DE3416140A1 - Immobilisierung von portaminobacter rubrum und verwendung des immobilisierten praeparates zur umwandlung von sucrose zu isomaltulose - Google Patents

Immobilisierung von portaminobacter rubrum und verwendung des immobilisierten praeparates zur umwandlung von sucrose zu isomaltulose

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Peter Dr. Egerer
Wilfried Dr. 4050 Mönchengladbach Haese
Hermann Dr. 4150 Krefeld Perrey
Günter Prof. Dr. 5600 Wuppertal Schmidt-Kastner
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Description

  • Immobilisierung von Protaminobacter rubrum und Ver-
  • wendung des immobilisierten Präparates zur Umwandlung von Sucrose zu Isomaltulose Die Erfindung betrifft Verfahren zur Immobilisierung von Protaminobacter rubrum durch Einschluß in polymerisierte Verbindungen, das nach diesen Verfahren erhältliche Präparat und dessen Verwendung zur Herstellung von Isomaltulose aus Sucrose.
  • Aus den EP-sen 49 742 und 49 801 ist bekannt, daß Isomaltulose aus Sucrose mittels immobilisierter Zellen von Protaminobater rubrum oder mittels gereinigter freier oder immobilisierter Sucrose-Mutase aus Protaminobacter-rubrum hergestellt werden kann. Dabei werden a) die Protaminobacter Zellen über ein Flockungsverfahren oder durch Einschluß in Ca-Alginat oder in bt-Carrageenan immobilisiert, b) Lösungen des gereinigten Enzyms Sucrose-Mutase zur Immobilisierung in Hohlfasern eingeschlossen, an feste oder lösliche Träger kovalent oder an feste Träger adsorptiv gebunden.
  • Die Wirtschaftlichkeit eines Herstellungsverfahrens für Isomaltulose wird unter anderem auch von den Kosten des hierzu verwendeten Biokatalysator und dessen Langzeitstabilität bestimmt.
  • Um Aktivitätseinbußen zu vermeiden, ist ein schonendes Immobilisierungsverfahren für Protaminobacter rubrum nötig, welches hohe Aktivitätsausbeuten und hohe Reproduzierbarkeit bietet. Weiterhin ist es von Vorteil, möglichst billige Trägermaterialien zur Immobilisierung zu verwenden.
  • Einschlußverfahren in ag-Carrageenan oder in Ca-Alginat zeichnen sich zwar durch schonende Bedingungen aus, oftmals stehen jedoch die handelsüblichen Preise für diese Stoffe einer Verwendung im technischen Maßstab entgegen.
  • Hinzu kommt, daß die Matrizen aus B -Carrageenan oder Ca-Alginat sehr anfällig gegenüber Änderungen verschiedener Parameter der wäßrigen Reaktionslösung sind, sofern nicht durch zusätzliche Quervernetzung der Trägermatrix z.B. mittels Glutaraldehyd Stabilisierung erfolgte.
  • Quervernetzer wie Glutaraldeyhd sind jedoch häufig für Minderung biologischer Aktivitäten verantwortlich.
  • Die Herstellung von immobilisierten Zellen durch Flokkung verwendet in der Regel preisgünstige Flockungshilfsmittel, jedoch ist die Aufarbeitung zum lagerfähigen, gekörnten Katalysator vielfach sehr arbeits- und zeitintensiv und verbunden mit hohem technischen Aufwand an Separations-, Trocken-, Mahl- und Klassiervorrichtungen.
  • Diese Vielzahl von mechanischen Operationen führt auch zu Minderung der Gesamtausbeute an Katalysatormaterial von bis zu 30 %.
  • Es wurde nun ein Verfahren zur Immobilisierung von Protaminobacter rubrum durch Einschluß in polymerisierte Verbindungen gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Protaminobacter rubrum in einer wäßrigen Lösung oder Dispersion mit einer wäßrigen Lösung von gut wasserlöslichen höhermolekularen polymerisierbaren Verbindungen mit zwei- oder mehrfunktionellen Gruppen pro Molekül und ein Molekulargewicht von über 400 besitzen, gemischt wird und diese Mischung, gegebenenfalls nachdem diese zuvor in einem inerten flüssigen Medium zu Perlen zerteilt worden ist, polymerisiert wird.
