KR100516824B1

KR100516824B1 - 불포화지방산을 이용한 생체분자 고정용 고체 지지체의 제조방법, 이에 의해 제조된 고체 지지체, 및 이를 이용한 효소 고정화 방법

Info

Publication number: KR100516824B1
Application number: KR10-2002-0032939A
Authority: KR
Inventors: 임진익; 배분남; 김수자
Original assignee: 학교법인 경희대학교
Priority date: 2002-06-12
Filing date: 2002-06-12
Publication date: 2005-09-26
Also published as: KR20030095645A

Abstract

본 발명은 이중결합을 포함하고 알킬 사슬의 말단에 카르복시기를 가지는 불포화 지방산과 아크릴아미드의 수용성 모노머를 첨가중합반응 시켜, 이들 성분 내에 존재하는 이중결합들이 반응하여 공중합 고분자 물질의 골격사슬이 되며, 작용기인 카르복시기를 가지는 불포화지방산의 알킬사슬이 스페이서 암(spacer arm)이 되는 고체 지지체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 지지체에 관한 것이며, 또한 이러한 고체 지지체를 이용하여 효소의 활성을 유지하면서 효소를 고정화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

불포화지방산을 이용한 생체분자 고정용 고체 지지체의 제조방법, 이에 의해 제조된 고체 지지체, 및 이를 이용한 효소 고정화 방법{METHOD FOR THE PREPARATION OF SOLID SUPPORT FOR IMMOBILIZATION OF BIOMOLECULES BY USING UNSATURATED FATTY ACID, SOLID SUPPORT PREPARED BY THE SAME, AND PROCESS FOR IMMOBILIZATION OF ENZYME BY USING THE SUPPORT}

본 발명은 고체 지지체의 제조방법, 이에 의해 제조되는 고체 지지체, 및 이를 이용한 효소 고정화 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 불포화 지방산을 이용하여 생체분자를 보다 효과적으로 고정화시키는데 사용되는 고체 지지체를 제조하는 방법 및 이러한 제조방법에 의해 제조된 지지체와, 이 지지체를 이용하여 효소의 활성을 유지하면서 효소를 고정화시키는 방법에 관한 것이다.

효소나 보조효소(coenzyme), 세포, 또는 미생물 등을 고정화시키는 기술은 오래 전부터 개발되어온 기술로, 응용생물산업 분야에서 연구 및 산업화에 매우 중요한 역할을 하여왔다. 특히, 비수용성 고체 지지체에 결합된 상태의 생체분자들은 활용범위가 넓어 그 중요성이 증가되어 왔다. 즉, 고정화된 효소나 고정화된 기타 생체분자들은 다양한 생체물질들을 분리정제 하는데 유용하고, 효소 저해제 등을 탐색하는데 있어서도 가장 바람직하며, 또한 산업적으로 의약품과 다른 유용물질의 합성 및 독성공해물질의 여과제로 사용되고, 인공장기의 원료로도 사용되는 등 널리 사용되어왔다. 더욱이, 생명공학의 혁명이라 일컬을 정도로 관심의 대상이 되었던 인간 유전체 해독이 완료된 이후 최근 들어 단백질의 기능 및 그 생리활성 규명과 효소의 산업적 응용에 대한 연구가 보다 활발히 이루어지고 있으며, 그로인해단백질, 효소 등과 같은 생체분자 고정화 기술 역시 보다 더 각광받기 시작하고 있다.

