JP4299945B2 - 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 - Google Patents
酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4299945B2 JP4299945B2 JP2000070372A JP2000070372A JP4299945B2 JP 4299945 B2 JP4299945 B2 JP 4299945B2 JP 2000070372 A JP2000070372 A JP 2000070372A JP 2000070372 A JP2000070372 A JP 2000070372A JP 4299945 B2 JP4299945 B2 JP 4299945B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- granular
- parts
- molded product
- urethane resin
- gel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素又は微生物の固定化法としては、従来から、包括法、物理的吸着法、共有結合法等多くの方法が知られている。これらの方法によって得られる塊状又はシート状の固定化物は、微生物反応や酵素反応に使用する場合には、細かく切断したり磨砕したりした後カラムに充填するのが普通である。しかしその場合、固定化物は面同志で密着することが多く、微生物反応や酵素反応の効率が悪くなり、また、屡々チャネリング現象を起こしてカラムを閉塞する等の欠点がある。
【０００３】
このため、最近では、酵素又は微生物菌体を粒状成形物として固定化することにより、流動しやすく、カラムへの充填作業が容易で、粒子同志の接触面積が少なくなり、それによって、微生物反応や酵素反応の効率をアップさせることが提案されている（例えば、特公昭６２−１９８３７号公報、特開平１０−２１０９６９号公報参照）。
【０００４】
一方、酵素又は微生物菌体を固定化するための材料として、従来から各種の親水性の光硬化性樹脂及び熱硬化性樹脂が使用されている。中でもポリウレタン樹脂は微生物菌体に対する付着性が良好で、十分な生物活性が得られることから好適なものとして実用化されているが、従来から用いられているポリウレタン樹脂は光重合もしくは熱重合反応性基が分子末端にしか存在しないため、高分子量化すると不飽和基濃度が低くなるため架橋点が少なくなり、その結果十分な強度を有する粒状成形物が得られないという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、酵素又は微生物菌体固定化用親水性樹脂として使用されるポリウレタン樹脂の機械的強度を向上させ、十分な強度を有する粒状成形物を製造する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記した目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、不飽和基濃度の高い特定の親水性ウレタン樹脂を用いることによって十分な強度をもつ粒状成形物が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
かくして、本発明に従えば、
（ａ）ジエポキシ化合物とエチレン性不飽和カルボン酸との付加物に、ポリイソシアネート化合物を反応させて得られる１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有する親水性ウレタン樹脂、
（ｂ） 重合開始剤、及び
（ｃ） アルカリ金属イオン又は多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力のある水溶性高分子多糖類
を含んでなる水性液状組成物を、アルカリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させるか又は該水性媒体の表面上に所定の時間、連続的に注加して液滴を所望の粒径になるまで生長させた後、その液滴を沈降させてゲル化させ、次いで得られる粒状ゲルを光重合及び／又は熱重合して該粒状ゲル中の親水性樹脂を硬化させることを特徴とする酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
（ａ）親水性ウレタン樹脂
本発明において酵素又は微生物菌体固定化用粒状担体の製造に用いられる１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有する親水性ウレタン樹脂（ａ）としては、ジエポキシ化合物とエチレン性不飽和カルボン酸を付加反応させて得られる不飽和基含有ジオール化合物にポリイソシアネート化合物を反応させて得られる、一般に、４００〜５００００、好ましくは５００〜２００００の範囲内の数平均分子量及び０．０４〜５モル／ｋｇ樹脂、好ましくは０．１〜４モル／ｋｇ樹脂の範囲内の不飽和基含量を有し、水性媒体中に均一に分散するに十分なイオン性又は非イオン性の親水性基、例えば水酸基、カルボキシル基、エーテル基、アミノ基等を含むものが挙げられる。
【０００９】
上記のジエポキシ化合物としては、例えば、ビスフェノールＡ、ビスフェノールＦ、ビスフェノールＳ等のビスフェノール化合物のジグリシジルエーテル化合物；ダイセル化学社製の脂環式ジエポキシ化合物である商品名セロキサイド２０２１、同２０８０及び３０００、一般式
【００１０】
【化１】
【００１１】
（ここでＲ1はアルキレン基等を示す）で表わされるエポリードＮＴ２１２、同ＮＴ２１４、同ＮＴ２２８及び同ＣＤＭ；ナガセ化成社製の一般式
【００１２】
【化２】
【００１３】
で表わされる商品名デナコールＥＸ−２０１、同２０３、同２１１、同２１２、同７０１、同７１１及び同７２１、一般式
【００１４】
【化３】
【００１５】
で表わされるデナコールＥＸ−８１０、同８１１、同８２１、同８３０、同８３２、同８４１、同８５０、同８５１及び同８６１、一般式
【００１６】
【化４】
【００１７】
で表わされるデナコールＥＸ−９１１、同９２０、同９２１、同９３１及び同９４１；等を挙げることができるが、これらのみに限定されるものではない。これらの化合物はそれぞれ単独でもしくは２種類以上混合して使用することができる。これらの中でも本発明において特に好適に用いられるものは、デナコールＥＸ−８３０、同８３２、同８４１及び同８６１である。
【００１８】
また、上記のエチレン性不飽和カルボン酸としては、例えば、（メタ）アクリル酸；東亜合成社製の商品名アロニックスＭ−５３００（ω−カルボキシ−ポリカプロラクトンモノアクリレート）、同５４００（フタル酸モノヒドロキシエチルアクリレート）及び同５６００（アクリル酸ダイマー）；大阪有機化学工業社製のビスコート＃２０００（フタル酸モノヒドロキシエチルアクリレート）、同＃２１００（フタル酸モノヒドロキシプロピルアクリレート）、同＃２１５０（ヘキサヒドロフタル酸モノヒドロキシプロピルアクリレート）及び同＃２１８０（テトラヒドロフタル酸モノヒドロキシプロピルアクリレート）；等を挙げることができるが、これらのみに限定されるものではない。これらの化合物はそれぞれ単独でもしくは２種類以上混合して使用することができる。これらの中でも、本発明において特に（メタ）アクリル酸が好適に用いられる。
【００１９】
ジエポキシ化合物と不飽和カルボン酸との付加反応によって得られる不飽和基含有ジオール化合物と反応させるポリイソシアネート化合物としては、例えば、メチレンジイソシアネート、エチレンジイソシアネート、プロピレンジイソシアネート、ブチレンジイソシアネート、オクタデシレンジイソシアネート、１，４−テトラメチレンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート、１，１０−デカメチレンジイソシアネート、トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート、ダイマー酸ジイソシアネート、リジンジイソシアネート等の脂肪族系ポリイソシアネート化合物類；キシリレンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、フェニレンジイソシアネート、４，４′−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタントリイソシアネート、３−フェニル−２−エチレンジイソシアネート、４−メトキシ−１，３−フェニレンジイソシアネート、２，４−ジイソシアネートジフェニルエーテル、４，４−ジイソシアネートジフェニルエーテル、２，４，６−トリレントリイソシアネート、２，４，４−トリイソシアネートジフェニルエーテル、ナフタレンジイソシアネート、１，４−アンスラセンジイソシアネート、クメン−２，４−ジイソシアネート等の芳香族系ポリイソシアネート化合物類；イソホロンジイソシアネート、４，４′−メチレンビス（シクロヘキシルイソシアネート）、メチルシクロヘキサン２，４−（又は２，６）−ジイソシアネート、４，４′−メチレンビス（シクロヘキシルイソシアネート）等の脂環族系ポリイソシアネート化合物類；等を挙げることができ、さらにこれらポリイソシアネート化合物の重合体（プレポリマー）も使用することができる。これらのポリイソシアネート化合物はそれぞれ単独でもしくは２種類以上混合して使用することができる。これらの中でも本発明において好適に用いられるものは、トリレンジイソシアネート、４，４′−ジフェニルメタンジイソシアネート及びイソホロンジイソシアネートである。
【００２０】
親水性ウレタン樹脂（ａ）を製造する際、必要に応じて、ポリオール化合物を使用して水酸基を導入したり、ポリエチレングリコール（分子量６０００以下）、ポリプロピレングリコール（分子量６０００以下）等の使用によってエーテル結合を導入してさらに親水性を向上させることができる。
