DE2629692C3 - Verfahren zum biologischen Festlegen von Enzymen oder mikrobiellen Zellen mittels durch Bestrahlung härtbarer Polymerer sowie danach hergestellte Erzeugnisse - Google Patents
Verfahren zum biologischen Festlegen von Enzymen oder mikrobiellen Zellen mittels durch Bestrahlung härtbarer Polymerer sowie danach hergestellte ErzeugnisseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum biologischen Festlegen von Enzymen oder mikrobiellen Zellen,
bei dem eine wäßrige Dispersion von Enzymen oder mikrowellen Zellen einerseits und einem durch Bestrahlung
härtbaren Polymeren andererseits hergestellt und die Mischung anschließend zum Härten bestrahlt wird,
sowie danach hergestellte Erzeugnisse.
Um die Instabilität der Enzymaktivität auf ein Minimum zu bringen und kontinuierliche enzymatische
Prozesse zu erleichtern, wird seit Neuerem das Verfahren der Immobilisierung und biologischen Festsetzung
der Enzyme angewendet, wobei diese dann als fester Katalysator verwendet werden. Dies ist seil
Kürzerem in verschiedenen Industriezweigen versucht worden.
Als Verfahren zum Herstellen der immobilisierten Enzyme sind ein Absorptionsverfahren, ein kovalentes
Bindungsverfahren, ein Vernetzungsverfahren sowie ein Einschließungsverfahren bekannt. Bei dem letztgenannten
Einschließungsverfahren wird das Enzym selbst nicht an eine Matrix gebunden, sondern wird im
Feingitter eines Geles eingeschlossen oder in mikroskopischem Maßstab eingekapselt. Die Enzymaktivität des
Produktes kann auf diese Weise wirksam gehalten werden, wobei verschiedene Arten von Enzymen und
mikrobiellen 7ellen nach diesem Verfahren behandelt werden können. Um das Verfahren ausführen /u
können, ist es ledoch erforderlich, daß ein inimobilisic
rendes Material /ur Vertilgung steht, welches l-n/vme
oder mikrobielle Zellen einsthließi, ohne daß bereits
eingeschlossene Kn/yme freigelassen werden, wobei das
M."erial weiterhin eine selektive Permeabilität für :.is
Substrat, wenn erforderlich, aufweisen muß.
Beim herkömmlichen Einschlußverfahren wird eine wäßrige Suspension von Enzymen oder mikrobiellen
Zellen mit niedermolekularen, hydrophilen Monomeren, wie beispielsweise Acrylamidhydroxyäthylmethacrylat,
Hydroxyäthylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat und
Hydroxypropylacrylat, gemischt Die Mischung wird, wie sie ist, durch Polymerisation immobilisiert. Bei
diesem Verfahren ist es jedoch schwierig, in zuverlässiger Weise selektive Permeabilität der erhaltenen
Polymermatrix zu steuern, wie es notwendig ist, damit die eingeschlossenen Enzyme oder mikrobiellen Zellen
nicht freigegeben werden. Zusätzlich hierzu ist die Toxizität des immobilisierten Produktes zu beachten,
die von Bedeutung ist, wenn das Produkt in der Nahrungsmittelindustrie und pharmazeutischen Industrie
verwendet wird, da nicht umgesetzte molekulare Monomere im Reaktionsprodukt verbleiben.