이러한 생체분자 고정화 기술은 지난 30여 년 간 당해 기술 분야의 많은 과학자 및 발명가들의 연구결과 다양한 생체분자 내지 생체물질의 고정화 기술이 개발되어 사용되고 있다. 전통적인 고정화 기술로는 담체라고 부르는 고체에 효소 등을 결합시키는 방법과 생체분자의 주변을 고분자 물질로 코팅하는 방법이 있으며, 특히 고체 지지체에 효소나 펩티드 등과 같은 생리활성 물질을 고정시켜 산업적 응용에 이용하려는 연구가 오래 전부터 진행되어 왔다. 그 결과 최근들어 몇가지 고정화 방법이 개발되었는데, 그 중 하나는 다당류 수지의 표면을 브롬화시아노겐(CNBr)으로 활성화시키고, 여기에 작용기를 가진 스페이서 암(spacer arm)을 결합시킨 후, 아민기를 가지는 리간드를 결합시키는 방법이며, 다른 하나는 도 1에 설명된 바와같이, 금 평판의 표면에 흡착된 티올기(-SH)를 가지는 탄소사슬 끝의 카르복시기를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 메티오디드(1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide methiodide)(EDAC)를 이용하여 활성화시킨 후, 활성화된 카르복시기와 효소의 아민기를 결합시키는 방법이며 [참조: Oriented Immobilization of Taq Polymerase for Development of Solide-State Device, 임금정, 2001, 경희대학교 화학과 석사논문], 또 다른 하나는 도2에 나타낸 바와같이, 아가로스 겔에 생체분자를 결합시키는 방법 [참조: 생체에너지 및 보효소재생산 시스템의 개발, 전문진, 김수자, 1991, 과학재단] 등이 있다. 그러나, 이러한 고정화 기술은 그 공정이 복잡하고 비용이 많이 드는 문제점이 있을 뿐만 아니라 고정화된 생체분자의 활성 저하 등으로 인하여 효율이 저하되는 등의 문제점을 안고 있다.

또한, 최근에는 도3에 설명된 바와같이, 아미노 알킬실란(amino alkylsilane) 또는 N-이소프로필아크릴아미드(N-isopropylacrylamide) 와 N-아크릴옥시숙신이미드(N-acryloxy succinimide) 공중합체 등을 이용하여 효소를 고정하는 방법 [참조: Immobilized Biomolecules in Analysis, T. Cass and F. S. Ligler, 1998, PAS, pp144]이 알려졌으며 몇 가지는 실용화되어 있는 실정이다. 그러나, 이러한 고정화 기술 역시 공정절차의 복잡함과 또한 효소의 안정성 문제가 제기되어 왔다.

한편, 생체분자를 고정화시키는 기술 분야에 있어서 해결되어야 하는 주된 기술적 과제는 작은 면적에 고밀도의 생체분자들을 결합시키고, 결합된 생체분자들의 생리활성 기능이 최대한 보존되어야 한다는 것이다. 또한, 생산비용의 절감을 통해 누구나 손쉽고 간단하게 고정화 기술을 실현시킬 수 있어야 함은 생리활성물질에 대한 연구 내지 개발을 보다 효과적으로 수행하기 위해서는 당연한 과제인 것이다. 그러나, 종래의 고정화 기술에 의해서는 위와같은 기술적 당면 과제들이 해결되지 못하고 있다는 문제점이 있다. 특히, 3차원의 복잡한 구조를 가지고 있는 효소 및 기타 다른 단백질들은 그 이외의 생체분자들과 비교해서 온도, 압력, pH, 농도 등 외부의 물리, 화학적 조건에 매우 민감한 거대분자들이다. 따라서, 작은 면적에 고밀도의 효소를 결합시킬 경우 효소로서 제 기능을 발휘하지 못하게 되는 경우가 많으며, 고체 지지체와 효소 사이를 가교결합 시켜야 하는데서 발생하는 고비용과 까다롭고 복잡한 반응 절차를 큰 문제점으로 갖고 있으며, 또한 복잡한 반응 절차는 온도, pH 및 유기용매 등의 물리, 화학적 조건 하에서 많은 생리활성물질들의 기능상실을 초래할 위험성마저 존재한다. 이러한 문제점들은 근본적으로 효소와 같은 거대분자의 특수한 구조와 이에 따른 반응성 및 결합자리의 특이성에 기인한 것이라 할 수 있다.

이상과 같이, 종래의 고정화 기술은 고정화 공정 절차가 복잡하며, 그로인해 비용이 많이 드는 등의 경제적인 부담이 크다는 문제점과 고정화되는 생체분자의 안정성 내지 생리활성의 저하를 초래하는 문제점을 안고 있다.