【００２１】
ポリオール化合物としては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，３−ブタンジオール、１，１０−デカンジオール、ネオペンチルグリコール、１，６−ヘキサンジオール、シクロヘキサンジオール、２−ブテン１，４−ジオール、３−シクロヘキセン−１，１−ジメタノール、３−メチレン−１，５−ペンタンジオール、（２−ヒドロキシエトキシ）−１−プロパノオール、水素化ビスフェノールＡ、グリセリン、ポリカプロラクトン、１，２，６−ヘキサントリオール、トリメチロルプロパン、ペンタントリオール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、３−（２−ヒドロキシエトキシ）−１，２−プロパンジオール、ペンタエリトリット、ジペンタエリトリット、マニトール、グルコース等を挙げることができる。
【００２２】
さらに、親水性ウレタン樹脂（ａ）の分子鎖末端に、必要に応じて、不飽和基を導入して硬化性を向上させることができ、そのためにポリウレタン樹脂に水酸基とエチレン性不飽和基を有する化合物或いはイソシアネート基とエチレン性不飽和基を有する化合物を反応させることもできる。
【００２３】
該水酸基とエチレン性不飽和基を有する化合物としては、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、アリルアルコール、ブタンジオールモノ（メタ）アクリレート、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートとカルボキシル基含有化合物（例えば、アジピン酸、セバシン酸、アゼライン酸等）との付加物、（メタ）アクリル酸とエポキシ化合物との付加物等を挙げることができる。
【００２４】
また、イソシアネート基とエチレン性不飽和基を有する、化合物としては、例えば、イソシアン酸エチルメタアクリレート、ジイソシアネート（例えば、イソホロンジイソシアネート）とヒドロキシエチル（メタ）アクリレートとのモノアダクト等が挙げられる。
【００２５】
親水性ウレタン樹脂（ａ）の製造に際し、ジエポキシ化合物と不飽和カルボン酸の反応割合は、エポキシ基／カルボキシ基の当量比で一般に１／１．８〜２．２、好適には１／２〜２．１の範囲内とすることができる。ジエポキシ化合物と不飽和カルボン酸の反応は、例えば、トリエチルアミン等のアミン類、テトラブチルアンモニウムブロマイド等の第４級アンモニウム塩等を触媒として用いて、それ自体公知の方法によって行うことができる。
【００２６】
また、上記反応によって得られる不飽和基含有ジオール化合物とポリイソシアネート化合物との反応割合は、水酸基とイソシアネート基との当量比で一般に１／３〜３／１、好適には１／２〜２／１の範囲内とすることができる。不飽和基含有ジオール化合物とポリイソシアネート化合物との反応はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、これら両成分を該反応を阻害しない不活性な有機溶媒に溶解もしくは分散し、テトラブチルスズ、トリフェニルアルミニウムなどの反応触媒を用いて、約２０〜約２５０℃で約１０分間〜約２４時間反応させることによって行うことができる。
（ｂ） 重合開始剤
本発明において用いる重合開始剤としては、光重合開始剤又はレドックス系熱重合開始剤を挙げることができる。
【００２７】
光重合開始剤としては、エチレン性不飽和化合物の重合に有用なものとして従来から知られているものを特に制限なく使用することができる。具体的には、例えば、ベンゾイン、ベンゾインメチルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾインブチルエーテル、ジエトキシアセトフェノン、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパン−１−オン、ベンジルジメチルケタール、１−ヒドロキシシクロヘキシル−フェニルケトン、２−メチル−２−モルホリノ（４−チオメチルフェニル）プロパン−１−オン、２−ベンジル−２−ジメチルアミノ−１−（４−モルホリノフェニル）−ブタノン、２，４，６−トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンオキサイド、２，４，６−トリメチルベンゾイルフェニルエトキシホスフィンオキサイド、ベンゾフェノン、Ｏ−ベンゾイル安息香酸メチル、ヒドロキシベンゾフェノン、２−イソプロピルチオキサントン、２，４−ジメチルチオキサントン、２，４−ジエチルチオキサントン、２，４−ジクロロチオキサントン、２，４，６−トリス（トリクロロメチル）−Ｓ−トリアジン、２−メチル−４，６−ビス（トリクロロ）−Ｓ−トリアジン、２−（４−メトキシフェニル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−Ｓ−トリアジンなどが挙げられる。これらの光重合開始剤はそれぞれ単独でもしくは２種類以上を混合して使用することができる。
【００２８】
また、これらの光重合開始剤による光重合反応を促進させるために、光増感促進剤を光重合開始剤と併用してもよい。併用し得る光増感促進剤としては、例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、メチルジエタノールアミン、４−ジメチルアミノ安息香酸メチル、４−ジメチルアミノ安息香酸エチル、４−ジメチルアミノ安息香酸イソアミル、安息香酸（２−ジメチルアミノ）エチル、ミヒラーケトン、４，４′−ジエチルアミノベンゾフェノン等の３級アミン系；トリフェニルホスフィン等のアルキルホスフィン系；β−チオジグリコール等のチオエーテル系などが挙げられる。これらの光増感促進剤はそれぞれ単独でもしくは２種類以上を混合して使用することができる。
【００２９】
さらに、レドックス系熱重合開始剤としては、従来から既知のものを使用することができ、例えば、−１０℃〜５０℃程度の比較的低温でラジカル重合を行ない得る、酸化剤と還元剤の組み合わせからなる重合開始剤が好適に使用される。
【００３０】
酸化剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、メチルエチルケトンペルオキシド、ジクミルペルオキシド、ｔ−ブチルパーベンゾエート、クメンヒドロペルオキシドなどの有機過酸化物類；ペルオキソ二硫酸アンモニウム、ペルオキソ二硫酸カリウムなどのペルオキソ二硫酸塩類；過酸化水素等が挙げられる。また、還元剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸水素塩類；硫酸第一鉄、塩化第一鉄などの二価の鉄塩類；Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、フエニルモルホリンなどのアミン類；ナフテン酸コバルト、ナフテン酸マンガン、ナフテン酸銅などのナフテン酸金属塩類等を挙げることができる。
【００３１】
これらのレドックス系熱重合開始剤のうち、本発明において特に有利に使用しうるものは、酸化剤がペルオキソ二硫酸塩類又は過酸化水素からなり、還元剤が亜硫酸水素塩類又は二価の鉄塩からなる組み合わせのものである。
（ｃ） 水溶性高分子多糖類
本発明において使用する水溶性高分子多糖類は、水溶性であり、かつ水性媒体中でアルカリ金属イオン又は多価金属イオンと接触したときに水に不溶性又は難溶性のゲルに変化する能力のある高分子多糖類であって、一般に約３０００〜約２００００００の範囲内の数平均分子量を有し、また、アルカリ金属イオン又は多価金属イオンと接触させる前の水溶性の状態で、通常少なくとも約１０ｇ／ｌ（２５℃）の溶解度を示すものが好適に使用される。
【００３２】
かかる特性をもつ水溶性高分子多糖類の具体例には、アルギン酸のアルカリ金属塩、カラギーナン等が包含される。
【００３３】
これら水溶性高分子多糖類は、水性媒体中に溶解した状態で、カラギーナンの場合は、カリウムイオン、ナトリウムイオン等のアルカリ金属イオンと接触することによって、また、アルギン酸のアルカリ金属塩の場合は、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン等のアルカリ土類金属イオン；或いはアルミニウムイオン、セリウムイオン、ニッケルイオン等の他の多価金属イオンのうちの少なくとも１種の多価金属イオンと接触することによってゲル化しうるものである。ゲル化が起るアルカリ金属イオン又は多価金属イオンの濃度は水溶性高分子多糖類の種類等により異なるが、一般には０．０１〜５モル／ｌ、特に０．０１〜３モル／ｌの範囲内である。
【００３４】
上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の各成分の相互の使用割合は厳密に制限されるものではなく、各成分の種類等に応じて広範にわたって変えることができるが、一般には、（ａ）成分の親水性ウレタン樹脂１００重量部に対し、（ｂ）及び（ｃ）の各成分はそれぞれ下記の割合で使用するのが適当である（カッコ内は好適範囲である）。
【００３５】
（ｂ） 重合開始剤：０．１〜１０重量部（０．３〜５重量部）
（ｃ） 水溶性高分子多糖類：０．５〜１５重量部（１〜８重量部）
また、上記（ｂ）の重合開始剤のうち、レドックス系熱重合開始剤は酸化剤と還元剤とを組み合わせて使用されるが、両者の混合割合はモル比で一般に５：１〜１：５、好適には２．５：１〜１：２．５の範囲内とするのが適当である。
【００３６】
