DE102008046227A1

DE102008046227A1 - Hochdurchsatzmethode zur Analyse der Fettsäurezusammensetzung in Plasmaphosphoglyceriden

Info

Publication number: DE102008046227A1
Application number: DE102008046227A
Authority: DE
Inventors: Claudia Glaser; Hans Dr. Demmelmair; Berthold Prof. Dr. Koletzko
Original assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Current assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2008-09-08
Publication date: 2009-12-17
Also published as: WO2009149871A1; EP2297584A1; US20110136243A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung von Phosphoglyceriden beschrieben, wobei einer phosphoglyceridhaltigen Probe Methanol zugesetzt wird, die Kombination gemischt wird und ausgefälltes Material von der Methanolphase getrennt wird, der Methanolphase ein Alkali-Alkoxid als Base zugesetzt wird, um eine Umesterung zu katalysieren, aus der nach der Umesterung erhaltenen Lösung die entstandenen Methylester aus der Lösung extrahiert werden und gaschromatographisch aufgetrennt werden. Weiterhin wird ein zur Durchführung des Verfahrens geeigneter Testkit gezeigt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Fettsäurezusammensetzung in Phosphoglyceriden und einen hierzu geeigneten Kit.
Im Plasma liegen Fettsäuren frei oder an Lipide, die wiederum mit Proteinen Lipoproteine bilden können, gebunden vor. Die Fettsäuren können unter anderem in Phospholipiden, von denen Phosphoglyceride eine Unterfraktion sind, Cholesterylestern und Triglyceriden gebunden sein. Es wurde nun festgestellt, dass die Fettsäurezusammensetzung im Blut und speziell die Fettsäurezusammensetzung in Phospholipiden korreliert mit der Fettsäurezusammensetzung in Zellen und Membranen. Außerdem spielen Lipide in Organen und Zellen eine wichtige Rolle. So weist das Nervensystem einen hohen Gehalt an Lipiden auf.
Weiterhin ist bekannt, dass es einen Zusammenhang gibt zwischen der Fettsäurezusammensetzung und dem Anteil spezifischer Fettsäuren, d. h. der Fettsäureverteilung in den Zellen und im Blut, und unterschiedlichsten Krankheiten und Zuständen. So berichten z. B. Vaisman et. al. in Am. J. Clin. Nutr. 2008, 87: el. 70 bis 80, dass die Zusammensetzung der Fettsäuren im Blut mit Syndromen wie Hyperaktivität und Aufmerksamkeitsmangelsyndrom bei Kindern korreliert und dass durch eine Diät ein Einfluss auf das Aufmerksamkeitsmangel-Syndrom bei Kindern genommen werden kann, wobei sich durch die Diät das Fettsäuremuster, z. B. der Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, veränderte. Durch diese Veränderung des Fettsäuremusters konnten Störungen behoben werden. Diese Veränderungen müssen jedoch überwacht werden. Dazu sind zuverlässige Nachweisverfahren, die mit geringen Probenmengen durchgeführt werden können, notwendig.
Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang der Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, der mit der mentalen Entwicklung von Kindern und älteren Menschen in Zusammenhang gebracht wird, z. B. langkettige mehrfach ungesättigte n-3-Fettsäuren (LC-PUFA). Der ”FA-Status” spielt eine wichtige Rolle für viele klinische Versuche und Untersuchungen zur Ernährung. Die FA-Konzentrationen könnten wertvolle biologische Marker für die Qualität und die Stoffwechselwege der Nahrung bilden. Ein leicht durchführbares, zuverlässiges Verfahren mit hohem Durchsatz wäre daher wünschenswert.
Weiterhin berichten L. Schaeffer et. al. in Human Molecular Genetics, 2006, vol. 15, Nr. 11, 1745 bis 1756, dass die Fettsäurezusammensetzung in Membranen eine wichtige Rolle bei zellulären Prozessen spielt und mit der Etiologie verschiedener komplexer Krankheiten assoziiert ist. Da weiterhin gefunden wurde, dass die Fettsäurezusammensetzung in den Phospholipiden im Plasma gut korreliert mit der Fettsäurezusammensetzung im Gewebe und ein Zusammenhang zwischen dem Fettsäurestatus im Gewebe und der geistigen Entwicklung von Kindern, mit Krankheiten, wie Herzkrankheiten, Krebs und Autoimmunkrankheiten festgestellt wurde, kommt dem Nachweis der Fettsäurezusammensetzung eine zunehmende Bedeutung zu. Vor allen Dingen wäre eine schnelle routinemäßige Bestimmung des Fettsäurestatus wertvoll als medizinischer aber auch ernährungsphysiologischer Marker.
Aufgrund der Bedeutung der Fettsäurezusammensetzung wurden auch bereits Verfahren zu deren Bestimmung entwickelt. Als Standard dient das Verfahren von Folch, bei dem die Proben mit einem Lösungsmittel extrahiert werden, der Extrakt auf Dünnschichtplatten aufgetrennt wird und dann die aufgetrennten Lipide von der Dünnschichtplatte gekratzt werden, umgeestert werden und dann gaschromatographisch bestimmt werden. Um ein Hochdurchsatzverfahren bereitzustellen, haben Masood et al. in Lipids (2008) 43: 171–180 ein Verfahren vorgeschlagen, das der Automatisierung zugänglich sein soll. Das Verfahren soll die aufwändige Aufarbeitung der Proben und die Umesterung erleichtern. Dazu werden Proben mit Methanol, Acetylchlorid und Toluol versetzt. Die Umesterung erfolgt bei 80°C und die umgeesterten Fettsäuren werden dann im Gaschromatographen analysiert. Eine Auftrennung der einzelnen Lipide erfolgt nicht, es werden alle in der Probe vorhandenen Fettsäuren als Methylester gaschromatographisch analysiert.
Die bisher zur Analytik der Fettsäurezusammensetzung im Plasma bekannten Verfahren erfordern einen hohen Aufwand bei der Vorbereitung der Proben, sind zeitaufwändig und auf Grund der damit verbundenen Kosten für Massenuntersuchungen nicht geeignet. Ein weiteres Problem besteht darin, dass für die derzeit bekannten Bestimmungsmethoden eine relativ hohe Menge an Blut erforderlich ist. Die Untersuchung der Fettsäurezusammensetzung ist besonders wichtig bei Kindern, um Entwicklungsstörungen durch falsche Ernährung möglichst aktuell festzustellen. Der hohe Bedarf an Blutplasma schränkt jedoch die Möglichkeit von wiederholten Untersuchungen und Reihenuntersuchungen ein.