  • Die aufgrund dieses Verfahrens immobilisierten Zellen können zur Herstellung von Isomaltulose aus Sucrose verwendet werden.
  • Die Fermentationsbrühe von Protaminobacter rubrum wird dabei, gegebenenfalls ohne Reinigungsschritte, durch Mikrofiltration oder durch kontinuierliche Zentrifugation konzentriert, besonders vorteilhaft um den Faktor 10. In den so erhaltenen Zellschlamm wird die mit einer geringen Menge Puffer vorgelöste gut wasserlösliche, höhermolekulare, polymerisierbare Verbindung eingebracht und homogen verrührt.
  • Durch das Vorlösen der höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindungen in einem geringen Volumen wäßrigen Puffers, der ähnlichen pH-Wert, Viskosität, Leitfähigkeit usw. wie das Zellpräparat aufweist, können abrupte änderungen während des Einschlusses vermieden und so die biologische Aktivitäten der Zellen weitgehend erhalten bleiben. Der mit gut wasserlöslicher polymerisierbarer höhermolekularer Verbindungen versetzte Zell schlamm von Protaminobacter rubrum wird entweder als Film, eventuell auch unter Einarbeitung eines Stützgewebes, z.B. aus Polyamid (Monodur PA 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH), oder in einer sonstigen geometrischen Form polymerisiert. Um die für Katalysatoren besonders günstige Perlform zu erzielen, ist es nötig, den mit polymerisierbaren Verbindungen versetzten Zell schlamm in einer Inertphase mechanisch zu Perlen zu zerteilen z.B. durch Rühren, wobei der Perldurchmesser durch die Rührerdrehzahl gesteuert werden kann.
  • Die Polymerisation kann chemisch oder photochemisch durch Bestrahlung mit Hilfe von Radikalstartern oder Photosensibilisatoren erfolgen.
  • Die so erhaltenen immobilisierten Zellen von Protaminobacter rubrum zeichnen sich durch hohe spezifische Sucrose-Mutase Aktivitäten sowie gute Langzeitstabilität aus und können direkt ohne weitere Verarbeitung oder Formgebung als Biokatalysatoren zur Umsetzung von Sucrose zu Isomaltulose eingesetzt werden.
  • Die Aufbewahrung der Katalysatorpräparate kann in wäßrigen aber auch nichtwäßrigen, z.B. organischen Medien, erfolgen. Zusätzlich können Zusätze wie Glykol, Polyetherdiole, z.B. Polyethylenglykole, verwendet werden.
  • Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von perlförmigem immobilisiertem Biokatalysator. Die Perlform stellt besonders bei kleinem Perldurchmesser von z.B. 0,2 mm -2,0 mm, eine ideale Katalysatorform für die Verwendung in kontinuierlichen Säulenreaktoren dar. Weitere Perldurchmesser liegen bei 0,5 mm bis 1,5 mm, allgemein kann der Perldurchmesser jedoch auch 0,05 mm bis 5 mm betragen. Es ist auch möglich, die immobilisierten Protaminobacter Zellen zu trocknen, trocken zu lagern, und nach Quellen in der Sucrose-haltigen Reaktionslösung direkt wiederzuverwenden.
  • Im folgenden werden die erfindungsgemäß verwendeten polymerisierbaren wasserlöslichen höhermolekularen Verbindungen, die sich zum Einschluß von Protaminobacter rubrum eignen, näher beschrieben.
  • Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen verwendeten höhermolekularen, bevorzugt zwei oder mehr ungesättigte Gruppen enthaltenden, härtbaren, wasserlöslichen Verbindungen läßt sich eine bessere Steuerung und Reproduzierbarkeit der Permeabilitäten erreichen, da sich diese Eigenschaften im wesentlichen durch die höhermolekularen, wasserlöslichen Verbindungen ergeben. Außerdem besteht durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen kein Toxizitätsproblem. Niedermolekulare toxische Verunreinigungen können außerdem vor dem Mischen mit dem biologischen Material entfernt werden.
  • Desweiteren wurde gefunden, daß die gut wasserlöslichen Verbindungen zunächst in einer gewissen Menge Wasser, Pufferlösung, Salzlösung und ähnlichem aufgelöst werden können, womit diese Polymerlösung der wäßrigen Lösung oder Dispersion des biologischen Materials hinsichtlich bestimmter Eigenschaften wie pH-Wert, Salzkonzentration, Viskosität u.a. angepaßt werden kann. Anschließend werden beide Lösungen bzw. die wäßrige Polymerlösung und die Zelldispersion gemischt und polymerisiert. Dieses Verfahren besitzt besonders Vorteile für empfindliche Biokatalysatoren, die dadurch keinen abrupten Änderungen des umgebenden Mediums ausgesetzt werden, wodurch eine Aktivitätseinbuße bei der Herstellung der polymerisierbaren Mischung weitgehend vermieden wird.
  • Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die mit der guten Wasserlöslichkeit einhergehende große Aufnahmekapazität des Polymeren für wäßrige Lösungen und Suspensionen. Es sind Gewichtsverhältnisse von wäßrigem biologischem Material zu festem Polymer zwischen 1:1 und 30:1 möglich, besonders geeignet sind Gewichtsverhältnisse zwischen 4:1 und 20:1.
  • Durch den möglichen großen Wassergehalt des immobilisierten biologischen Materials vor und nach der Polymerisation befinden sich die Biomaterialien in einer beson- ders geeigneten, schonenden Umgebung, wodurch die Aktivität stabil gehalten werden kann und wodurch zusätzlich der Substrat- und Produktfluß begünstigt sind. Durch Variation der Struktur und des Molekulargewichts der polymerisierbaren, gut wasserlöslichen, höhermolekularen Verbindungen sind die Eigenschaften des polymeren Netzwerkkes in weitem Maße variationsfähig. Dadurch lassen sich die Vernetzungsdichte, die Permeabilität, das Quellverhalten und weitere Eigenschaften optimieren, um den Anforderungen des biologischen Materials zu entsprechen.
  • Zur Immobilisierung wurden wasserlösliche, höhermolekulare, polymerisierbare Verbindungen, die zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen pro Molekül und ein Molekulargewicht von über 400 besitzen, mit insbesondere Molekulargewichten von 1000 bis 20000, insbesondere Verbindungen mit ethylenisch ungesättigten Gruppen, verwendet.
  • Bevorzugt seien genannt - mit ungesättigten Carbonsäuren modifizierten Umsetzungsprodukte von Polyetherpolyolen, besonders bevorzugt Polyethylenglykole, mit di- oder mehrfunktionellen Isocyanaten, ganz besonders bevorzugt Isophorondiisocyanat, Toluylendiisocyanat, Desmodur N oder Desmodur L.
  • - Umsetzungsprodukte von Polyetherpolyolen, bevorzugt Polyethylenglykole, mit ungesättigten Car- bonsäuren, bevorzugt Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure, und/oder mit isocyanatgruppen-haltigen Derivaten, bevorzugt Isocyanatoethylmethacrylat, Isocyanatoethylacrylat, - sowie Umsetzungsprodukte von Urethan-modifizierten ungesättigten Carbonsäuren mit Polyetherdiolen.
  • Die Polymerisation kann unter Inertgas durchgeführt und in Gegenwart üblicher Radikalstarter wie Azo-bis(isobutyronitril), t-Butylperoctoat, Benzoylperoxid, Dicyclohexylperoxydicarbonat, Methylethylketonperoxid, Cumolhydroperoxid, Acetyl-cyclohexansulfonyl-peroxid oder Dicumylperoxid sowie durch Redoxsysteme wie Kaliumperoxodisulfat-Riboflavin, Kaliumperoxodisulfat-Natriumbisulfit, Wasserstoffperoxid-Verbindungen des zweiwertigen Eisens erfolgen. Als Beschleuniger können ebenfalls zahlreiche Verbindungen dienen, z .B. z.B. N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin.