이에, 본 발명자들은 상술한 바와같은 종래 고정화 기술의 문제점들을 해결하고자 광범위한 연구를 진행하였으며, 그 결과 보다 온화한 조건에서 효소와 같은 생리활성물질들을 그 활성을 효과적으로 유지시키면서 성공적으로 고정시키기 위해서는 단순화된 공정으로 인한 짧은 반응시간과 낮은 온도에서의 높은 반응성 유지, 그리고 유기용매를 사용하지 않는 방법뿐이라는 점을 인식하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 효소와 같은 생체분자의 활성자리를 보호하고 저렴한 비용으로 생체분자를 안전하게 고체 지지체에 고정시키기 위해서는 다음과 같은 조건들이 충족되어야 한다.

첫째, 생체분자 고정화 기술 사용시 될 수 있는 한 유기용매의 사용을 피해야 한다. 효소나 기타 생리 활성물질들의 대부분은 체내의 수분과 접촉하고 있으며 이 상태에서 활성을 가지므로 최대한 체내에서와 유사한 조건을 만들어 주어야 생리활성이 보존될 것이다.

둘째, 고정화 전체 공정에서 온도는 약 4℃가 유지되는 조건에서 실시되는 것이 바람직하다. 대부분의 생체분자들은 온도에 민감하기 때문에 저온의 환경에서도 반응들이 이루어질 수 있어야 한다.

셋째, 고체 지지체와 생리활성물질 사이의 스페이서 암(spacer arm) 물질의 가격이 저렴하며, 공정은 단순화되어야 한다. 또한, 효소에 의한 전처리가 필요없이 바로 고체 지지체나 스페이서 암의 작용기와 반응이 일어나야 하며 반응시간이 지연되어서는 안된다.

이러한 조건들이 충족되는 고정화 기술이 비로소 종래의 고정화 기술에 따른 다양한 문제점들을 해결할 수 있으며, 본 발명자들은 이러한 새로운 기술을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 위와같은 새로운 발견에 기초한 본 발명의 첫 번째 목적은, 상기와 같은 조건들을 충족시켜 생체분자를 보다 효과적으로 고정화시키는 것을 가능케하는데 사용될 수 있는 고체 지지체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은, 상기와 같은 제조방법에 의해서 새로이 제조되는 고체 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은, 상기와 같이 제조된 고체 지지체를 이용하여 고정화 효소의 활성을 유지하면서 효소를 고정화시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적들을 위해, 본 발명은 불포화 지방산 과 이중결합을 포함하는 모노머를 이용하여 고체 지지체를 제조하고, 또한 이렇게 제조된 지지체의 작용기인 카르복시기 작용기에 기질에 의해 활성자리가 보호된 효소를 아미드 결합시킴으로서 고정화 효소의 활성을 유지하면서 효소를 고정화시키는 것을 기술적 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

도 1은 금 표면에 효소를 고정화시키는 방법을 나타낸 것이고, 도 2는 아가로스 겔에 NAD+를 고정화시키는 방법을 나타낸 것이고, 도 3은 N-이소프로필아크릴아미드 및 N-아크릴옥시숙신이미드 공중합체를 이용하여 효소를 고정화시키는 방법을 나타낸 것이며, 도 4a 및 도 4b는 실시예 1의 구현예로, 폴리아크릴아미드 및 올레산 공중합체 지지체를 이용하여 효소를 고정화시키는 방법 및 이에 따라 고정화된 효소를 나타낸 것이다. 한편, 도 5는 고정화된 키모트립신의 날짜별 활성 측정을 나타낸 그래프이고, 도 6 및 도 7은 고정화되어있지 않은 키모트립신과 고정화된 키모트립신의 안정성을 단백질변성시약인 요소를 이용하여 측정 비교한 결과로서, 도 6은 요소 농도별 효소의 활성비교 그래프이고, 도 7은 5M 요소 용액에서 효소의 활성비교 그래프이다.