Durch die GB-PS 14 07 129 ist bereits ein Verfahren der eingangs genannten Art bekanntgeworden, bei dem
eine wäßrige Lösung, die ein Enzym und wenigstens ein wasserlösliches Monomeres oder Polymeres enthält,
eingefroren wird, woraufhin die eingefrorene Lösung mit ionisierender Strahlung behandelt wird, um so das
Monomere oder Polymere bzw. die Monomeren oder Polymeren zu härten. Dieses bekannte Verfahren, bei
dem also ionisierende Strahlung (Gamma- oder Elektronenstrahlung) eingesetzt wird, hat den Nachteil,
daß während des Härtens die Aktivität der Enzyme oder der mikrobiellen Zellen beeinträchtigt werden kann,
wobei das erforderliche Einfrieren der Lösung vor der Bestrahlung noch eine zusätzliche Komplikation des
Verfahrens bedeutet. Durch die US-PS 38 60 490 ist das Einschließen von Mikroorganismen in hydrophilen
Acrylaten oder Meihacrylaten bekanntgeworden, um so ein kontrolliertes In-Kontakt-Kommen der Mikroorganismen
mit der Umgebung zu gewährleisten, jedoch treten bei derartigen Verfahren, wie bereits ausgeführt
wurde, Schwierigkeiten hinsichtlich der Einstellung der selektiven Permeabilität der erhaltenen Polymermatrix
sowie hinsichtlich der möglichen Toxizität des immobilisierten Produktes auf. Aus der US-PS 39 68 016 ist es
bekannt, daß mittels aktinischer Strahlung bestimmte Polymermischungen gehärtet werden können, jedoch
findet sich hier keine Beziehung zum gattungsgemäßen Verfahren und den dabei auftretenden Problemen. In
den US-Patentschriften 37 88 950 und 38 59 169 wird die Fotopolymerisation von Monomeren, zwecks Einschlusses
von Mikroorganismen, beschrieben, wobei aber die weiter oben bereits erläuterten, auf die Verwendung
von Monomeren zurückzuführenden Probleme auftreten. Dasselbe trifft für die US-PS 38 44 892 zu, bei der
Enzyme durch Reaktion mit einem epoxyhaltigen Polymeren immobilisiert werden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen,
welches die Nachteile der bekannten Verfahren vermeidet und zu Produkten führt, die eine stabile
Enzymaktivität aufweisen, wobei die eingeschlossenen Enzyme oder mikrobiellen Zellen in der Polymermatrix
bei steuerbarer Permeabilität derselben zuverlässig festgehalten werden sollen. Dabei soll weiterhin erreicht
werden, daß die nach dem erfindiingsgemäßen Verfahren
hergestellten neuartigen immobilisierten lin/ymc
oder mikrobiellen /eilen selbst gut verarbeitbar und nicht toxisch sind.
Erfindurigsgemüß wird diese Aulgabe durch ein
Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß als Polymeres ein fotohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht
300 bis 30 000) verwendet wird, welches zwei oder mehr fotopolymerisierbare, äthylenisch ungesättigte
Gruppen pro Molekül sowie nichtionische hydrophile Gruppen aufweist: und daß die Mischung in
situ mit aktinischer Strahlung bestrahlt wird.
Im Unterschied zu dem Verfahren der gattungsgemäßen Art, bei dem wasserlösliche Monomere oder
Polymere verwendet werden und die Härtung durch ionisierende Strahlung erfolgt, wird beim erfindungsgemäßen
Verfahren ein hydrophiles Polymeres, we'ches nicht wasserlöslich ist, in Suspension verwendet, wobei
lediglich aktinische Strahlung zum Härten angewandt wird, die die Enzymaktivität nicht beeinträchtigt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, dessen besonders bevorzugte Ausführungsformen sich aus den
Unteransprüchen ergeben, wird also eine wäßrige Suspension von Enzymen oder mikrobiellen Zellen mit
einem nicht-ionischen hydrophilen Harz gut gemischt und in die gewünschte Form gebracht Dann folgt eine
Polymerisation durch Bestrahlung mit aktinischen Strahlen von 2 500 bis 6 ooo Ä Wellenlänge. Das
nichtionische hydrophile Harz hat ein mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht von 300 bis 30 000,
vorzugsweise zwischen 500 und 20 000, und weist zwei oder mehr fotopolymerisierbare, äthylenisch ungesättigte
Gruppen pro Molekül auf.
