CH628929A5

CH628929A5 - Reagent for the determination of lipase activity and process for its preparation

Info

Publication number: CH628929A5
Application number: CH554077A
Authority: CH
Inventors: Earl Browning Huntley; Warren Keene Miller
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1976-05-04
Filing date: 1977-05-03
Publication date: 1982-03-31
Also published as: FR2350604B1; GB1530238A; FR2350604A1; IE44834L; JPS52134499A; DE2719704A1; CA1109373A; BE854219A; IE44834B1; NL7704782A; LU77256A1; DK194577A; IT1114613B

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenz zur Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Lösung, ein Verfahren zur Herstellung des genannten Reagenzes sowie eine Verwendung des Reagenzes zur Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Lösung.

Lipase ist ein durch die Bauchspeicheldrüse gebildetes Enzym. Die Lipase-Aktivität im Blut oder im Blutserum wird durch Pankreatitis und andere Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse erhöht. Ein Mass der Lipase-Aktivität im Blut oder Blutserum ist daher ein wertvolles diagnostisches Hilfsmittel für den Arzt.

Eine traditionelle Methode zur Messung der Lipase-Akti-vität ist die von Shihabi und Bishop in Clinical Chemistry 17 (1971) 1150-1153 beschriebene turbidimetrische Methode, bei der die Verringerung der Extinktion einer Olivenöl-Wasser-Emulsion zur Lipase-Aktivität in Beziehung gebracht wird. Olivenöl ist ein Gemisch von Substanzen, die mit dem Sammelbegriff Triglycerid bezeichnet werden. Wenn es in wässriger Lösung gemischt wird, bildet Triglycerid eine Emulsion. Auf diese Emulsion fallendes Licht wird durch die Ö1-iröpfchen zerstreut, so dass sehr wenig Licht durch die Emulsion durchgelassen wird. Lipase hydrolysiert das Triglycerid zu Fragmenten, die im Reaktionsgemisch löslich sind. Während das Triglycerid hydrolysiert wird, wird die Lichtstreuung durch die Emulsion geringer, und die Lichtdurchlässig-5 keit des Mediums steigt.

Zur Zeit wird angenommen, dass die Lipase das Triglycerid an der Flüssigkeits-Öl-Grenzfläche angreift, so dass der emulgierte Zustand des Triglycerids für die Reaktion wichtig ist. Angesichts dieser Wichtigkeit sind die heutigen Verfahren io zur Bildung der Triglyceridemulsion unzureichend. Triglyce-ridemulsionen, die in einem Homogenisator, z.B. einem Mischer, oder durch ein Lösungsmittel-Wasser-Gemisch gebildet werden, haben begrenzte Haltbarkeit (4 bis 8 Wochen). Ausserdem sind sie schwierig herzustellen und im allgemeinen 15 nicht reproduzierbar. Beide Nachteile begrenzen die Brauchbarkeit der Bestimmung in automatischen Analysatoren.

Das erfindungsgemässe Reagenz zur Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Lösung und ein Verfahren zur Herstellung des genannten Reagenzes sind in den vorangehenden Pa-20 tentansprüchen 1 bzw. 5 charakterisiert.

Bei der bevorzugten Ausführungsform wird als Hilfsstoff Polyäthylenglykol und ein Zucker oder Zuckeralkohol, z.B. Mannit, Inosit, Sorbit, Maltose, Dextrose, Lactose, Dextran oder deren Gemisch, verwendet. Dieser Hilfsstoff wird mit 25 Triolein, einem der hauptsächlichen Triglyceride, imprägniert.

Die erste Stufe beim Verfahren zur Herstellung des Tri-glycerid-Reagenzes für die Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Probe, insbesondere einer Blutprobe oder Blutserumprobe, besteht darin, dass das Triglycerid in einem geeigneten 30 Lösungsmittel gelöst wird. Das Triglycerid ist ein Substrat für die Lipase. Bisher wurde gereinigtes Olivenöl oder Triolein, eines der hauptsächlichen Triglyceride, verwendet. Der Einfachheit halber wird die Erfindung nachstehend im Zusammenhang mit der Verwendung von Triolein beschrieben, je-35 doch reagiert Lipase mit jedem Triglycerid, so dass jedes Triglycerid oder jede Kombination von Triglyceriden für die Zwecke der Erfindung verwendet werden kann.

