DE1617672A1

DE1617672A1 - Verfahren zur Herstellung von fuer immunochemische Bestimmungen von Antigenen geeigneten Erythrocyten und deren Dosierungsformen

Info

Publication number: DE1617672A1
Application number: DE19671617672
Authority: DE
Inventors: David Dr Dingwall
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1966-03-24
Filing date: 1967-03-20
Publication date: 1971-04-01
Also published as: CH508390A; IL27578A; GB1179131A; AT270864B; BE696050A; NL126572C; GR36578B; SE335592B; US3548051A; NL6603909A; ES338201A1; DK126452B

Description

betreffend

Verfahren zur Herstellung von für immunochemisehe Bestimmungen von Antigen] geeigneten Erythrocyten und deren Dosierungsformen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der mechanischen Eigenschaften von Erythrocyten, sodaß sich diese zu Tabletten oder sonstigen festen Dosierungsformen pressen lassen, ohne daß sie dadurch als Hilfsstoff für immunochemisehe Bestimmungen unbrauchbar werden.

Es ist bekannt, daß Erythrocyten von Säugetieren, wie Rindern, Pferden, Schafen, Kaninchen sowie Hühnern und Menschen, als Hilfsstoff für immunochemisehe Bestimmungen verwendet werden können, die auf der Reaktion eines Antigens mit seinem Antikörper beruhen. Die Erythrocyten lassen sich beispielsweise als Träger von Antigen verwenden, wie Choriongonadotropin (HOG), vergleiche Acta Endocrinologica 35, 261

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(1960), Serumgonaj/dotropin und Wachstumshormon, vergl. Nature 182, 951 (1958), und ferner Serumalbumin, r-Globulin, Insulin, luteogenes Hormon und Tetanus-Toxoid.

S.V. Boyden berichtet in Proc. Soc. Exp. Biol. & Med. 73, 289 (1950), daß die adsorbierenden Eigenschaften der Oberfläche von Erythrocyten stark verbessert werden durch Behandlung mit einem Gerbmittel oder Beizmittel, wodurch das Antigen weit besser an den Erythrocyten festhaften kann.

Die Verwendung der folgenden Gerb- oder Beizmittel ist in der Literatur beschrieben? Insulin, Tannin, Hydrochinon, Bisdiazobenzidin, beispielsweise in Fed. Proc. 17, 461, (1953), Formalin, beispielsweise in Schweiz. Z.Path. Bakt. 21, 1043 (1958) sowie Acetaldehyd, Brenztraubensäurealdehyd und Glyoxal. Es wurde ferner bereits eine aufeinanderfolgende Behandlung von Erythrocyten mit verschiedenen Gerb- und Beizmitteln anwendet, beispielsweise eine Vorbehandlung mit Formalin unter nachfolgender Umsetzung mit Tannin, (vergl. Wide und Gemzell in der bereits erwähnten Literaturstelle aus Acta Endocrinologica).

In den letzten paar Jahren erschienen verschiedene Veröffentlichungen über Schwangerschaftstests, die sich in vitro durchführen lassen. Hierbei werden Erythrocyten verwendet, die mit einem Gerb- oder Beizmittel vorbehandelt und mit HQG sensibilisiert wurden. Die Beaktion hiervon

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•mit einem homologen Antiserum kann durch das in dem zu untersuchenden Urin vorhandene HGG verhindert werden. Es kommt dann zur Bildung eines spezifischen Sedimentationsmusters der Erythrocyten am Boden des lteaktionsgefäßes.

Bisher wurden die sensibilisierten Erythroeyten nach der Vorbehandlung in Form einer wässrigen Suspension gelagert, vorzugsweise jedoch in einer gefriergetrockneten i^lorm. Erythrocyten sind jedoch sehr instabile Partikel, und die Konservierung dieser Träger war bereits Anlaß für viele Überlegungen und Arbeiten. Oie mit einem Beizmittel vorbehandelten Erythrocyten sind weniger instabil und können leicht getrocknet werden, wobei sie dann in gefriergetrocknetem Zustand ziemlich lange Zeit stabil sind. Es "besteht jedoch die Äotwendigkeit einer Präsentationsform, in der die Erythrocyten leicht handhabbar und ^Isichzeitig stabil sind, wobei sie all ihre wesentlichen Eigenschaften für die *7irkungsweise immunochemischer Bestimmungsverfahren beibehalten.