Erfindungsgemäß wird das Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes bzw. Kunstharzes vor der
Durchführung des Verfahrens so eingestellt, daß das Harz durch Substrate hindurchgeht, jedoch eingeschlossene
Enzyme oder mikrobielle Zellen nicht freiläßt. Das Material wird durch photohärtbare aktinische Strahlen
in einem einzigen Schritt gehärtet, wodurch sich ein mechanisch stabiles, immobilisiertes Produkt ergibt. Das
photohärtbare Harz weist vorzugsweise hydrophile Gruppen in einem derartigen Ausmaß auf, daß das Harz
sich gleichmäßig mit der wäßrigen Lösung (Pufferlösung od. dgl.) mischt, welche die Suspension der
hydrophilen Enzyme oder mikrobiellen Zellen enthält. Die Aktivität der Enzyme oder der mikrobiellen Zellen
kann auf diese Weise in einem sehr stabilen Zustand gehalten werden. Weiterhin werden die Enzyme oder
mikrobiellen Zellen immobilisiert, ohne daß sie ihre Aktivität verlören. Im Unterschied von demjenigen
Verfahren, bei dem Gammastrahlen oder Elektronenstrahlen verwendet werden, erfolgt während des
Härtens kein Abbau der Aktivität der Enzyme oder der mikrobiellen Zellen, da erfindungsgemäß aktinische
Strahlen verwendet werden.
Um die Enzyme oder mikrobiellen Zellen zu immobilisieren, sind zwei oder mehr photopolymerisierbare,
äthylenisch ungesättigte Gruppen für jedes Molekül des photohärtbaren Harzes erforderlich. Wenn
das zahlenmäßig mittlere Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes unter 300 liegt, ist zu besorgen, daß
das gehärtete Produkt spröde wird, und zwar deshalb, weil die Linearität der Vernetzung oder Verzweigung
niedrig ist. Wenn andererseits das mittlere zahlenmäßige Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes höher
als 30 000 ist, so wird die Viskosität der Mischung aus llarznutterial um! de" Enzym- oder mikrobiellen
Zellsuspension hoch, wodurch die Verarhcitbarkeil des
Harzes beeinträchtigt wird. Aus diesem Grunde sollte das mutlere zahlenmäßige Molekulargewicht des
photoh jrtbaien ! hu/es innerhalb des Bereiches ν. .n 300
bis 30 000. vorzugsweise zwischen 500 bis 20 000, liegen.
Es hat sich gezeigt, daß die nachfolgenden Vorteile im
Vergleich zu herkömmlichen Verfahren erzielt werden können, wenn Enzyme oder mikrobielle Zellen nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert werden: Das photohärtbare Harz, welches nicht-ionische
hydrophile Gruppen aufweist, wird von Monomeren mit niedrigen Molekulargewichten erzeugt Im nächsten
Schritt wird die Mischung aus dem photohärtbaren Harz und der wäßrigen Dispersion aus Enzymen oder
ίο mikrobiellen Zellen (nachfolgend als »Enzym-Harz-Zusammensetzung«
bezeichnet) durch Bestrahlung mit aktinischen Strahlen gehärtet Die Dimensionen der
freien Räume im so erzeugten Polymergitter können also frei gesteuert werden. Das Freisetzen oder
H Abgaben von Enzymen oder mikrobiellen Zellen kann verhindert werden, wodurch sich wirtschaftliche Vorteile
ergeben. Wenn das photohärtbare Harz durch Gammastrahlen oder Elektronenstrahlen gehärtet würde,
so würde die Aktivität des Enzymes, welches in der Harzzusammensetzung enthalten ist, reduziert, weil die
Energie von Gammastrahlen oder Elektronenstrahlen sehr groß ist Beim erfindungsgemäßen Verfahren tritt
ein derartiger Nachteil jedoch nicht auf, weil hier ultraviolette Sirahlen oder sichtbare Lichtstrahlen
verwendet werden, um die Enzymharzzusammensetzung zu härten. Infolgedessen kann die Enzymaktivität
gut aufrechterhalten werden. Weiterhin hat die Tatsache, daß d?s Harzgerüst vorher gebildet wird und
die Enzymharzzusammensetzung durch Kurzzeitbe-
Ki strahlung mit aktinischen Strahlen gehärtet wird, zur
Folge, daß eine Verringerung der Aktivität des Enzymes oder der mikrobiellen Zellen nicht auftritt. Dies stellt
einen Vorteil dar, der nicht erhalten werden könnte, wenn die Photohärtung unmittelbar erfolgte, um
i) Polymere direkt aus niedermolekularen Monomeren zu
erzeugen.
Weiterhin sind die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei also die Suspension des Enzymes
oder der mikrobiellen Zellen und das photohärtbare
κι Kunstharz gemischt und anschließend die Mischung mit aktinischen Strahlen behandelt werden, sehr einfach.