  • Eine weitere Möglichkeit der Polymerisation besteht in der Bestrahlung der Mischung mit aktinischem Licht.
  • Es eignen sich beispielsweise Hochdruckquecksilberlampen, Niederdruckquecksilberlampen, Fluoreszenzlampen, Xenonlampen, Kohlelichtbögen sowie Sonnenbestrahlung. Eine Bestrahlung mit Elektronenstrahlen oder Gammastrahlen ist ebenfalls möglich, jedoch muß mit einer gewissen Schädigung des biologischen Materials gerechnet werden. Ferner kann die Photopolymerisation durch Photosensibilisatoren beschleunigt werden.
  • Es können bekannte Photosensibilisatoren wie£-Carbonylalkohole, z.B. Benzoin oder Acetoin, Acyloinether wie Benzoinmethylether, Benzoinethylether, Benzoinisopropylether, i -substituierte Acryloine wie 06 -Methylbenzoin und &-Methoxybenzoin u.a. sowie durch ionische Gruppen wie z.B. Carbonsäure-, Sulfonsäure- oder Aminogruppen modifizierte und dadurch wasserlöslich gemachte Derivate verwendet werden.
  • Desweiteren können polycyclische aromatische Verbindungen wie Naphthol und Hydroxyanthracen, Azoamide wie beispielsweise 2-Cyano-2-butylazoformamid sowie Metallsalze wie Uranylnitrat und Eisenchlorid, wie auch Mercaptane, Disulfide, Halogenide oder Farbstoffe verwendet werden.
  • Das immobilisierte Biomaterial kann während der Polymerisation durch Formgebung nahezu beliebige Gestalt annehmen. Es sind Folien, Filme, Formteile usw. darstellbar. Weiterhin können durch Einbau von Stützgeweben die mechanischen Eigenschaften modifiziert werden.
  • Ebenso sind Beschichtungen von Elektroden, Membranen, oder anderen Materialien durchführbar.
  • Desweiteren kann die Polymerisation in Form einer Dispersion des noch nicht polymerisierten biologischen Materials in einem inerten flüssigen Medium wie z.B. aliphatischen, cycloaliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen, sowie halogenierten Derivaten derselben, desweiteren in Ethern, Estern oder sonstigen, nicht wassermischbaren Stoffen wie auch in Siliconölen und Paraffinölen, bzw. auch Gemischen derselben untereinander, durch- geführt werden, wobei in Abhängigkeit von ver Verteilung, die durch Rühren, Einleiten von Inertgas, z.B. Stickstoff, oder sonstiges Zudosieren der wäßrigen Phase, z.B. durch Einpumpen oder Einsprühen in die inerte Phase erreicht werden kann, die Größe der Perlen sehr variabel ist. Weiterhin kann durch Zusätze zur Wasser- oder Inertphase deren Viskosität, Dichte, Oberflächenspannung, usw. verändert werden, was ebenfalls den Perldurchmesser beeinflußt.
  • Durch die hohe Aufnahmekapazität für Wasser - besonders gut eignen sich Gewichtsverhältnisse von wäßriger Lösung oder Suspension des biologischen Materials zu festem Polymer zwischen 4:1 und 20:1 - die das immobilisierte Material vor und nach der Polymerisation besitzt, ergeben auch Vorteile hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens. Dadurch können einerseits große Mengen an wäßrigen Lösungen oder Dispersionen des biologischen Materials in einer relativ kleinen Menge der polymerisierbaren Verbindungen eingeschlossen werden, andererseits können dadurch Fermenterbrühen direkt oder nach Konzentrierung z.B. durch Mikrofiltration oder Zentrifugieren immobilisiert werden, ohne daß weitere Bestandteile des Fermentermediums entfernt werden müssen.