本発明によって製造される粒状成形物は、一般に水とほぼ同じ１．０〜１．０３の範囲内の比重を有しているが、流動床型の大型リアクターや複雑な構造のリアクター中で流動させて使用する場合、下方に移動しやすく均一に流動させることが困難な場合がある。このような場合には粒状成形物の比重を低くする必要があり、粒状成形物の組成物中に無機質系微小中空ビーズを添加することによって粒状成形物の比重を低くすることができる。
【００３７】
粒状成型物の比重調整のために使用される無機質系微小中空ビーズとしては、好ましくは珪素を主成分とし、殊に珪酸塩又はアルミナシリカを主成分とし、粒子内に中空体構造を有する比重が０．３〜０．７の範囲内にある完全閉鎖型微小中空粒子を使用することができる。具体的には、例えば、中空ガラスビーズ、中空セライトなどを挙げることができる。
【００３８】
微小中空ビーズは、一般に１〜２００μｍ、好適には３〜５０μｍの範囲内の平均粒子径を有することができ、また、中空の大きさは、所望される比重によっても異なるが、通常、ビーズの直径の 1/2 以下、好ましくは 1/3 以下であることが有利である。
【００３９】
中空の直径が 1/2 より大きいものは、得られる固定化用粒状成形物中で破壊したりして圧縮強度が低下するおそれがある。
【００４０】
微小中空ビーズは、前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の各成分からなる水性液状組成物中の（ａ）成分１００重量部に対し０．１〜１０重量部の割合で添加することによって、得られる粒状成形物の比重が０．９０〜１．００の範囲内になるように調整することができる。
【００４１】
他方、粒状成形物の比重を大きくしたい場合には、ガラスビーズ、微細硫酸バリウム等の比重が１以上の無機質系粉粒体を（ａ）成分１００重量部に対して０．１〜３０重量部の割合で粒状成形物の組成物中に添加することによって、粒状組成物の比重が１〜１．２４の範囲内になるように比重調整することができる。
【００４２】
以上に述べた（ａ）〜（ｃ）の各成分及び必要に応じて添加される比重調整用の上記した添加剤は水性媒体中に溶解ないし分散させることにより、水性液状組成物が調製される。この液状組成物の固形分濃度は一般に５〜３０重量％の範囲内が適当である。なお、（ｃ）成分でレドックス系熱重合開始剤を使用する場合は酸化剤又は還元剤のいずれか一方を、必要に応じて、アルカリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中に、例えば０．０５〜５重量％、好ましくは０．１〜２重量％の範囲内の濃度で含有させるようにしてもよい。
【００４３】
このようにして調製される水性液状組成物は、次いで、前述した如き種類のアルカリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下するか、又は平均粒子径が５ｍｍ以上の粒状物を得る場合には、該水性媒体表面上に所定の時間連続的に注加して液滴を所望の粒径になるまで生長させた後、その液滴を沈降させることにより、該液状組成物が粒状でゲル化せしめられる。
【００４４】
アルカリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中への水性液状組成物の滴下は、例えば、注射器の先端から該液状組成物を滴下する方法、遠心力を利用して該液状組成物を粒状に飛散させる方法、スプレーノズルの先端から該液状組成物を霧化して粒状とし滴下する方法などの方法により行なうことができる。また、水性液状組成物の水性媒体表面への注加は、所望の孔径のノズル口から細い液流として連続的に供給することによって行うことができる。液滴の大きさは、最終の粒状固定化物に望まれる粒径に応じて自由に変えることができるが、通常、滴下法では、直径が約０．１〜約５ｍｍ、好ましくは約０．５〜約４ｍｍの範囲内の液滴として滴下させるのが、また注加法では、約０．５〜３ｃｍの範囲内の液滴とするのが好都合である。
【００４５】
上記の如くして生成せしめた粒状ゲルは、そのまま水性媒体中に分散させた状態で、或いは水性媒体から分離した後、光重合又は熱重合させることにより、該粒状ゲル中の親水性樹脂を硬化せしめる。これにより粒状ゲルは水に実質的に不溶性で機械的強度の大きい酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物を得ることができる。
【００４６】
上記の硬化を光重合によって行う場合、使用しうる活性光線の波長は、該粒状ゲル中に含まれる親水性樹脂の種類等に応じて異なるが、一般には、約２５０〜約６００ｎｍの範囲内の波長の光を発する光源を照射に使用するのが有利である。そのような光源の例としては、低圧水銀灯、高圧水銀灯、蛍光灯、キセノンランプ、カーボンアーク灯、太陽光等が挙げられる。照射時間は光源の光の強さ、光源からの距離等に応じて変える必要があるが、一般には約０．５〜約１０分間の範囲内とすることができる。
【００４７】
また、親水性樹脂の硬化を熱重合によって行う場合、粒状ゲルはレドックス系熱重合開始剤を含有しているので、室温で放置しておくだけでも熱重合が進行して必要な機械的強度が得られるまでに硬化されるが、必要に応じ、恒温雰囲気中で硬化させてもよい。恒温雰囲気の温度は一般に０℃〜５０℃、特に２０℃〜４０℃の範囲内が好適である。また、必要な機械的強度を得るためには、少なくとも熱硬化に１０分〜３０分の時間をかけることが望ましい。
【００４８】
なお、親水性樹脂の硬化は光重合と熱重合の併用によっても行うことができる。
【００４９】
このように光重合及び／又は熱重合による硬化処理が終った粒状ゲルは水又は緩衝水溶液で洗浄し、そのまゝあるいは凍結乾燥して保存することができる。
【００５０】
本発明によって製造される酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物は、表面の構造が特に酵素又は微生物の付着に適しており、酵素又は微生物を大量に付着させることができる。該担体に付着させうる微生物は、嫌気性微生物、好気性微生物のどちらでも用いることができ、微生物の種類としては、例えば、アスパルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属などのカビ類、サッカロミセス属、ファフィア属、カンジダ属などの酵母類；ザイモモナス属、シュードモナス属、ニトロソモナス属、ニトロバクター属、パラコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ属、バチルス属などの細菌類等を挙げることができる。
【００５１】
なお、酵素や微生物は、親水性樹脂の硬化温度が常温のような低温度であれば、予め（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の各成分からなる水性液状物に混合しておいて包括固定化してもよい。
【００５２】
かくして、本発明の固定化用粒状成形物の製造方法によれば、従来の親水性ウレタン樹脂を用いて製造した粒状成形物と同等の酵素又は微生物菌体への付着性を有し、且つ粒状成形物の強度が大巾に向上した粒状成形物を得ることができる。しかも、本発明の方法により提供される粒状成形物は、水中における流動性に優れているため、流動床型のバイオリアクターまたは攪拌型の発酵槽等に使用するのに最も適しているが、固定床型のバイオリアクター、発酵槽等に応用することも可能である。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、製造例、実施例および比較例において「部」および「％」は重量基準である。
親水性ウレタンの製造例
製造例１
４つ口フラスコにトルエン１５００部、デナコールＥＸ−８２１（ナガセ化成工業社製）１９５０部、ハイドロキノン０．１部及びテトラエチルアンモニウムブロマイド１部を入れて撹拌し、空気を吹き込みながらアクリル酸７２０部を１１０℃で１時間かけて滴下し、さらに８時間その温度を保持し反応させ、不飽和基含有ジオールの溶液を得た。さらに空気を吹き込みながらこの溶液にイソホロンジイソシアネート８８８部を添加して撹拌し、１００℃で８時間保持し反応させる。イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水５４００部を添加し、７０℃で反応槽内を真空ポンプで１時間減圧してトルエンを除去し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度２．８モル／ｋｇ；平均分子量３５６０）の約４０％水溶液（Ａ）を得た。
製造例２
４つ口フラスコにトルエン１６００部、デナコールＥＸ−８４１（ナガセ化成工業社製）２３００部、ハイドロキノン０．１部及びテトラエチルアンモニウムブロマイド１部を入れて撹拌し、空気を吹き込みながらアクリル酸４３２部を１１０℃で１時間かけて滴下し、さらに８時間その温度を保持し反応させ、不飽和基含有ジオールの溶液を得た。さらに空気を吹き込みながらこの溶液にイソホロンジイソシアネート８８８部を添加して撹拌し、１００℃で８時間反応させた。さらにアクリル酸２−ヒドロキシエチル２３２部を反応容器に入れ、空気を吹き込みながら８０℃で３時間反応させ、イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水５８００部を添加し、７０℃で反応槽内を真空ポンプで１時間減圧してトルエンを除去し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度２．１モル／ｋｇ；平均分子量３８５０）の約４０％水溶液（Ｂ）を得た。
製造例３