Zusätzlich hierzu werden keine niedermolekularen Monomeren, die allgemein toxisch sind, verarbeitet. Die
Arbeitsumgebung, in welcher der Härtungsschritt
■i > erfolgt, kann auf diese Weise stark verbessert werden.
Wenn Enzyme oder mikrobielle Zellen dadurch immobilisiert werden, daß niedermolekulare Monomere
Anwendung finden, wie es bei den herkömmlichen Verfahren der Fall ist, so koexistieren die Enzyme oder
in mikrobiellen Zellen mit den restlichen Monomeren, so
daß die Monomeren durch starkes Erhitzen, durch Säure- oder Alkalibehandlung oder auch durch Behandlung
mit organischen Lösungsmitteln entfernt werden müssen. Auf diese Weise wird die Aktivität der Enzyme
ν; oder mikrobiellen Zellen in nachteiliger Weise herabgesetzt.
Beim Verfahren nach der Erfindung hingegen kann das Restmonomere leicht in dem Schritt, in dem
das photohärtbare Harz erzeugt wird, entfernt werden, d. h. also, ehe die Enzyme oder mikrobiellen Zellen
fan eingeschlossen werden. Das nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellte Produkt kann also in der Nahrungsmittelindustrie sowie in der pharmazeutischen
Industrie sicher gebraucht werden, bei denen ansonsten die Toxidilät des verbleibenden Monomercs ein
,. ι Problem darstellen würde. Fin weiterer Vorteil lieg:
darin, daß die Formgebung ooer der GieLtvorgang ohne
Schwierigkeiten stattfinden können, weil sich das Härten mittels Bestrahlung in kurzer Zeit erfolgt und
das photohärtbare Harz in gewissem Ausmaß viskos ist. Wenn die Enzyme oder mikrowellen Zellen in eine
Membran oder einen Film eingebracht werden, können andere Harze in das photohärtbare Harz eingemischt
werden, um die mechanische Festigkeit des so erzeugten Film- oder Folienproduktes zu verbessern. Auch können
vorab starke Bindungen in die Moleküle des photohärtbaren Harzes eingeführt werden. Die mechanische
Festigkeit der immobilisierten Enzyme oder mikrobiellen
Zellen kann also frei kontrolliert werden. Je nach Bedarf knnn eine photohärtbare Harzlosung, welche
Enzyme oder mikrobielle Zellen enthält, imprägnierungsartig in ein anderes synthetisches oder natürliches
Material eingebracht oder auf dieses aufgebracht werden, beispielsweise in bzw. auf Substrate, woraufhin
dann die Härtung mittels Bestrahlung mit aktinischen Strahlen erfolgt.
Jedwedes der oben angegebenen photohärtbaren Harze kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, jedoch sind nachfolgend einige Beispiele angegeben.
Photohärtbare Harze
Aus Polyäthylenglykol und Acryl- oder Methacrylsäure hergestellte Polyester; Diester aus ungesättigter
Monokarbonsäure, hergestellt aus zwei Molen von Acryl- oder Methacrylsäure und einem Mol von
Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 600 bis 10 000; und Veresterungsprodukte aus ungesättigter
Karbonsäure, hergestellt aus drei Molen Acryl- oder Methacrylsäure, η Molen einer tribasischen Säure, wie
beispielsweise Trimellitsäure und \(n + 1) Molen
Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 600 bis 10 000.
Urethanisierte Adducte von Polyäthylenglykol und
2-Hydroxyäthylacrylat oder Methacrylat
2-Hydroxyäthylacrylat oder Methacrylat
Urethanisierte Produkte, die aus η Molen von Diisocyanat, wie Tolylen Diisocyanat, Xylol Diisocyanat,
Isophoron Diisocyanat und Hexamethylendiisocyanat, n-\ Molen von Polyäthvlenglykol mit einem
Molekulargewicht von 800 bis 10 000, und zwei Molen einer ungesättigten Monohydroxyverbindung, wie beispielsweise
2-Hydroxyäthylacrylat oder Methacrylat. hergestellt sind; urethanisierte Produkte, wie aus η
Molen Triisocyanat, wie Desrnodur L (Warenzeichen der Firma Farbenfabriken Bayer AG), n—\ Molen
Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 800 bis 10 000 und η + 2 Molen 2-Hydroxyäthylacrylat oder
Methacrylat hergestellt sind; und urethanisierte Produkte, die aus zwei Molen Diisocyanat, 1 Mol Polyäthylenglykol
mit einem Molekulargewicht von 400 bis 10 000 und 2 Molen einer ungesättigten Monohydroxyverbindung,
wie 2-Hydroxyäthylacrylat oder Methacrylat hergestellt sind.