본 발명의 고체 지지체는 생체분자를 보다 효과적으로 고정화시키는데 사용될 수 있도록 고안된 것으로서, 이중결합을 포함하고 알킬 사슬의 말단에 작용기인 카르복시기를 가지는 불포화 지방산과 이중결합을 가지는 모노머를 첨가중합반응 시키는 과정으로 구성되며, 이때 불포화 지방산 및 모노머 성분 내에 존재하는 이중결합들이 반응을 하여 공중합 고분자 물질의 골격사슬이되며, 작용기인 카르복시기를 가지는 불포화지방산의 알킬사슬이 스페이서 암(spacer arm)을 형성한다.

여기서, 본 발명에 사용될 수 있는 불포화 지방산은 이중결합 및 카르복시기를 가지는 임의의 불포화 지방산일 수 있다. 이러한 불포화 지방산의 예로는, 팔미톨레산(palmitoleic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 리놀렌산(linolenic acid)인 이중결합이 1개에서 4개사이로 구성된 불포화지방산이다. 또한, 본 발명에 사용될 수 있는 모노머는 이중결합을 가지는 임의의 모노머일 수 있으며, 그 예로는, 아크릴아미드와 같이 수용성 모노머를 의미 한다. 종래의 전형적인 고정화 기술에 따른 고체 지지체를 제조하는 공정은, 천연 또는 합성 고분자 물질을 활성화시킨 후, 여기에 다시 작용기를 가진 가교성분인 스페이서 암을 결합시키는 복잡한 과정을 거치는 데 비하여, 본 발명에 의한 고체 지지체의 제조공정은 이중결합 및 작용기인 카르복시기를 가지는 불포화지방산을 사용하여 이 불포화지방산과 이중결합을 가지는 모노머 사이의 한 단계 반응으로 손쉽게 스페이서 암이 결합된 고체 지지체를 합성할 수 있어 공정을 단순화시키고, 비용을 대폭 감소시킬 수 있게 한다.

한편, 이렇게 제조된 고체 지지체는 고체 지지체에 결합된 불포화지방산의 알킬사슬 말단에 작용기인 카르복시기를 가지고 있는 관계로, 본 발명에서는 이를 이용하여 효소 및 누클레오티드와 기타 단백질과 같은 다양한 생체분자를 보다 효과적으로 고정화시키는 방법을 달성하고 있으며, 특히 고정화되는 효소의 활성을 유지시키면서, 효소를 고정화시키는 방법을 달성하고 있다.

본 발명의 고체 지지체를 이용하여 효소를 고정화시키는 방법은, 우선 고체 지지체에 결합된 불포화 지방산의 알킬 사슬 말단의 카르복시기를 수용성 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 메티오디드(EDAC)로 처리하여 활성화시킨다. 이리하여 생성된 N-아실리소우레아(N-acylisourea)는 고정화될 효소와의 짝지움 반응에서 친전자체로 반응하며, 효소의 α-아미노기와 라이신(Lys)의 ε-NH₂기는 친핵체로 작용하여 축합반응이 일어나 아미드 결합을 이룬다. 한편, 고정화되는 효소의 활성을 유지시키기 위해서 효소의 활성자리를 기질(substrate)과 미리 반응시켜 보호한다. 경우에 따라서는 고정화시키고자 하는 효소를 기질과 먼저 반응시켜 효소활성자리를 보호한 후, EDAC로 카르복시기를 활성화시킨 불포화 지방산을 가하여 효소와 지방산을 반응시키고, 여기에 이중결합을 가지는 모노머를 가하여 공중합 고분자 형태를 이루게 하여, 효소의 고정화를 완성할 수 있다

즉, 본 발명에 따른 효소의 고정화 과정을 정리하여 살펴보면 다음과 같다.

첫째, 불포화 지방산과 모노머들의 첨가중합반응으로 형성된 고체 지지체에 결합된 불포화지방산들의 알킬 사슬 말단의 카르복시기 그룹을 활성화시키는 단계.

