Blutprobe oder Blutserumprobe, besteht darin, daß das Triglycerid in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst wird. Das Triglycerid ist ein Substrat für die Lipase. Bisher wurde gereinigtes Olivenöl oder Triolein, eines der hauptsächlichen Triglyceride, verwendet. Der Einfachheit halber wird die Erfindung nachstehend im Zusammenhang mit der Verwendung von Triolein beschrieben, jedoch reagiert Lipase mit jedem Triglycerid, so daß jedes Triglycerid oder jede Kombination von Triglyceriden für die Zwecke der Erfindung verwendet werden kann.

Das zum Auflösen des Triglycerids verwendete Lösungsmittel hängt natürlich vom gewählten Triglycerid ab. Zahlreiche Lösungsmittel für Triglyceride sind bekannt. Das zur Bildung des Trigylcerid-Reagenz gemäß der Erfindung verwendete Lösungsmittel muß vier Voraussetzungen erfüllen: Es muß das jeweils verwendete Triglycerid lösen. Es darf den jeweils verwendeten Hilfsstoff nicht lösen. Es muß unter Bedingungen, die das Triglycerid oder den Hilfsstoff nicht schädigen, verdampfen. Schließlich darf es keinen Rückstand oder höchstens nur einen inerten Rückstand, d.h. einen Rückstand, der mit dem anderen verwendeten Reagenz nicht reaktionsfähig oder nicht schädlich dafür ist,

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-β-

hinterlassen.

Lösungsmittel wie Chloroform und Äthanol lösen Triolein. Es wurde gefunden, daß Chloroform oder Äthanol oder Gemische von Chloroform mit vorzugsweise bis zu etwa 5O% Äthanol eine gleichmäßige Lösung des Trioleins bilden.

Das Volumen des zum Auflösen des Triglycerids verwendeten Lösungsmittels wird so gewählt, daß beim Zusammenführen der flüssigen Triglyceridlösung mit dem Hilfsstoff die Flüssigkeit das feste Material gerade sättigt. Wenn zu wenig Lösungsmittel verwendet wird, wird das Lösungsmittel und damit das Triglycerid ungleichmäßig im Feststoff verteilt. Wenn das Pulver zerteilt wird, entstehen Reagenzteile mit unterschiedlichen Triglyceridkonzentrationen. Wenn zuviel Lösungsmittel verwendet wird, wird der Feststoff nicht von der gesamten Lösung, insbesondere nicht von dem gesamten darin enthaltenen Triglycerid imprägniert. Wenn man den Feststoff vor dem Trocknen abtropfen läßt, ist ein Verlust eines Teils des Triglycerids die Folge; falls nicht, wird der Feststoff von dem Teil des Triglycerids, der in der Lösung enthalten ist, die den Feststoff nicht imprägniert, ungleichmäßig umhüllt. In Abhängigkeit von der erforderlichen Genauigkeit können alle diese Bedingungen in Kauf genommen werden, jedoch sollte die verwendete Lösungsmittelmenge zur Erzielung bester Ergebnisse so gewählt werden, daß die Triglyceridlösung das feste Material im wesentlichen sättigt.

Die in der Lösung verwendete Triglyceridmenge ist eine Angelegenheit der Wahl. Die Menge sollte so gewählt werden, daß die gewünschte Triglyceridkonzentration für ein gegebenes Volumen der festen Matrix, die durch Abdampfen des Lösungsmittels gebildet wird, erhalten wird.

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Gemäß Definition ist ein Hilfsstoff eine inerte Substanz, die einen Träger für ein bestimmtes Reagenz, im vorliegenden Fall das Triglycerid, bildet. Der zur Bildung der festen Matrix gemäß der Erfindung gewählte Hilfsstoff muß drei Bedingungen erfüllen:Er darf sich in dem zum Auflösen des Triglycerids gewählten Lösungsmittel nicht lösen. Er muss das Medium, in dem die Lipaaebestimnung vorgenommen wird, lösen. Diese Auflösung ist erforderlich ,um das Triglycerid in die Reaktionslösung zur Bildung der Emulsion freizugeben.Die Reaktionslösung ist normalerweise eine wässrige Lösung,die bei einem pll zwischen etwa 8,5 und 9,5 gehalten wird. Schließlich muß der Hilfsstoff inert und bei der Bestimmung nicht nachweisbar sein. Es gibt zahlreiche bekannte Stoffe, die als Hilfsstoffe für die Zwecke der Erfindung geeignet sind. Gebräuchlich hiervon sind Zucker und Zuckeralkohole, z.B. Mannit, Inosit, Sorbit, Maltose, Dextrose, Lactose, Dextran und Gemische dieser Stoffe.