４つ口フラスコにトルエン１０００部、セロキサイド２０８１（ダイセル化学工業社製）４００部、ハイドロキノン０．１部及びテトラエチルアンモニウムブロマイド１部を入れて撹拌し、空気を吹き込みながらアクリル酸１４４部を１１０℃で１時間かけて滴下し、さらに８時間その温度を保持し反応させ、不飽和基含有ジオールの溶液を得た。さらに空気を吹き込みながらこの溶液にポリエチレングリコール（平均分子量約６００）１２００部及びイソホロンジイソシアネート４４４部を添加して撹拌し、１００℃で８時間反応させた。さらにイソシアン酸エチルメタクリレート３１０部を反応容器に入れ、空気を吹き込みながら８０℃で３時間反応させ、イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水３８００部を添加し、７０℃で反応槽内を真空ポンプで１時間減圧してトルエンを除去し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度１．６モル／ｋｇ；平均分子量２５００）の約４０％水溶液（Ｃ）を得た。
製造例４（比較用）
ポリエチレングリコール（平均分子量約２０００）２０００部およびイソホロンジイソシアネート４４４部を反応容器に入れ、８０℃で２時間反応させた。さらにアクリル酸２−ヒドロキシエチル２３２部およびハイドロキノン２部を反応容器に入れ、空気を吹き込みながら８０℃で３時間反応させ、イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水４０００部を添加し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度０．７５モル／ｋｇ；平均分子量約２６８０）の約４０％水溶液（Ｄ）を得た。
製造例５（比較用）
ポリエチレングリコール（平均分子量約６００）１２００部およびイソホロンジイソシアネート６６６部を反応容器に入れ、８０℃で２時間反応させた。さらにアクリル酸２−ヒドロキシエチル２３２部およびハイドロキノン２部を反応容器に入れ、空気を吹き込みながら８０℃で３時間反応させ、イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水３１００部を添加し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度０．９５モル／ｋｇ；平均分子量約２１００）の約４０％水溶液（Ｅ）を得た。
実施例１
製造例１のウレタン樹脂溶液（Ａ）１００部、ベンゾインイソブチルエーテル２部、蒸留水１００部および２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００部をよく混合し、得られる水性液状組成物を、５％塩化カルシウム水溶液中に注射器の先端から液面高さ約１０ｃｍより滴下したところ、粒径約２ｍｍの粒状物が得られた。この粒状物を平らなペトリ皿にとり、ペトリ皿の上面および下面から１ｋＷ高圧水銀灯で紫外光線を３０秒照射して粒状成形物を得た。
実施例２
実施例１で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例２のウレタン樹脂溶液（Ｂ）を使用する以外は実施例１と同様にして粒状成形物を得た。
実施例３
実施例１で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例３のウレタン樹脂溶液（Ｃ）を使用する以外は実施例１と同様にして粒状成形物を得た。
実施例４
製造例１のウレタン樹脂溶液（Ａ）１００部、ペルオキソ二硫酸アンモニウム１部、亜硫酸水素ナトリウム１部、蒸留水１００部および２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００部をよく混合し、得られる水性液状組成物を、５％塩化カルシウム水溶液中に注射器の先端から液面高さ約１０ｃｍより滴下したところ、粒径約２ｍｍの粒状物が得られた。この粒状物をそのまま３０℃で３０分放置して粒状成形物を得た。
実施例５
製造例１のウレタン樹脂溶液（Ａ）１００部、ベンゾインイソブチルエーテル２部、ペルオキソ二硫酸アンモニウム１部、亜硫酸水素ナトリウム１部、蒸留水１００部および２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００部をよく混合し、得られる水性液状組成物を、５％塩化カルシウム水溶液中に注射器の先端から液面高さ約１０ｃｍより滴下したところ、粒径約２ｍｍの粒状物が得られた。この粒状物をそのまま上面および下面から１ｋＷ高圧水銀灯で紫外光線を３０秒照射し、さらに３０℃で３０分放置して粒状成形物を得た。
比較例１
実施例１で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例４のウレタン樹脂溶液（Ｄ）を使用する以外は実施例１と同様にして粒状成形物を得た。
比較例２
実施例１で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例５のウレタン樹脂溶液（Ｅ）を使用する以外は実施例１と同様にして粒状成形物を得た。
比較例３
実施例４で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例４のウレタン樹脂溶液（Ｄ）を使用する以外は実施例４と同様にして粒状成形物を得た。
【００５４】
上記で得た実施例１〜５及び比較例１〜３の粒状成形物の圧縮強度、菌体付着性を表１に示す。菌体付着性の評価は次の様にして行った。
【００５５】
粒状成形物を５００ｍｌの三角フラスコに取り、ついでそれぞれにＧＹ−１０培地（酵母エキス１ｇ／Ｌ、グルコース１００ｇ／Ｌからなる）を１００ｍＬ加えた。それに２％の濃度でザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）ＩＦＯ１３７５６を加え、３０℃で２４時間静置賦活培養を行った。賦活後、それぞれ固定化用粒状形成物の表面を蒸留水で洗浄した後、賦活発酵液を新しい培地と交換し、２４時間静置培養を行い、エタノール濃度を測定した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【発明の効果】
本発明の酵素又は微生物固定化用粒状成形物の製造方法では、親水性ウレタン樹脂として不飽和基濃度の高いものを用いるので、得られる粒状成形物の圧縮強度は非常に大きく、しかも酵素又は微生物菌体の付着性に優れた粒状成形物を得ることができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素又は微生物の固定化法としては、従来から、包括法、物理的吸着法、共有結合法等多くの方法が知られている。これらの方法によって得られる塊状又はシート状の固定化物は、微生物反応や酵素反応に使用する場合には、細かく切断したり磨砕したりした後カラムに充填するのが普通である。しかしその場合、固定化物は面同志で密着することが多く、微生物反応や酵素反応の効率が悪くなり、また、屡々チャネリング現象を起こしてカラムを閉塞する等の欠点がある。
【０００３】
このため、最近では、酵素又は微生物菌体を粒状成形物として固定化することにより、流動しやすく、カラムへの充填作業が容易で、粒子同志の接触面積が少なくなり、それによって、微生物反応や酵素反応の効率をアップさせることが提案されている（例えば、特公昭６２−１９８３７号公報、特開平１０−２１０９６９号公報参照）。
【０００４】
一方、酵素又は微生物菌体を固定化するための材料として、従来から各種の親水性の光硬化性樹脂及び熱硬化性樹脂が使用されている。中でもポリウレタン樹脂は微生物菌体に対する付着性が良好で、十分な生物活性が得られることから好適なものとして実用化されているが、従来から用いられているポリウレタン樹脂は光重合もしくは熱重合反応性基が分子末端にしか存在しないため、高分子量化すると不飽和基濃度が低くなるため架橋点が少なくなり、その結果十分な強度を有する粒状成形物が得られないという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、酵素又は微生物菌体固定化用親水性樹脂として使用されるポリウレタン樹脂の機械的強度を向上させ、十分な強度を有する粒状成形物を製造する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記した目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、不飽和基濃度の高い特定の親水性ウレタン樹脂を用いることによって十分な強度をもつ粒状成形物が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
かくして、本発明に従えば、
（ａ）ジエポキシ化合物とエチレン性不飽和カルボン酸との付加物に、ポリイソシアネート化合物を反応させて得られる１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有する親水性ウレタン樹脂、
（ｂ） 重合開始剤、及び
（ｃ） アルカリ金属イオン又は多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力のある水溶性高分子多糖類
を含んでなる水性液状組成物を、アルカリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させるか又は該水性媒体の表面上に所定の時間、連続的に注加して液滴を所望の粒径になるまで生長させた後、その液滴を沈降させてゲル化させ、次いで得られる粒状ゲルを光重合及び／又は熱重合して該粒状ゲル中の親水性樹脂を硬化させることを特徴とする酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
（ａ）親水性ウレタン樹脂