둘째, 고정화되는 효소를 기질과 반응시켜 효소의 활성자리를 보호하는 단계.

셋째, 기 반응시킨 효소와 기질 용액과 불포화 지방산의 카르복시기 사이에 아미드 결합을 이루는 단계.

넷째, 효소에 결합되어있는 기질물질을 세척 제거하는 단계.

이하에서는 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명한다.

다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 기재된 것일 뿐, 이에 의해서 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 아크릴아미드 및 올레산을 이용한 고체 지지체 제조 및 키모트립신 고정화 방법

아크릴아미드 (acrylamide) 29.2g 과 가교제로서 N,N-메틸렌-비스-아크릴아미드 (N,N-methylene-bis-acrylamide) 0.8g 을 100㎖ 의 증류수에 녹인후 A 용액으로 사용하였다. 먼저 A 용액 0.5㎖ 을 증류수 1㎖ 과 함꼐 섞고, 올레산을 0.1M 가 되도록 가한 후 5분간 교반시켰다. 라디칼 반응 개시제인 10% 과황산암모늄 (ammonium persulfate) 를 30㎕ 가하고, 촉진제인 N,N,N,N-테트라메틸에틸렌디아민(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine) (TEMED) 를 3㎕ 가하였다. 증류수를 가하여 최종부피를 3㎖ 이 되도록 하였다. 일정크기의 주형에 넣은 후 10분 정도 방치하면 폴리아크릴아미드에 불포화지방산이 결합된 공중합 고분자가 제조된다. 이 고분자를 70% 의 에탄올 용액으로 12시간 세척한 후, 증류수로 다시 3시간 동안 세척하여 에탄올을 제거하고, 10㎖ 의 0.1M EDAC 수용액을 가하여 1시간 동안 진탕시켜 카르복시기를 활성화시켜준다. 0.1N 의 수산화나트륨 (NaOH) 수용액을 가하여 pH 7.6이 되도록 조정한 증류수 10㎖ 에 0.2M 키모트립신과 0.3M 의 기질 N-벤조일-L-티로신 에틸 에스테르 (N-benzoyl-L-tyrosine ethyl ester) 의 반응 용액에 카르복시기가 활성화된 겔을 1시간 동안 진탕시켜 효소를 고정화시켜준 후, 0.05M Tris-HCl 완충용액 (pH 7.6)으로 1시간 세척한 후 사용한다.

고정된 효소의 활성을 확인하기 위하여 고분자의 일부를 떼어내어 키모트립 신의 기질인 N-숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐리드 (N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide) 용액 속에 넣고 키모트립신에 의해 분해되어 나오는 p-니트로아닐린 (p-nitroaniline) 의 존재를 390nm 의 흡광도의 증가로 확인 할 수 있었다. 도 5는 390nm 흡광도의 증가를 날짜별 (1일, 5일, 10일, 15일, 30일, 60일, 90일, 120일, 150일)로 연속 측정한 결과이다. 5개월이 지난 후에도 고정화되어 있는 효소는 안정하였다. 반면 고정화시키지 않은 키모트립신은 5일만에 활성이 사라졌음을 확인하였다.

다음은 고정화되어있지 않은 키모트립신과 고정화된 키모트립신의 안정성을 단백질변성시약인 요소를 이용하여 측정 비교한 결과이다.

6M의 요소 용액에서 고정화된 효소는 1시간 후 50%의 활성이 남아있는 것에 비해 고정화되어 있지 않은 효소의 경우 남아있는 효소의 활성은 3%가 안되었다(도 6). 또한 5M의 요소 용액에서 고정화된 효소의 경우 180분까지 80%이상의 효율을 보인 반면 고정화되지 않은 효소의 경우 시간대별 큰 폭으로 감소하여 60분 후에 남아있는 효소의 활성은 17%에 불과하였다(도 7). 기존에 발표된바와 같이 고정화된 효소는 고정되지 않은 효소보다 안정성이 높아진다는 연구결과를 얻을 수 있었다.