Eine gleichmaßigere Verteilung des Triglycerids in der festen Matrix wird erreicht, wenn außer den vorstehend genannten Substanzen Polyäthylenglykol verwendet wird. Geeignet ist beispielsweise das Produkt der Handelsbezeichnung "Carbowax 60O0". Diese Verbindung verhindert Agglomeration der Triglyceridtröpfchen in der festen Matrix und begünstigt die Bildung eines gleichmäßigen Überzuges der Triglyceridlösung auf der Oberfläche der festen Matrix. Das Polyäthylenglykol ist jedoch nicht unbedingt notwendig.

Nachdem das Triglycerid und das Lösungsmittel für das Triglycerid gewählt und unter Bildung der gewünschten Lösung gemischt worden sind, werden die Triglyceridlösung und der Hilfsstoff gemischt. Dies kann in verschiedener bekannter Weise erfolgen. Insbesondere kann ein mechanischer "Hobarf'-Mischer verwendet werden. Das Mischen wird so lange durchgeführt, bis der Hilfsstoff gerade gesättigt 709847/08 1 0

ist. Der gesättigte Hilfsstoff wird dann getrocknet, um das zum Auflösen des Triglycerids verwendete Lösungsmittel zu verdampfen, wobei eine feste Matrix, die gleichmäßig mit dem Triglycerid imprägniert ist, gebildet wird. Das Trocknen kann in verschiedener bekannter Weise erfolgen. Insbesondere kann mit Luft unter einem Abzug getrocknet werden. Die imprägnierte feste Matrix kann als Pulver verwendet oder unter Anwendung üblicher Tablettierverfahren tablettiert werden.

Nachstehend wird als spezielles Beispiel die Herstellung der mit dem Triglycerid imprägnierten Matrix beschrieben. 94 Teile Mannit und 5 Teile Polyäthylenglykol "Carbowax 6OOO" werden zur Bildung eines Hilfsstoffs gemischt. 1 Teil Triolein wird in einem Gemisch von 50% Chloroform und 5O% Äthanol gelöst. Die Lösungsmittelmenge wird so gewählt, daß beim Mischen mit dem Hilfsstoff ein festes Gemisch, das gerade gesättigt ist, gebildet wird. Das Lösungsmittelgemisch, das das Triolein enthält, wird dann zum Gemisch aus Mannit und Polyäthylenglykol "Carbowax 6000" in einem mechanischen "Hobart"-Mischer gegeben, worauf 30 Minuten gemischt wird. Der in dieser Weise gebildete gesättigte Hilfsstoff wird dann 60 Minuten oder bis zum vollständigen Abdampfen des Lösungsmittels unter einem Abzug an der Luft getrocknet. Hierbei wird eine feste Matrix gebildet, die mit Triolein gleichmäßig imprägniert ist. Diese feste Matrix liegt in Pulverform vor. Das imprägnierte Gemisch wird dann zu Tabletten von etwa 85 mg gepreßt, die ungefähr je 0,87 mg Triolein enthalten.

Eine Bestimmung der Lipase-Aktivität in menschlichem Serum wird dann nach einer kinetischen turbidiroetrischen Methode vorgenommen, bei der die Geschwindigkeit der "Klärung" der Triolein-Emulsion bei 34O nm überwacht wird. Diese Geschwindigkeit ist proportional der Lipase-Aktivitat der Probe. Calciumchlorid und Gallensalze werden als

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Aktivatoren für die Lipase verwendet.Das System wird ferner unter Verwendung von Tris(hydroxymethyl)aminomethan-("Tris")-Puffer gepuffert, der als pH-Regler (pH 8,6 bis 9,0) für die wäßrige Reaktionslösung dient. Die Reaktion verläuft wie folgt:

•v^4^T^i „™„i„4~». Ca , Lipase^ freie Fettsäuren + Trioleinemulsion —rt—— _s i-i_ ,-.·. j j

pH 8,8 (25 Cf gemischte Glyceride

(trübe) (abnehmende Trübung)