  • Desweiteren ist es jedoch vor und nach der Immobilisierung auch möglich, geringere Mengen der wäßrigen Lösungen zu verwenden, sowie einen Teil des Anteils an Wasser gegen andere Flüssigkeiten wie z.B. Alkohole zu ersetzen.
  • Es ist auch möglich, die immobilisierten Protaminobacter rubrum Zellen in anderen als wäßrigen Lösungen, z.B. in aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen, einzusetzen.
  • Die nach vorstehendem Verfahren immobilisierten Protaminobacter rubrum Zellen lassen sich als Biokatalysatoren zu Biotransformationen einsetzen.
  • Beispiele Fermentation von Protaminobacter rubrum Zur Produktion von Sucrose Mutase wurde der Stamm Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) verwendet.
  • Die Nährlösung besteht aus 5 % Dicksaft, 2 % Maisquellwasser und 0,05 % (NH4)2 HPO4, der pH-Wert beträgt 7.1. Mit 1 ml einer Protaminobacter rubrum Abschwemmung wurden in einem 1 1 Eilenmeyerkolben 200 ml Nährlösung beimpft. Die Fermentation läuft 15 h bei 310C auf der Rundschüttelmaschine.
  • Mit dieser Vorkultur wurde ein 300 1 Fermenter mit 200 1 obiger Nährlösung angeimpft und 16 h fermentiert.
  • Die Aktivität der Fermenterlösung an Sucrose Mutase betrug 9.1 U/ml. 1 U = 1 ßMol Sucrose/min umgesetzt.
  • Die 200 1 Fermenterlösung wurden durch kontinuierliche Zentrifugation etwa um den Faktor 10 konzentriert, und diese konzentrierte Protaminobacter Zellsuspension direkt zu nachfolgenden Immobilisierungsexperimenten im Pilot-Maßstab eingesetzt.
  • Beispiel A (s. Fig. 1) 2189 g Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 1550 (Chemische Werke Hüls) wurden mit 98,4 g Acrylsäure unter Zusatz von 22,8 g p-Toluolsulfonsäure, 2,3 g Di-tert.-butylhydrochinon sowie 2,3 g p-Methoxyphenol in Toluol verestert.
  • 1100 g des Esters wurden mit 74,2 g Isophorondiisocyanat unter Zusatz von 0,15 g Desmorapid SO umgesetzt.
  • 100 g dieses so erhaltenen polymerisierbaren Acrylatharzes wurden mit 1 g Irgacure (Ciba-Geigy) gemischt und mit 40 g (0,01 M) Phosphatpuffer pH 7 versetzt, sodaß eine Lösung entstand.
  • Diese Lösung wurde mit 348 g der durch Mikrofiltration konzentierten Fermenterbrühe von Protaminobacter rubrum gemischt und als 500 ijm dicke Filme (Format 40 cm x 60 cm) mittels vier Quecksilberhochdrucklampen polymerisiert.
  • Anschließend wurden die Filme in kleine Stücke zerschnitten (ungefähr 0,5 cm2) und in eine thermostatisierbare 1 1 Säule eingebracht. Der Bioreaktor wurde bei 300C mit einer 50 % Sucroselösung nach Sterilfilter (Millistak, Fa. Millipore) durchströmt. Nach Einstellen eines Durchflusses von etwa 130 ml/h wurde ein Sucroseumsatz von etwa 70-80 % erzielt. Die Produktlösung wurde per HPLC analysiert. Nach 40 Tagen war noch keine Aktivitätsminderung festzustellen.
  • In Fig. 1 wird die kontinuierliche Umwandlung von Saccharose in Palatinose mit eingeschlossenen Zellen von Protaminobacter rubrum dargestellt: 1 L Reaktorvolumen, 50 % Saccharose, 300C.