Cass and F. S. Ligler [Immobilized Biomolecules in Analysis, T. , 1998, PAS, pp144]방법에 의해 고정화된 키모트립신의 활성도 및 생산비용과 제조시 소요시간을 직접 실험을 통하여 비교해 보았다. 표 1은 'Cass and F. S. Ligler'의 방법과 불포화지방산을 이용한 방법을 비교한 표이다.

구분비교 내용	기존방법	불포화지방산을 이용한 고정화방법
제조시 소요시간	34시간	18시간
제조비용면	고가의 수입시약들이 필요	대부분 국산 시약들로 제조 가능
1개월후 효소활성도 보존율	72 ±7%	90 ±10%

위의 결과에서 기존방법에 비하여 공정의 간소화와 그에 따른 비용절감 및 효율의 증대를 확인 할 수 있었다.

실시예 2 : 불포화 지방산을 이용한 누클레오티드 계열인 NAD+의 고정화 방법

아크릴아미드 (acrylamide) 29.2g 과 가교제로서 N,N-메틸렌-비스-아크릴아미드 (N,N-methylene-bis-acrylamide) 0.8g 을 100㎖ 의 증류수에 녹인후 A 용액으로 사용하였다. 먼저 A 용액 0.5㎖ 을 증류수 1㎖ 과 함꼐 섞고, 올레산을 0.1M 가 되도록 가한 후 5분간 교반시켰다. 라디칼 반응 개시제인 10% 과황산암모늄 (ammonium persulfate) 를 30㎕ 가하고, 촉진제인 N,N,N,N-테트라메틸에틸렌디아민(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine) (TEMED) 를 3㎕ 가하였다. 증류수를 가하여 최종부피를 3㎖ 이 되도록 하였다. 일정크기의 주형에 넣은 후 10분 정도 방치하면 폴리아크릴아미드에 불포화지방산이 결합된 공중합 고분자가 제조된다. 이 고분자를 70% 의 에탄올 용액으로 12시간 세척한 후, 증류수로 다시 3시간 동안 세척하여 에탄올을 제거하고, 10㎖ 의 0.1M EDAC 수용액을 가하여 1시간 동안 진탕시켜 카르복시기를 활성화시켜준다. 0.1N 의 수산화나트륨 (NaOH) 수용액을 가하여 pH 7.6이 되도록 조정한 증류수 10㎖ 에 0.2M NAD+ 용액에 카르복시기가 활성화된 겔을 1시간 동안 진탕시켜 보조효소를 고정화시켜준 후, 0.05M Tris-HCl 완충용액 (pH 7.6)으로 1시간 세척한 후 사용한다.

고정된 보조효소(NAD+)의 활성을 확인하기 위하여 고분자의 일부를 떼어내어 락트산 탈수소 효소를 이용한 락트산으로 부터 피루베이트로의 산화반응에서 생성되는 NADH의 양을 340nm에서 흡광도의 증가로 정량적인 측정을 할 수 있었다. 그 결과 앞서 키모트립신과 같은 결과를 거두었으며, 3개월간 24시간별로 측정해본 결과 활성보존율이 87 ±9%였으며, 비교 예에서 아가로스 겔에 NAD+를 결합시키는 방법 [참조: 생체에너지 및 보효소재생산 시스템의 개발, 전문진, 김수자, 1991, 과학재단] 의 75 ±3% 보다 높은 보조효소 활성 보존효과를 나타내었다. 더욱 상세하게는 아래 표과 같다. 표 2는 전문진, 김수자의 방법과 불포화지방산을 이용한 방법을 비교한 표이다.

구분비교 내용	기존방법	불포화지방산을 이용한 고정화방법
제조시 소요시간	4 일	18시간
제조비용면	고가의 수입 시약필요	국산 시약으로 제조 가능
1개월후 효소활성도 보존율	75 ±3%	87 ±9%

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 가장 큰 장점으로는 공정의 단순화와 제조 시간의 단축 국내 생산 재료를 이용함으로써 비용의 저렴화를 달성하였다는 점이며, 또한 고효율로 고정된 생체분자를 얻을 수 있다는 것이다.