本発明において酵素又は微生物菌体固定化用粒状担体の製造に用いられる１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有する親水性ウレタン樹脂（ａ）としては、ジエポキシ化合物とエチレン性不飽和カルボン酸を付加反応させて得られる不飽和基含有ジオール化合物にポリイソシアネート化合物を反応させて得られる、一般に、４００〜５００００、好ましくは５００〜２００００の範囲内の数平均分子量及び０．０４〜５モル／ｋｇ樹脂、好ましくは０．１〜４モル／ｋｇ樹脂の範囲内の不飽和基含量を有し、水性媒体中に均一に分散するに十分なイオン性又は非イオン性の親水性基、例えば水酸基、カルボキシル基、エーテル基、アミノ基等を含むものが挙げられる。
【０００９】
上記のジエポキシ化合物としては、例えば、ビスフェノールＡ、ビスフェノールＦ、ビスフェノールＳ等のビスフェノール化合物のジグリシジルエーテル化合物；ダイセル化学社製の脂環式ジエポキシ化合物である商品名セロキサイド２０２１、同２０８０及び３０００、一般式
【００１０】
【化１】
（ここでＲ1はアルキレン基等を示す）で表わされるエポリードＮＴ２１２、同ＮＴ２１４、同ＮＴ２２８及び同ＣＤＭ；ナガセ化成社製の一般式
【００１２】
【化２】
で表わされる商品名デナコールＥＸ−２０１、同２０３、同２１１、同２１２、同７０１、同７１１及び同７２１、一般式
【００１４】
【化３】
で表わされるデナコールＥＸ−８１０、同８１１、同８２１、同８３０、同８３２、同８４１、同８５０、同８５１及び同８６１、一般式
【００１６】
【化４】
で表わされるデナコールＥＸ−９１１、同９２０、同９２１、同９３１及び同９４１；等を挙げることができるが、これらのみに限定されるものではない。これらの化合物はそれぞれ単独でもしくは２種類以上混合して使用することができる。これらの中でも本発明において特に好適に用いられるものは、デナコールＥＸ−８３０、同８３２、同８４１及び同８６１である。
【００１８】
また、上記のエチレン性不飽和カルボン酸としては、例えば、（メタ）アクリル酸；東亜合成社製の商品名アロニックスＭ−５３００（ω−カルボキシ−ポリカプロラクトンモノアクリレート）、同５４００（フタル酸モノヒドロキシエチルアクリレート）及び同５６００（アクリル酸ダイマー）；大阪有機化学工業社製のビスコート＃２０００（フタル酸モノヒドロキシエチルアクリレート）、同＃２１００（フタル酸モノヒドロキシプロピルアクリレート）、同＃２１５０（ヘキサヒドロフタル酸モノヒドロキシプロピルアクリレート）及び同＃２１８０（テトラヒドロフタル酸モノヒドロキシプロピルアクリレート）；等を挙げることができるが、これらのみに限定されるものではない。これらの化合物はそれぞれ単独でもしくは２種類以上混合して使用することができる。これらの中でも、本発明において特に（メタ）アクリル酸が好適に用いられる。
【００１９】
ジエポキシ化合物と不飽和カルボン酸との付加反応によって得られる不飽和基含有ジオール化合物と反応させるポリイソシアネート化合物としては、例えば、メチレンジイソシアネート、エチレンジイソシアネート、プロピレンジイソシアネート、ブチレンジイソシアネート、オクタデシレンジイソシアネート、１，４−テトラメチレンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート、１，１０−デカメチレンジイソシアネート、トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート、ダイマー酸ジイソシアネート、リジンジイソシアネート等の脂肪族系ポリイソシアネート化合物類；キシリレンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、フェニレンジイソシアネート、４，４′−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタントリイソシアネート、３−フェニル−２−エチレンジイソシアネート、４−メトキシ−１，３−フェニレンジイソシアネート、２，４−ジイソシアネートジフェニルエーテル、４，４−ジイソシアネートジフェニルエーテル、２，４，６−トリレントリイソシアネート、２，４，４−トリイソシアネートジフェニルエーテル、ナフタレンジイソシアネート、１，４−アンスラセンジイソシアネート、クメン−２，４−ジイソシアネート等の芳香族系ポリイソシアネート化合物類；イソホロンジイソシアネート、４，４′−メチレンビス（シクロヘキシルイソシアネート）、メチルシクロヘキサン２，４−（又は２，６）−ジイソシアネート、４，４′−メチレンビス（シクロヘキシルイソシアネート）等の脂環族系ポリイソシアネート化合物類；等を挙げることができ、さらにこれらポリイソシアネート化合物の重合体（プレポリマー）も使用することができる。これらのポリイソシアネート化合物はそれぞれ単独でもしくは２種類以上混合して使用することができる。これらの中でも本発明において好適に用いられるものは、トリレンジイソシアネート、４，４′−ジフェニルメタンジイソシアネート及びイソホロンジイソシアネートである。
【００２０】
親水性ウレタン樹脂（ａ）を製造する際、必要に応じて、ポリオール化合物を使用して水酸基を導入したり、ポリエチレングリコール（分子量６０００以下）、ポリプロピレングリコール（分子量６０００以下）等の使用によってエーテル結合を導入してさらに親水性を向上させることができる。
【００２１】
ポリオール化合物としては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，３−ブタンジオール、１，１０−デカンジオール、ネオペンチルグリコール、１，６−ヘキサンジオール、シクロヘキサンジオール、２−ブテン１，４−ジオール、３−シクロヘキセン−１，１−ジメタノール、３−メチレン−１，５−ペンタンジオール、（２−ヒドロキシエトキシ）−１−プロパノオール、水素化ビスフェノールＡ、グリセリン、ポリカプロラクトン、１，２，６−ヘキサントリオール、トリメチロルプロパン、ペンタントリオール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、３−（２−ヒドロキシエトキシ）−１，２−プロパンジオール、ペンタエリトリット、ジペンタエリトリット、マニトール、グルコース等を挙げることができる。
【００２２】
さらに、親水性ウレタン樹脂（ａ）の分子鎖末端に、必要に応じて、不飽和基を導入して硬化性を向上させることができ、そのためにポリウレタン樹脂に水酸基とエチレン性不飽和基を有する化合物或いはイソシアネート基とエチレン性不飽和基を有する化合物を反応させることもできる。
【００２３】
該水酸基とエチレン性不飽和基を有する化合物としては、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、アリルアルコール、ブタンジオールモノ（メタ）アクリレート、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートとカルボキシル基含有化合物（例えば、アジピン酸、セバシン酸、アゼライン酸等）との付加物、（メタ）アクリル酸とエポキシ化合物との付加物等を挙げることができる。
【００２４】
また、イソシアネート基とエチレン性不飽和基を有する、化合物としては、例えば、イソシアン酸エチルメタアクリレート、ジイソシアネート（例えば、イソホロンジイソシアネート）とヒドロキシエチル（メタ）アクリレートとのモノアダクト等が挙げられる。
【００２５】
親水性ウレタン樹脂（ａ）の製造に際し、ジエポキシ化合物と不飽和カルボン酸の反応割合は、エポキシ基／カルボキシ基の当量比で一般に１／１．８〜２．２、好適には１／２〜２．１の範囲内とすることができる。ジエポキシ化合物と不飽和カルボン酸の反応は、例えば、トリエチルアミン等のアミン類、テトラブチルアンモニウムブロマイド等の第４級アンモニウム塩等を触媒として用いて、それ自体公知の方法によって行うことができる。
【００２６】
また、上記反応によって得られる不飽和基含有ジオール化合物とポリイソシアネート化合物との反応割合は、水酸基とイソシアネート基との当量比で一般に１／３〜３／１、好適には１／２〜２／１の範囲内とすることができる。不飽和基含有ジオール化合物とポリイソシアネート化合物との反応はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、これら両成分を該反応を阻害しない不活性な有機溶媒に溶解もしくは分散し、テトラブチルスズ、トリフェニルアルミニウムなどの反応触媒を用いて、約２０〜約２５０℃で約１０分間〜約２４時間反応させることによって行うことができる。
（ｂ） 重合開始剤
本発明において用いる重合開始剤としては、光重合開始剤又はレドックス系熱重合開始剤を挙げることができる。
【００２７】
光重合開始剤としては、エチレン性不飽和化合物の重合に有用なものとして従来から知られているものを特に制限なく使用することができる。具体的には、例えば、ベンゾイン、ベンゾインメチルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾインブチルエーテル、ジエトキシアセトフェノン、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパン−１−オン、ベンジルジメチルケタール、１−ヒドロキシシクロヘキシル−フェニルケトン、２−メチル−２−モルホリノ（４−チオメチルフェニル）プロパン−１−オン、２−ベンジル−２−ジメチルアミノ−１−（４−モルホリノフェニル）−ブタノン、２，４，６−トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンオキサイド、２，４，６−トリメチルベンゾイルフェニルエトキシホスフィンオキサイド、ベンゾフェノン、Ｏ−ベンゾイル安息香酸メチル、ヒドロキシベンゾフェノン、２−イソプロピルチオキサントン、２，４−ジメチルチオキサントン、２，４−ジエチルチオキサントン、２，４−ジクロロチオキサントン、２，４，６−トリス（トリクロロメチル）−Ｓ−トリアジン、２−メチル−４，６−ビス（トリクロロ）−Ｓ−トリアジン、２−（４−メトキシフェニル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−Ｓ−トリアジンなどが挙げられる。これらの光重合開始剤はそれぞれ単独でもしくは２種類以上を混合して使用することができる。