  • Durchfluß tml/h/ % umgesetzte Saccharose; Palatinose /kg/d7 Beispiel B (s. Fig. 2) Die Protaminobacter rubrum Zellen enthaltende Mischung aus Beispiel A (175 g) wurde in Polyamidgewebestücke (Monodur 250 N, Verseidag-Industrietextilien GmbH) des Formats 40 cm x 60 cm verstrichen und durch Belichtung polymerisiert. Die so hergestellten verstärkten Filme wurden gemeinsam mit unbeschichtetem Polyamidgewebe so aufgewickelt, daß sich jeweils zwischen 2 Lagen des Films eine Lage des unbeschichteten Gewebes befand. Das zylindrisch aufgewickelten Material wurde in eine 1 1 Säule hineingeschoben, wobei der Säuleninnendurchmesser so gewählt wurde, daß das Material den ganzen Säulendurchmesser ausfüllte, und bei 300C mit einer 50 % Sucroselösung, pH 6,5, durchströmt. Die Sucrose-Vorratslösung wurde über ein Sterilfilter Milli-Stak (Fa. Millipore) per Schlauchpumpe durch die Reaktorsäule gepumpt. Nach Einstellen eines Durchflusses von etwa 60 ml/h wurde ein konstanter Sucroseumsatz von etwa 75 % erzielt. Die Produktlösung wurde per HPLC analysiert und wies 68,5 % Isomaltulose 4,5 % 1,1'-Disaccharid, 1,2 % Frucktose 0,8 % Glucose auf.
  • Die Sucrose Mutase-Aktivität der immobilisierten Protaminobacter-Zellen war über 50 Tage hinweg stabil.
  • In Fig. 2 wird die kontinuierliche Umwandlung von Saccharose in Palatinose mit eingeschlossenen Protaminobacter rubrum Zellen dargestellt.
  • 1 L Reaktorvolumen, 50 % Saccharose, 300C.
  • Durchfluß tml/h7 % umgesetzte Saccharose; Palatinose /kg/d7 Beispiel C 1000 g Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 1000 (Chemische Werke Hüls) wurde mit 72 g Acrylsäure unter Zusatz von 9,2 g p-Toluolsulfonsäure und 1,0 g Di-tert.-butylhydrochinon sowie 1,0 g p-Methoxyphenol in Toluol verestert.
  • 750 g des so erhaltenen Esters wurde mit 83,3 g Isophorondiisocyanat unter Zusatz von 0,09 g Desmorapid SO umgesetzt.
  • Aus 500 g des so erhaltenen polymerisierbaren Acrylatharzes, 5 g Irgacure (Ciba-Geigy), 100 g Phosphatpuffer, 0,01 M, pH 7, sowie 2750 g konzentrierter Fermenterbrühe wurden analog Beispiel A kleine Filmstücke hergestellt, mit denen eine 5 1 Säule gefüllt wurde.
  • Dieser Biorektor wurde bei 300C nach Vorschalten eines Millistak-Sterilfilters (Fa. Millipore) mit 50 % Sucroselösung, pH 7,0, durchströmt. Nach Einstellung eines Durchflusses von etwa 500 ml/h wurde ein Sucroseumsatz zwischen 78,7 und 80,0 % gemessen.
  • Per HPLC ergab sich eine Produktverteilung von beispielsweise 21,25 % Sucrose, 69,91 Isomaltulose, 5,81 % 1,1'-Disaccharid, 1,84 % Fructose, 1,19 % Glucose. Über 40 Tage hinweg wurde keine Aktivitätsminderung des Biokatalysators festgestellt.
  • Beispiel D 1658 g des in Beispiel A hergestellten Esters wurden mit 182 g Isocyanatoethylmethacrylat (DOW Chemicals) unter Zusatz von 0,36 g Desmorapid SO umgesetzt.
  • 700 g dieses so erhaltenen polymerisierbaren Acrylatharzes wurden mit 210 g Phosphatpuffer, 0,01 M, pH 7,0 und 35 g 1 ,2-Diphenyl-2-hydroxy-3-/N (N-Methyl) -pyrrolidinium7-propan-1 -on-methylsulfat gemischt. Zu dieser Lösung wurde 4,9 kg der durch Mikrofiltration konzentierten Fermenterbrühe, die Protaminobacter robrum Zellen enthält, gegeben und diese Mischung in 32,2 kg eines Paraffinöl-Siliconöl-Gemisches mit einer spez.