Ein weiterer Nachteil der bisher bekannten Verfahren besteht darin, dass zur Aufarbeitung der Proben ein hoher Anteil an Lösungsmitteln erforderlich ist. Nicht nur die Kosten der Lösungsmittel sind nachteilig, sondern auch die Belastung der Umwelt bei Verwendung von Lösungsmitteln.
Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Analyse der Fettsäurezusammensetzung in Phosphoglyceriden bereitzustellen, das in kurzer Zeit, ohne aufwändige Aufbereitung der Proben, mit geringen Bedarf an Lösungsmitteln durchgeführt werden kann und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Weiterhin war es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das Reihenuntersuchungen und insbesondere der Automatisierung zugänglich ist. Weiterhin sollte ein Verfahren bereitgestellt werden, das mit geringen Probemengen auskommt.
Die gestellten Aufgaben werden gelöst mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie es in den Ansprüchen definiert ist. Der erfindungsgemäße Kit stellt darüber hinaus die geeigneten Mittel zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung von Phosphoglyceriden zur Verfügung gestellt, bei dem einer phosphoglyceridhaltigen Probe Methanol zugesetzt wird, die Kombination gemischt wird und ausgefälltes Material von der Methanolphase getrennt wird, der Methanolphase ein Alkali-Alkoxid als Base zugesetzt wird, um eine Umesterung zu katalysieren, aus der nach der Umesterung erhaltenen Lösung die entstandenen Methylester aus der Lösung extrahiert werden und gaschromatographisch aufgetrennt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es überraschenderweise möglich, die Fettsäurezusammensetzung von Phosphoglyceriden in einfacher, reproduzierbarer Art und Weise zu bestimmen, ohne aufwändige Präparation der Proben und ohne die Notwendigkeit für zeitaufwändige Trennungsschritte.
Unter Phosphoglyceriden oder Phosphatiden werden hier Lipide verstanden, die aus den Grundbausteinen Phosphorsäure, Glycerin und Fettsäuren, d. h. aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Carbonsäuren mit bis zu 30 C-Atomen, in der Regel mit 8 bis 26 C-Atomen, aufgebaut sind. Der Ausdruck „Phosphoglycerid” bezeichnet insbesondere Glycerinderivate, die an zwei OH-Gruppen mit Fettsäureresten und an der dritten OH-Gruppe mit Phosphorsäure verestert sind, wobei der Phosphorsäurerest weiter verestert sein kann, z. B. mit Cholin.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass das erfindungsgemäß eingesetzte Methanol ein ideales Reagenz ist, mit dem mehrere vorteilhafte Ziele erreicht werden können. Zum einen bewirkt Methanol eine Abtrennung der gewünschten Phosphoglyceride von anderen in der Probe enthaltenen Bestandteilen, wie Proteinen und unpolaren Lipiden, da es eine selektive Lösungskraft für die Phsophogly ceride, nicht aber für andere die Untersuchung störende Bestandteile der Probe besitzt. Methanol löst Phosphoglyceride praktisch vollständig auf, fällt in dem Plasma vorhandene Proteine aus, und löst unpolare Lipide nicht oder nur geringfügig. Durch Zugabe von Methanol ist es daher möglich, auf einfache Art und Weise eine Anreicherung der gewünschten phosphoglyceridhaltigen Verbindungen und eine Abreicherung der unerwünschten Proteine und unpolaren Lipide zu bewirken. In einer ersten Stufe wird daher der phosphoglyceridhaltigen Probe Methanol zugesetzt und die Kombination gemischt und anschließend zentrifugiert.
Das Ausgangsmaterial bzw. Probenmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren kann jedes phosphoglyceridhaltige Material sein, es kann entweder eine natürliche Probe oder ein synthetisch hergestelltes Gemisch (z. B. für Vergleichszwecke) sein. In der Regel werden Proben von Körperflüssigeiten oder Körperbestandteilen untersucht. Die phosphoglyceridhaltige Probe, die dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen wird, ist in der Regel eine Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, wobei Blutplasma oder Blutserum bevorzugt ist. Plasma bezeichnet dabei eine Blutprobe, die von allen zellulären Bestandteilen befreit ist, während Blutserum eine Probe bezeichnet, der neben den zellulären Bestandteilen zusätzlich die gerinnenden Anteile entzogen wurden. Bevorzugt ist das Probematerial Blut, insbesondere Blutplasma oder Blutserum.
Im Plasma sind verschiedene Lipidfraktionen enthalten, neben Phosphoglyceriden weitere polare Komponenten, wie Sphingomyelin und nicht veresterte Fettsäuren, und unpolare Lipide, wie Cholesterylester und Triglyceride. Eine Korrelation zu der Fettsäurezusammensetzung der Zellen wurde in den Phosphoglyceriden gefunden, einer Gruppe der Phospholipide, die Glycerin als Grundgerüst aufweist. Es wurde gefunden, dass diese Klasse weniger empfindlich für kurzzeitige Veränderungen ist. Ihr Einfluss lässt sich untersuchen durch Vergleich der Fettsäurezusammensetzung.
Es wurde gefunden, dass sich die Fettsäurezusammensetzung in Phosphoglyceriden gut als Marker eignet, da sie sehr gut mit der Fettsäurezusammensetzung in Zellen korreliert.