überraschenderweise wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Erythrocyten gefunden, die sieh für immunochemische Bestimmungen von Antigenen eignen, wobei man Erythrocyten mit einem oder mehreren Gerbmitteln behandelt und anschließend mit dem Antigen sensibilisiert, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die letzte Stufe der bensi-. bilisierung in Gegenwart von i'ormaldehyd in einer Konzentration

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von unter^2 fa Gew./Vol) bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 8 durchgeführt wird. Die mechanischen Eigenschaften der so behandelten j&rythrocyten werden in einem solchen Ausmaß verbessert, daß sie zu Tabletten gepreßt werden können, wobei die Eignung bzw. Verwendbarkeit dieser Erythrocyten als Hilfsstoff für immunochemische .Reaktionen nach Suspension dieser i'abletten erhalten bleibt.

Gemäß der JJH Patentschrift 3 096 250 war es bereits bekannt, die Sensxbilisierung von mit Formalin vorbehandelten Erythrocyten in Gegenwart einer iOrmalinlösung vorzunehmen, und zwar bei einem pH-Wert innerhalb von zwei Einheiten des isoelektrischen Punktes des verwendeten Antigens. Dies bedeutet, daß bei Verwendung des Antigens HCG, mit einem isoelektrischen Punkt von 2,98, die Sensxbilisierung unterhalb pH 5 erfolgen muß, also ganz anders als bei dem vorliegenden Verfahren, bei welchem nur gute Ergebnisse bei einem pH-Wert über 5,5 erzielt werden. Ein weiterer Unterschied liegt noch darin, daß nach dem bekannten Verfahren eine höhere Formalinkonzentration_P nämlich 2 bis 10 ^, angewendet wird, während das neue Verfahren eine Konzentration von unter 2 $, vorzugsweise unter 0,25 $ (G-eWo/Vol.; verwendet. Schließlich ist die Gegenwart von Formaldehyd nach dem Verfahren der oben erwähnten Patentschrift im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Verfahren während der gesamten Sensibilisierungspea?ie4e-2ext erforderlich.

Es wurden Vergleichsversuche mit dem vorliegenden Be-109814/7Π07

ihandlungsverfahren durchgeführt, und zwar mit HCG- als Antigen, "bei verschiedenen pH-Werten, wobei die Bedingungen ansonsten denjenigen glichen, die in Beispiel 1 der oben erwähnten Patentschrift beschrieben wurden. Hieraus geht deutlich hervor, daß eine Behandlung bei pH4,4 bis 5,0 nicht zu Erythroeyten führt, die sich für immunοchemische Bestimmungen verwenden lassen.

Bs wurde ferner gefunden, daß man ausgezeichnete Ergebnisse mit Irythrοcyten erhält, die der Eeihe nach mit Formalin und Tannin vorbehandelt wurden. Dieses Verfahren eignet sich besonders gut zur Verwendung von menschlichen! Choriongonadotropin (HCG-) als Antigen. Eine HG G—Konzentrat ion von 10 bis 50 I—Einheiten/ml wird bevorzugt. Wenn sehr reines HCG- verwendet wirds, so muß die Konzentration auf etwa 200 I-Einheiten/al erhöht werden. Bei dem Sensibilisierungsverfahren mit HCGr₉ das normalerweise einen oder Efchisre Sage dauert, läßt man den Formaldehyd auf die Erythrocyte!? während" der letzten 12 bis 24 stunden oder in etwa darum hsrii.si₃ -.vorzugsweise jedoch während der letzten 15 Stunden^ einwirken* Die Temperaturg bei der die Yiirkung optimal ist_p liegt zwischen 30 und 40⁰C, vorzugsweise wirö. jedoch eine temperatur von 37 G verwendete