Ungesättigte Cellulose
Adduct von wasserlöslichen Cellulosen, wie CeIIuIoseacetatphthalat,
Hydroxypropylmethylcellulosephthalat und Hydroxyäthylcellulose mit ungesättigten Glycidylverbindungen,
wie Glycidylacrylat und Glycidylmethacrylat oder ungesättigten Säureanhydriden, wie
Itakonsäureanhydrid und Maleinanhydrid.
Ungesättigte Polyamide
Ungesättigtes Polyamid, welches durch Hinzufügen des Adductes von 1 Mol Diisocyanat, wie Tolylendiisocyanat
und Xyloldiisocyanat, unü 1 Mol einer ungesättigten Hydroxylverbindung, wie 2-Hydroxyäthylacrylat,
zu einem wasserlöslichen Polyamid, wie beispielsweise Gelatine, hergestellt sind.
ί Das Verfahren nach der Erfindung läßt sich auf
verschiedene Arten von Enzymen und mikrobiellen Zellen anwenden. Diese werden effektiv immobilisiert,
ohne daß ihre Aktivität verloren geht
Nachfolgend werden die Enzyme und mikrobielle
in Zellen, bei denen die Erfindung angewendet werden
kann, an Hand von Beispielen erläutert Es ist aber zu beachten, daß es sich dabei um nicht-begrenzende
Beispiele handelt.
Enzyme
Urease, Glykoseoxidase, Katalase, Glukoamylase, Glukoseisomerase, Invertase, Glukoseoxidase-Katalase,
Lactase, D-Aminosäureoxidase, «-Galaktosidase, Aminoacrylase,
Aspertase und Penizillinamidase.
Mikrobielle Zellen
Zellen von Lactobacillus bulgaricus, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Azotobacter vinelandii und
Proteus vulgaris.
Um die Photopolymerisation beim erfindungsgemäßen Verfahren zu beschleunigen, können bekannte
Photosensibilisatoren der Enzymharzzusammensetzung zugesetzt werden.
Beispiele für derartige Photosensibilisatoren sind
in Λ-Karbonylalkohole, wie Benzoin und Acetoin; Acyloinäther
wie Benzoinmethyläther. Benzoinäthyläther, Benzoinisopropyläther, Anisoinäthy'äther und Pivaloinäthyläther;
«-substituierte Acyloine, wie a-Methylbenzoin
und a-Methoxybenzoin; Polycyclische aromatische
jj Verbindungen, wie Naphthol und Hydroxyanthracen:
Azoamide wie beispielsweise 2-Cyano-2-Butylazoformamid; und Metallsalze, wie Uranylnitrat und Eisenchlorid.
Weiterhin können auch Merkaptane, Disulfide, Halogenide und Farbstoffe verwendet werden.
4(i Diese Photosensibilisatoren weiden entweder allein
oder als Mischung von zwei oder mehreren derselben im Verhältnis von 0,2 bis 7 Gew.-%, bezogen auf die
photohärtbaren Harze, verwendet.
Beim erfindungsgemaßen Verfahren wird die Enzym-
-r, harzzusammensetzung zunächst in die gewünschte
Form gebracht, woraufhin dann die Zusammensetzung mit aktinischer Strahlung behandelt wird. Solange die
aktinischen Strahlen auf die zu härtende Zusammensetzung auftreffen, kann die Zusammensetzung in jedwede
gewünschte Form und Dicke gebracht werden, und zwar mit oder ohne Behälter oder Umhüllung.