Nach Zusatz von Methanol bildet sich somit ein Gemisch aus Wasser und Methanol (Wasser aus der Probe und zugesetztes Methanol), das die oben ausgeführten Lösungseigenschaften aufweist. Die Menge an zugesetztem Methanol ist an sich nicht kritisch. Sie sollte nicht zu hoch sein, um den Lösungsmittelverbrauch in einem ökonomischen Bereich zu halten. Außerdem könnten dann, wenn das Ver hältnis von Methanol zu Wasser zu hoch ist (zuviel Methanol im Verhältnis zu dem in der Probe vorhandenen Wasser) unerwünschte unpolarere Substanzen gelöst werden. Die Menge an Methanol sollte auch nicht zu gering sein, um die erwünschten Lösungseigenschaften beitragen zu können. Außerdem können sich dann, wenn zu wenig Methanol und zu viel Wasser in der Probe vorhanden ist, unter Umständen die Phospholipide nicht vollständig lösen. Der Anteil ist unter anderem abhängig vom Wassergehalt der Probe und dem Anteil an zu lösenden Bestandteilen. Der Fachmann kann die geeignete Menge leicht durch Routineversuche herausfinden. Es wurde gefunden, dass ein geeignetes Volumen an Methanol dem 3- bis 15-fachen, bevorzugt 5- bis 7-fachen Probenvolumen entspricht. Das Methanol hat bevorzugt Reagenzienqualität.
Um unerwünschte Reaktionen in der Probe zu vermeiden, ist es bevorzugt, den ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Raumtemperatur oder einer geringeren Temperatur durchzuführen. Geeignet sind Temperaturen im Bereich von 0 bis 45°C, bevorzugt 0 bis 25°C, besonders bevorzugt 5 bis 15°C. Geeigneterweise kann der Probe, die entweder Körpertemperatur, Raumtemperatur oder Kühlschranktemperatur aufweist, gekühltes Methanol, d. h. Methanol mit einer Temperatur im Bereich von 0 bis 20°C, bevorzugt 5 bis 20°C, zugesetzt werden, sodass die Temperatur der Mischung dann in einem geeigneten Bereich liegt.
Wie oben ausgeführt bewirkt der Zusatz von Methanol, dass Proteine und ggf. weitere Inhaltsstoffe, die in Methanol unlöslich sind, ausgefällt werden. Um die ausgefällten Bestandteile von der Mischung abzutrennen, können an sich bekannte Methoden verwendet werden. Bevorzugt wird zur Abtrennung die Mischung zentrifugiert. Die Zentrifugation kann in an sich bekannter Weise erfolgen, solange bis die zellulären Bestandteile sich im unteren Teil des Zentrifugengefäßes abgesetzt haben. Die Bedingungen der Zentrifugation sind die für solche Trennungen üblichen. So kann geeigneterweise mit ca. 500 bis 1500 × g zentrifugiert werden. Eine Zentrifugationszeit von 1 bis 10 min, bevorzugt 3 bis 7 min, hat sich als besonders geeignet erwiesen.
Andere Trennverfahren zur Abtrennung der ausgefällten Bestandteile können ebenfalls angewendet werden, z. B. Filtration etc.
Die bei der Abtrennung erhaltene Flüssigkeit d. h. die Methanolphase, bei der Zentrifugation in der Regel der Überstand, wird der nächsten Verfahrensstufe zugeführt. Der Überstand enthält die gewünschten Phosphoglyceride, weiterhin Sphingomyelin und nicht veresterte Fettsäuren sowie einen geringen Anteil an unpolaren Lipiden. In einer zweiten Stufe wird die Methanolphase, die angereichert die Phosphoglyceride und darüber hinaus weitere polare und unpolare Bestandteile enthält, einer Umesterung unterzogen. Die Umesterung wird durchgeführt, um aus den Fettsäuren Derivate herzustellen, die gaschromatographisch aufgetrennt werden können, d. h. eine Flüchtigkeit im für die Gaschromatographie geeigneten Bereich haben.
In der Regel werden hierzu Methylester hergestellt. Andere für die Gaschromatographie geeignete Ester können auch hergestellt werden, wobei dann der jeweils geeignete Alkohol zugesetzt wird.
Fettsäuremethylester haben eine Flüchtigkeit in einem Bereich, der für die gaschromatographische Auftrennung besonders geeignet ist.
Die Umesterung zur Bildung von Methylestern erfolgt in der Überstandslösung, die bereits das Veresterungsmittel Methanol enthält. Um die Umesterung durchzuführen, wird ein basischer Katalysator verwendet. Es wurde gefunden, dass der Einsatz eines Alkalialkoxids als basischer Katalysator spezifisch die Umesterung der in den Phosphoglyceriden vorliegenden Fettsäuren bewirkt, nicht aber eine Veresterung der ebenfalls in der Lösung vorhandenen freien Fettsäuren, bzw. der an Shingomyelin und Cholesterylestern gebundenen Fettsäuren. Aufgrund dieser Selektivität bei der Umesterung ist es möglich, gezielt die gewünschten Fettsäuren, d. h. die als Phosphoglyceride gebundenen Fettsäuren als Methylester bereitzustellen, ohne gleichzeitig die unerwünschten freien Fettsäuren mit zu verestern.
Es wurde gefunden, dass Alkalialkoxide besonders geeignete Katalysatoren sind, wobei als Alkali bevorzugt Natrium oder Kalium, insbesondere Natrium verwendet wird. Das Alkoxid kann von einem Alkohol mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, insbesondere von Methanol abgeleitet sein. Besonders bevorzugt wird Natriummethoxid als basischer Katalysator verwendet.
Um die Veresterung so selektiv wie möglich zu halten, hat es sich als geeignet erwiesen, die Veresterungsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 45°C, bevorzugt 15 bis 30°C, besonders bevorzugt bei Raumtemperatur, d. h. im Bereich von 20 bis 25°C, durchzuführen.
Weiterhin wurde festgestellt, dass die Umesterungsreaktion sehr schnell erfolgt und daher auch nach kurzer Zeit gestoppt werden kann, um dann die Methylester zu extrahieren. Eine Reaktionszeit im Bereich von bis zu 10 min ist bereits ausrei chend, um im Wesentlichen alle in den Phosphoglyceriden gebundenen Fettsäuren in Methylester umzuwandeln. Bevorzugt kann daher die Reaktion nach 2 bis 10 min durch Zugabe einer Säure, bevorzugt einer methanolischen Säure, gestoppt werden. Es wurde gefunden, dass auch eine längere Reaktionszeit nicht schädlich ist, da die Umesterungsreaktion gegenüber der Verseifungsreaktion stark bevorzugt ist. Um jedoch die Effizienz zu erhöhen, sollte die Umesterungsreaktion nichtlänger als 10 min durchgeführt werden.