Bs wurde ferner gefunden _s Antigen die erfinäuagegemäBe ©twa β _s 4 immer zu s@hr guten Br,

von HOG- als i3®i einem pH=¥©rt von

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Schließlich, wurde ein Verfahren zur Herstellung von Tabletten oder anderen festen Formen von Dosierungseinheiten von Erythrocyten .gefunden, die sich für immunochemische Bestimmungen eignen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die erfindungsgemäß hergestellten Erythrocyten mit den für die Tablettierung und die immunochemische Bestimmung erforderlichen Hilfsstoffen vermischt und anschließend in die entsprechenden Dosierungseinheiten gepreßt werden.

Zahlreiche Versuche wurden mit Suspensionen von Erythrocyten durchgeführt, die nach Sensibilisierung, meistens nach ein-oder zweiwöchigem Lagern erhalten wurden, ferner mit den Pulvern, welche nach dem Gefriertrocknen der Suspension, ebenfalls nach 1- bis 2—wöohiger Lagerung, und schließlich mit den aus diesen Pulvern hergestellten Tabletteh₉ die etwa 15 mg wogen» erhalten wurden, um hierdurch die optimalen Bedingungen für die erfindungsgemäße Behandlung zu ermitteln. Diese Versuche wurden in folgender Art und Weise durchgeführt.

Aus einem geeigneten Antiserum wurde eine Reihe verschiedener Verdünnungen hergestellt, die mit einer bestimmten Menge eines Urins ohne HCG- versetzt wurden. Die zu untersuchende Erythrocyten-Zubereitung wurde mit diesem Gemisch vermischt« Anschließend wurde geprüft, ob die Erythrocyten bei hoher Verdünnung des Antiserums vollständig agglutinierten. Die gleiche Erythrocyten-Zubereitung wurde ferner zu Gemischen der gleichen Verdünnungen des Anti serums und su Urin mit HÖG zugesetai;» Das Ergebnis wurde dann als brauchbar ange-

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sehen, wenn innerhalb einer kurzen Zeit, beispielsweise ■in weniger als-zwei Stunden, die Gegenwart von einer I-Einheit HCG/ml gezeigt werden konnte, d.h., wenn die Agglutination der mit HCG beladenen Erythrocyten mit Antiserum in einer geeigneten Verdünnung durch Urin vollständig inhibert werden konnte, welcher eine I-Einheit/ml enthielt.

Die erfindungsgemäß behandelten Erythrocyten wurden so fest, daß- sie zu Tabletten gepreßt werden konnten. Für diesen Zweck lassen sich die herkömmlichen Hilfsstoffe verwenden, welche die Erythrocyten und. das an diese gebundene Antiger(nicht angreifen dürfen. Selbstverständlich darf die Bindung zwischen dem Antigen und den Erythrocyten durch die verwendeten Hilfsstoffe nicht nachteilig beeinflußt werden, und diese dürfen keinen wahrnehmbaren Einfluß auf die mit den Erythrocyten geplanten Bestimmungen hajei.-, soda:·? die Sensibilität, die Genauigkeit und die Geschwindigkeit der Bestimmungsreaktion nicht wesentlich verändert wird.

Ferner zeigte sich, daß erfindungsgemäß behandelte Erytfarocyten nicht nur stark verbesserte mechanische Eigenschaften haben, sondern daß sie auch gegenüber Agglutination mit Antiserum stärker empfindlich sind. Auf diese Weise ließ sich eine vollständige Agglutination sogar mit einer nicht behandelten Suspension von mit HCG sensibilisierten Erythrocyten bei einer Verdünnung des Antiserums von 1:2500 erreichen, während die gleiche Suspension nach der erfindungsgemäßen Behandlung die gleiche Reaktion bei einer Verdünnung

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des Antiserums von 1:7500 bis 1:15 000 hervorrief.

Die Erfindung ist nicht auf die Anwendung zur Sensibilisierung von Erythrocyten mit HCG beschränkt. Sie läßt sich ferner zur Serisibilisierung mit irgendeinem Antigen verwenden, welches die vorliegende Behandlung mit Formaldehyd aushält.

