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Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material
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Die Erfindung betrifft Verfahren zur Immobilisierung von biologischem
Material durch Einschluß in polymerisierte Verbindungen, das nach diesem Verfahren
erhältliche immobilisierte biologische Material und dessen Verwendung zu Biotransformationen.
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Die Immobilisierung von Biokatalysatoren führt in der Regel zu verfahrenstechnischen
und wirtschaftlichen Vorteilen. Es lassen sich chemische und physikalische Eigenschaften,
manchmal auch Selektivität und Spezifität des Biokatalysators durch die Immobilisierung
modifizieren.
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Die Methoden zur Immobilisierung lassen sich allgemein in folgende
Gruppen einteilen - Adsorption an vorgefertigte Träger - Kovalente Bindung an Träger
- - Quervernetzung - Einschluß in eine Polymermatrix.
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Das Einschlußverfahren beruht darauf, daß das Biomaterial hinsichtlich
seines Bewegungsraumes während der Polymerisation in ein Netzwerk mehr oder minder
einheitlicher Maschen- und Porenweite eingeschlossen wird.
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Dieses Polymernetzwerk sollte für den Biokatalysator unpassierbar
sein, während es dem Substrat und dem Produkt einer an diesem Katalysator durchgeführten
Umsetzung praktisch keinen Widerstand bieten sollte.
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Herkömmliche Verfahren verwenden niedermolekulare, hydrophile Monomere
zum Aufbau des Netzwerkes, beispielsweise Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat,
Hydroxypropylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Acrylamid u.a., die mit der wäßrigen
Lösung oder Dispersion des Biomaterials gemischt und anschließend polymerisiert
werden.
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Zum Beispiel werden in der US-PS 3 788 950 monofunktionelle Acrylsäurederivate
wie Acrylamid mit einer geringen Menge an Vernetzer wie N,N-Methylenbisacrylamid
verwendet. In der US-PS 3 859 169 werden z.B. Monoester der Acrylsäure mit Glykolen
in Verbindung mit einem Vernetzer und einem löslichen Polymer verwendet. Die US-PS
3 860 490 beschreibt den Einsatz niedermolekularer Hydroxyalkyl-acrylate und -methacrylate
zur Bildung des Polymernetzwerkes.
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Bei allen diesen Verfahren treten jedoch Schwierigkeiten bei der Steuerung
und Reproduzierbarkeit der Permeabilitäten für das biologische Material sowie für
dessen Substrate und Produkte auf. Für eine Eignung als Immo-
bilisierungsmaterial
sind diese Größen jedoch essentiell.
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Außerdem ist die Verwendung niedermolekularer Acrylsäurederivate wegen
ihrer Toxizität nachteilig. Es kann während der Polymerisation zu einer Schädigung
des Biokatalysators kommen, oder im Polymerisat befindliche Restmonomere schränkten
die Verwendung des immobilisierten Biokatalysators zur Herstellung von Produkten
für die Nahrungsmittelindustrie oder für die pharmazeutische Industrie stark ein.
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Es wurde nun ein Verfahren zur Immobilisierung von biologischem Material
durch Einschluß in polymerisierbare Verbindungen gefunden, das im wesentlichen darin
besteht, gut wasserlösliche höhermolekulare polymerisierbare Verbindungen als polymerisierbares
Material zu verwenden, das zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen
pro Molekül und ein Molekulargewicht über 400 besitzt.
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Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Immobilisierung von
biologischem Material durch Einschluß in polymerisierbare Verbindungen, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß wäßrige Lösungen oder Dispersionen des biologischen Materials
mit einer wäßrigen Lösung von gut wasserlöslichen, höhermolekularen, polymerisierbaren
Verbindungen, die zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen pro Molekül
und ein Molekulargewicht über 400 besitzen, gemischt werden und die Mischung polymerisiert
wird.