In einer dritten Stufe werden dann die aus den Fettsäuren der Phosphoglyceride gebildeten Fettsäureester in ein organisches Lösungsmittel extrahiert, um sie dann einer gaschromatographischen Auftrennung zu unterziehen. Der Extrakt kann direkt eingespritzt werden. Als organisches Lösungsmittel ist jedes Lösungsmittel geeignet, das die Fettsäuremethylester aus der Methanolphase extrahieren kann. In der Regel sind ein unpolares und gegenüber den Recktanten inertes Lösungsmittel oder eine Mischung von Lösungsmitteln geeignet. Das organische Lösungsmittel muss darüber hinaus für das Einspritzen in den Gaschromatographen geeignet sein, d. h. darf kein Signal zu ungeeigneter Zeit erzeugen. Solche Lösungsmittel sind dem Fachmann wohl bekannt. Als besonders geeignet haben sich Kohlenwasserstoffe erwiesen, insbesondere Hexan.
Die Extraktion in ein organisches Lösungsmittel kann wiederholt werden, um die Genauigkeit zu erhöhen, eine zweite Extraktion hat sich als nützlich erwiesen. Weiterhin kann nach der Extraktion das Lösungsmittel verdampft werden, um dann die Probe in einer definierten Menge des Lösungsmittels für die Gaschromatographie aufzunehmen.
Um während der Aufarbeitung Veränderungen der Fettsäuren, insbesondere eine Oxidation von ungesättigten Bindungen zu vermeiden, kann der Aufarbeitungsmischung ein Antioxidans zugesetzt werden. Die Fettsäureoxidation verhindernde Antioxidantien sind dem Fachmann wohl bekannt. Ein Beispiel ist BHT.
Erfindungsgemäß ist es möglich, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung noch weiter durch Anwendung interner Standards zu erhöhen. Der innere Standard wird, wie es dem Fachmann bekannt ist, zusammen mit der Probe untersucht und lässt Rückschlüsse auf die Wiederfindung der interessierenden Verbindungen zu. Auf Basis der erhaltenen Werte kann dann die tatsächliche Konzentration berechnet werden. Bevorzugt wird als interner Standard oder innerer Standard mindestens eine Phosphoglyceridverbindung oder eine Mischung von Phosphoglyceridverbindungen eingesetzt, besonders bevorzugt mindestens ein Di-Fettsäure-sn-glycero-3-phosphocholin, wobei als Fettsäure(n) bevorzugt solche mit 14 bis 20 C-Atomen verwendet werden.
In allen Dokumenten des Standes der Technik wurde davon ausgegangen, dass die Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung in Phospholipiden bzw. Phosphoglyceriden nur erfolgen kann, wenn vorher die Phospholipide von anderen Lipidbestandteilen getrennt wurden. Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass ein derartiger Trennungsgang, der zeitaufwändig ist und einen hohen Lösungsmittelverbrauch erfordert, nicht notwendig ist, wenn man die einzelnen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens einhält.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die Fettsäurezusammensetzung in Phosphoglyceriden auf einfache Art und Weise zu analysieren, wobei alle vorhandenen Fettsäuren qualitativ und quantitativ erfasst werden können. Die Reproduzierbarkeit ist hoch und kann durch Verwendung geeigneter Standards noch weiter erhöht werden. Aus den mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnissen können daher zuverlässige Schlüsse gezogen werden. Dem Arzt wird damit ein Mittel an die Hand gegeben, um verschiedenartige Störungen und Krankheiten, die durch unzureichende Fettsäureversorgung oder unausgewogene Nahrung entstehen, zu analysieren und während der Behandlung zu überwachen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl für Einzelanalysen als auch vor allem für Reihenuntersuchungen und große klinische Studien.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zur Analyse der Fettsäurezusammensetzung von Phosphoglyceriden in Plasma, der alle für die Analyse notwendigen Bestandteile bereitstellt. Der Kit umfasst einen Behälter zur Aufnahme einer Probe, Methanol zur Lösung der Phosphoglyceride, ein Alkalialkoxid als Umesterungskatalysator, ggf. eine methanolische Säure als Stoppmittel, ein organisches Lösungsmittel zur Extraktion der veresterten Fettsäuren und als Träger für die Gaschromatographie sowie mindestens ein Phosphoglycerid, bevorzugt mindestens ein Di-Fettsäure-sn-glycero-3-phosphocholin als inneren Standard.
Die Reagenzien sind jeweils in getrennten Behältern und können gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zudosiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Alkalialkoxid Natriummethoxid.
Als innerer Standard kann eine Einzelverbindung oder eine Mischung von unterschiedlichen Phosphoglyceriden verwendet werden, wobei sich unterschiedliche Verbindungen in den Fettsäuren und/oder einem weiteren am Phosphorsäurerest gebundenen Ester unterscheiden können. Üblicherweise sind die für den inneren Standard verwendeten Verbindungen solche, die in der zu untersuchenden Probe erwartet werden oder den zu erwartenden ähnlich sind. Besonders bevorzugt wird ein Phosphocholin verestert mit gesättigten C15- und/oder C17-Alkansäuren verwendet, da diese Fettsäure nicht in der Probe vorkommt, aber den zu erwartenden (C16/C18) sehr ähnlich ist. Mit anderen Worten wird bevorzugt eine Verbindung gewählt, die in der Probe stark vertreten ist, z. B. Phosphocholin, die aber eine Fettsäure trägt, welche nicht oder nur geringfügig in der Probe vertreten ist Das organische Lösungsmittel kann, wie oben ausgeführt, eine einzelne Verbindung oder eine Mischung sein. Bevorzugt ist es ein Kohlenwasserstoff, insbesondere Hexan.
Weiterhin ist in einer bevorzugten Ausführungsform zusätzlich ein Stoppmittel in dem Kit enthalten. Das Stoppmittel ist bevorzugt eine Säure, insbesondere eine in Methanol gelöste Säure. Als besonders gut geeignet hat sich eine methanolische Mineralsäure, wie methanolisches Hydrochlorid erwiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Reagenzien bereits in den Anteilen bereitgestellt, die zur Durchführung des Verfahrens notwendig sind. Dazu wird das Methanol in einer Menge bereitgestellt, die dem 5- bis 20-Fachen der Probenmenge entspricht, das Alkalialkoxid wird in einer Menge bereitgestellt, die dem 0,1- bis 0,5-Fachen des Probenvolumens entspricht, die interne Standardlösung wird in einem Volumen bereitgestellt, das dem 0,8- bis 1,2-Fachen des Probenvolumens entspricht und das Extraktionsmittel wird in einem Volumen bereitgestellt, das dem 2- bis 5-Fachen des Probenvolumens entspricht.