  • 3 Dichte von 0,9 g /cm3 getropft. Nach Zusatz von 5 g Emulgator (Span 80) wurde durch intensives Rühren und durch Stickstoffeinleitung für eine Zerteilung der obigen zellenthaltenden Mischung in Perlen erreicht, die mittels 4 Quecksilberhochdrucklampen und 1 1/2 stündiger Bestrahlung polymerisiert wurden.
  • Die erhaltenen Perlen (mittlerer Durchmesser 1 mm) wurden in eine 10 1 Säule gefüllt und bei 300C mit einer 50 % Sucroselösung nach Sterilfiltration durch Millistak-Filter (Fa. Millipore) durchströmt. Der pH-Wert wurde zwischen 6,4 und 6,6 eingestellt. Schon nach kurzer Zeit wurde ein relativ konstanter Durchfluß von etwa 2,8 l/h erreicht und die Produktlösung per HPLC analysiert.
  • Ein typisches Produktspektrum sah wie folgt aus: 2,53 % Fructose, 1,86 % Glucose, 15.11 % Sucrose, 74,42 % Isomaltulose, 6,08 % 1,1'-Disaccharid. Es waren keine Tri-, Tetra- oder sonstige Oligosaccharide nachweisbar.
  • Beispiel E 1200 g des Esters aus Beispiel A wurden mit 63,3 g Desmodur N und 38,3 g Isophorondiisocyanat unter Zusatz von 0,2 g Desmorapid S0 umgesetzt.
  • Aus 800 g dieses so erhaltenen polymerisierbaren Acrylatharzes, 40 g Irgacure (Ciba-Geigy), 320 g Phosphatpuffer, 0,01 M, pH 7,0, sowie 4,0 kg Protaminobacter Zellsuspension, konzentriert um den Faktor 10, und 30 kg Siliconöl mit einer Dichte von 0,95 g/cm3 wurden analog Beispiel D Perlen (mittlerer Durchmesser 1,5 mm) hergestellt und in eine 10 1 Säule gefüllt.
  • Der mit immobilisierten Protaminobacter rubrum gefüllte 10 1 Bioreaktor wurde bei 30°C von einer sterilfiltrierten 50 % Sucroselösung durchströmt und nach Einstellen eines Durchflusses von etwa 3,05 lih kontinuierlich betrieben. Der pH-Wert wurde dabei auf 6,4-6,6 geregelt.
  • Der Reaktor wurde über 2 Monate hinweg ohne nennenswerte Aktivitätsverluste betrieben. Für typisches Analysenbeispiel, welches per HPLC ermittelt wurde: 31,1 % Sucrose, 60,7 % Isomaltulose, 1,7 % Fructose, 1,4 % Glucose, 5,1 % 1,1'-Disaccharid, keine Oligosaccharide.
  • Die Durchflußrate des Bioreaktors wurde nun auf etwa 1,75 l/h erniedrigt und folgendes Produktspektrum ermittelt: 4,3 % Fructose, 3,9 % Glucose, 0,9 % Sucrose, 81,7 % Isomaltulose, 9,2 % 1,1'-Disaccharid, keine Oligosaccharide.

Claims (16)

  1. Patentansprüche 1. Verfahren zur Immobilisierung von Protaminobacter rubrum durch Einschluß in polymerisierte Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß wäßrige Lösungen oder Dispersionen des biologischen Materials mit einer wäßrigen Lösung gut wasserlöslicher, höhermolekularer polymerisierbarer Verbindungen, die zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen pro Molekül und ein Molekulargewicht über 400 besitzen, gemischt und anschließend polymerisiert werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Photosensibilisator zugesetzt wird und die Polymerisation durch Bestrahlung erfolgt.
  3. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis der wäßrigen Lösung oder der Dispersion von Protaminobacter rubrum zu der gut wasserlöslichen polymerisierbaren höhermolekularen Verbindung bzw. deren wäßrigen Lösungen zwischen 1:1 bis 30:1, insbesondere zwischen 4:1 bis 20:1 liegt.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gut wasserlöslichen höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindungen Umsetzungsprodukte von Polyetherpolyolen mit dioer mehrfunktionelllen Isocyanaten, modifiziert mit ungesättigten Carbonsäuren sind.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß a) die Polyetherpolyole Polyethylenglykole mit einem MW von 400 und größer sind, b) die Isocyanate Isophorondiisocyanat, Toluylendiisocyanat, Desmodur N und Desmodur L sind, c) daß die ungesättigten Carbonsäuren Acrylsäure, Methacrylsäure und/oder Itaconsäure sind.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Umsetzungsprodukte von Polyetherpolyolen mit ungesättigten Carbonsäuren und/oder isocyanathaltigen Derivaten derselben handelt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß a) Polyetherpolyole Polyethylenglykole mit einem Molekulargewicht von 400 und größer sind, b) die ungesättigten Carbonsäuren Acrylsäure, Methacrylsäure und/oder Itaconsäure sind, c) die isocyanathaltigen Derivate Isocyanatoethylmethacrylat und/oder Isocyanatoethylacrylat sind.
  8. 8. Verfahren nach vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immobilisierung direkt Fermentationsbrühen, gegebenenfalls nach vorhergehender Konzentrierung, verwendet werden ohne Entfernen von Bestandteilen des Fermentationsmediums.
  9. 9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen oder Enzyme in Gegenwart von Desinfektionsmitteln, Bakteriziden oder Fungiziden immobilisiert werden, somit chemisch sterilisiert in den Bioreaktor überführt werden und die Sterilisationsmittel vor Anlauf der Reaktion aus dem geschlossenen, sterilen Reaktorsystem ausgewaschen werden.
  10. 10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zellsuspension von Protaminobacter rubrum, bevorzugt jene mit einem Feststoffgehalt von 5 % bis 25 %, mit einer wäßrigen Lösung der gut wasserlöslichen höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindung gemischt und polymerisiert wird.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von wäßriger Zellsuspension zu festem Polymer von 1:1 bis 30:1, bevorzugt von 4:1 bis 20:1 beträgt.
  12. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Protaminobacter rubrum enthaltende wäßrige Lösung der gut wasser- löslichen, höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindung in einer zweiten, nichtwäßrigen Inertphase zu Perlen dispergiert und diese perlförmige Wasserphase polymerisiert wird.
  13. 13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß - das Gewichtsverhältnis Wasserphase zu Inertphase zwischen 1:1 und 1:20 liegt, - die Zerteilung der wäßrigen Phase zu Perlen durch Rühren und/oder Durchleiten von Inertgas, oder durch Einsprühen oder Einpumpen der wäßrigen Phase in die Inertphase erfolgt, - Perlen der mittleren Durchmesser 0,05 mm bis 5 mm, bevorzugt 0,2 mm bis 2 mm, besonders bevorzugt 0,5 mm bis 1,5 mm demgemäß hergestellt werden, - die Inertphase einen mit Wasser schlecht oder nicht mischbaren Stoff darstellt, wie beispielsweise aliphatische, cycloaliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe, deren Derivate sowie Siliconöle und Paraffinöle bzw. auch Gemische derselben untereinander.
  14. 14. Immobilisierte Protaminobacter rubrum Zellen erhältlich nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
  15. 15. Verwendung der immobilisierten Protaminobacter rubrum Zellen und Anspruch 14 zu Biotransformationen.
  16. 16. Verwendung des nach den vorhergehenden Ansprüchen hergestellten immobiliserten Protaminobacter rubrum Zellen enthaltendes Materials zur Umwandlung von Sucrose zu Isomaltulose.
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