구체적으로는, 아크릴아미드-올레산 공중합체에 키모트립신을 고정하고 그 겔상에서 정제 전단계인 식물조직의 조추출물을 전기이동시킨 후 키모트립신이 고정된 고분자 내에서 효과적으로 키모트립신 저해물질을 검색할 수 있었다. 이 고분자에 정제가 되지 않은 추출물과 함께 흔들어 준 후 완충용액으로 세척 후 pH와 이온세기를 변화시킴으로 다른 완충용액을 가하여 키모트립신에 결합된 단백질을 탈착시키어 확인한 결과 키모트립신의 저해활성을 확인 할 수 있었다. 또한 이와 같이 고정화된 효소는 24시간 간격으로 그 활성을 측정한 결과 5개월 후에도 90±10%의 활성을 보여 높은 안정성을 나타내었다.

게다가, 본 기술의 응용분야로는 미량의 특정효소의 검색 및 다량의 물질분리에 유용하며, 고분자 지지체의 자유로운 성형가공이 가능하기 때문에 효소나 보조 효소등 고가의 물질의 재생산 시스템이나 효소를 사용하는 화학공장의 반응기 및 바이오 센서 등의 사용 등에도 아주 유용하게 응용 가능하다.

도 1은 금 표면에 효소를 고정화시키는 방법을 나타낸 것이다.

도 2는 아가로스 겔에 NAD+를 고정화시키는 방법을 나타낸 것이다.

도 3은 N-이소프로필아크릴아미드 및 N-아크릴옥시숙신이미드 공중합체를 이용하여 효소를 고정화시키는 방법을 나타낸 것이다.

도 4a 및 도 4b는 실시예 1의 구현예로, 폴리아크릴아미드 및 올레산 공중합체 지지체를 이용하여 효소를 고정화시키는 방법 및 이에 따라 고정화된 효소를 나타낸 것이다.

도 5는 고정화된 키모트립신의 날짜별 활성 측정을 나타낸 그래프이다.

도 6 및 도 7은 고정화되어있지 않은 키모트립신과 고정화된 키모트립신의 안정성을 단백질변성시약인 요소를 이용하여 측정 비교한 결과로서, 도 6은 요소 농도별 효소의 활성비교 그래프이고, 도 7은 5M 요소 용액에서 효소의 활성비교 그래프이다.

Claims

팔미톨레산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산 및 아라키돈산 중에서 선택되는, 이중결합을 포함하고 알킬 사슬의 말단에 작용기인 카르복시기를 가지는 불포화 지방산과, 이중결합을 가지는 수용성 모노머로서 아크릴아미드를 첨가중합 반응시키는 것을 특징으로 하는 고체 지지체의 제조방법.
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팔미톨레산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산 및 아라키돈산 중에서 선택되는, 이중결합을 포함하고 알킬 사슬의 말단에 작용기인 카르복시기를 가지는 불포화 지방산과, 이중결합을 가지는 수용성 모노머로서 아크릴아미드의 첨가중합체로 이루어진 고체 지지체.
팔미톨레산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산 및 아라키돈산 중에서 선택되는, 이중결합을 포함하고 알킬 사슬의 말단에 작용기인 카르복시기를 가지는 불포화 지방산과, 이중결합을 가지는 수용성 모노머로서 아크릴아미드의 첨가중합반응으로 형성된 고체 지지체에 결합된 불포화지방산들의 알킬 사슬 말단의 카르복시기 그룹을 활성화시키는 단계; 고정화되는 효소를 기질과 반응시켜 효소의 활성자리를 보호하는 단계; 기 반응시킨 효소와 기질 용액과 불포화 지방산의 카르복시기 사이에 아미드 결합을 이루는 단계; 효소의 활성자리로부터 기질을 세척 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 고정화 방법.