Beispielsweise kann die Zusammensetzung aut die Oberfläche eines Artikels aufgebracht werden. Auch
kann die Zusammensetzung auf ein anderes Material
•v> auflaminiert werden, auch in einen transparenten Behälter eingebracht werden. Schließlich ist ein
Einimprägnieren in ein poröses Material möglich. Fernerhin kann die Zusammensetzung auch unter
Bestrahlung frei strömen. Die Artikel, die mit der
W) Zusammensetzung versehen werden wollen, können
beliebiger natürlicher oder synthetischer Art sein, einschließlich gestrickter oder gewebter Bekleidungsstücke
oder Textilien, Meta'lerzeugnissen od. dgl.
Als Lichtquelle für die uKtinische Strahlung ist
h~. jedwedes Gerät geeignet, welches Lichtstrahlen im
Bereich von 2 500 bis 6 0°0 Ä Wellenlänge abgibt. Als
Beispiele für derartige Lichtquellen sind Hochdruckquecksilberlampen,
NieuerdiULkquecks'lberlampen,
Fluoiescenzlampen, Xenonlampen, Kohlelichtbögen
sowie Sonnenbestrahlung zu nennen. Die Bestrahlungszeit liegt allgyrr.ein zwischen 1 Minute und zehn
Minuten. Es ist vorteilhaft, Lichtstrahlen in einer Atmc'.;'i:ai"L ««'.,·. einem inertgas einwirken zu lassen, um
die Bestrahlungszeit herabzusetzen.
Nachfolgend wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen im einzelnen erläutert. In den
Ausführungsbetspic'en, wenn nicht anders angegeben,
Teile und Prozente immer bezogen auf das Gewicht angegeben.
Aus 90 Teilen NK-Ester 23G (Warenzeichen eines Dimethacrylates von Polyäthylenglykol mit einem
Molekulargewicht von 1 000, hergestellt durch die Firma Shin Nakamura Chemical Ind. Ltd, Japan), 10
Teilen einer 0,5%igen wäßrigen Lösung von Glukoseoxidase (mit Katalasegehalt), aufgelöst in einer 0,1 molaren
Phosphatpufferlösung pH-Wert von 5,6, und einem Teil Benzoinäthyläther wurde eine einheitliche Mischung
hergestellt In die so hergestellte, gemischte Lösung wurde eine Plantinelektrode eingetaucht Die
gemischte Lösung, mit der darin befindlichen Elektrode, wurde bei einer Temperatur von weniger als 25° C fünf
Minuten lang mittels einer Niederdruckquecksilberlampe aus um die Elektrode liegenden Richtungen bestrahlt.
Auf diese Weise wurde die Elektrode mit einem immobilisierten Enzym bedeckt. Die genannte Elektrode
und eine andere Bleielektrode, als Gegenelektrode, wurden in eine O,l°/oigen Glukoselösung eingetaucht,
woraufhin eine elektrische Messung erfolgte, als deren Ergebnis das durch die Glukose bewirkte Verhalten der
Elektroden beobachtet wurde.
Ein photohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht: 2160) wurde aus einem Mol Xyloldiisocyanat,
750 g Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1 500 und 1,1 Mol von 2-Hydroxyäthylmethacrylat
hergestellt Weiterhin wurden 85 Teile des so hergestellten photohärtbaren Harzes, 15 Teile
0,l%iger Pufferlösung von Urease, und 2 Teile von Benzoinmethyläther innig miteinander vermischt. Eine
Glasplatte von 3 mm wurde horizontal angeordnet Auf der Glasplatte wurde ein quadratischer Rahmen (5 cm
χ 5 cm) als Innenabmessung) mittels Abstandshaltern von 1 mm Dicke gebildet Die so erhaltene Mischung
wurde in den Innenbereich des Rahmens auf der Glasplatte gegossen. Auf die Glasplatte wurde in
dichter Anordnung eine Polyesterplatte mit einer Dicke von 0,5 mm aufgelegt Dann erfolgte eine Bestrahlung
bei einer Temperatur von weniger als 35° C für 2 Minuten mittels einer 2-kW-Hochdruckquecksilberlampe,
die in einem Abstand von 5 cm oberhalb der Polyesterplatte angeordnet wurde. Hierdurch entstand
ein transparentes immobilisiertes Enzymprodukt Der Enzymfilm wurde dann dreimal mit jeweils 200 ml
destillierten Wassers abgespült und in 100 ml einer 0,01 molaren Harnstofflösung eingetaucht, die mit einer
0,01 molaren Phosphatpufferlösung präpariert war. Dann ließ man Harnstoff 30 Minuten lang bei 300C
reagieren. Dann wurden 5 ml der Reaktionslösung
herausgenommen. Nach der Zusetzung von 5 ml von 0,1 N-HCL zu der Lösung, wurde diese mit 0,1 N-NaOH
zurücktitriert Als Resultat dieses Versuches ergab sich,
daß das Aktivitätsverhältnis zu demjenigen des natürlichen Enzymes 68% betrug.
Ein photohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht: 2160) wurde aus einem Mol Xyloldi-
j isoeyanai, 750 g Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht
von 1 500 und 1,1 Molen 2-Hydroxyäthylmethacrylat
hergestellt. Weiterhin wurden 65 Teile dieses photohärtbaren Harzes, 2OTeUe NK-Ester M-9G
(Warenzeichen für Methacrylat aus Methoxypolyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 400,
hergestellt durch die Firma Shin Nakamura Chemical Ind. Ltd.), 1 Teil Benzoinäthyläther und 15 Teile der
durch Dispersion von 100 g Glukoseisomerase in 100 ml
Pufferlösung hergestellten Lösung einheitlich miteinander vermischt
Ein Teströhrchen aus Glas mit einem Außendurchmesser von 19 mm wurde konzentrisch in einem
anderen Reagenzglas mit einem Innendurchmesser von 22 mm angeordnet Die oben angegebene, gemischte
Lösung wurde in den Zwischenraum zwischen den beiden Glasröhrchen eingegossen. Dann enoigte die
Bestrahlung bei einer Temperatur von weniger als 35° C 3 Minuten lang, wobei vier 500-W-Hochdruckquecksilberlampen
aus vier Richtungen senkrecht an den Längswänden der Teströhrchen eingesetzt wurden.
Hierdurch ergab sich ein rohrförmiges, transparentes, festes Produkt. Das rohrförmige Produkt wurde mit 10
ml von 2%iger Glukosephosphatpufferlösung gefüllt, die Magnesiumionen enthielt und bei 500C gehalten. Die
so Flüssigkeit, welche durch den rohrförmigen Film hindurchdiffundierte, wurde gesammelt Die Farbe
wurde mittels der Zystein-Karbazol-Methode entwikkelt um so die Bildung von Fruktose durch Colorimetry
bei 560 πιμ Wellenlänge zu messen. Als Resultat ergab
J5 sich, daß 93% der Glukose in Fruktose verwandelt
waren.
Eine Enzymlösung wurde hergestellt, indem 50 mg Invertase und 50 mg Glukoseisomerase zu 10 ml
Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,0 hinzugefügt wurden. Zu dieser Enzymlösung wurden gleichmäßig 90
g Nk-Ester 23G (verwendet in Beispiel 1) und 1 g Benzoinäthyläther zugesetzt. Die vorstehende Mischung
wurde dann in den Beispiel 2 angegebenen Rahmen eingegossen, woraufhin ein 0,2 m dicke
Polyesterfolie dicht auf die Mischung aufgelegt wurde. Dieser so erhaltene Film wurde bei einer Temperatur
von weniger als 35° C 1 Minute lang unter Verwendung
so einer Niederdruckquecksilberlampe bestrahlt wodurch ein immobilisierter Enzymfilm entstand. Dieser Enzymfilm
wurde in mehrere Stücke quadratischer Form mit einer Kantenlänge von 1 cm zerschnitten und dann
dreimal mit 11 Wasser abgespült Die ausgeschnittenen
Stücke wurden dann in 100 ml 2%iger Sucroselösung (pH: 7,0) als Substrat eingetaucht, woraufhin eine
Reaktion für 60 Minuten bei 45° C erfolgte. Die erzeugte Fruktose wurde nach der Zystein-Karbazol-Methode
analysiert, wobei sich ergab, daß das Verhältnis der
Aktivität zu derjenigen des ursprünglichen Enzyms 45% betrug.