Für immunochemische Bestimmungen können sowohl das beispielsweise nach Gefrier- oder Sprühtrocknung der Suspension erhaltene Pulver der sensibilisierten Erythrocyten als auch die hieraus gepreßten Tabletten verwendet werden.

Da die nach Gefriertrocknung der Suspension der Erythrocyten erhaltenen Pulver sehr hygroskopisch sind, werden sie vorzugsweise in einer Atmosphäre mit geringer relativer Feuchtigkeit, insbesondere bis zu etwa 20 #, mit den anderen Hilfsstoffen vermischt und gepreßt. Es Empfiehlt sich solche Zusätze auszuwählen und solche Bedingungen beim Pressen anzuwenden, daß die Auflösungszeit der Tabletten kurz ist, beispielsweise unter 3 Minuten liegt*

Als Beispiele für verwendbare Hilfsstoffe lassen sich die folgenden erwähnen, die vorzugsweise zur Herstellung von Tabletten zur Durchführung von Schwangerschaftsreaktionen verwendet werden. Als Füllstoffe eignen sich unter anderem: Saccharose, Mannit, Lactose und üreum. Als Schmiermittel eignen sich beispielsweise Borsäure, Stärke, Carbowachs 4000

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und Magnesiumstearat. Geeignete Desintegrationsmittel sind Stärke und Alginsäure. Andere Zusätze sind beispielsweise Stoffe, die für die genannte Bestimmung verwendet werden, wie Phosphate, z.B. Monokaliumphosphat und Dinatriumphosphat, welche als Puffer für die aus den Tabletten hergestellte Suspension dienen, ferner Natriumchlorid und ein Mittel zur Ghelatbildung, wie das Dinatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure (E.D.T*A.) und Albumin. Die erforderlichen Zusätze können in trockenem Zustand mit den behandelten Erythrocyten vor dem Tablettieren vermischt werden. Vorteilhafter ist es jedoch, die löslichen Zusätze zusammen aufzulösen und sie durch Sprühtrocknung zu trocknen. Dieses Produkt wird dann mit den behandelten Erythrocyten vermischt. Hierbei erhält man ein sehr homogenes Gemisch und verhindert gleichzeitig, daß die Erythrocyten während der weiteren Behandlung durch grobkristallinecBestandteile der Hilfsstoffe beschädigt bzw. zerstört werden

Bei der Verarbeitung von unlöslichen Hilfsstoffen sollte besonderes Augenmerk darauf verwendet werden, daß diese die Bestimmungen nicht stören, die mit einer aus den Tabletten erhaltenen Suspension durchgeführt werdenο Die unlöslichen Bestandteile sind nämlich leicht in der Lage, das Sedimentationsmuster der Erythrocyten zu verändern, wodurch die Genauigkeit der Beobachtung ungünstig beeinfluß wird.

Beschreibung der bevorzugten Durchführungsformen

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Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben·

Beispiel 1

Eine Suspension von Schaferythrocyten, die in bekannter Art und Weise mit Formalin und Tannin behandelt wurden, wurde zentrifugiert, mit einem Phosphat-Natriumchlorid-Puffer von pH 6,4 gewaschen und dann in diesen Puffer eingesetzt. Zu diesem Gemisch wurde ein gleiches Volumen einer Lösung von 50 I-Einheiten HCG/ml in einem Puffer von pH 6,4 zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 37⁰C 48 Stunden lang gelagert, worauf man Formaldehyd zusetzte bis eine Endkonzentration von 0,25 #(Gew./Voi) Formaldehyd erreicht war· Das Gemisch wurde dann bei einer Temperatur von 37⁰C 15 Stunden lang gelagert, worauf man die Erythrocyten erneut zentriigierte, mit einer physiologischen Salzlösung wusch und als 10 $> V/V· Suspension in eine physiologische Salzlösung, die 0,1 $> Einderserumalbumin enthielt, einverleibte, und diesen Ansatz einige Tage lang bei 0 bis 4°C lagerte.