Das zum Auflösen des Triglycerids verwendete Lösungsmittel hängt natürlich vom gewählten Triglycerid ab. Zahl-40 reiche Lösungsmittel für Triglyceride sind bekannt. Das zur Bildung des Triglycerid-Reagenzes gemäss der Erfindung verwendete Lösungsmittel muss vier Voraussetzungen erfüllen: Es muss das jeweils verwendete Triglycerid lösen. Es darf den jeweils verwendeten Hilfsstoff nicht lösen. Es muss unter Be-45 dingungen, die das Triglycerid oder den Hilfsstoff nicht schädigen, verdampfen. Schliesslich darf es keinen Rückstand oder höchstens nur einen inerten Rückstand, d.h. einen Rückstand, der mit dem anderen verwendeten Reagenz nicht reaktionsfähig oder nicht schädlich dafür ist, hinterlassen. 50 Lösungsmittel wie Chloroform und Äthanol lösen Triolein. Es wurde gefunden, dass Chloroform oder Äthanol oder Gemische von Chloroform mit vorzugsweise bis zu etwa 50% Äthanol eine gleichmässige Lösung des Trioleins bilden.

Das Volumen des zum Auflösen des Triglycerids verwen-55 deten Lösungsmittels wird so gewählt, dass beim Zusammenführen der flüssigen Triglyceridlösung mit dem Hilfsstoff die Flüssigkeit das feste Material gerade sättigt. Wenn zu wenig Lösungsmittel verwendet wird, wird das Lösungsmittel und damit das Triglycerid ungleichmässig im Feststoff verteilt. 60 Wenn das Pulver zerteilt wird, entstehen Reagenzteile mit unterschiedlichen Triglyceridkonzentrationen. Wenn zuviel Lösungsmittel verwendet wird, wird der Feststoff nicht von der gesamten Lösung, insbesondere nicht von dem gesamten darin enthaltenen Triglycerid imprägniert. Wenn man den Feststoff 65 vor dem Trocknen abtropfen lässt, ist ein Verlust eines Teils des Triglycerids die Folge; falls nicht, wird der Feststoff von dem Teil des Triglycerids, der in der Lösung enthalten ist, die den Feststoff nicht imprägniert, ungleichmässig umhüllt. In

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Abhängigkeit von der erforderlichen Genauigkeit können alle diese Bedingungen in Kauf genommen werden, jedoch sollte die verwendete Lösungsmittelmenge zur Erzielung bester Ergebnisse so gewählt werden, dass die Triglyceridlösung das feste Material im wesentlichen sättigt.

Die in der Lösung verwendete Triglyceridmenge ist eine Angelegenheit der Wahl. Die Menge sollte so gewählt werden, dass die gewünschte Triglyceridkonzentration für ein gegebenes Volumen der festen Matrix, die durch Abdampfen des Lösungsmittels gebildet wird, erhalten wird.

Gemäss Definition ist ein Hilfsstoff eine inerte Substanz, die einen Träger für ein bestimmtes Reagenz, im vorliegenden Fall das Triglycerid, bildet. Der zur Bildung der festen Matrix gemäss der Erfindung gewählte Hilfsstoff muss drei Bedingungen erfüllen: Er darf sich in dem zum Auflösen des Triglycerids gewählten Lösungsmittel nicht lösen. Er muss das Medium, in dem die Lipasebestimmung vorgenommen wird, lösen. Diese Auflösung ist erforderlich, um das Triglycerid in die Reaktionslösung zur Bildung der Emulsion freizugeben. Die Reaktionslösung ist normalerweise eine wässrige Lösung, die bei einem pH zwischen etwa 8,5 und 9,5 gehalten wird. Schliesslich muss der Hilfsstoff inert und bei der Bestimmung nicht nachweisbar sein. Es gibt zahlreiche bekannte Stoffe, die als Hilfsstoffe für die Zwecke der Erfindung geeignet sind. Gebräuchlich hiervon sind Zucker und Zuckeralkohole, z.B. Mannit, Inosit, Sorbit, Maltose, Dextrose, Lactose, Dextran und Gemische dieser Stoffe.

Eine gleichmässigere Verteilung des Triglycerids in der festen Matrix wird erreicht, wenn ausser den vorstehend genannten Substanzen Polyäthylenglykol verwendet wird. Geeignet ist beispielsweise das Produkt der Handelsbezeichnung «Carbowax 6000». Diese Verbindung verhindert Agglomeration der Triglyceridtröpfchen in der festen Matrix und begünstigt die Bildung eines gleichmässigen Überzuges der Triglyceridlösung auf der Oberfläche der festen Matrix. Das Polyäthylenglykol ist jedoch nicht unbedingt notwendig.

Nachdem das Triglycerid und das Lösungsmittel für das Triglycerid gewählt und unter Bildung der gewünschten Lösung gemischt worden sind, werden die Triglyceridlösung und der Hilfsstoff gemischt. Dies kann in verschiedener bekannter Weise erfolgen. Insbesondere kann ein mechanischer «Hobart»-Mischer verwendet werden. Das Mischen wird so lange durchgeführt, bis der Hilfsstoff gerade gesättigt ist. Der gesättigte Hilfsstoff wird dann getrocknet, um das zum Auflösen des Triglycerids verwendete Lösungsmittel zu verdampfen, wobei eine feste Matrix, die gleichmässig mit dem Triglycerid imprägniert ist, gebildet wird. Das Trocknen kann in verschiedener bekannter Weise erfolgen. Insbesondere kann mit Luft unter einem Abzug getrocknet werden. Die imprägnierte feste Matrix kann als Pulver verwendet oder unter Anwendung üblicher Tabi etti er verfahren tablettiert werden.

Nachstehend wird als spezielles Beispiel die Herstellung der mit dem Triglycerid imprägnierten Matrix beschrieben. 94 Teile Mannit und 5 Teile Polyäthylenglykol «Carbowax 6000» werden zur Bildung eines Hilfsstoffs gemischt. 1 Teil Triolein wird in einem Gemisch von 50% Chloroform und 50% Äthanol gelöst. Die Lösungsmittelmenge wird so gewählt, dass beim Mischen mit dem Hilfsstoff ein festes Gemisch, das gerade gesättigt ist, gebildet wird. Das Lösungsmittelgemisch, das das Triolein enthält, wird dann zum Gemisch aus Mannit und Polyäthylenglykol «Carbowax 6000» 5 in einen mechanischen «Hobart»-Mischer gegeben, worauf 30 Minuten gemischt wird. Der in dieser Weise gebildete gesättigte Hilfsstsoff wird dann 60 Minuten oder bis zum vollständigen Abdampfen des Lösungsmittels unter einem Abzug an der Luft getrocknet. Hierbei wird eine feste Matrix gebil-10 det, die mit Triolein gleichmässig imprägniert ist. Diese feste Matrix liegt in Pulverform vor. Das imprägnierte Gemisch wird dann zu Tabletten von etwa 85 mg gepresst, die unge-fährt je 0,87 mg Triolein enthalten.

Eine Bestimmung der Lipase-Aktivität in menschlichem 15 Serum wird dann nach einer kinetischen turbidimetrischen Methode vorgenommen, bei der die Geschwindigkeit der «Klärung» der Triolein-Emulsion bei 340 nm überwacht wird. Diese Geschwindigkeit ist proportional der Lipase-Aktivität der Probe. Calciumchlorid und Gallensalze werden als Akti-20 vatoren für die Lipase verwendet. Das System wird ferner unter Verwendung von Tris(hydroxymethyl)aminomethan--(«Tris»)-Puffer gepuffert, der als pH-Regler (pH 8,6 bis 9,0) für die wässrige Reaktionslösung dient. Die Reaktion verläuft wie folgt:

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Trioleinemulsion (trübe)

Ca-, Lipase freie Fettsärcen + nH q r oVf-n > gemischte Glycende ptl 8,8 (Z3-L.) (abnehmende Trübung)

30 Nachstehend wird ein spezielles Beispiel einer Lipase-Bestimmung beschrieben:

Ein Bestimmungskästchen, das die folgenden Reagentien enthält, wird hergestellt:

35 Tris-Puf fer, pH 8,

8 ± 0,2

50

(iMol

Desoxycholat

35,5

{iMol

Calciumchlorid

0,7

[iMol

40 Triolein (in der vorstehend beschriebenen

Tablettenform) 0,98 jxMol

Diese Reagentien werden zu 4,8 ml Wasser gegeben. Der Lösung wird eine Probe von 0,20 ml, die eine bekannte Lip-45 asemenge enthält, zugesetzt. Durch leichtes Mischen löst sich der Hilfsstoff in der Tablette, wobei eine Triolein-Emulsion in der wässrigen Reaktionslösung gebildet wird. Während das in der Probe enthaltene Lipase-Enzym mit der Triolein-Emulsion reagiert, werden freie Fettsäuren und gemischte 50 Glyceride gebildet, wobei das Gemisch zunehmend optisch transparent wird. Es zeigt sich, dass die bei 340 nm überwachte Geschwindigkeit der «Klärung» der Triolein-Emulsion proportional der Lipase-Aktivität ist.

Die Verwendung der vorstehend beschriebenen Tabletten 55 ergibt in hohem Masse reproduzierbare Emulsionen und verleiht dem Substrat Beständigkeit für lange Zeit (wenigstens zwölf Monate).

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Claims

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1. Reagenz zur Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Lösung, gekennzeichnet durch eine feste Matrix eines in einer wässrigen Reaktionslösung löslichen, mit einem Triglycerid imprägnierten, inerten Trägerstoffs.

2. Reagenz gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerstoff mit Triolein imprägniert ist.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Reagenz gemäss einem der Patentansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerstoff ein Zucker, vorzugsweise Maltose, Glucose, Lactose, ein Zuckeralkohol, vorzugsweise Mannit, Inosit oder Sorbit, oder Dextran ist.

4. Reagenz gemäss Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerstoff ausserdem Polyäthylenglykol enthält.

5. Verfahren zur Herstellung des Reagenzes gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man a) wenigstens ein Triglycerid in einem Lösungsmittel löst,

b) die erhaltene flüssige Lösung mit einer entsprechenden Menge des in einer wässrigen Reaktionslösung löslichen, inerten Trägerstoffs mischt, wobei man das Volumen des zur Bildung der flüssigen Lösung verwendeten Lösungsmittels so wählt, dass der Trägerstoff praktisch mit dem Lösungsmittel gesättigt ist, und c) das Lösungsmittel abdampft, so dass eine feste Matrix aus dem mit dem Triglycerid imprägnierten Trägerstoff zurückbleibt, wobei man die zur Bildung der flüssigen Lösung verwendete Menge des Triglycerids so wählt, dass die gewünschte Konzentration an Triglycerid pro Gewichtseinheit der festen Matrix erhalten wird.

6. Verfahren gemäss Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lösungsmittel Chloroform oder ein Gemisch von Chloroform und Äthanol verwendet.

7. Verfahren gemäss einem der Patentansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Matrix aus dem mit dem Triglycerid imprägnierten Hilfsstoff tablettiert.

8. Verwendung des Reagenzes gemäss Patentanspruch 1 zur Bestimmung der Lipase-Aktivität einer Probe durch Umsetzung der Probe mit einer Emulsion eines Triglycerids in einer wässrigen Reaktionslösung und Messung der Geschwindigkeit, mit der das Triglycerid zu löslichen Fragmenten hy-drolysiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass man die Emulsion bildet, indem man das Reagenz in der wässrigen Reaktionslösung löst und dadurch das Triglycerid in die Reaktionslösung freigibt.