Besonders bevorzugt sind in dem Kit Methanol/Alkalioxid/organisches Lösungsmittel in einem Verhältnis von 5–10: 0,05–0,2:2–10 vorhanden.
Figuren
1 zeigt die Zusammensetzung der Hauptplasmalipidklassen in Prozent (PL = Phospholipide, NEFA = nicht veresterte Fettsäuren, TAG = Triacylglycerole und CE = Cholesterylester) in den Folch-Extrakten (Diagramm A) und in den methanolischen Überständen der 16 verschiedenen Proben (Diagramm B).
Die 2 und 3 zeigen Korrelationskurven für die Konzentrationen der Fettsäuren und von Docosahexaensäure in Phosphoglyceriden, als Beispiele um die hohe Korrelation über einen breiten Konzentrationsbereich zu demonstrieren.
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren weiter, sollen jedoch nicht als beschränkend angesehen werden.
Beispiel 1
Reagenzien und Proben
Die Lösungsmittel wurden in höchstmöglicher Reinheit von Merck KGAA (Darmstadt, Deutschland) erhalten. Methanolische HCl (3 n) und Natriummethoxid (25 Gew.-% in Methanol) wurden von Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) erworben. Zwei innere Standards wurden angewendet. Für den inneren Standard A wurden Pentadecansäure, Cholesterylpentadecanoat, Tripentadecanoin und 1,2-Dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (Sigma-Aldrich) in Methanol/Chloroform (35:15) gelöst. Der innere Standard B bestand aus 1,2-Dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin gelöst in Methanol. Zur Bestimmung der Effizienz der basenkatalysierten Umesterung wurde Octadecan (Sigma-Aldrich) in Methanol als innerer Standard gelöst. Um eine Oxidation der Fettsäuren zu verhindern, wurden 2 g/l 2,6-Di-tert.-butyl-p-cresol (butyliertes Hydroxytoluol, BHT, Sigma-Aldrich) jedem inneren Standard zugefügt. GLC-85, enthaltend 32 Fettsäuremethylester (Nu-Check Prep, Inc., Elysian, MN, USA) wurde als externer Standard angewendet. L-α-Phosphatidylcholin (Typ XVI-E, ungefähr 99% DC) und Sphingomyelin (Hühnereidotter, ≥ 98% DC) wurden von Sigma-Aldrich erworben. Eine Mischung aus Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat und Natriumsulfat (1:2:2, Merck KGAA) wurde als Puffer zur Neutralisierung nach der säurekatalysierten Umesterung angewendet. 33 Blutproben von gesunden Freiwilligen (die fasteten oder nicht fasteten) wurden in EDTA-haltigen Vakutainern gesammelt. Das Plasma wurde durch Zentrifugation (900 × g, 5 min) abgetrennt und bei –20°C bis zur Analyse aufbewahrt.
Folch-Extraktion (Vergleich)
Zu 250 μl Plasma wurden 100 μl innerer Standard A zugegeben, die Lipide wurden gemäß einer modifizierten Folch-Methode (J. Folch, M. Lees, und G. H. Sloane Stanley, (1975) A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues, J. Biol. Chem. 226, 497–509) extrahiert unter Verwendung von Chloroform/Methanol (2:1, V/V) und zweimal mit NaCl-Lösung (2% in Wasser) gewaschen. Die Extrakte wurden bei 30°C bei vermindertem Druck getrocknet und zum Auftrag auf Dünnschichtchromatographie-Platten in 400 μl Chloroform/Methanol (1:1) aufgenommen.
Lipidfraktionstrennung mit DC, säurekatalysierte Umesterung
N-Heptan, Diisopropylether und Essigsäure (60:40:3) wurden als mobile Phase zur Trennung der Phospholipide, von freiem Cholesterol, nicht veresterten Fettsäuren, Triacylglycerolen und Cholesterolestern angewendet. Die entsprechenden Banden wurden aus der DC-Platte gekratzt, in Glasröhrchen überführt und 1,5 ml methanolische HCl zugegeben. Die verschlossenen Röhrchen wurden 30 s lang geschüttelt und 45 min lang auf 85°C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Proben mit Carbonatpuffer neutralisiert. Für die Methylesterextraktion wurde 1 ml Hexan zugegeben. Nach 5-minütiger Zentrifugation mit 900 × g wurde die obere Hexanphase in ein weiteres Glasröhrchen überführt. Die Extraktion wurde wiederholt und die vereinigten Extrakte wurden bis zur Trockene unter Stickstoffströmung bei Raumtemperatur getrocknet. Der trockene Rückstand wurde in 50 μl Hexan (das 2 g/l BHT enthielt) für die gaschromatographische (GC) Analyse aufgenommen.
Basenkatalysierte Umesterung der Phosphoglyceridfettsäuren (erfindungsgemäß) Zur Analyse der Plasmaphosphoglyceridfettsäuren wurden 100 μl Plasma, 100 μl innerer Standard B und 0,6 ml Methanol (vorgekühlt auf 5°C) in Glasröhrchen vereinigt und 30 s lang geschüttelt. Nach 5-minütiger Zentrifugation mit 900 × g wurde der Überstand in ein weiteres Glasröhrchen überführt. Nach Zugabe von 25 μl Natriummethoxidlösung wurden die Röhrchen geschüttelt und die Synthese der Methylester bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Reaktion wurde nach 3 min gestoppt, indem 75 μl methanolische HCl zugegeben wurden. Zur Extraktion wurden 300 μl Hexan zugefügt und die Röhrchen wurden 30 s lang geschüttelt. Die obere Hexanphase wurde in ein 2-ml-Gläschen überführt. Die Extraktion wurde wiederholt und die vereinigten Extrakte wurden unter Stickstoffströmung bei Raumtemperatur getrocknet. Der trockene Rückstand wurde in 50 μl Hexan (das 2 g/l BHT enthielt) zur GC-Analyse aufgenommen.
Zur Auswertung der Lipidzusammensetzungen im methanolischen Überstand nach Ausfällung des Proteins im Plasma und dem Vergleich der Wiederfindung der Phospholipide im methanolischen Überstand mit dem Folch-Extrakt wurde der Überstand auf eine DC-Platte gegeben. Die Lipide wurden durch DC getrennt und in Fettsäuremethylester (FAME) mit säurekatalysierter Umesterung umgewandelt.
Zur Optimierung der basenkatalysierten Umesterung und Extraktion der Fettsäuremethylester wurde eine Modellprobe, die 100 μl Wasser (stellvertretend für Plasma), 100 μl inneren Standard B und 100 μl Octadecanstandard (der nicht an den Reaktionen teilnahm) angewendet. Das Verhältnis der Peakflächen von Methylpentadecanoat zu Octadecan wurde als Indikator für die Effizienz der Umesterung bzw. Extraktion verwendet.
Chromatographie
Die einzelnen FAME wurden mit Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektor quantitativ ausgewertet. Die GC-Analyse wurde mit einer BTX-70-Säule (60 m × 0,32 mm, SGE, Weiterstadt, Deutschland) unter Verwendung eines Agilent 5890 Serie II Gaschromatographen (Agilent, Waldbronn, Deutschland) durchgeführt. Identische GC-Bedingungen (Anfangstemperatur 130°C, Anstieg 3°C/min bis 170°C, 1,5°C bis 180°C und 3°C bis 210°C, isothermischer Zeitraum für 23 min, HE als Trägergas, Säulenkopfdruck: 1,5 bar) wurden für alle gaschromatographischen Analysen angewendet.
Quantitative Auswertung der Daten
Einzelne FAME wurden identifiziert durch Vergleich mit authentischen Standards. Für jeden Fettsäuremethylester wurde der Anteil bezogen auf Pentadecansäuremethylester (innerer Standard) bestimmt unter Verwendung von GLC-85 als äußerem Standard. EZChrom Eliteversion 3.1.7 wurde zur Peakintegration verwendet.
Statistische Analyse
Für Fettsäuren mit einer Länge zwischen 14 und 24 Kohlenstoffatomen wurden die Ergebnisse ausgedrückt als absolute Plasmakonzentrationen (mg/l) und als Prozentwerte (Prozent Gew/Gew). Die FA-Daten wurden dargestellt als Mittelwert ± SD. Die Korrelationen wurden ausgewertet unter Verwendung des zweiseitigen Spearmantests und von gepaarten t-Tests zum Vergleich zwischen Mittelwerten (P kleiner 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen). Die statistische Analyse wurde durchgeführt mit SPSS für Windows, Version 15.0.1 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Ergebnisse
Analyse der Phosphoglyceridfettsäuren
Die Intraassay-Reproduzierbarkeit (n = 8) für die Analyse der Phospholipide wurde bestimmt gemäß Folch-Extraktion/DC im Vergleich zu den durch Proteinausfällung mit Methanol/DC erhaltenen und im Vergleich zu den aus Phosphoglyceriden mit der erfindungsgemäßen basenkatalysierte Umesterung erhaltenen Ergebnissen, Die Phospholipidfettsäurekonzentrationen (mg/l) und Zusammensetzungen (Prozent Gew-Gew) waren in Folch-Extrakten und methanolischen Überständen vergleichbar (Tabelle 1 und Tabelle 2), aber zeigten für einige Fettsäuren statistisch signifikante Unterschiede. Wie erwartet unterschieden sich die Phosphoglyceridfettsäurekonzentrationen von denen in Phospholipiden. Die Konzentrationen der gesättigten Fettsäuren C20:0, C22:0 und C24:0 und der einfach ungesättigten Fettsäure C24: 1 n-9 in den Phosphoglyceriden waren unterhalb der Nachweisgrenze. Die Phosphoglyceridgesamt-FA-Konzentration war etwa 10% geringer als in Phospholipiden, wohingegen einige einzelne Fettsäuren höhere Konzentrationen zeigten. Für Phosphoglyceride, die durch basenkatalysierte Umesterung erhalten wurden, wurde der CV für alle FA als unter 4% gefunden, wobei C18: 3 n-3, das 0,21% zu den Gesamtfettsäuren beiträgt, den höchsten CV (3,8%) hatte.
Um den Zusammenhang zwischen der Fettsäurekonzentration, die für Plasmaphospholipide durch Extraktion/DC und säurekatalysierte Umesterung erhalten wurde, und der Konzentration nach basenkatalysierter Umesterung des methanolischen Überstands des Plasmaproteinpräzipitats festzustellen, wurden 16 verschiedene Plasmaproben verwendet. Die Plasmalipidzusammensetzung der Probe wurde abgeschätzt durch die Summe der Fettsäuren, die in den Einzelfraktionen bestimmt wurden nach Extraktion und DC-Trennung. Die Phospholipide trugen 37,7% bis 54,6% bei, die nicht veresterten Fettsäuren 1,3% bis 3,7%, die Triacylglycerole 15,4% bis 35,8% und die Cholesterylester 23,6% bis 32,4% (1A). Die Lipidzusammensetzung im methanolischen Überstand nach Proteinausfällung und DC war 90,9% bis 96,8% Phospholipide, 1,3% bis 6,3% nicht veresterte Fettsäuren, 0,9% bis 2,5% Triacylglycerole und 0,8% bis 2,0% Cholesterylester (1B). Nicht veresterte Fettsäuren, Sphingomyelin- und Cholesterylfettsäuren wurden durch Reaktion mit Natriummethoxid unter den angegebenen Bedingungen nicht in FAME umgewandelt. Die Gesamtphospholipid-FA-Konzentration für diese Proben war im Durchschnitt 1317,4 mg/l (1054,2 mg/l bis 1908,3 mg/l) gemäß der Extraktionsmethode. Für die basenkatalysierte Umesterung wurden ins gesamt 1229,9 mg/l (970,4 mg/l bis 1836,3 mg/l FA) in Plasmaphosphoglyceriden gefunden.
Die Korrelation der FA-Konzentrationen und die Beiträge zu den Phospholipiden in Prozent, die gemäß Folch-Extraktion/DC, durch Proteinausfällung mit Methanol/DC und in Phosphoglyceriden, die durch basenkatalysierte Umesterung erhalten wurden, wurde bestimmt (Tabelle 3). Für die Konzentrationen aller analysierten Fettsäuren in Phospholipiden, die durch Extraktion/DC erhalten wurden, und in Phosphoglyceriden, die durch basenkatalysierte Umesterung erhalten wurden, wurden Korrelationskoeffizienten von mehr als 0,9 (P < 0,0001) erzielt (außer für C14:0 und C18: 3 n-6). Sowohl C14:0 als auch C18: 3 n-6 zeigten sehr geringe Konzentrationen und ihr Anteil an den Gesamtfettsäuren in Prozent in Phospholipiden und Phosphoglyceriden war unter 1%. Für den Anteil aller analysierten Fettsäuren in Phospholipiden, die mit Folch-Extraktion/DC erhalten wurden und in Phosphoglyceriden, die durch basenkatalysierte Umesterung erhalten wurden, in Prozent, waren die Korrelationskoeffizienten höher als 0,9 (P < 0,0001) für die meisten Fettsäuren. Nur für C14:0, C20: 1 n-9, C22: 4 n-9 und C18: 3 n-3 waren die r-Werte zwischen 0,76 und 0,89 mit P-Werten ≤ 0,001.
Die 2 und 3 zeigen die Korrelationskurven für die Fettsäuren aus Phosphoglyceriden im Vergleich.
Die Wiederfindung der Phospholipide (n = 16) in den methanolischen Überständen erwies sich als 88,1% ± 6,6% (Mittelwert ± SD) im Vergleich zur Folch-Extraktion. Der innere Standard, der direkt dem Plasma zugegeben wurde, ermöglichte die Korrektur des Verlusts an Phospholipiden, so dass 101,0% ± 2,6% der Phospholipide korrekt in den methanolischen Überständen bestimmt wurden.
Da die Hydrolyse der Methylester ein Problem sein könnte, wenn Wasser (aus der Plasmaprobe) während der basenkatalysierten Umesterung vorhanden ist, wurden die Reaktionsausbeuten in methanolischer Lösung, die 100 μl Wasser und 100 μl internen Standard B enthielt, untersucht. Es wurde gefunden, dass Reaktionszeiten zwischen 3 min und 10 min eine vollständige Umesterung der Fettsäuren aus den Phosphoglyceriden sicherstellten. Die Wiederfindung des internen Standards B war 99,1% ± 0,8% (Mittelwert ± SD) bezogen auf den Octadecanstandard in 8 unabhängigen Analysen.
Nach der basenkatalysierten Umesterung wurden die FAME zweimal mit 300 μl Hexan extrahiert. Um die Extraktionseffizienz auszuwerten, wurden die Proben erneut mit 1 ml Hexan extrahiert. Diese Extrakte enthielten weniger als 1% der gesamten FAME, die mit den vorherigen Extraktionen gewonnen worden waren.
Die Lagerung der für die GC-fertigen Derivate über einen Monat bei –20°C zeigte keine signifikanten Veränderungen der FA-Konzentrationen.
Die folgenden Tabellen zeigen:
Tabelle 1
Intra-assay (n = 8) Reproduzierbarkeit der Fettsäurekonzentrationen (mg/l) in Phospholipiden (PL) erhalten durch Folchextraktion/TLC, durch Proteinpräzipitation mit Methanol/TLC und in Phosphoglyceriden erhalten durch basenkatalysierte Umesterung
Tabelle 2
Intra-assay (n = 8) Reproduzierbarkeit der Fettsäurezusammensetzung (%) in Phospholipiden (PL) erhalten durch Folchextraktion/TLC, durch Proteinpräzipitation mit Methanol/TLC und in Phosphoglyceriden erhalten durch basenkatalysierte Umesterung
Tabelle 3

Korrelationen (n = 16. P < 0.0001, except for * P = 0.001) der Fettsäurekonzentrationen (mg/l) und Zusammensetzungen (% wt/wt) in Phospholipiden (PL) durch Folchextraktion/TLC, durch Protein-präzipitation mit Methanol/TLC und in Phosphoglyceriden erhalten durch basenkatalysierte Umesterung Tabelle 1

Fettsäuren (FS)	PL von Folch et al.		PL in Methanol		Phosphoglyceride
Fettsäuren (FS)	Mittelwert	Varianzkoeffizient	Mittelwert	Varianzkoeff.	Mittelwert	Varianzkoeffizient
Gesättigte FS
C14:0	5.24	2.4	6.38	3.6	7.95	3.2
C16:0	368.36	0.8	376.36	1.2	354.78	0.7
C17:0	5.37	1.3	5.41	2.5	4.93	1.4
C18:0	185.00	1.5	188.00	2.0	168.46	1.1
C20:0	6.67	1.4	7.06	3.2	ND	ND
C22:0	15.64	1.5	16.35	1.5	ND	ND
C24:0	14.11	2.7	14.94	2.9	ND	ND
Einfach ungesättigte FS
C14:1	ND	ND	ND	ND	ND	ND
C16:1n-7	9.85	1.5	10.55	1.7	14.05	2.0
C18:1n-7	19.88	1.4	19.64	1.5	20.69	1.0
C18:1n-9	143.35	1.0	142.99	1.4	156.59	1.3
C20:1n-9	2.35	1.5	2.18	3.3	2.26	2.3
C24:1n-9	28.89	1.2	29.63	1.6	ND	ND
n-9 PUFA
C20:3n-9	2.64	2.9	2.79	4.9	2.76	1.9
n-6 PUFA
C18:2n-6	248.15	1.1	243.21	1.4	251.05	1.4
C18:3n-6	1.73	8.0	1.84	2.8	2.15	2.5
C20:2n-6	3.78	1.7	3.85	3.9	3.96	1.9
C20:3n-6	43.25	1.3	40.91	1.7	41.59	1.3
C20:4n-6	133.09	1.2	126.76	1.4	124.89	1.3