【００２８】
また、これらの光重合開始剤による光重合反応を促進させるために、光増感促進剤を光重合開始剤と併用してもよい。併用し得る光増感促進剤としては、例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、メチルジエタノールアミン、４−ジメチルアミノ安息香酸メチル、４−ジメチルアミノ安息香酸エチル、４−ジメチルアミノ安息香酸イソアミル、安息香酸（２−ジメチルアミノ）エチル、ミヒラーケトン、４，４′−ジエチルアミノベンゾフェノン等の３級アミン系；トリフェニルホスフィン等のアルキルホスフィン系；β−チオジグリコール等のチオエーテル系などが挙げられる。これらの光増感促進剤はそれぞれ単独でもしくは２種類以上を混合して使用することができる。
【００２９】
さらに、レドックス系熱重合開始剤としては、従来から既知のものを使用することができ、例えば、−１０℃〜５０℃程度の比較的低温でラジカル重合を行ない得る、酸化剤と還元剤の組み合わせからなる重合開始剤が好適に使用される。
【００３０】
酸化剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、メチルエチルケトンペルオキシド、ジクミルペルオキシド、ｔ−ブチルパーベンゾエート、クメンヒドロペルオキシドなどの有機過酸化物類；ペルオキソ二硫酸アンモニウム、ペルオキソ二硫酸カリウムなどのペルオキソ二硫酸塩類；過酸化水素等が挙げられる。また、還元剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸水素塩類；硫酸第一鉄、塩化第一鉄などの二価の鉄塩類；Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、フエニルモルホリンなどのアミン類；ナフテン酸コバルト、ナフテン酸マンガン、ナフテン酸銅などのナフテン酸金属塩類等を挙げることができる。
【００３１】
これらのレドックス系熱重合開始剤のうち、本発明において特に有利に使用しうるものは、酸化剤がペルオキソ二硫酸塩類又は過酸化水素からなり、還元剤が亜硫酸水素塩類又は二価の鉄塩からなる組み合わせのものである。
（ｃ） 水溶性高分子多糖類
本発明において使用する水溶性高分子多糖類は、水溶性であり、かつ水性媒体中でアルカリ金属イオン又は多価金属イオンと接触したときに水に不溶性又は難溶性のゲルに変化する能力のある高分子多糖類であって、一般に約３０００〜約２００００００の範囲内の数平均分子量を有し、また、アルカリ金属イオン又は多価金属イオンと接触させる前の水溶性の状態で、通常少なくとも約１０ｇ／ｌ（２５℃）の溶解度を示すものが好適に使用される。
【００３２】
かかる特性をもつ水溶性高分子多糖類の具体例には、アルギン酸のアルカリ金属塩、カラギーナン等が包含される。
【００３３】
これら水溶性高分子多糖類は、水性媒体中に溶解した状態で、カラギーナンの場合は、カリウムイオン、ナトリウムイオン等のアルカリ金属イオンと接触することによって、また、アルギン酸のアルカリ金属塩の場合は、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン等のアルカリ土類金属イオン；或いはアルミニウムイオン、セリウムイオン、ニッケルイオン等の他の多価金属イオンのうちの少なくとも１種の多価金属イオンと接触することによってゲル化しうるものである。ゲル化が起るアルカリ金属イオン又は多価金属イオンの濃度は水溶性高分子多糖類の種類等により異なるが、一般には０．０１〜５モル／ｌ、特に０．０１〜３モル／ｌの範囲内である。
【００３４】
上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の各成分の相互の使用割合は厳密に制限されるものではなく、各成分の種類等に応じて広範にわたって変えることができるが、一般には、（ａ）成分の親水性ウレタン樹脂１００重量部に対し、（ｂ）及び（ｃ）の各成分はそれぞれ下記の割合で使用するのが適当である（カッコ内は好適範囲である）。
【００３５】
（ｂ） 重合開始剤：０．１〜１０重量部（０．３〜５重量部）
（ｃ） 水溶性高分子多糖類：０．５〜１５重量部（１〜８重量部）
また、上記（ｂ）の重合開始剤のうち、レドックス系熱重合開始剤は酸化剤と還元剤とを組み合わせて使用されるが、両者の混合割合はモル比で一般に５：１〜１：５、好適には２．５：１〜１：２．５の範囲内とするのが適当である。
【００３６】
本発明によって製造される粒状成形物は、一般に水とほぼ同じ１．０〜１．０３の範囲内の比重を有しているが、流動床型の大型リアクターや複雑な構造のリアクター中で流動させて使用する場合、下方に移動しやすく均一に流動させることが困難な場合がある。このような場合には粒状成形物の比重を低くする必要があり、粒状成形物の組成物中に無機質系微小中空ビーズを添加することによって粒状成形物の比重を低くすることができる。
【００３７】
粒状成型物の比重調整のために使用される無機質系微小中空ビーズとしては、好ましくは珪素を主成分とし、殊に珪酸塩又はアルミナシリカを主成分とし、粒子内に中空体構造を有する比重が０．３〜０．７の範囲内にある完全閉鎖型微小中空粒子を使用することができる。具体的には、例えば、中空ガラスビーズ、中空セライトなどを挙げることができる。
【００３８】
微小中空ビーズは、一般に１〜２００μｍ、好適には３〜５０μｍの範囲内の平均粒子径を有することができ、また、中空の大きさは、所望される比重によっても異なるが、通常、ビーズの直径の 1/2 以下、好ましくは 1/3 以下であることが有利である。
【００３９】
中空の直径が 1/2 より大きいものは、得られる固定化用粒状成形物中で破壊したりして圧縮強度が低下するおそれがある。
【００４０】
微小中空ビーズは、前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の各成分からなる水性液状組成物中の（ａ）成分１００重量部に対し０．１〜１０重量部の割合で添加することによって、得られる粒状成形物の比重が０．９０〜１．００の範囲内になるように調整することができる。
【００４１】
他方、粒状成形物の比重を大きくしたい場合には、ガラスビーズ、微細硫酸バリウム等の比重が１以上の無機質系粉粒体を（ａ）成分１００重量部に対して０．１〜３０重量部の割合で粒状成形物の組成物中に添加することによって、粒状組成物の比重が１〜１．２４の範囲内になるように比重調整することができる。
【００４２】
以上に述べた（ａ）〜（ｃ）の各成分及び必要に応じて添加される比重調整用の上記した添加剤は水性媒体中に溶解ないし分散させることにより、水性液状組成物が調製される。この液状組成物の固形分濃度は一般に５〜３０重量％の範囲内が適当である。なお、（ｃ）成分でレドックス系熱重合開始剤を使用する場合は酸化剤又は還元剤のいずれか一方を、必要に応じて、アルカリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中に、例えば０．０５〜５重量％、好ましくは０．１〜２重量％の範囲内の濃度で含有させるようにしてもよい。
【００４３】
このようにして調製される水性液状組成物は、次いで、前述した如き種類のアルカリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下するか、又は平均粒子径が５ｍｍ以上の粒状物を得る場合には、該水性媒体表面上に所定の時間連続的に注加して液滴を所望の粒径になるまで生長させた後、その液滴を沈降させることにより、該液状組成物が粒状でゲル化せしめられる。
【００４４】
アルカリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中への水性液状組成物の滴下は、例えば、注射器の先端から該液状組成物を滴下する方法、遠心力を利用して該液状組成物を粒状に飛散させる方法、スプレーノズルの先端から該液状組成物を霧化して粒状とし滴下する方法などの方法により行なうことができる。また、水性液状組成物の水性媒体表面への注加は、所望の孔径のノズル口から細い液流として連続的に供給することによって行うことができる。液滴の大きさは、最終の粒状固定化物に望まれる粒径に応じて自由に変えることができるが、通常、滴下法では、直径が約０．１〜約５ｍｍ、好ましくは約０．５〜約４ｍｍの範囲内の液滴として滴下させるのが、また注加法では、約０．５〜３ｃｍの範囲内の液滴とするのが好都合である。
【００４５】
上記の如くして生成せしめた粒状ゲルは、そのまま水性媒体中に分散させた状態で、或いは水性媒体から分離した後、光重合又は熱重合させることにより、該粒状ゲル中の親水性樹脂を硬化せしめる。これにより粒状ゲルは水に実質的に不溶性で機械的強度の大きい酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物を得ることができる。
【００４６】
上記の硬化を光重合によって行う場合、使用しうる活性光線の波長は、該粒状ゲル中に含まれる親水性樹脂の種類等に応じて異なるが、一般には、約２５０〜約６００ｎｍの範囲内の波長の光を発する光源を照射に使用するのが有利である。そのような光源の例としては、低圧水銀灯、高圧水銀灯、蛍光灯、キセノンランプ、カーボンアーク灯、太陽光等が挙げられる。照射時間は光源の光の強さ、光源からの距離等に応じて変える必要があるが、一般には約０．５〜約１０分間の範囲内とすることができる。
【００４７】