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Durch die Verwendung der erfindungsgemäß verwendeten höhermolekularen,
bevorzugt zwei oder mehr, ungesättigte Gruppen enthaltenden, härtbaren, wasserlöslichen
Verbindungen läßt sich eine bessere Steuerung und Reproduzierbarkeit der Permeabilitäten
erreichen, da sich diese Eigenschaften im wesentlichen durch die höhermolekularen,
wasserlöslichen Verbindungen ergeben. Außerdem besteht durch die Verwendung von
insbesondere höhermolekularen Verbindungen kein Toxizitätsproblem. Niedermolekulare
toxische Verunreinigungen können außerdem vor dem Mischen mit dem biologischen Material
entfernt werden.
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Desweiteren wurde gefunden, daß die gut wasserlöslichen erfindungsgemäßen
Verbindungen zunächst in einer gewissen Menge Wasser, Pufferlösung, Salzlösung und
ähnlichem aufgelöst werden können, womit diese Polymerlösung der wäßrigen Lösung
oder Dispersion des biologischen Materials hinsichtlich bestimmter Eigenschaften
wie pH-Wert, Salzkonzentration, Viskosität u.a. angepaßt werden kann.
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Anschließend werden beide Lösungen bzw. die wäßrige Polymerlösung
und die Zelldispersion gemischt und polymerisiert. Dieses Verfahren besitzt besonders
Vorteile für empfindliche Biokatalysatoren, die dadurch keinen abrupten Änderungen
des umgebenden Mediums ausgesetzt werden, wodurch eine Aktivitätseinbuße bei der
Herstellung der polymerisierbaren Mischung weitgehend vermieden wird.
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Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die mit der guten
Wasserlöslichkeit einhergehende große Aufnahmekapazität des Polymeren für wäßrige
Lösungen
und Suspensionen. Es sind Gewichtsverhältnisse von wäßrigem
biologischem Material zu festem Polymer zwischen 1:1 und 30:1 möglich, besonders
geeignet sind Verhältnisse zwischen 4:1 und 20:1.
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Durch den möglichen großen Wassergehalt des immobilisierten biologischen
Materials vor und nach der Polymerisation befinden sich die Biomaterialien in einer
besonders geeigneten, schonenden Umgebung, wodurch die Aktivität stabil gehalten
werden kann und wodurch zusätzlich der Substrat- und Produktfluß begünstigt sind.
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Durch Variation der Struktur und des Molekulargewichts der polymerisierbaren,
gut wasserlöslichen, höhermolekularen Verbindungen sind die Eigenschaften des polymeren
Netzwerkes in weitem Maße variationsfähig. Dadurch lassen sich die Vernetzungsdichte,
die Permeabilität, das Queliverhalten und weitere Eigenschaften optimieren, um den
Anforderungen des biologischen Materials zu entsprechen.
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Zur Immobilisierung wurden wasserlösliche, höhermolekulare, polymerisierbare
Verbindungen, die zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen pro Molekül
und ein Molekulargewicht von über 400 besitzen, insbesondere mit Molekulargewichten
von 1.000 bis 20.000, insbesondere Verbindungen mit ethylenisch ungesättigten Gruppen,
verwendet.
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Bevorzugt seien genannt - mit ungesättigten Carbonsäuren modifizierte
Umsetzungsprodukte von Polyetherpolyolen, besonders bevorzugt Polyethylenglykole,
mit di- oder mehrfunktionellen
Isocyanaten, ganz besonders bevorzugt
Isophorondiisocyanat, Toluylendiisocyanat, Desmodur N oder Desmodur L.
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- Umsetzungsprodukte von Polyetherpolyolen, bevorzugt Polyethylenglykole,
mit ungesättigten Carbonsäuren, bevorzugt Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure,
und/oder mit isocyanatgruppenhaltigen Derivaten, bevorzugt Isocyanatoethylmethacrylat,
Isocyanatoethylacrylat, - sowie Umsetzungsprodukte von Urethan-modifizierten ungesättigten
Carbonsäuren mit Polyetherdiolen.
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Die Polymerisation kann unter Inertgas durchgeführt und in Gegenwart
üblicher Radikalstarter wie Azo-bis(isobutyronitril), t-Butylperoctoat, Benzoylperoxid,
Dicyclohexyl-peroxydicarbonat, Methylethylketonperoxid, Cumolhydroperoxid, Acetyl-cyclohexansulfonyl-peroxid
oder Dicumylperoxid sowie durch Redoxsysteme wie Kaliumperoxodisulfat-Riboflavin,
Kaliumperoxodisulfat-Natriumbisulfit, Wasserstoffperoxid-Verbindungen des zweiwertigen
Eisens erfolgen. Als Beschleuniger können ebenfalls zahlreiche Verbindungen dienen,
z.B. N,N,N' ,N'-Tetramethylethylendiamin.
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Eine weitere Möglichkeit der Polymerisation besteht in der Bestrahlung
der Mischung mit aktinischem Licht. Es eignen sich beispielsweise Hochdruckquecksilberlampen,
Niederdruckquecksilberlampen, Fluoreszenzlampen, Xenonlampen, Kohlelichtbögen sowie
Sonnenbestrahlung. Eine Bestrahlung mit Elektronenstrahlen oder Gammastrahlen
ist
ebenfalls möglich, jedoch muß mit einer gewissen Schädigung des biologischen Materials
gerechnet werden.
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Ferner kann die Photopolymerisation durch Photosensibilisatoren beschleunigt
werden. Es können bekannte Photosensibilisatoren wie g -Carbonylalkohole, z.B. Benzoin
oder Acetoin, Acyloinether wie Benzoinmethylether, Benzoinethylether, Benzoinisopropylether,
i -substituierte Acyloine wie i -Methylbenzoin und i -Methoxybenzoin u.a. sowie
durch ionische Gruppen wie z.B. Carbonsäure-, Sulfonsäure- oder Aminogruppen modifizierte
und dadurch wasserlöslich gemachte Derivate verwendet werden.
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Desweiteren können polycyclische aromatische Verbindungen wie Naphthol
und Hydroxyanthracen, Azoamide wie beispielsweise 2-Cyano-2-butylazoformamid sowie
Metallsalze wie Uranylnitrat und Eisenchlorid, wie auch Mercaptane, Disulfide, Halogenide
oder Farbstoffe verwendet werden.
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Das immobilisierte Biomaterial kann während der Polymerisation durch
Formgebung nahezu beliebige Gestalt annehmen. Es sind Folien, Filme, Formteile usw.
darstellbar. Weiterhin können durch Einbau von Stützgeweben die mechanischen Eigenschaften
modifiziert werden. Ebenso sind Beschichtungen von Elektroden, Membranen, oder anderen
Materialien durchführbar.
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Durch die hohe Aufnahmekapazität für Wasser - besonders gut eignen
sich Gewichtsverhältnisse von wäßriger Lösung oder Suspension des biologischen Materials
zu festem Polymer zwischen 4:1 und 20:1 - die das immobilisierte Material
vor
und nach der Polymerisation besitzt, ergeben sich auch Vorteile hinsichtlich der
Wirtschaftlichkeit des Verfahrens. Dadurch können einerseits große Mengen an wäßrigen
Lösungen oder Dispersionen des biologischen Materials in einer relativ kleinen Menge
der polymerisierbaren Verbindungen eingeschlossen werden, andererseits können dadurch
Fermenterbrühen direkt oder nach Konzentrierung z.B. durch Mikrofiltration oder
Zentrifugieren immobilisiert werden.
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Desweiteren ist es jedoch vor und nach der Immobilisierung auch möglich,
geringere Mengen an Wasser oder wäßrigen Lösungen zu verwenden, sowie einen Teil
des Anteils an Wasser gegen andere Flüssigkeiten wie z.B.
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Alkohole zu ersetzen.
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Es ist auch möglich, die immobilisierten biologischen Materialien
in anderen als wäßrigen Lösungen, z.B.
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in aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen, einzusetzen.
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Die nach vorstehendem Verfahren immobilisierten biologischen Materialien,
insbesondere Zellen oder Enzyme, lassen sich als Biokatalysatoren zu Biotransformationen
einsetzen.
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Interessante Mikroorganismen für die erfindungsgemäße Immobilisierung
sind die folgenden: Aspergillus niger, Gluconobacter suboxydans, Gluconobacter oxydans,
Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Protaminobacter rubrum,
Serratia
plymuthica, Pseudomonas putida, Cunninghamella elegans, Clostridien wie z.B.
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Clostridium thermoaceticum, Clostridium kluyveri, Clostridium butyricum,
Clostridium sporogenes, Bacillus licheniformis, Streptomyces olivaceus.
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Beispiele Beispiel A Immobilisierung von Alkoholdehydrogenase 48,7
g Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 800 (hergestellt von
dem Chemischen Werken Hüls) wurde mit 4,7 g Acrylsäure unter Zusatz von 0,54 g p-Toluolsulfonsäure
und 50 mg Di-tert.-butylhydrochinon sowie 50 mg p-Methoxyphenol in Toluol verestert.
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25,0 g dieses Esters wurden mit 3,9 g Ioscyanatoethylmethacrylat (hergestellt
von Dow Chemicals) unter Zusatz von 4 mg Desmorapid SO (Rheinchemie Rheinau GmbH)
umgesetzt.
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1 g des so erhaltenen polymerisierbaren Harzes wurden mit 50 mg Irgacure
651 (Ciba-Geigy) gemischt und mit 2 g Phosphat-Puffer (pH 7, 0,01 M) versetzt. In
dieser Lösung wurde 200 mg Alkoholdehydrogenase (aus Hefe, Fa. Boehringer Mannheim,
enthaltend 120 Enzymprotein der Aktivität 400 U/mg) gelöst, aus der Lösung ein 500
Am dicker Film gezogen und mittels einer Quecksilberhochdrucklampe 10 min. bestrahlt,
so daß ein fester Film entstand.
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Ein Viertel des so erhaltenen Präparates (entsprechend 30 mg Alkohol-Dehydrogenase)
wurde in kleine Stücke geschnitten und in einem 100 ml Erlenmeyerkolben bis
zu
einem Endvolumen von 20 ml mit 0,1 M Tris. HCl, pH 8,6 enthaltend 142 mg NAD, Li-Salz
(Fa. Boehringer, Mannheim), 0,1 M Semicarbazid, 5 % Ethanol p.A. versetzt.
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Der Reaktionslösung wurden zu bestimmten Zeiten Proben entnommen und
nach Verdünnung das W-VIS Spectrum des entstehenden NADH gemessen. Nach etwa 50
min. war die Gesamtmenge an NAD zu NADH reduziert worden mit einer Initialgeschwindigkeit
von 8,1 ß Mol/min. Die immobilisierte Alkohol-Dehydrogenase besitzt somit eine spezifische
Aktivität von 0,28 U/mg immobilisiertes Enzymprotein. Das immobilisierte Präparat
konnte wiederholt verwendet werden.
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Beispiel B Immobilisierung von Lipase 1 g des polymerisierbaren Harzes
aus Beispiel A wurde mit 50 mg Irgacure 651 (Ciba-Geigy) gemischt und mit 3 g Phosphatpuffer
(0,01 M, pH 7) versetzt. In dieser Lösung wurde 0,8 g Lipase (aus Candida cylindracea,
Sigma) dispergiert. Die gesamte Mischung wurde anschlie-Bend auf ein Polyamidgewebe
(Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) verstrichen und mittels einer
Quecksilberhochdrucklampe 10 min. bestrahlt, so daß ein fester Film, verstärkt durch
das Polyamidgewebe, entstand.
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160 mg Lipase eingeschlossen in obiges Polymer, entsprechend 72 cm2
zerschnittener Folie, wurden in 40 ml H2O mit 2 g Sucrose-Palmitat-Stearat 15 (Fa.
Serva, Heidelberg) bei 250C inkubiert. Freiwerdende Fettsäure wurde mit 0,1 N NaOH
per pH-Stat (pH 7,1) titriert.
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Die Aktivität immobilisierte Lipase wurde zu 5,8 mU/mg trockenes Lipase-Präparat
errechnet (1 U = 1 Mol freigesetzte Fettsäure pro Minute).
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Beipiel C Immobilisierung von Esterase 25,0 g des hergestellten Esters
aus Beispiel A wurden mit 2,3 g Desmodur N (BAYER AG, Leverkusen) und 1,4 g Isophorondiisocyanat
unter Zusatz von 7,5 mg Desmorapid SO (Rheinchemie Rheinau GmbH) umgesetzt.
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5 g des so erhaltenen polymerisierbaren Harzes, 250 mg Irgacure 651
(Ciba-Geigy), 8,5 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) und 3 ml Esterase-Suspension (aus
Schweineleber, Boehringer Mannheim GmbH) wurden gemischt und auf einem Polyamidgewebe
(Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) verstrichen.
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Nach Belichten mittels einer Quecksilberhochdrucklampe wurde ein durch
das Polyamidgewebe verstärkter Film erhalten.
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36 cm2 der so erhaltenen Esterase-Folie wurden in 45 ml 0,1 M Natriumphosphat
pH 7,0 mit 5 ml einer
100 mM Lösung von Nitroterephthalsäuredimethylester
in Methanol bei 300C auf einer Rotationsschüttelmaschine inkubiert.
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Die Analyse der Reaktionslösung erfolgte per HPLC.
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Nach 48 h ist keine Ausgangsverbindung mehr nachweisbar.
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Es bildeten sich die beiden Nitroterephthalsäuremonoester sowie in
geringer Menge auch Nitroterephthalsäure.
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Beispiel D Immobilisierung von L-Lactat-Dehydrogenase 5 g des in Beispiel
C verwendeten polymerisierbaren Harzes wurden mit 250 mg Phenylglyoxysäure, 5 g
Phosphatpuffer (0,01 M pH 7) und 3 ml L-Lactat-Dehydrogenase-Suspension (aus Schweinemuskel,
Boehringer Mannheim GmbH, enthaltend 10 mg Enzymprotein, ca. 550 U/mg) gemischt
und analog Beispiel C zu einem Film verarbeitet.
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Die Hälfte des so erhaltenen Films, enthaltend etwa 15 mg Enzymprotein,
wurde zerschnitten und in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer
(pH 8,0), 10 mM NADH, 0,05 M Pyruvat-Na-Salz inkubiert. Die Temperatur betrug 300C,
die Reaktionslösung wurde auf einer Schüttelmaschine mit 200 Bewegungen pro Minute
geschüttelt.
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Von Zeit zu Zeit wurden Proben entnommen und nach Verdünnung photometrisch
die NADH-Abnahme gegen eine Blindprobe ohne immobilisierte L-Lactat Dehydrogenase
bestimmt.
Nach 60 Minuten war die gesamte Menge an NADH zu NAD oxidiert worden. Die Initialgeschwindigkeit
wurde zu 3,9 «Mol/min bestimmt, was einer spezifischen Aktivität von 0,26 U/mg eingeschlossenes
Enzymprotein entspricht.
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Beispiel E Immobilisierung von Bäckerhefe 100,0 g Polyethylenglykol
mit einem mittleren Molekulargewicht von 1.000 (Chemische Werke Hüls) wurde mit
7,2 g Acrylsäure unter Zusatz von 0,92 g p-Toluolsulfonsäure und 0,1 g Di-tert.-butylhydrochinon
sowie 0,1 g p-Methoxyphenol in Toluol verestert.
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75,0 g des so erhaltenen Esters wurde mit 8,3 g Isophorondiisocyanat
unter Zusatz von 9 mg Desmorapid SO umgesetzt.
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5,0 g des polymerisierbaren Harzes wurde mit 0,1 g Irgacure 651 (Ciba-Geigy)
und 1,0 g Pufferlösung (0,01 M, pH 7) gemischt. Zu dieser Lösung wurde eine Mischung
aus 13,7 g Bäckerhefe (25 % Feststoffgehalt) und 13,7 g Pufferlösung (0,01 M, pH
7) gegeben. Die so erhaltene Mischung wurde nach Ausstreichen auf ein Polyamidgewebe
mittels einer Quecksilberhochdrucklampe belichtet, so daß ein fester Film entstand.
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36 cm2 des so erhaltenen Films wurden auf ihre NADH-Oxidase Aktivität
getestet. Dazu wurde der Film zer-
schnitten und in einem 200 ml
Erlenmeyerkolben bis zu einem Endvolumen von 50 ml mit 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer,
pH 8,0, sowie mit 360 mg NADH (Grad I, Boehringer Mannheim) versetzt und auf einer
Rotationsschüttelmaschine mit 200 rpm gegen eine Blindprobe ohne immobilisierte
Bäckerhefe bei 300C inkubiert.
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Die immobilisierten Hefezellen oxidierten NADH mit einer Geschwindigkeit
von 5,3 ßMol/h, gemessen als Mittelwert über 48 h. Diese Reaktion ist zur NAD-Regenerierung
mittels O2 in gekoppelten Enzymsystemen verwendbar.
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Beispiel F Immobilisierung von Bäckerhefe 218,9 g Polyethylenglykol
mit einem mittleren Molekulargewicht von 1.550 (Chemische Werke Hüls) wurde mit
9,8 g Acrylsäure unter Zusatz von 2,3 g p-Toluolsulfonsäure, 0,23 g Di-tert.-butylhydrochinon
sowie 0,23 g p-Methoxyphenol in Toluol verestert.
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165,8 g des so erhaltenen Esters wurden mit 18,2 g Isocyanatoethylmethacrylat
(Dow Chemicals) unter Zusatz von 36 mg Desmorapid SO umgesetzt.
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9,0 g dieses polymerisierbaren Harzes wurden mit 90 mg Irgacure 651
gemischt und mit 2,7 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) versetzt. Diese so erhaltene
Lösung wurde zu einer Mischung aus 20,0 g Bäckerhefe
und 2Q,0 g
Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) gegeben, daraus ein 500 Fm dicker Film gezogen und
durch Bestrahlung mittels einer Quecksilberhochdrucklampe polymerisiert.
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36 m2 der so erhaltenen Folie wurden auf NADH-Oxidase Aktivität getestet.
Die zerkleinerte Folie wurde in 200 ml Erlenmeyerkolben bis zu einem Endvolumen
von 50 ml mit 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 8,0, sowie mit 360 mg NADH (Grad
I, Fa. Boehringer, Mannheim) versetzt und auf einer Rotationsschüttelmaschine mit
200 rpm gegen eine Blindprobe der gleichen Zusammensetzung jedoch ohne immobilisierte
Bäckerhefe bei 300C inkubiert. NADH wurde mit einer Geschwindigkeit von 7,4 ßMol/h,
gemessen als Mittelwert über 48 h, oxidiert.
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Beispiel G Immobilisierung von Protaminobacter rubrum 110,0 g des
Esters aus Beispiel F wurden mit 7,4 g Isophorondiisocyanat unter Zusatz von 15
mg Desmorapid SO umgesetzt.
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5,0 g dieses so erhaltenen polymerisierbaren Acrylatharzes wurden
mit 50 mg Irgacure 651 gemischt und mit 2,0 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) versetzt,
so daß eine Lösung entstand.
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Zur Produktion von Sucrose Mutase wird der Stamm Protaminobacter rubrum
(CBS 574.77) verwendet. Die Nährlösung besteht aus 5 % Dicksaft, 2 % Maisquellwasser
und 0,05 % (NH4)2HPO4, der pH-Wert beträgt 7,2. Mit 1 ml einer Protaminobacter rubrum
Abschwemmung werden in einem 1 1 Erlenmeyerkolben 200 ml Nährlösung beimpft.
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Die Fermentation läuft 15 h bei 310C auf der Rundschüttelmaschine.
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Mit dieser Vorkultur werden in einem 30 Liter Fermenter 20 Liter obiger
Nährlösung angeimpft und 16 h bei 310C fermentiert. Die Fermentationslösung wurde
durch Mikrofiltration um den Faktor 10 konzentriert.
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17,5 g dieser konzentrierten Fermenterlösung wurde mit der obigen
Acrylatharzlösung vermischt und in ein Polyamidgewebe (Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien
GmbH) verstrichen. Nach Bestrahlung für 15 Minuten mittels einer Quecksilberhochdrucklampe
entstand ein polyamidverstärkter Film.
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Zum Test der immobilisierten Protaminobacter rubrum Zellen wurde deren
Sucrose Mutase Aktivität gemessen.
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Hierzu wurden 36 cm2 Folie in 50 ml 50 % Sucrose-Lösung pH 7,0, bei
300C auf einer Rotationsschüttelmaschine inkubiert und zu verschiedenen Zeiten Proben
genommen.
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Die Bestimmung des Umsatzes von Sucrose zu Isomaltulose erfolgte per
HPLC. Die Umsatzrate betrug 0,60 g/h Sucrose, was 620 U/g Trockenzellen entspricht.
1 Mol/ min umgesetzte Sucrose entspricht 1 U.
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Beispiel H Immobilisierung von Protaminobacter rubrum 80,0 g des Esters
aus Beispiel F wurden mit 4,2 g Desmodur N und 2,6 g Isophorondiisocyanat unter
Zusatz von 13 mg Desmorapid SO umgesetzt.
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Analog Beispiel G wurden 10 g dieses polymerisierbaren Harzes, 100
mg Irgacure 651 und 4 g Phosphatpuffer vermischt und nach Zusatz von 50 g der mikrofiltrierten
Fermentationsbrühe daraus ein Film hergestellt.
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Analog Beispiel G erfolgte die Bestimmung der Sucrose Mutase. Die
Umsatzrate betrug 1,06 g/h Sucrose, was 910 U/g Trockenzellen entspricht.
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Beispiel J Immobilisierung von Cipase 197 g Oktaethylenglykol wurden
mit 36 g Acrylsäure unter Zusatz von 2 g p-Toluolsulfonsäure und 0,35 g di-tert.-butylhydrochinon
sowie 0,35 p-Methoxyphenol in Toluol verestert. 100 g des so erhaltenen Esters wurden
mit 47 g Isophorondiisocyanat und 90 mg Desmorapid S0 umgesetzt.
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5 g des so erhaltenen polymerisierbaren Harzes wurden in 2 g 0,01
M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, gelöst, mit 6 g einer Lipase-Suspension (Lipase
aus Candida
cylindracea, Fa. Sigma; 17 % Feststoffgehalt) gemischt
und mit 10Q mg Irgacure 651 (Ciba-Geigy) zersetzt.
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Diese wäßrige Lipase-Mischung wurde auf ein Polyamid-Stützgewebe (Monodur
PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) verstrichen und durch 10-minütige Bestrahlung
mit einer Hg-Hochdrucklampe polymerisiert.
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72 cm2 der so erhaltenen immobilisierten Lipase werden in 40 ml wasser
pH 7,1 eingebracht und mit 1,0 g Sucrose-Palmitat-Stearat 15 (Fa. Serva, Heidelberg)
bei 250C versetzt. Freiwerdende Fettsäuren werden am pH-Staten mit 0,1 N NaOH titriert.
Pro Stunde werden 2,74 ml 0,1 N NaOH verbraucht, was 274 Mol freier Fettsäure entspricht.
Pro cm2 immobilisierter Lipase-Folie errechnen sich 0,065 FMol/min freiwerdende
Fettsäure.