C22:4n-6	5.41	1.5	5.20	5.1	4.64	2.6
C22:5n-6	4.08	3.2	3.98	2.9	3.70	2.5
n-3 PUFA
C18:3n-3	1.92	2.5	1.74	3.0	2.59	3.8
C20:5n-3	10.50	1.3	9.74	1.6	9.99	1.6
C22:5n-3	12.00	1.1	10.68	1.2	10.69	1.5
C22:6n-3	46.22	1.9	41.13	0.8	42.15	1.4
Gesamtfettsäuren
	1317.42	0.9	1311.29	1.3	1229.85	0.9

Tabelle 2

Fettsäuren (FS)	PL von Folch et al.		PL in Methanol		Phosphoglyceride
Fettsäuren (FS)	Mittelwert	Varianzkoeffizient	Mittelwert	Varianzkoeff.	Mittelwert	Varianzkoeffizient
Gesättigte FS
C14:0	0.40	3.0	0.49	3.9	0.65	3.4
C16:0	27.96	0.3	28.70	0.2	28.85	0.6
C17:0	0.41	0.7	0.41	1.8	0.40	0.6
C18:0	14.04	0.9	14.34	1.4	13.70	0.7
C20:0	0.51	1.1	0.54	1.9	ND	ND
C22:0	1.19	1.4	1.25	0.4	ND	ND
C24:0	1.07	2.6	1.14	2.7	ND	ND
Einfach ungesättigte FS
C14:1	ND	ND	ND	ND	ND	ND
C16:1n-7	0.75	1.7	0.80	1.5	1.14	1.8
C18:1n-7	1.51	0.6	1.50	1.3	1.68	0.6
C18:1n-9	10.88	0.5	10.90	0.7	12.73	0.7
C20:1n-9	0.18	1.6	0.17	3.1	0.18	2.6
C24:1n-9	2.19	0.8	2.26	0.9	ND	ND
n-9 PUFA
C20:3n-9	0.20	2.3	0.21	3.7	0.22	1.8
n-6 PUFA
C18:2n-6	18.84	0.8	18.55	0.3	20.41	0.7
C18:3n-6	0.13	8.5	0.14	3.6	0.17	2.4
C20:2n-6	0.29	1.5	0.29	3.0	0.32	1.3
C20:3n-6	3.28	0.6	3.12	0.6	3.38	0.7
C20:4n-6	10.10	0.4	9.67	0.4	10.15	0.8
C22:4n-6	0.41	1.4	0.40	4.4	0.38	2.0
C22:5n-6	0.31	3.2	0.30	2.6	0.30	2.1
n-3 PUFA
C18:3n-3	0.15	2.1	0.13	2.3	0.21	3.7
C20:5n-3	0.80	0.6	0.74	0.6	0.81	0.7
C22:5n-3	0.91	0.6	0.81	1.0	0.87	0.9
C22:6n-3	3.51	1.1	3.14	0.7	3.43	0.9

Tabelle 3

Fettsäuren (FS)	Folch PL vs. Methanol PL		Folch PL vs. Phosphoglyceride
Fettsäuren (FS)	FS Konzentration	FS Zusammensetzung	FS Konzentration	FS Zusammensetzung
Gesättigte FS
C14:0	0.974	0.941	0.841	0.835
C16:0	0.994	0.900	1.000	0.918
C17:0	0.973	0.964	0.958	0.956
C18:0	0.971	0.994	0.933	0.985
C20:0	0.906	0.979	ND	ND
C22:0	0.921	0.985	ND	ND
C24:0	0.968	0.981	ND	ND
Einfach ungesättigte FS
C14:1	ND	ND	ND	ND
C16:1n-7	0.929	0.958	0.924	0.962
C18:1n-7	0.959	0.982	0.974	0.970
C18:1n-9	0.974	0.956	0.976	0.968
C20:1n-9	0.956	0.909	0.913	0.804
C24:1n-9	0.960	0.981	ND	ND
n-9 PUFA
C20:3n-9	0.979	0.979	0.978	0.999
n-6 PUFA
C18:2n-6	0.979	0.991	0.974	0.956
C18:3n-6	0.802	0.730*	0.885	0.938
C20:2n-6	0.986	0.967	0.975	0.963
C20:3n-6	0.991	0.990	0.974	0.982
C20:4n-6	0.977	0.985	0.944	0.950
C22:4n-6	0.954	0.921	0.915	0.760*
C22:5n-6	0.987	0.984	0.979	0.996
n-3 PUFA
C18:3n-3	0.982	0.982	0.916	0.888
C20:5n-3	0.991	0.985	0.995	0.985
C22:5n-3	0.952	0.964	0.950	0.940
C22:6n-3	0.941	0.951	0.915	0.946
Gesamtfettsäuren
	0.988		0.974

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verfahren zur Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung von Phosphoglyceriden, wobei einer phosphoglyceridhaltigen Probe Methanol zugesetzt wird, die Kombination gemischt wird und ausgefälltes Material von der Methanolphase getrennt wird, der Methanolphase ein Alkali-Alkoxid als Base zugesetzt wird, um eine Umesterung zu katalysieren, aus der nach der Umesterung erhaltenen Lösung die entstandenen Methylester aus der Lösung extrahiert werden und gaschromatographisch aufgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die phosphoglyceridhaltige Probe eine Blutprobe, insbesondere Blutplasma oder Blutserum ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Base Natriummethoxid verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umesterung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 45°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umesterung bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 30°C, bevorzugt bei Raumtemperatur im Bereich von 20 bis 25°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion mit einem unpolaren Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion mit Hexan durchgeführt wird.
Kit zur Analyse der Fettsäurezusammensetzung in Phosphoglyceriden umfassend einen Behälter zur Aufnahme einer Probe in getrennten Behältern Methanol zur Lösung der Phosphoglyceride ein Alkali-Alkoxid als Umesterungskatalysator, ein organisches Lösungsmittel zur Extraktion der Fettsäuremethylester und als Träger für die Gaschromatographie sowie mindestens ein Phosphoglycerid als inneren Standard.
Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalialkoxid Natriummethoxid ist.
Kit nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass weiterhin eine alkoholische Säure als Stoppmittel enthalten ist.
Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Standard mindestens ein Di-Fettsäure-sn-glycero-3-phosphocholin enthalten ist.