Aus 90 Gewichtsteilen NK-Ester 23G (verwendet in Beispiel 1), 10 Teilen Proteus vulgaris also mikrowellen
Zellen, suspendiert in einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0, unds 1 Teil
Benzoinmethyläther wurde eine gleichförmige Mi-
schung hergestellt, niese Misei.jüg wurde »uf einen
'■'ia>.esiieifer. aufgebracht, wobei sich ein 0,5 mm dicke
Film ergab. Dann wurde eine 0,3 mm dicke transparente Polyesterplatte hierauf angecdnei. Dann erfolgte eine
Bestrahlung be\ einer Temperatur unterhalb 25°C für 3
Minuten mittels einer Niederdruckquecksilberlampe, die in 5 cm Abstand oberhalb angeordnet war. Nach der
Beschichtung wurde die Polyesterplatte abgezogen, wodurch sich ein immobilisiertes Produkt aus mikrobielien
Zellen ergab, welches die Gaze als Träger aufwies.
Aus einem Mol Hydroxyäthylacrylat, einem Mol Isophorondiiäocyanat und 2 000 g Holyäthylenglykol mit
einem Molekulargewicht von 4 000 wurde ein photohärtbare.s
Harz hergestellt
Dann wurden 100 Teile des so hergestellten photohärtbaren Harzes, 300 Teile einer 2%igen
Pufferlösung (pH 4,5) von Glukoamylase, und 1 Teil Benzoinäthyläther innig miteinander vermischt.
Ein Polyesterfilm mit einer Dicke von 0,2 mm wurde horizontal angeordnet woraufhin ein quadratischer
Rahmen (5 cm χ 5 cm als Innenabmessung) hergestellt
wurde, indem Abstandshalter von 0,3 mm verwendet \vi Jtu. Dann wurde die oben beschriebene Mischung
in den so auf den i'olyesterfilm gebildeten Rahmen eingegossen. Auf der gemischten Lösung wurde eine
Polyesterplatte mit einer Dicke von 0,2 mm dicht angeordnet. Dann erfolgte eine Bestrahlung bei einer
Temperatur von weniger als 35°C für 3 Minuten mittels einer 2-kW-Hochdruckquecksilberlampe, die mit einem
Abstand von 5 cm oberhalb der Polyesterplatte angeordnet wurde, wodurch ein transparentes, immobilisertes
Enzymprodukt erhalten wurde.
7ehn Stücke dieses Enzymfilmes (5 mm χ 5 mm)
wurden dreimal mit jeweils 10 ml destiüierten Wassers abgewaschen und in 10 ml einer 10-mM-Maltaselösung
eingetaucht, die mit McElvaine-Pufferlösung (pH: 4,5) präpariert war. Die Maltase ließ man dann 30 Minuten
lang bei 40° C reagieren. Dann wurde 1 ml der Reaktionslösung herausgenommen. Die gebildete Glukose
wurde mittels eines Glukostaten gemessen, der durch die Firma Worthingtom Biochemical Corp.
hergestellt wurde. Als Resultat dieser Untersuchung ergab sich, daß das Aktivitätsverhältnis, bezogen auf
native Enzyme, 65% betrug.
Claims (5)
1. Verfahren zum biologischen Festlegen von Enzymen oder mikrobie.'len Zellen, bei dem eine
wäßrige Dispersion von Enzymen oder mikrobiellen Zellen einerseits und einem durch Bestrahlung
härtbaren Polymeren andererseits hergestellt und die Mischung anschließend zum Härten bestrahlt
wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymeres ein fotohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges
Molekulargewicht 300 bis 30 000) verwendet wird, welches zwei oder mehr fotopolymerisierbare,
äthylenisch ungesättigte Gruppen pro Molekül sowie nicht-ionische hydrophile Gruppen aufweist;
und daß die Mischung in situ mit aktinischer Strahlung bestrahlt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mittlere zahlenmäßige Molekulargewicht
des fotohärtbaren Harzes zwischen 500 und 20 000 liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlänge der aktinischen
Strahlung im Bereich von 2 500 bis 6 000 Ä liegt.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischung
des fotohärtbaren Harzes ein Reaktionszusatz aus einem Polymerisationsinitiator und/oder
einem Fotosensibilisator zugesetzt wird.
5. Biologisch immobilisierte Enzyme oder mikrobielle Zellen, hergestellt nach dem Verfahren nach
einem der vorangehenden Ansprüche.
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