Nachstehend wird ein spezielles Beispiel einer Lipase-Bestimmung beschrieben:

Ein Bestimmungskästchen, das die folgenden Reagentien enthält, wird hergestellt:

Tris-Puffer, pH 8,8 + 0,2; 50 jiMol Desoxycholat 35,5 uMol

Calciumchlorid 0,7 uMol

Triolein (in der vorstehend 0,98 pMol beschriebenen Tablettenform)

Diese Reagentien werden zu 4,8 ml Wasser gegeben. Der Lösung wird eine Probe von 0,20 ml, die eine bekannte Lipasemenge enthält, zugesetzt. Durch leichtes Mischen löst sich der Hilfsstoff in der Tablette, wobei eine Triolein-Emulsion in der wäßrigen Reaktionslösung gebildet wird. Während das in der Probe enthaltene Lipase-Enzym mit der Triolein-Emulsion reagiert, werden freie Pettsäuren und gemischte Glyceride gebildet, wobei das Gemisch zunehmend optisch transparent wird. Es zeigt sich, daß die bei 340 nm überwachte Geschwindigkeit der "Klärung" der Triolein-Emulsion proportional der Lipase-Aktivität ist.

Die Verwendung der vorstehend beschriebenen Tabletten ergibt in hohem Maße reproduzierbare Emulsionen und verleiht dem Substrat Beständigkeit für lange Zeit (wenigstens zwölf Monate).

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Claims

Patentansprüche

/i. JVerfahren zur Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Probe —durch Umsetzung der Probe mit einer Emulsion eines Triglycerids in einer wäßrigen Reaktionslösung und Messung der Geschwindigkeit, mit der das Triglycerid zu löslichen Fragmenten hydrolysiert wiri, dadurch gekennzeichnet, daß man die Emulsion bildet, indem man eine feste Matrix aus einem gleichmäßig mit dem Triglycerid imprägnierten, in der wäßrigen Reaktionslösung löslichen Hilfsstoff in der wäßrigen Reaktionslösung löst und hierdurch das Triglycerid in die wäßrige Reaktionslösung freigibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Triglycerid Triolein verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hilfsstoff Zucker oder einen Zuckeralkohol verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,

daß man als Hilfsstoff Mannit, Inosit, Sorbit, Maltose,

Lactose,
Dextrose,/Dextran oder Gemische dieser Verbindungen verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Hilfsstoff zusätzlich Polyäthylenglykol enthält.
6. Reagenz für die Verwendung beim Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, bestehend aus einer festen Matrix aus einem gleichmäßig mit einem Triglycerid imprägnierten, in der wäßrigen Reaktionslösung löslichen Hilfsstoff.
7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es als Triglycerid Triolein enthält.
8. Reagenz für die Verwendung beim Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, bestehend aus einer festen Matrix aus einem gleichmäßig mit einem Triglycerid imprägnierten Hilfsstoff, der aus Polyäthylenglykol und einem Zucker oder

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ORIGINAL INSPECTED

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Zuckeralkohol aus der aus Mannit, Inosit, Sorbit, Maltose, Dextrose, Lactose, Dextran und Gemischen dieser Verbindungen bestehenden Gruppe besteht.
9. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es als Triglycerid Triolein enthält.
10. Verfahren zur Herstellung von Reagentien nach Anspruch 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine flüssige Lösung wenigstens eines Triglycerids mit einem Lösungsmittel für dieses Triglycerid bildet,

b) die flüssige Lösung mit einer vorbestimmten Menge des in der wäßrigen Reaktionslösung löslichen Hilfsstoffs bildet, wobei man das Volumen des zur Bildung der flüssigen Lösung verwendeten Lösungsmittels so wählt, daß der Hilfsstoff im wesentlichen gesättigt ist, und

c) das Lösungsmittel abdampft, so daß eine feste Matrix aus dem mit dem Triglycerid imprägnierten Hilfsstoff zurückbleibt, wobei man die zur Bildung der flüssigen Lösung verwendete Menge des Triglycerids so wählt, daß die gewünschte Konzentration an Triglycerid pro Gewichtseinheit der festen Matrix erhalten wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Chloroform verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel ein Gemisch von Chloroform und Äthanol verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Matrix aus dem mit dem Triglycerid imprägnierten Hilfsstoff tablettiert.

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