Hierauf wurden die Erythrocyten abzentrifugiert, mit einer physiologischen Salzlösung gewaschen und in an sich bekannter Weise getrocknet. Das Pulver stellt ein gutes Reagens auf HCG dar.

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Beispiel 2

500 ml der Suspension der Erythrocyten mit einem pH-Wert von 6,4 gemäß Beispiel 1, wurden mit 300 ml einer lösung von HCG mit 50 !-Einheiten HCG/ml bei 7,6 und anschließend mit !Formaldehyd mit einer Endkonzentration von 0,5 behandelt# Nach dem Gefriertrocknen wurde das Pulver tablettierte Die dabei erhaltenen Tabletten führten zu ausgezeichneten Ergebnissen, wenn sie als ein Reagens für immunochemische Sehwangerschaftsuntersuchungen verwendet wurden.

Beispiel 3

Nach dem Verfahren clts Beispiels 1 wurden Tvybhrocyten mit HCG in Gegenwart ron formaldehyd mit einer 'Snö.-konzentration von 0,25 $» und zwar bei ©in©r !Temperatur von 3O⁰C die letzten 24 Stunden behandelt· Nach Gefriertrocknen und Pressen erhielt man Tabletten* die bei Verwendung als Reagens für einen HCG Sest zu ausgezeichneten Ergebnissen führten«

Beispiel 4

Yersuehe. wurden durchgeführt unter Behandlung mit Formaldehyd während der letzten 15 Stunden d©r Sensibilisierung der Irythreeyten mit HCG gemäß Beispiel 1, wobei hier jedoeh ©in pH-Wert von 5$5 verwendet wurde« Die Suspension wurde in einem liiro-Sprühtroekner mit einer Einlaß-

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temperatur von 125⁰C und einer Auslaßtemperatur von ?5°C getrocknet. Das so hergestellte Pulver wurde dann alt 0,4- i» (Gew./Gew.) Kartoffelstärke vermischt und zu Tabletten mit einem Gewicht von etw.m 15 mg gepreßt. Biese führten «tt ausgezeichneten Ergebnissen, wenn sie als Reagens für iaununo chemie ehe Schwanger schaftsbestimmungen verwendet wurden«

Patentansprüche

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Claims

Patentansprü c he

1. Verfahren zur Herstellung von für immunoehemische Bestimmungen von Antigenen geeigneten Erythrocyten durch Behandlung von Erythrocyten mit einem oder mehreren Gerbmitteln und anschliessende Sensibilisierung mit dem Antigen« dadurch ge kennzeichne t, dass man die letzte Stufe der Sensibilisierung in Gegenwart von Formaldehyd in einer Konzentration von unter 2 £ (Gew.AoI·) bei einem pH-Wert zwischen 5»5 und

8 durchführt,

2. Verfahren nach Anspruch !,dadurch g e k e η tt ζ ei c hn e t« dass man als Ausgangsmaterial Erythrocyten verwendet, die der Reihe nach mit Formaldehyd und Tannin behandelt wurden.

3* Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Antigen menschliches Choriongonadotropin verwendet..

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, dass man die Sensibilisierung in einer Formaldehydlösung mit einer Konzentration von etwa o,25 # (Gew./Vo.) vornimmt.

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5. Verfahren nach Anspruch 1 Us 4t dadurch g e k e η η -zeichnet, da ββ man die Behandlung bei einer Temperatur von etwa 37^-C vorninmt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch g e k β η η -ζ β i c h η β t, dass Ban die Behandlung etwa während der letzten 15 Stunden der Sensibilisierung vornimmt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung bei einem pH-Wert von etwa 6,4 vornimmt.

V-

8. Verfahren zur Herstellung von Tabletten oder anderen

festen Dosierungsformen aus für immunoehemische Bestimmungen geeigneten Erythroeyten gemäsa den Ansprüchen 1 bis 7» dadurch gekennz ei chnet, dass man die behandelten Erythxocyten mit den für die Tablettierung und das Bestimmungsverfahren erforderlichen Hilfsstoffen vermischt und dieses Semis oh dann zu den Sosierungsformen presst.

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