また、親水性樹脂の硬化を熱重合によって行う場合、粒状ゲルはレドックス系熱重合開始剤を含有しているので、室温で放置しておくだけでも熱重合が進行して必要な機械的強度が得られるまでに硬化されるが、必要に応じ、恒温雰囲気中で硬化させてもよい。恒温雰囲気の温度は一般に０℃〜５０℃、特に２０℃〜４０℃の範囲内が好適である。また、必要な機械的強度を得るためには、少なくとも熱硬化に１０分〜３０分の時間をかけることが望ましい。
【００４８】
なお、親水性樹脂の硬化は光重合と熱重合の併用によっても行うことができる。
【００４９】
このように光重合及び／又は熱重合による硬化処理が終った粒状ゲルは水又は緩衝水溶液で洗浄し、そのまゝあるいは凍結乾燥して保存することができる。
【００５０】
本発明によって製造される酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物は、表面の構造が特に酵素又は微生物の付着に適しており、酵素又は微生物を大量に付着させることができる。該担体に付着させうる微生物は、嫌気性微生物、好気性微生物のどちらでも用いることができ、微生物の種類としては、例えば、アスパルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属などのカビ類、サッカロミセス属、ファフィア属、カンジダ属などの酵母類；ザイモモナス属、シュードモナス属、ニトロソモナス属、ニトロバクター属、パラコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ属、バチルス属などの細菌類等を挙げることができる。
【００５１】
なお、酵素や微生物は、親水性樹脂の硬化温度が常温のような低温度であれば、予め（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の各成分からなる水性液状物に混合しておいて包括固定化してもよい。
【００５２】
かくして、本発明の固定化用粒状成形物の製造方法によれば、従来の親水性ウレタン樹脂を用いて製造した粒状成形物と同等の酵素又は微生物菌体への付着性を有し、且つ粒状成形物の強度が大巾に向上した粒状成形物を得ることができる。しかも、本発明の方法により提供される粒状成形物は、水中における流動性に優れているため、流動床型のバイオリアクターまたは攪拌型の発酵槽等に使用するのに最も適しているが、固定床型のバイオリアクター、発酵槽等に応用することも可能である。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、製造例、実施例および比較例において「部」および「％」は重量基準である。
親水性ウレタンの製造例
製造例１
４つ口フラスコにトルエン１５００部、デナコールＥＸ−８２１（ナガセ化成工業社製）１９５０部、ハイドロキノン０．１部及びテトラエチルアンモニウムブロマイド１部を入れて撹拌し、空気を吹き込みながらアクリル酸７２０部を１１０℃で１時間かけて滴下し、さらに８時間その温度を保持し反応させ、不飽和基含有ジオールの溶液を得た。さらに空気を吹き込みながらこの溶液にイソホロンジイソシアネート８８８部を添加して撹拌し、１００℃で８時間保持し反応させる。イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水５４００部を添加し、７０℃で反応槽内を真空ポンプで１時間減圧してトルエンを除去し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度２．８モル／ｋｇ；平均分子量３５６０）の約４０％水溶液（Ａ）を得た。
製造例２
４つ口フラスコにトルエン１６００部、デナコールＥＸ−８４１（ナガセ化成工業社製）２３００部、ハイドロキノン０．１部及びテトラエチルアンモニウムブロマイド１部を入れて撹拌し、空気を吹き込みながらアクリル酸４３２部を１１０℃で１時間かけて滴下し、さらに８時間その温度を保持し反応させ、不飽和基含有ジオールの溶液を得た。さらに空気を吹き込みながらこの溶液にイソホロンジイソシアネート８８８部を添加して撹拌し、１００℃で８時間反応させた。さらにアクリル酸２−ヒドロキシエチル２３２部を反応容器に入れ、空気を吹き込みながら８０℃で３時間反応させ、イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水５８００部を添加し、７０℃で反応槽内を真空ポンプで１時間減圧してトルエンを除去し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度２．１モル／ｋｇ；平均分子量３８５０）の約４０％水溶液（Ｂ）を得た。
製造例３
４つ口フラスコにトルエン１０００部、セロキサイド２０８１（ダイセル化学工業社製）４００部、ハイドロキノン０．１部及びテトラエチルアンモニウムブロマイド１部を入れて撹拌し、空気を吹き込みながらアクリル酸１４４部を１１０℃で１時間かけて滴下し、さらに８時間その温度を保持し反応させ、不飽和基含有ジオールの溶液を得た。さらに空気を吹き込みながらこの溶液にポリエチレングリコール（平均分子量約６００）１２００部及びイソホロンジイソシアネート４４４部を添加して撹拌し、１００℃で８時間反応させた。さらにイソシアン酸エチルメタクリレート３１０部を反応容器に入れ、空気を吹き込みながら８０℃で３時間反応させ、イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水３８００部を添加し、７０℃で反応槽内を真空ポンプで１時間減圧してトルエンを除去し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度１．６モル／ｋｇ；平均分子量２５００）の約４０％水溶液（Ｃ）を得た。
製造例４（比較用）
ポリエチレングリコール（平均分子量約２０００）２０００部およびイソホロンジイソシアネート４４４部を反応容器に入れ、８０℃で２時間反応させた。さらにアクリル酸２−ヒドロキシエチル２３２部およびハイドロキノン２部を反応容器に入れ、空気を吹き込みながら８０℃で３時間反応させ、イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水４０００部を添加し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度０．７５モル／ｋｇ；平均分子量約２６８０）の約４０％水溶液（Ｄ）を得た。
製造例５（比較用）
ポリエチレングリコール（平均分子量約６００）１２００部およびイソホロンジイソシアネート６６６部を反応容器に入れ、８０℃で２時間反応させた。さらにアクリル酸２−ヒドロキシエチル２３２部およびハイドロキノン２部を反応容器に入れ、空気を吹き込みながら８０℃で３時間反応させ、イソシアネート基の残存がほとんど認められなくなったのを確認した後、脱イオン水３１００部を添加し、エチレン性不飽和基含有親水性ウレタン樹脂（不飽和度０．９５モル／ｋｇ；平均分子量約２１００）の約４０％水溶液（Ｅ）を得た。
実施例１
製造例１のウレタン樹脂溶液（Ａ）１００部、ベンゾインイソブチルエーテル２部、蒸留水１００部および２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００部をよく混合し、得られる水性液状組成物を、５％塩化カルシウム水溶液中に注射器の先端から液面高さ約１０ｃｍより滴下したところ、粒径約２ｍｍの粒状物が得られた。この粒状物を平らなペトリ皿にとり、ペトリ皿の上面および下面から１ｋＷ高圧水銀灯で紫外光線を３０秒照射して粒状成形物を得た。
実施例２
実施例１で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例２のウレタン樹脂溶液（Ｂ）を使用する以外は実施例１と同様にして粒状成形物を得た。
実施例３
実施例１で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例３のウレタン樹脂溶液（Ｃ）を使用する以外は実施例１と同様にして粒状成形物を得た。
実施例４
製造例１のウレタン樹脂溶液（Ａ）１００部、ペルオキソ二硫酸アンモニウム１部、亜硫酸水素ナトリウム１部、蒸留水１００部および２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００部をよく混合し、得られる水性液状組成物を、５％塩化カルシウム水溶液中に注射器の先端から液面高さ約１０ｃｍより滴下したところ、粒径約２ｍｍの粒状物が得られた。この粒状物をそのまま３０℃で３０分放置して粒状成形物を得た。
実施例５
製造例１のウレタン樹脂溶液（Ａ）１００部、ベンゾインイソブチルエーテル２部、ペルオキソ二硫酸アンモニウム１部、亜硫酸水素ナトリウム１部、蒸留水１００部および２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００部をよく混合し、得られる水性液状組成物を、５％塩化カルシウム水溶液中に注射器の先端から液面高さ約１０ｃｍより滴下したところ、粒径約２ｍｍの粒状物が得られた。この粒状物をそのまま上面および下面から１ｋＷ高圧水銀灯で紫外光線を３０秒照射し、さらに３０℃で３０分放置して粒状成形物を得た。
比較例１
実施例１で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例４のウレタン樹脂溶液（Ｄ）を使用する以外は実施例１と同様にして粒状成形物を得た。
比較例２
実施例１で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例５のウレタン樹脂溶液（Ｅ）を使用する以外は実施例１と同様にして粒状成形物を得た。
比較例３
実施例４で用いたウレタン樹脂溶液（Ａ）の代わりに製造例４のウレタン樹脂溶液（Ｄ）を使用する以外は実施例４と同様にして粒状成形物を得た。
【００５４】
上記で得た実施例１〜５及び比較例１〜３の粒状成形物の圧縮強度、菌体付着性を表１に示す。菌体付着性の評価は次の様にして行った。
