JPS60234583A - プロタミノバクター・ルブルムの固定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロタミノバクタ−・ルプルム（Ｐｒｏ−ｔａ
ｍｉｎａｂａｃｔｇｒ　ｒｕｂｒｕｍ　）を重合した仕
合物に封埋すること（ｅｍｈｇｒｔｄｉｎ、ｑ　）によ
る該プロタミノバクタ−・ルプルムの固定化方法、この
方法によって得られる調製物及びスクロースからイソマ
ルツロースを製造する際のその用途に関する。

イソマルツロ〜　スをスクロースかう、プロタミノバク
タ−・ルブルムの固定化された細胞を用いて、或いはプ
ロタミノバクタ−・ルプルムから精製した遊離のまたは
固定化されたスクロース・ムターゼ←ｖｕｃｒｏｚａ　
ｒｎｕｔａｚｅ　）を用いて製造し得ることはヨーロッ
パ特許第４９．７４２号及び同第４９、８０１号により
公知である。これらの方法においては、α）プロタミノ
バクタ−細胞を凝結法（ｆＬｏｃｃｔＬｌαｔｉｏｎ　
ｐｒｏｃｅｓｓ　）を用いて、またはアルギン酸Ｃａも
しくＦｉＸ−カシダニエン中に封埋することによって固
定化し、セしてｂ）精製した酵素スクロース・ムターゼ
の溶液を中空の繊維中忙封埋し、固体もしくけ可溶性担
体に共有結合によって結合させるか、または固体の担体
に吸着的に結合させて固定化している。

また、イソマルツロースの製造方法の利点はなかでも、
この方法に用いる生物触媒（ｈｉｏｃａｔａＬｙｚｔ）
の原価及びその長期間の安定性によって決定される。

活性の損失を避けるために、高度の活性度付与及び良好
な再生度を与えてグロタミノパクター・ルプルムを固定
化する温和な方法であることが必要である。また、固定
化に対して可能な限シ安い担体物質を用いることが有利
である。

に−カラダニエンまたけアルギン酸Ｃａ中に封埋する方
法は温和な条件によることに特色がろるが、これらの物
質に対する経済的価格は度々工業約規模におけるその用
途と対立する。加えて、×−カラグニエンまたはアルギ
ン酸Ｃαのマトリックスは、例えばグルタルアルデヒド
を用いて該担体マ）　ＩＪラックス追加の交叉結合によ
って安定化を行わなければ、水性反応溶液の種々なパラ
メーターにおける変化に対して極めて敏感である。しか
しながら、グルタルアルデヒドの如き交叉結合剤は度々
生物学的活性を減少させる原因となる。

一般に凝結によシ固定化された細胞の製造は安い凝結剤
を用いることであるが、しかし保存可能な粒状触媒を生
成させるための処理は度々極めて労力及び時間を必要と
し、分離、乾燥、粉砕及び分別装置に対する装置上にか
なり技術的な出費を伴う。また、この多数の機械的操作
は触媒物質の総数率を３０％まで減少させる。

水溶液または水性分散液体中のデロタミノ・ぐフタ−・
ルプルムを、１分子当シ権数個の二官能性または多官能
性基を有し且つ４００を超える分子量を有する高分子の
容易に水に溶解しうる重合可能な化合物の水溶液と混合
し、そしてこの混合物を、適当ならば不活性液体媒質中
であらかじめ粉砕してビーズにした後、重合させること
を特徴とするプロタミノバクタ−・ルプルムを重合した
化合物中に封埋することによる該プロタミノバクタ−・
ルプルムの固定化方法が見出された。

この方法に基づいて固定化された細胞は、スクロースか
らイソマルツロースを製造する際に用いることができる
。

この方法においては、プロタミノバクタ−・ルプルムの
発酵液を、殊に有利にはファクター１０により、限外濾
過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｒＬ）または連続的
遠心分離によって、適当ならば精製段階なしに濃縮する
。少量の緩衝剤に溶解した後、高分子の容易に水に可溶
性の重合可能な化合物をかくして得られた細胞懸濁液に
導入し、この混合物を攪拌して均質にする。細胞調製物
と同様なｐＨ値、粘度、伝導率等を有する少量の高分子
の重合可能な化合物中に前もって溶解する結果として、
封埋中に突然の変化を避けることができ、かくして実質
的に細胞の生物学的活性を保持することができる。重合
可能な高分子の水に容易に溶解しうる化合物を加えたプ
ロタミノバクタ−・ルプルムの細胞懸濁液を、必要に応
じて支持布帛、例えばポリアミド布帛〔モノチュール（
ＭｏｎｏｒＬｔｂｒ）ＰＡ２５ＯＮ１　ペルセイダーク
ーインダストリエテクスタイリｘ　ン（Ｖｅｒｒｇｉｃ
Ｌａ＞　−１ｎｄｕｓｔｒｉｅｔｔｘｔｉＬｉｇｔｓ　
）ＧｍｈＥ〕の配合によって、フィルムの形態で、また
は他の幾何学的形態で重合させる。触媒に対する殊に好
ましいビーズ形状にするために、重合可能な化合物を加
えた細胞懸濁液を不活性相中で例えば攪拌によって機械
的に粉砕してビーズにすることか必要であり、ビーズの
直径を攪拌速度によって調節することができる。

重合は化学的に或いは遊離ラジカル開始剤または光増感
剤を用いて照射によって光化学的に行うことができる。

かくして得られるプロタミノバクタ−・ルブルムの固定
化された細胞は、高度の特異的スクロース・ムターゼ活
性及び良好な長期間安定性を有することに特徴があり、
更に処理または成形せずに、スクロースをイソマルツロ
ースへ転化する際の生物触媒として直接用いることがで
きる。

触媒調製物は水性媒質中及びまた非水性、例えば有機媒
質中に保存することができる。加えて、添加物、例えば
グリコールまたはポリエーテルジオール、例えばポリエ
チどングリコールを用・い“ることかできる。

ビーズ形態において固定化された生物触媒の使用が殊に
有利である。殊に、例えば０．２闘〜２．０鱈の小ビー
ズ直径で、このビーズ形態が連続カラム反応器に用いる
ための触媒の理懇的形状である。

更に、ビーズ直径は０．５耀〜１．５闘であるが、しか
しながら、一般にまたビーズ直径は０．０５　朋〜５Ｍ
であることもできる。また、固定化されたプロタミノバ
クタ−細胞を乾燥すること、乾燥生成物を保存すること
、及びスクロース含有反応溶液で膨張させた後、更に処
理せずに再び使用することができる。

本発明に従って用いられる且つプロタミノバクタ−・ル
プルムを封埋するために適する重合可能な水溶性の高分
子化合物を次に更に詳細に述べる。

本発明に従って用いる且つ好ましくは２個またはそれ以
上の不飽和基を含む高分子の硬化し得る水溶性化合物の
使用は透過特性の良好な調節及び再生を達成することを
可能にする。その理由はこれらの特性が本質的に高分子
の水溶性化合物に起因するためである。加えて、本発明
による化合物を用いる結果として、毒性の問題がない。

また生物学的材料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍαｔｇｒ
ｉａＬ　）と混合する前に、低分子の毒性不純物を除去
することもできる。

更に、容易に水に溶解しうる化合物を、この重合体溶液
をｐＨ％塩濃度、粘度等の如き特性に関して生物学的材
料の水溶液または水性分散液に癲するように調節し得る
ある量の水、緩衝剤溶液、塩溶液等中にまず溶解させる
ことができる。次に２種の溶液または水性重合体溶液及
び細胞分散液を混合し、そして重合させる。この方法は
殊に敏感な生物触媒に対して利点を有し、これによって
周囲の媒質中で突然の変化にさらされず、その結果とし
て、重合可能な混合物を製造する際の活性損失が実質的
に避けられる。

更に本発明の利点は、水に対する良好な溶解度と共に、
水溶液または水性懸濁液に対する重合体の高い吸収容量
である。水性生物学的材料対固体重合体の重量比１：１
乃至６０：１が可能である、４：１乃至２０：１間の重
量比が殊に適当である。

重合前及び後の固定された生物学的材料の高い水分含有
量が可能であるために、生物材料は殊に適当な温和な環
境にあシ、その結果として活性度を安定に保持すること
ができ、加えて、基質及び生成物の流れが促進される。

重合体ネットワークの特性は、重合可能な水に容易に可
溶性の高分子化合物の構造及び分子量を変えることによ
って、広範囲に変えることができる。この方法によって
、生物学的材料の必要性を満すために交叉結合の密度、
透過性、膨張反応及び他の特性を最適にすることが可能
である。

１分子当り２個またはそれ以上の重合可能な基を含み且
つ分子量４００以上、殊に分子量１．　ｏ　ｏ　’。

〜２０．０００を有する水溶性の高分子の重合可能な化
合物及び特にエチレン性不飽和基を含む化合物を固定化
に際して用いる。

その合成に基づき、これらの化合物は、高分子の親水性
化合物と重合可能なエチレン性不飽和基を含む化合物と
の反応によって生成する化合物であると言うことができ
る。反応体の双方は、相互にまたはそれ自体を什学的に
結合させ得るが、或いは二官能性または多官能性試薬に
よって相互にまたはそれ自体結合させ得る官能基を含有
しなければならない。

かかる高分子の親水性化合物の例はポリエチレンクリコ
ール、エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロック
重合体及び共重合体、アルコキシル化、特にエトキシル
化された２価または多価アルコール、並びに水に容易に
可溶性である重合体、例えば全てまたは一部分ケン化さ
れたポリビニルアセテート、水に容易に可溶性の重縮合
物、例えば上記の高分子の親水性化合物とソカルポン酸
またはポリカルざン酸から製造したポリエステル、及び
水に容易に可溶性である重付加化合物、例えば上記の高
分子の親水性化合物とソイソシアネートまたはポリイソ
シアネートから製造したポリエーテル−ポリウレタンで
ある。

また上記の高分子の親水性化合物に存在するヒドロキシ
ル基を普通の方法によって、例えばアンモニアとの反応
によって、全てまたは一部アミノ基に転化することがで
きる。

重合可能なエチレン性不飽和基を含む適当な化合物の例
は次のものである：不飽和カルがン酸、酸塩化物、ソカ
ルボン酸、酸無水物またはその官能性銹導体。

好ましい化合物は次のものであるニアクリル酸、メタク
リル酸、クロトン酸、塩化アクリロイル、塩化メタアク
リロイル、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、無水マ
レイン酸、無水イタコン酸、アクリル酸グリシツル、メ
タクリル酸グリシツル、アクリル酸ヒドロキシエチル、
アクリル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸ヒドロキ
シエチル、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル
酸イソシアナトエチル、メタクリル酸イソシアナトエチ
ル及びアクリル酸４−イソシアナト−３−メチル−２−
ブチル。

従って、高分子量の親水性化合物と重合可能なエチレン
性不飽和化合物との結合の特質は極めて広く変わり、例
えばエステル、エーテル、ウレタン為アミド、アミン及
びウレア結合を生ス：゛る。この結合は文献によシ公知
の方法によって、即ち例えばヒドロキシルまたけアミノ
基と酸、酸ハロゲン化物または酸無水物との反応によシ
対応するエステルまたけアミドを生成させるか、エポキ
シドとの反応によシ対応するエステルまたはアミドを生
成させるか、或いはインシアネートとの反応によって対
応するウレタンまたはウレアを生成させることによって
行うことができる。

更に、高分子の親水性化合物とエチレン性不飽和僅を含
む化合物との直接結合に加えて、またこの結合を二官能
性または多官能性試薬によって行うことができる。

かかる二官能性または多官能性試薬の例は二官能性また
は多官能性インシアネート、例えばイソホロンジイソシ
アネート、トルイレンソイソシアネート、ヘキサメチレ
ンツイソシアネート、ビューレット基を含むポリイソシ
アネート〔例えばデスモデュール（Ｄｇｔｎｏｄｕｒ　
）　Ｎ、ヘキサメチレンジイソシアネートと水との反応
生成物〕、ジインシアネートと多価アルコールとの反応
において生成するポリイソシアネート（例えばデスモデ
ュールＬ、）ルイレンジイソシアネートとトリメチロー
ルプロパンとの反応生成物）及びソエポキシドまたはポ
リエポキシド、例えばビスフェノールＡジグリシジルエ
ーテルまたはジグリシジルへキサヒドロフタレートであ
る。これらの試薬の結合は例えばウレタンまたはエーテ
ルの生成に伴い、高分子の親水性化合物及びヒドロキシ
ル基を含み且つ重合可能なエチレン性不飽和基を含む化
合物のヒドロキシル基によって生ずる。

また本発明による化合物の製造に対して、種々な結合原
理を相互に組合せて行うことができる。

しかしながら、高分子の親水性化合物、エチレン性不飽
和基をもつ化合物及び、適当ならば、二官能性または多
官能性試薬の特質及び割合を、本発明に従って製造され
る高分子量の重合可能な化合物が水に容易に可溶性であ
シ且つ生物学的材料の水溶液または水性分散体に対して
大きな吸収容量があるように選ばなければならない。

水溶性の好ましい高分子の重合可能な化合物として次の
ものを挙けることができるニ ーポリエチレン−ポリオールかも製造した化合物、その
ヒドロキシル基の一部は不飽和カルボン酸でエステル化
されておシ、そして残シの基はイソシアネート基を含む
不飽和カルボン酸の誘導体と反応している。

殊に好ましいものとして次のものを挙げることができる
ニ ー４００よシ多い分子量を有するポリエチレングリコー
ルから製造した化合物、そのヒドロキシル基の一部はア
クリル酸またはメタクリル酸でエステル化されており、
そして残シの基はメタクリル酸インシアナトエチルまた
はアクリル酸４−イソシアナト−３−メチル−２−ブチ
ルと反応している。

製造する際に、ポリエーテル−ポリオールのヒドロキシ
ル基の一部をまずインシアネート基を含む不飽和カルが
ン酸の誘導体と反応させ、次に残りの基を不飽和カルボ
ン酸でエステル化することができるが、しかし、まずヒ
ドロキシル基の一部を不飽和カルボン酸と反応させ、次
にヒドロキシル基の残りをインシアネート基を含む不飽
和カルぎン酸の誘導体と反応させることが好ましい。

水溶性の好ましい高分子の重合可能な化合物の例と１７
て次のものを挙げることができるニーポリエーテル−ポ
リオールから製造【７た化合物、そのヒドロキシル基の
一部は不飽和カルボン酸でエステル化されておシ、そし
て残りの基は二官能性または多官能性イソシアネートと
反応している。

これに関］、て、殊に好ましいものとして次のものを挙
けることができるニ ー４００よシ大の分子量を有するポリエチレングリコー
ルから製造した化合物、そのヒドロキシル基の一部はア
クリル酸またはメタクリル酸でエステル化されており、
そして残シの基はインホロシソイソシアネート、トルイ
レンジイソシアネート、ビューレット基を含むポリイソ
シアネート、またはジイソシアネートと多価アルコール
との反応により生じたポリイソシアネートと反応してい
る。

製造する際に、ポリエーテル−ポリオールのヒドロキシ
ル基の一部をまず二官能性または多官能性インシアネー
トと反応させ、次に残りの基を不飽和カルボン酸でエス
テル化することができる。

しかしながら、まず部分エステル化を行い、次に二官能
性または多官能性イソシアネートとの反応を行うことが
更に有利である。

重合は不活性ガス下で且つ普通のラジカル開始剤、例え
ばアゾビス（インブチロニトリル）、過オクタン酸ｔ−
ブチル、過酸化ベンゾイル、ソシクロへキシルバーオキ
シソカルボネート、メチルエチルケトンＡ−オキシド、
クメンヒドロパーオキシド、アセチルシクロヘキサンス
ルホニルバーオキシド、過酸化ツクミル、ベルオクソニ
硫酸カリウムまたはベルオクソニ硫酸アンモニウムの存
在下において行うことができ、そして酸化還元系、例え
ばベルオクンニ硫酸カリウム／リボフラビン、ベルオク
ソニ硫酸カリウム／重亜硫酸ナトリウム、またけ２価の
鉄の過酸化水素化合物によって起こすことができる。ま
た多数の化合物、例えばＮ。

Ｎ　、　Ｎｌ、　Ｎ１．テトラメチルエチレンジアミン
またはβ−ソメチルアミノズロ２オニトリルを促進剤と
して用いることができる。

重合に対する他の選択できる方法は活性線による混合物
の照射からなる。例えば高圧水銀ランプ、Ｊ顎銀ランデ
、ケイ光ランプ、キセノンランデ、炭素アーク及び太陽
光照射が適当である。同様に、電子ビームまたは１線に
よる照射が可能であるが、しかし、生物学的材料に対す
るある程度の損傷を予習しなければならない。また光増
感剤によって光重合を促進させることもできる。公知の
光増感剤、例工ばα−カルゲニルアルコール、例エバベ
ンゾインまたはアセトイン、アシロインエーテル、例エ
ハヘンソインメチルエーテル、ベンゾインエチルエーテ
ルまたはベンゾインインプロピルエーテル、α−置換さ
れたアシロイン、例えばα−メチルベンゾイン及びα−
メトキシベンゾイン等、並びに陰イオン性基、例えばカ
ルがン酸、スルホン酸またけアミド基で修飾し、かくし
て水溶性にした誘導体を用いることができる。

更に、多環式芳香族化合物、例えばナフトール及びヒド
ロキシアントラセン、アゾアミド、例えば２−シアノ−
２−ブチルアゾホルムアミド、及び金属塩、例えば硝酸
ウラニル及び塩化鉄、並びにメルカプタン、ジサルファ
イド、ハライド及び染料を用いることができる。

固定化された生物材料は、重合中に成形される結果とし
て、実際に全ての所望の形状であることができる。シー
ト、フィルム、成形品等を製造す極、膜または他の材料
を被覆することができる。

更に、重合は、不活性な液体媒質、例えば脂肪族、環式
脂肪族及び芳香族炭化水素、またそのノ・ロダン化され
た誘導体、並びにまたシリコーン油及びパラフィン油ま
たは之れらの相互の混合物中の未だ重合していない生物
学的材料の分散体の形態において行うことができ、ビー
ズの大きさは、攪拌、不活性ガス、例えば窒素の吹き込
み、或いはポンプ導入の如き水相への他の計量導入法に
よって、または不活性相中に噴霧することによって行う
ことができる分布に応じて、極めて可変である。また水
相または不活性相に添加物を加えることによυ、ビーズ
の直径に影響を及ぼすこれらの相の粘度、密度、表面張
力等を改善することができる。

本方法の経済性に関する利点は、重合前及び後に固定さ
れた材料に含まれる水に対して、高吸収容量をもたらす
ことである一生物学的材料の水溶液または水性懸濁液対
固体重合体の重量比は４：１乃−Ｍ２Ｏ：１間が殊に適
当である。この方法によって、第一に、重合可能な化合
物の比較的少量中に生物学的材料の水溶液または水性分
散体の多量を封埋することができ、第二に、発酵媒質の
成分を除去する必要なく、発酵液を直接または、例えば
限外済過もしくけ遠心分離によって濃縮後、固定化する
ことができる。

しかしながら、更に固定化前及び後に、水溶液の少量を
用い、含有水分の一部を他の液体、例えばアルコールと
入れ換えることができる。

また、固定化されたプロタミノバクタ−・ルプルム細胞
を非水溶液、例えば脂肪族まだは芳香族炭化水素中で使
用することもできる。

上記の方法によって固定されたプロタミノバクタ−・／
Ｌ、プルム細胞は生物転換（ｂｉｏｔｒａｒＬｚｆａｒ
−ｍａｔｉｏｎｚ　）に対する生物触媒として用いるこ
とがスクロース・ムターゼの製造のためにプロタミノバ
クタ−・ルプルム菌株ＣＢＳ　５７４．７７’１いた。

栄養液は濃いソユース５％、トウモロコシ浸漬液２チ及
び（ＮＨ４）、ＩＩＰｏ、　０．０５％からなっていた
；そのｐＨ値けＺｌであった。容量１１の三角フラスコ
中でプロタミノバクタ−・ルブルム抽出液１　ｍｌを栄
養液２００　ｍｌに接種した。発酵を軌道回転振盪器に
よって５１℃で１５時間行った。

この予備培養物を上記の栄養液２００１を含む容量３０
０／の発酵器に接種し、発酵を１６時間行った。

発酵溶液のスクロース・ムターゼ活性は９１Ｕ／　ｍｌ
であった。１Ｕ＝１分間当り反応したスクロース１１Ｉ
モル゛。

発酵溶液２００　ｍｌをファクター約１０で連続的に遠
心分離して濃縮し、この濃縮したプロタミノバクタ−・
ルプルム細胞を更に処理せずに、続いてのパイロット規
模における固定化実験に用いた。

実施例Ａ（第１図参照） 平均分子［１，５５０を有するポリエチレングリコール
〔ヘミツシエ替ベルケ８ヒールス（Ｃｈｇｍｉｓ−ｃｈ
ｅ　ｆＰ’ｅｒｋｔ　ｌｈｂｌｇ　）　：］　２，１８
９　ｙをトルエン中で、ｐ−トルエンスルホン酸２２．
８？、ソーｔａｒｔ　−ブチルヒドロキノン２．３２及
びｐ−メトキシフェノール２．３２を添加して、アクリ
ル酸９８．４２でエステル什した。

このエステル１．１００　ｆを、デスモラビツド（Ｄｇ
ｒｒｎｏｒａｐｉｄ　）　Ｓｏ　Ｑ、　１５　ｙを添加
しテ、インホロンソイソシアネート７４．２ｔと反応さ
せた。

この方法で得られた重合可能なアクリル樹脂１００２を
イルガキューア（Ｉｒ、ｑａｃｕｒｔ　）　［チパ＋　
、）１イキ−（Ｃｉｈａ　−Ｇｔｉｙｙ　））　１ｆと
混合し、ｐＨ値７のリン酸塩緩衝剤４０　ｙ　（０，０
１Ｊｆ）を加えて溶液を生成させた。

この溶液を、限外Ｅ過によって濃縮したプロタミノバク
タ−・ルプルムの発酵液６４８ｆと混合し、４個の高圧
水銀ランプを用いて、厚さ５００μｍのフィルム状（４
０ｃＩｎＸ　６０ｃｍ判）に重合させた。

次にこのフィルムを小片（はぼ０．５　ｆｆｌ　）に切
断し、この小片を定温に調節されたカラムに導入した。

無菌のフィルター〔ミリスタック（Ｍｉ　Ｚハ５−ｔａ
ｋ　）、ミリポア　（ＭｉｌＬｉｐｏｒｅ　）製〕を通
した後、５０ｑ６スクロース溶液を生物反応器に３０℃
で通した。流量約１３０ｍ／！／時に調節した後、約７
０〜８０チのスクロース転化率が達成された。生成物の
溶液をＨＰＬＣによって分析した。４０日後、活性の減
少は検出できなかった。

プロタミノバクタ−・ルブルムの封埋した細胞によるス
クロースのパラチノースの連続転化を第１図に説明する
； 反応器容量ｉｚ、５ｏｅ４スクロース、５０℃・−・−
・　流速（ｍｅ１１０ ００　転化されたスクロースチ ○○　パラチノース［ｋｇ／ｄ） 実施例Ｂ（第２図参照） 実施例Ａによるプロタミノバクタ−・ルプルム細胞を含
む混合物（１７℃Ｍ）を４０ｃｎＬ×６０α判のポリア
ミド織物〔モノデュール（Ｍｏｎｏｔｕｒ　）２５０＃
、ベルセイダー７−インダストリエテクスタイリｘン（
Ｖｅｒ、？ｇｉｄａ、ｑ−１ｎｄｕｚｔｒｉｇｔｇｘｔ
ｉＬ−ｉｍｎ　）　Ｇｍｈｌｌ）の柱上に刷は塗りし、
光線にさらして重合させた。かくして製造した強化フィ
ルムを、未被覆の層がフィルムの各２層間にあるように
して、未被覆ポリアミド織物と共に巻き上げた。

円筒状に巻き上げた材料を１１のカラム中に挿入し、カ
ラムの内直径を材料がカラムの全直径を満たすように選
び、このカラムＫｐＨ値６，５の５０チスクロース溶液
を３０℃で通した。スクロース原液を、ペリスタ−ポン
プによって、ミリスタック無菌フィルター（ミリボア製
）を通して反応カラムにポンプ導入した。流速を約６０
ｍ／！／時に調節した後、約７５チの一定スクロース転
化率が得られた。生成物の溶液をＨＰＬＣによって分析
し、この溶液はイソマルツロース６ａ５％、１　、１’
−ジサッカリド４．５’ｌ、レグロース１．２％及びグ
ルコース０．８チを含有していた。

固定化されたプロタミノバクタ−細胞のスクロース・ム
ターゼ活性は５０日間にわたって安定であった。

封埋したプロタミノバクタ−・ルプルム細胞によるスク
ロースのパラチノースへの連続転化を第２図に説明する
。

反応器容量ＩＪ、５０％スクロース、５０°Ｃ・−・−
・　流速〔−／時〕 ・・　転化されたスフロー２％ ○○　パラチノース〔ゆ／ｄ〕 実施例Ｃ 平均分子［１，０００を有するポリエチレングリコール
（ヘミツシエ拳ペルケｅヒールス）１，０００ＩＫ−）
ルエン中で、Ｐ−１’ルエンスルホン酸９２２、ソーｔ
ａｒｔ−ブチルヒドロキノン１．０２及びＰ−メトキシ
フェノール１．Ｏｆを添加して、アクリル酸７２ｆでエ
ステル化した。

かくして得られたエステル７５０ｖを、デスモラピツド
５００，０９１を添加して、インホロンソイノシアネー
）　８３．３　Ｆと反応させた。

かくして得られた重合可能なアクリル樹脂５００１、イ
ルガキューア（チパーガイギー）５ｆ１０．０１Ｍ及び
ｐＨ値７のリン酸塩緩衝剤１００ｆ及び濃縮した発酵液
２．７５０９を用いて、フィルムの小片を実施例Ａと同
様にして製造し、これを用いて５１のカラムに充填した
。

ミリスタック無菌フィルター（ミリボア製）の上流に置
いた後、この生物反応器（ｈｉｏｒｇａｃｔｏｒ　）に
ｐＨ値ＺＯの５０％スクロース溶液を６０℃で通した。

流速を約５００ｍ１／時に調節した後、スクロースの転
化率＃：１７ａ７乃中８０．０％間であることがわかっ
た。

ＨＰＬＣによって測定した際、生成物の分布は例エバス
クロース２１．２５％、イソマルツロース６９９１チ、
１．１′−ジサツカリド５．８１％、レプロース１．８
４％及びグルコース１．１９％であった。生成ゑ媒の活
性の減少は４０日間にわたって見出されなかった。

実施例り 実施例１において製造したエステル１．６５８　ｆを、
デスモラピツドＳＯ０，５６ｆを添加して、メタフリル
酸イソシアナトエチル〔ダウ・ケミカルｆ　（ＤＯＷ　
Ｃｈｇｍｉｃａｌｖ　）　）　１８２　ｔと反応サセた
。

かくして得られた重合可能なアクリル樹脂７００ｆを０
．０１＆及びｐＨ値７．０のリン酸塩緩衝剤２１０ｖ及
び１．２−ジフェニル−２−ヒドロキシ−３−ＣＮ−（
Ｎ−メチル）−ピロリジニウム〕−プロパンー１−オン
メチルサルフェート３５１と混合した。限外濾過によっ
て濃縮し且つプロタミノバクタ−・ルブルム細胞を含む
発酵液４、９　ｋｌ？を上記の溶液に加え、この混合物
を、比重０、９　ｔ　／　ｃａを有する／ぞラフイン油
／シリコ＝ン油混合物３２．２ｋｌＦに滴下した。乳化
剤〔ス・ぞン（Ｓｐａル）８０〕５ｆを加えた後、はげ
しく攪拌し、そして窒素を導入して、上記の細胞含有混
合物の分散体をビーズにし、このものを４個の高圧水銀
ランプでＩＬ４時間照射して重合させた。

得られたビーズ（平均直径１鴎）を１（ｌの力２ムに充
填し、ミリスタック・フィルター（ミリボア製）で滅菌
濾過した後、５０チスクロース溶液をカラムに３０℃で
通した。ｐＨ値を６，４乃至６．６間に調節した。短時
間後に１約２．８１７時の相対一定流速が得られ、そし
て生成物の溶液をＨＰＬ（４Ｃよって分析した。典型的
な生成物スペクトルは次の通りであったニレブロース２
．５３％、グルコース１．８６チ、スクロース１５．１
１％、イソマルツロース７４．４２％及び１．１′−ソ
テツカリド６．０８　％。トリー、テトラ−または他の
オリゴ−サツカリドは検出できなかった。

実施例Ｅ 実施例Ａによるエステル１．２０　Ｏｆを、デスモラビ
ツド５ＩＪ０．２ｆを添加して、デスモデュールＮ６５
．５？及びインホロンソイソシアネート３ａ３ｔ°と反
応させた。

かくして得られた重合可能なアクリル樹脂８００り、イ
ルガキューア（チパーガイギー）　４０　ｔｚｏ、０１
Ｍ及びｐＥ＠７．０のリン酸塩緩衝剤３２０２並びに１
０のファクターで濃縮したプロタミノバクタ−細胞懸濁
液４．０　ｋｌｉＪ及び密度０．９５Ｆ／−を有するシ
リコーン油３０ゆを実施例りと同様にして用いてビーズ
（平均直径１．５１ｌｌＩ）を製造し、とのビーオを１
ＯＡ’のカラムに充填した。

無菌の東件下で濾過し、だ５０係スクロース溶液を、固
定化したプロタミノバクタ−・ルプルムを充填した１０
／の生物反応器に３０℃で通し、流速を約３．０５１／
時に調節した後、生物反応器を連続的に操作した。この
工程において、ｐＨ値を６．４〜６．６に調節した。

活性度の認められるほどの損失もなく、反応器を２チ月
間にわたって操作した。ＨＰＬＣによって測定された分
析の典型的な例は次の通シであったニ スクロース３１．１％、イソマルツロース６０．７チ、
レプロース１．７％、ヘグルコース１．４チ、１゜１′
−ソサツカリド５１チ及びオリゴサツカリド無し。

生物反応器の流速を約１．７５Ｊ／時に減少させ、次の
生成物スペクトルが測定されたニレブロース４．３％、
グルコース３．９係、スクロース０．９％、イソマルツ
ロース８１．７％、１．１’−ソサツカリド９．２％及
びオリゴサツカリド無し。

実施例Ｆ リン酸塩緩衝剤（０，０１Ｍ及びｐＨ値７．０　）１２
Ｆを実施例Ａにおいて用いた重合可能な樹脂５５．５ｆ
に加え、溶液を生成させた。

この溶液を交叉流限外濾過（ｃｒｏｐｓ　−ｆｌｏｗｍ
ｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　）によって濃縮したプ
ロタミノバクタ−・ルプルム発酵液５００２と混合し、
この混合物に過硫酸アンモニウム１．１ｆを溶解した。

Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’、　Ｎｌ−テトラメチルエチレン
ソアミン１．１２を加えた後、混合物をはげしく攪拌し
、層の厚さが約３闘になるように、皿上に注いだ。

重合が数分以内に開始した。重合した生成物を５Ｘ５Ｘ
！ＩＩＥｍの寸法の小片に切断し、この小片を１１のカ
ラムに充填した。

５０チスクロース溶液によって５０℃で長期間操作した
際、２２５ｍ７！／時の流速でスクロースの５８％の転
化率が達成された。８日後、生産減少は検出できなかっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はプロタミノバクタ−・ルプルムを封埋した細胞
によるスクロースのパラチノースへ連続転化を説明する
グラフである。 第２図は封埋したプロタミノバクタ−・ルプルム細胞に
よるスクロースのパラチノースへの連続転化を説明する
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的材料の水溶液または水性分散液を、１分子
   当シ２個またはそれ以上の重合可能な官能基を含み且つ
   ４０１１ｋを超える分子量を有する水に容易に溶解しう
   る高分子量の重合可能な化合物の水溶液と混合し、次に
   重合させることを特徴とする重合した化合物中にプロタ
   ミノバクタ−・ルプＡ／　ム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｈａ
   ｃｔａｒ　ｒｕｂｒｗｍ　）を封埋することによる該プ
   ロタミノバクタ−・ルプルムの固定仕方法。 ２、　フリー・ラジカル重合開始剤及び／またはフリー
   ・ラジカル重合開始剤系及び／または促進剤を加える特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、水溶性のフリー・ラジカル重合開始剤、殊に被ルオ
   クソニ硫酸アンモニウム、及び水溶性の促進剤、例えば
   Ｎ　、　＃　、　Ｎｌ、　Ｎｌ−テトラメチルエチレン
   ソアミンを加える特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、光増感剤を加え、そして重合を照射によって行う特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、　プロタミノバクタ−・ルブルムの水溶液または水
   性分散液対水に容易に溶解しうる重合可能な高分子量の
   化合物またはその水溶液の重量比が１＝１乃至３０：１
   間、殊に４：１乃至２ｏ：１間である特許請求の範囲第
   １〜５項のいずれかに記載の方法。 ６、水に容易に溶解しうる高分子量の重合可能な化合物
   を、ヒドロキシル基の一部が不飽和カルボン酸でエステ
   ル化されており、そして残シがイソシアネート基を含む
   不飽和カルビン酸の誘導体と反応しているポリエーテル
   −ポリオールから製造する特許請求の範囲第１〜５項の
   いずれかに記載の方法。 Ｚ　α）ポリエーテルポリオールが４００またはそれ以
   上の分子量を有するポリエチレングリコールであり、 ｈ）不飽和カルデン酸がアクリル酸及び／またはメタク
   リル酸であシ、 Ｃ）イソシアネート基を含む不飽和カルボン酸の誘導体
   がアクリル酸インシアナトエチル、メタクリル酸イソシ
   アナトエチル及び／またはアクリル酸４−イソシアナト
   −３−メチル−ブト−２−イルである 特許請求の範囲第６項記載の方法。 ａ　水に容易に溶解しうる高分子量の重合可能な化合物
   を、ヒドロキシル基の一部が不飽和カルビン酸でエステ
   ル化されており、そして残りが二官能性または多官能性
   インシアネート基と反応しているポリエーテル−ポリオ
   ールから製造する特許請求の範囲第１〜５項のいずれか
   に記載の方法。 ９　α）ポリエーテル−ポリオールが４００またはそれ
   以上の分子量を有するポリエチレングリコールであり、 ｂ）不飽和カルボン酸がアクリル酸及び／またはメタク
   リル酸であシ、 Ｃ）二官能性または多官能性イソシアネートがイソホロ
   ンソイソシアネート、トルイレンツインシアネート、ヘ
   キサメチレンジイソシアネート、ビューレット基を含む
   ポリインシアネート及び／またはソイソシアネートと多
   価アルコールとの反応によって生成したポリイソシアネ
   ートである特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、発酵液を、適当ならばあらかじめ濃縮した後、発
   酵媒質の構成成分を除去せずに固定化に直接用いる特許
   請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の方法。 １１、細胞または酵素を消毒剤、殺バクテリア剤または
   殺菌・殺カビ剤の存在下において固定化し、かくして化
   学的に滅菌した状態で生物反応器中に移し、そして反応
   を開始させる前に、密封された無菌の反応器系から該滅
   菌剤を洗い出すことからなる特許請求の範囲第１〜１０
   項のいずれかに記載の方法。 １２、プロタミノバクタ−・ルブルムの細胞懸濁液、好
   ましくは固体含有量５％〜２５％の該懸濁液を容易に水
   に溶解しうる高分子量の重合可能な化合物と混合し、そ
   して重合させることからなる特許請求の範囲第１〜１１
   項のいずれかに記載の方法。 １３、水性細胞懸濁液対固体重合体の重量比が１：１乃
   全３０：１、好ましくは４：１乃至２０：１である特許
   請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、プロタミノバクタ−・ルブルムを含有する容易に
   水に溶解しうる高分子量の重合可能な化合物の水溶液を
   第二の非水性の不活性相に分散させてビーズを生成させ
   、そしてビーズの形態における該水性相を重合させるこ
   とからなる特許請求の範囲第１〜１３項のいずれかに記
   載の方法。 １５、水相対不活性相の重量比が１＝１乃至１：２０間
   であり、 ビーズを生成させるための水性相の分散を、攪拌及び／
   または不活性ガスの吹き込みによ９行なうか、或いは水
   性相を不活性相中に噴霧またはポンプ導入することによ
   って行い、 かくして、平均直径０．０５　ｍ〜５龍、好ましくはり
   、　２　ｓｎ〜２ｓｎ、殊に好ましくは０．５　ｍｇ〜
   １．５靜のビーズを製造し、 不活性相が水とわずかに混和し得るかまたは非混和性で
   ある物質、例えば脂肪族、環式脂肪族または芳香族炭什
   水素、その誘導体並びにシリコーン油及びＡラフイン油
   そしてまたこれらの相互の混合物から構成される 特許請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の方法。 １６、特許請求の範囲第１〜１５項のいずれかに記載の
   方法によって得られる固定化されたプロタミノバクタ−
   ・ルプルム細胞。 １Ｚ　生物転換のための特許請求の範囲第１〜１６項の
   いずれかに記載の方法によって固定化されたプロタミノ
   バクタ−・ルプルム細胞の使用。 １８、スクロースをイソマルツロースに転化するための
   特許請求の範囲第１〜１６項のいずれかに記載の方法に
   従って製造し且つ固定化されたプロタミノバクタ−・ル
   プルム細胞を含む材料の使用。