【００５５】
粒状成形物を５００ｍｌの三角フラスコに取り、ついでそれぞれにＧＹ−１０培地（酵母エキス１ｇ／Ｌ、グルコース１００ｇ／Ｌからなる）を１００ｍＬ加えた。それに２％の濃度でザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）ＩＦＯ１３７５６を加え、３０℃で２４時間静置賦活培養を行った。賦活後、それぞれ固定化用粒状形成物の表面を蒸留水で洗浄した後、賦活発酵液を新しい培地と交換し、２４時間静置培養を行い、エタノール濃度を測定した。
【００５６】
【表１】
【発明の効果】
本発明の酵素又は微生物固定化用粒状成形物の製造方法では、親水性ウレタン樹脂として不飽和基濃度の高いものを用いるので、得られる粒状成形物の圧縮強度は非常に大きく、しかも酵素又は微生物菌体の付着性に優れた粒状成形物を得ることができる。
Claims (3)
- （ａ）ジエポキシ化合物とエチレン性不飽和カルボン酸との付加物に、ポリイソシアネート化合物を反応させて得られる１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有する親水性ウレタン樹脂、
（ｂ） 重合開始剤、及び
（ｃ） アルカリ金属イオン又は多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力のある水溶性高分子多糖類
を含んでなる水性液状組成物を、アルカリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させるか又は該水性媒体の表面上に所定の時間連続的に注加して液滴を所望の粒径になるまで生長させた後、その液滴を沈降させてゲル化させ、次いで得られる粒状ゲルを光重合及び／又は熱重合して該粒状ゲル中の親水性樹脂を硬化させることを特徴とする酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法。 - 親水性ウレタン樹脂（ａ）の数平均分子量が４００〜５００００であり且つ不飽和基含量が０．０４〜５モル／ｋｇ樹脂である請求項１記載の方法。
- 重合開始剤（ｂ）が光重合開始剤又はレドックス系熱重合開始剤である請求項１又は２記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000070372A JP4299945B2 (ja) | 2000-03-14 | 2000-03-14 | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000070372A JP4299945B2 (ja) | 2000-03-14 | 2000-03-14 | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001252073A JP2001252073A (ja) | 2001-09-18 |
| JP4299945B2 true JP4299945B2 (ja) | 2009-07-22 |
Family
ID=18589112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000070372A Expired - Fee Related JP4299945B2 (ja) | 2000-03-14 | 2000-03-14 | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4299945B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4430254B2 (ja) | 2001-01-31 | 2010-03-10 | 関西ペイント株式会社 | 微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 |
| KR100516824B1 (ko) * | 2002-06-12 | 2005-09-26 | 학교법인 경희대학교 | 불포화지방산을 이용한 생체분자 고정용 고체 지지체의 제조방법, 이에 의해 제조된 고체 지지체, 및 이를 이용한 효소 고정화 방법 |
-
2000
- 2000-03-14 JP JP2000070372A patent/JP4299945B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001252073A (ja) | 2001-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6855746B2 (en) | Process for the production of molded particles for enzyme- or microbial cell-immobilization | |
| US20070225387A1 (en) | Polymer Compositions for Dual or Multi Staged Curing | |
| CN110964477A (zh) | 一种热塑性聚氨酯薄膜或薄片紫外光固化胶及其制备方法 | |
| US5011560A (en) | Method of adhesion and composition therefor | |
| JP4299945B2 (ja) | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 | |
| JP5493123B2 (ja) | 微生物固定化用担体 | |
| KR100762159B1 (ko) | 미생물 고정화 담체 혼합물 및 이를 이용한 바이오리액터 | |
| JP4343562B2 (ja) | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状担体 | |
| JP4430254B2 (ja) | 微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 | |
| JP4526143B2 (ja) | 微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 | |
| WO2022004416A1 (ja) | 光湿気硬化型樹脂組成物、及び硬化体 | |
| JPH03199217A (ja) | 液状硬化性樹脂組成物 | |
| JP3775706B2 (ja) | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 | |
| JP7191454B2 (ja) | 酵素又は微生物固定化用担体 | |
| JP2010035487A (ja) | 酵素又は微生物菌体固定化成形物の製造方法 | |
| JP4384338B2 (ja) | 酵素又は微生物固定化担体組成物 | |
| JP2003061653A (ja) | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 | |
| JP5400010B2 (ja) | 酵素又は微生物固定化用担体 | |
| JP5385212B2 (ja) | 酵素又は微生物固定化用担体 | |
| JPS60234582A (ja) | 生物学的材料の固定化方法 | |
| JPH10152511A (ja) | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の比重調整方法 | |
| JPH03199227A (ja) | 硬化性樹脂の製造方法 | |
| JPH10191973A (ja) | 酵素又は微生物菌体固定化用大粒径担体の製造方法 | |
| JP2001190274A (ja) | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の製造方法 | |
| JPH10168105A (ja) | 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の比重調整方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070301 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20070709 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20080126 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090414 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090420 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120424 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120424 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120424 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130424 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130424 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140424 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |