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Verfahren zur Herstellung von immobilisiertem biolo-
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gischem Material in Perlform Die Erfindung betrifft Verfahren zur
Herstellung von immobilisiertem biologischem Material durch Einschluß in polymerisierte
Verbindungen in Perlform, das nach diesen Verfahren erhältliche immobilisierte biologische
Material und dessen Verwendung zu Biotransformationen.
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Die Immobilisierung von Biokatalysatoren führt in der Regel zu verfahrenstechnischen
und wirtschaftlichen Vorteilen. Es lassen sich chemische und physikalische Eigenschaften,
manchmal auch Selektivität und Spezifität des Biokatalysators durch die Immobilisierung
modifizieren.
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Die Methoden zur Immobilisierung lassen sich allgemein in folgende
Gruppen einteilen - Adsorption an vorgefertigte Träger - Kovalente Bindung an Träger
- Quervernetzung - Einschluß in eine Polymermatrix.
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Das Einschlußverfahren beruht darauf, daß das Biomaterial hinsichtlich
seines Bewegungsraumes während der Polymerisation in ein Netzwerk mehr oder minder
einheitlicher Maschen- und Porenweite eingeschlossen wird. Dieses Polymernetzwerk
sollte für den Biokatalysator unpassierbar sein, während das Netzwerk dem Substrat
und dem Produkt einer an diesem Katalysator durchgeführten Umsetzung praktisch keinen
Widerstand bieten sollte.
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Herkömmliche Verfahren verwenden niedermolekulare, hydrophile Monomere
zum Aufbau des Netzwerkes, wie beispielsweise Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat,
Hydroxypropylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Acrylamid u.a., die mit der wäßrigen
Lösung oder Dispersion des Biomaterials gemischt und anschließend polymerisiert
werden.
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Zum Beispiel werden in der PS-US 3 788 950 monofunktionelle Acrylsäurederivate
wie Acrylamid mit einer geringen Menge an Vernetzer wie N,N-Methylenbisacrylamid
verwendet.
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In der US-PS 3 859 169 werden z.B. Monoester der Acrylsäure mit Glykolen
in Verbindung mit einem Vernetzer und einem löslichen Polymer verwendet. Bei all
diesen Verfahren können jedoch nur durch äußere Formgebung Materialien wie Filme,
Folien, Gußteile u.a. erhalten werden. Zur Verwendung dieser Materialien ist oftmals
ein nachträgliches Bearbeiten notwendig, womit sich jedoch die für Katalysatoren
günstige Kugelform kaum erreichen läßt.
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Die US-PS 3 860 490 erwähnt die Möglichkeit der Herstellung von Perlen
durch Suspensionspolymerisation in einem inerten Medium, jedoch ist das Verfahren
durch die Verwendung niedermolekularer Hydroxy-alkylacrylate und -methacrylate nachteilig,
da - wie bei allen oben erwähnten Verfahren - Schwierigkeiten bei der Steuerung
und Reproduzierbarkeit der Permeabilitäten für das biologische Material sowie für
dessen Substrate und Produkte auftreten. Für eine Eignung als Immobilisierungsmaterial
sind diese Größen jedoch essentiell. Außerdem ist die Verwendung niedermolekularer
Acrylsäurederivate wegen ihrer Toxizität nachteilig. Es kann während der Polymerisation
zu einer Schädigung des Biokatalysators kommen, oder im Polymerisat befindliche
Restmonomere schränken die Verwendung des immobilisierten Biokatalysators zur Herstellung
von Produkten für die Nahrungsmittelindustrie oder für die pharmazeutische Industrie
stark ein.
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Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von immobilisiertem biologischem
Material durch Einschluß in polymerisierte Verbindungen gefunden, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß eine wäßrige Lösung oder Dispersion eines biologischen Materials mit einer
wäßrigen Lösung von gut wasserlöslichen höhermolekularen polymerisierbaren Verbindungen,
die zwei oder mehr polymerisierbare funktionelle Gruppen pro Molekül und ein Molekulargewicht
von über 400 besitzen, gemischt wird und diese Mischung in einem inerten flüssigen
Medium zu Perlen zerteilt und polymerisiert wird. Als Inertphase können insbesondere
mit Wasser nicht mischbare Stoffe wie z.B.
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aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlen-
wasserstoffe
wie z.B. Hexan, Cyclohexan, Toluol sowie auch halogenierte Derivate derselben, desweiteren
Alkohole, Ether, Ester oder sonstige, nicht wassermischbare Stoffe wie auch Siliconöle
und Paraffinöle dienen, bzw.
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auch Gemische derselben untereinander.
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Durch die Verwendung der höhermolekularen, zwei oder mehr ungesättigte
Gruppen enthaltenden, härtbaren wasserlöslichen Verbindungen läßt sich eine bessere
Steuerung und Reproduzierbarkeit der Permeabilitäten erreichen, da sich diese Eigenschaften
im wesentlichen durch die höhermolekularen wasserlöslichen Verbindungen ergeben.
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Außerdem besteht durch die Verwendung von höhermolekularen polymerisierbaren
Verbindungen kein Toxizitätsproblem. Niedermolekulare toxische Verunreinigungen
können außerdem vor dem Mischen mit dem biologischen Material entfernt werden.
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Die gut wasserlöslichen erfindungsgemäßen Verbindungen können zunächst
in einer gewissen Menge Wasser, Pufferlösung, Salzlösung und ähnlichem aufgelöst
werden, womit die Polymerlösung der wäßrigen Lösung oder Dispersion des biologischen
Materials hinsichtlich bestimmter Eigenschaften wie pH-Wert, Salzkonzentration,
Viskosität u.a. angepaßt werden kann. Besonders empfindliche Biokatalysatoren erleiden
dadurch keine abrupte Änderung des umgebenden Mediums und es können auf diese Weise
Aktivitätseinbußen vermieden werden.
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Ein weiterer Vorteil ist die mit der guten Wasserlöslichkeit einhergehende
große Aufnahmekapazität des Polymeren
für wäßrige Lösungen und
Suspensionen. Es sind Gewichtsverhältnisse von wäßrigem biologischem Material zu
festem Polymer zwischen 1:1 und 30:1 möglich und vorteilhaft, besonders geeignet
sind Verhältnisse zwischen 4:1 und 20:1.
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Die durch dieses Verfahren direkt erhaltene Perlform besitzt besondere
Vorteile bei der Verwendung des immobilisierten Biomaterials. Einerseits eignet
sich die Kugelform besonders zur Füllung von Säulenreaktoren, wobei eine gute Durchströmung
gewährleistet ist, Verstopfungen vermieden werden können und gleichzeitig durch
die große Oberfläche eine gute Reaktionsgeschwindigkeit für die Umsetzung am Biokatalysator
resultiert.
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Auch in strömenden Systemen ist die Kugelform auf Grund der hydrodynamischen
Eigenschaften besonders geeignet.
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Ferner stellt das vorliegende Verfahren eine Vereinfachung und Verbesserung
der bisherigen Verfahren dar.
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Die Kugelform wird direkt bei der Polymerisation erhalten und ist
durch die Verfahrensbedingungen gut steuerbar.
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Zum Beispiel kann die Polymerisation in Form einer Dispersion des
noch nicht polymerisierten biologischen Materials in einem inerten, flüssigen Medium
wie z.B. aliphatischen, cycloaliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen,
funktionellen Derivaten derselben oder auch Siliconölen, Paraffinölen, durchgeführt
werden, wobei in Abhängigkeit von der Verteilung, die durch Rühren, Einleiten von
Inertgas, z.B. Stickstoff, oder sonstiges
Zudosieren der wäßrigen
Phase, z.B. durch Einpumpen oder Einsprühen in die inerte Phase erreicht werden
kann, die Größe der Perlen sehr variabel ist. Weiterhin kann durch Zusätze zur Wasser-
oder Inertphase deren Viskosität, Dichte, Oberflächenspannung usw. verändert werden,
was ebenfalls den Perldurchmesser beeinflußt.
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Es sind auf diese Weise mittlere Perldurchnesser von 0,05 mm bis 5
mm möglich, wobei Perlen größeren Durchmesser, z.B. größer 2 mm, der gewünschten
Reaktion einen hohen Diffusionswiderstand entgegensetzen. Vorteilhaft sind besonders
Perlen eines mittleren Durchmessers von 0,2 mm bis 2 mm.
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Neben der Einfachheit der Herstellung der Perlen ergeben sich Vorteile
für die Immobilisierung hinsichtlich der Handhabung unter Sterilbedingungen des
Biomaterials, da das Verfahren vom Mischen bis zum fertigen immobilisierten Material
in einem geschlossenen System durchgeführt werden kann. Das immobilisierte Biomaterial
kann anschließend leicht durch Filtration gewonnen werden. Es ist jedoch auch möglich,
die gesamte Mischung unter OOC abzukühlen, um das Material dadurch längere Zeit
lagern zu können. Das Abkühlen kann auch über den Erstarrungspunkt des äußeren Mediums
hinaus durchgeführt werden, wobei dessen Erstarrungspunkt ebenfalls durch Zusätze
oder Beimengen von anderen Stoffen erniedrigt werden kann.
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Zur Immobilisierung werden wasserlösliche, höhermolekulare, polymerisierbare
Verbindungen, die zwei oder
mehr polymerisierbare funktionelle
Gruppen pro Molekül und ein Molekulargewicht von über 400, insbesondere zwischen
1.000 und 10.000, besitzen, insbesondere Verbindungen mit ethylenisch ungesättigten
Gruppen, verwendet.
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Ihrem Aufbau nach lassen sie- sich als Verbindungen beschreiben, die
aus der Reaktion von höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen mit Verbindungen,
die polymerisierbare ethylenisch ungesättigte Gruppen enthalten, entstehen. Beide
Reaktionspartner müssen dabei funktionelle Gruppen enthalten, die erlauben, sie
chemisch mit- oder untereinander zu verknüpfen bzw. mit Hilfe von di- oder mehrfunktionellen
Reagentien mit- oder untereinander zu verknüpfen.
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Beispielsweise sind solche höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen
Polyethylenglycole, Ethylenoxid-Propylenoxid-Block- und Mischpolymerisate, alkoxylierte,
besonders ethoxylierte zwei- oder mehrwertige Alkohole sowie gut wasserlösliche
Polymerisate, z. B. ganz oder teilweise verseifte Polyvinylacetate, gut wasserlösliche
Polykondensate wie z. B. Polyester, hergestellt aus obigen höhermolekularen, hydrophilen
Verbindungen mit Di- bzw. Polycarbonsäuren und gut wasserlöslichen Polyadditionsverbindungen
wie z. B. Polyetherpolyurethane, hergestellt aus obigen höhermolekularen, hydrophilen
Verbindungen mit Di- bzw. Polyisocyanaten.
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Ferner können die in den obigen genannten höhermolekularen, hydrophilen
Verbindungen enthaltenen Hydroxylgrup-
pen ganz oder teilweise
nach üblichen Verfahren, wie z.
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B. Umsetzung mit Ammoniak, in Aminogruppen umgewandelt sein.
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Als Verbindungen mit polymerisierbaren, ethylenisch ungesättigten
Gruppen sind z. B. geeignet: ungesättigte Carbonsäuren, Säurechloride, Dicarbonsäuren,
Säureanhydride oder funktionelle Derivate derselben.
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Bevorzugt sind Acrylsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure, Acrylsäurechlorid,
Methacrylsäurechlorid, Itaconsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Maleinsäureanhydrid,
Itaconsäureanhydrid, Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, Hydroxyethylacrylat,
Hydroxypropylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Isocyanatoethylacrylat,
Isocyanatoethylmethacrylat, 4-Isocyanato-3-methyl-but-2-ylacrylat.
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Die Verknüpfung der höhermolekularen, hydrophilen Verbindungen mit
den polymerisierbaren, ethylenisch ungesättigten Verbindungen ist somit unterschiedlichster
Natur, beispielsweise ergeben sich Ester-, Ether-, Urethan-, Amid-, Amin- und Harnstoffbindungen.
Die Herstellung der Verknüpfung kann dabei nach literaturbekannten Verfahren erfolgen,
d. h. beispielsweise durch Umsetzung der Hydroxyl- oder Aminogruppen mit Säuren,
Säurehalogeniden oder Säureanhydriden zu den entsprechenden Estern oder Amiden,
mit Epoxiden zu den entsprechenden Ethern oder Aminen oder mit Isocyanaten zu den
entsprechenden Urethanen oder Harnstoffen.
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Ferner kann neben der direkten Verknüpfung der höhermolekularen, hydrophilen
Verbindungen mit den Verbindungen, die die ethylenisch ungesättigten Gruppen enthalten,
die Verknüpfung auch mittels bi- oder mehrfunktioneller Reagentien erfolgen.
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Beispiele solcher bi- oder mehrfunktioneller Reagentien sind di- oder
mehrfunktionelle Isocyanate wie Isophorondiisocyanat, Toluylendiisocyanat, Hexamethylendiisocyanat,
Biuretgruppenhaltige Polyisocyanate (z. B. Desmodur N, Umsetzungsprodukt von Hexamethylendiisocyanat
mit Wasser), Polyisocyanate, die aus der Umsetzung von Diisocyanaten mit mehrwertigen
Alkoholen entstehen (z. B.
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Desmodur L, Umsetzungsprodukt von Toluylendiisocyanat mit Trimethylolpropan)
sowie Di- oder Polyepoxide wie z. B. Bisphenol-A-digylcidylether oder Hexahydrophthalsäurediglycidylester.
Die Verknüpfung dieser Reagentien erfolgt dabei z. B. mit den Hydroxylgruppen der
höhermolekularen, hydrophilen Verbindung und hydroxylgruppenhaltigen Verbindungen,
die polymerisierbare, ethylenisch ungesättigte Gruppen enthalten, unter Urethan-
bzw.
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Etherbildung.
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Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen können die verschiedenen
Verknüpfungsprinzipien auch untereinander kombiniert werden.
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Art und Anteil der hydrophilen, höhermolekularen Verbindungen, der
Verbindungen, die die ethylenisch ungesättigten Gruppen tragen sowie ggf. der di-
oder mehrfunktionellen Reagentien müssen jedoch so gewählt werden, daß
die
daraus hergestellten erfindungsgemäßen, höhermolekularen, polymerisierbaren Verbindungen
so hydrophil sind, daß die gute Wasserlöslichkeit und große Aufnahmekapazität für
wäßrige Lösungen oder Dispersionen an biologischem Material gegeben ist.
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Als bevorzugte wasserlösliche, höhermolekulare, polymerisierbare Verbindungen
seien genannt: - Verbindungen, die aus Polyetherpolyolen, der Hydroxylgruppen teilweise
mit ungesättigten Carbonsäuren verestert und zum anderen Teil mit isocyanatgruppenhaltigen
Derivaten ungesättigter- Carbonsäuren umgesetzt sind, hergestellt sind.
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Besonders bevorzugt seien genannt: - Verbindungen, die aus Polyethylenglykolen
mit einem Molekulargewicht größer 400, deren Hydroxylgruppen teilweise mit Acrylsäure
oder Methacrylsäure verestert und zum anderen Teil mit Isocyanatoethylmethacrylat
oder 4-Isocyanato-3-methyl-but-2-ylacrylat umgesetzt sind, hergestellt sind.
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Bei der Herstellung können die Hydroxylgruppen der Polyetherpolyole
zunächst teilweise mit den isocyanatgruppenhaltigen Derivaten ungesättigter Carbonsäuren
umgesetzt werden und anschließend zum anderen Teil mit den ungesättigten Carbonsäuren
verestert werden, bevorzugt ist jedoch, zuerst die teilweise Umsetzung mit den ungesättigten
Carbonsäuren und anschließend die Umsetzung des anderen Teils der Hydroxylgruppen
mit den isocyanatgruppenhaltigen Derivaten ungesättigter Carbonsäuren.
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Weiterhin seien als bevorzugte, wasserlösliche, höhermolekulare, polymerisierbare
Verbindungen genannt: - Verbindungen, die aus Polyetherpolyolen, deren Hydroxylgruppen
teilweise mit ungesättigten Carbonsäuren verestert und zum anderen Teil mit di-
oder mehrfunktionellen Isocyanaten umgesetzt sind, hergestellt sind.
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Besonders bevorzugt hierbei seien genannt: - Verbindungen, die aus
Polyethylenglykolen mit einem Molekulargewicht größer 400, deren Hydroxylgruppen
teilweise mit Acrylsäure oder Methacrylsäure verestert und zum anderen Teil mit
Isophorondiisocyanat, Toluylendiisocyanat, biuretgruppenhaltigen Polyisocyanaten
oder Polyisocyanaten, die aus der Umsetzung von Diisocyanaten mit mehrwertigen Alkoholen
entstehen, hergestellt sind.
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Bei der Herstellung können die Hydroxylgruppen der Polyetherpolyole
zunächst teilweise mit den di- oder mehrfunktionellen Isocyanaten umgesetzt werden
und anschließend zum anderen Teil mit ungesättigten Carbonsäuren verestert werden.
Vorteilhafter ist es jedoch, zuerst die teilweise Veresterung und anschließend die
Umsetzung mit den di- oder mehrfunktionellen Isocyanaten durchzuführen.
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Die Polymerisation kann unter Inertgas durchgeführt und in Gegenwart
üblicher Radikalstarter wie Azo-bis(isobutyronitril), t-Butylperoctoat, Benzoylperoxid,
Dicyclohexylperoxydicarbonat, Methylethylketonperoxid, Cumolhydroperoxid, Acetyl-cyclohexansulfonyl-peroxid,
Dicumylperoxid, Kaliumperoxodisulfat oder Ammoniumperoxo-
disulfat
sowie durch Redoxsysteme wie Kaliumperoxodisulfat-Riboflavin, Kaliumperoxödisulfat-Natriumbisulfit,
Wasserstoffperoxid-Verbindungen des zweiwertigen Eisens erfolen. Als Beschleuniger
können ebenfalls zahlreiche Verbindungen dienen, z. B. N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
oder ß-Dimethylaminoptopionitril.
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Eine weitere Möglichkeit der Polymerisation besteht in der Bestrahlung
der Mischung mit aktinischem Licht. Es eignen sich beispielsweise Hochdruckquecksilberlampen,
Niederdruckquecksilberlampen, Fluoreszenzlampen, Xenonlampen, Kohlelichtbögen sowie
Sonnenbestrahlung.
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Eine Bestrahlung mit Elektronenstrahlen oder Gammastrahlen ist ebenfalls
möglich, jedoch muß mit einer gewissen Schädigung des biologischen Materials gerechnet
werden. Ferner kann die Photopolymerisation durch Photosensibilisatoren beschleunigt
werden. Es können bekannte Photosensibilisatoren wie CC -Carbonylalkohole, z.B.
Benzoin oder Acetoin, Acyloinether wie Benzoinmethylether, Benzoinethylether, Benzoinisopropylether,
OC-substituierte Acyloine wie OC-Methylbenzoin und OC-Methoxybenzoin u.a. sowie
durch ionische Gruppen wie z.B. Carbonsäure-, Sulfonsäure- oder Aminogruppen modifizierte
und dadurch wasserlöslich gemachte Derivate verwendet werdenj Desweiteren können
polycyclische aromatische Verbindungen wie Naphthol und Hydroxyanthracen, Azoamide
wie beispielsweise 2-Cyano-2-butylazoformamid sowie Metallsalze wie Uranylnitrat
und Eisenchlorid, wie auch Mercaptane, Disulfide, Halogenide und Farbstoffe verwendet
werden.
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Durch die hohe Aufnahmekapazität für Wasser - besonders gut eignen
sich Gewichtsverhältnisse von wäßriger Lösung oder Suspension des biologischen Materials
zu festen Polymer zwischen 4:1 und 20:1 -, die das immobilisierte Material vor und
nach der Polymerisation besitzt, ergeben sich auch Vorteile hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit
des Verfahrens. Dadurch können einerseits große Mengen an wäßrigen Lösungen oder
Dispersionen des biologischen Materials in einer relativ kleinen Menge der polymerisierbaren
Verbindungen eingeschlossen werden, andererseits können dadurch Fermenterbrühen
direkt oder nach Konzentrierung z.B. durch Mikrofiltration oder Zentrifugieren immobilisiert
werden.
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Desweiteren ist es jedoch vor und nach der Immobilisierung auch möglich,
geringere Mengen an Wasser oder wäßrigen Lösungen zu verwenden, sowie einen Teil
des Anteils an Wasser gegen andere Flüssigkeiten wie z.B. Alkohole zu ersetzen.
Es ist auch möglich, die immobilisierten biologischen Materialien in anderen als
wäßrigen Lösungen, z.B. in aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen,
einzusetzen.
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Die nach vorstehendem Verfahren immobilierten biologischen Materialien,
insbesondere Zellen oder Enzyme, lassen sich als Biokatalysatoren zu Biotransformationen
einsetzen.
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Als interessante Mikroorganismen für die erfindungsgemäße Immobilisierung
kommen die folgenden in Frage:
Aspergillus niger, Gluconobacter
suboxydans, Gluconobacter oxydans, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Protaminobacter
rubrum Serratia plymuthica, Pseudomonas putida, Cunninghamella elegans, Clostridien
wie z.B. Clostridium thermoaceticum, Clostridium kluyveri, Clostridium butyricum,
Clostridium sporogenes, Bacillus licheniformis, Streptomyces olivaceus.
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Beispiele Beispiel A Immobilisierung von Alkoholdehydrogenase 48,7
g Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 800 (hergestellt von
den Chemischen Werken Hüls) wurde mit 4,7 g Acrylsäure unter Zusatz von 0,54 g p-Toluolsulfonsäure
und 50 mg Di-tert.-butylhydrochinon sowie 50 mg p-Methoxyphenol in Toluol verestert.
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25,0 g dieses Esters wurden mit 3,9 g Isocyanatoethylmethacrylat (hergestellt
von Dow Chemicals) unter Zusatz von 4 mg Desmorapid SO (Rheinchemie Rheinau GmbH)
umgesetzt.
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1 g des so erhaltenen polymerisierbaren Harzes wurden mit 50 mg 1,
2-Diphenyl-2-hydroxy-3/N (N-methyl)pyrollidinium7-propan-l-on-methylsulfat gemischt
und mit 15 g Phosphat-Puffer (0,01 M, pH 7) versetzt. In dieser Lösung wurde 200
mg Alkoholdehydrogenase (aus Hefe, Fa. Boehringer, Mannheim, enthaltend 120 mg Enzymprotein,
400 U/mg) gelöst und die Lösung in 100 g einer Mischung aus Silikonöl/Paraffinöl
mit einer spez. Dichte von 0,9 g/cm3 getropft, wobei sich durch intensives Rühren
und Durchleiten von Stickstoff Perlen ausbildeten, die durch 15 minütige Bestrahlung
mittels einer Hg-Hochdrucklampe polymerisiert wurden.
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1,0 g der so erhaltenen Perlen wurden in 50 ml Erlenmeyerkolben mit
10 ml 0,1 M Kaliumphosphat pH 8,5, 10 mM NADH, l % Acetaldehyd auf der Rundschtttelmaschine,
230 rpm, bei 30°C inkubiert.
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Nach 6 h waren etwa 50 % des eingesetzten NADH, 50 pMol, zu NAD oxidiert,
die Initialgeschwindigkeit betrug dabei 0,23 pmol/min.
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Beispiel B Immobilisierung von L-Låctåt Dehydrogenase 25,0 g des hergestellten
Esters aus Beispiel A wurden mit 2,3 g Desmodur N (BAYER AG Leverkusen) und 1,4
g Isophorondiisocyanat unter Zusatz von 7,5 mg Desmorapid (Rheinchemie Rheinau GmbH)
umgesetzt.
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Analog Beispiel A wurden 0,6 mg t-LaCtat-Dehydrogenase (aus Schweinemuskel,
Fa. Boehringer, Mannheim, enthaltend 2 mg Enzymprotein, ca. 550 U/mg) anstelle der
Alkohol-Dehydrogenase in Perlform immobilisiert.
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Die erhaltenen Perlen wurden in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit
20 ml 0,1 M Kaliumphosphät-Puffer, pH 8,0, 10 mM NADH, 0,05 M Pyruvat-Na-Salz bei
300C, 200 rpm, inkubiert.
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Entnommene Proben wurden nach Verdünnung photometrisch auf die NADH-Abnahme
gegen eine Blindprobe getestet.
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Nach 3 h war die gesamte Menge an NADH zu NAD oxidiert.
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Die Initialgeschwindigkeit betrug 1,4 pMol/min.
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Beispiel C Immobilisierung von Bäckerhefe 100,0 g Polyethylenglykol
mit einem mittleren Molekulargewicht von 1000 (Chemische Werke Hüls) wurde mit 7,2
g Acrylsäure unter Zusatz von 0,92 g p-Toluolsulfonsäure und 0,1 g Di-tert.-butylhydrochinon
sowie 0,1 g p-Methoxyphenol in Toluol verestert.
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75,0 g des so erhaltenen Esters wurde mit 8,3 g Isophorondiisocyanat
unter Zusatz von 9 mg Desmorapid S0 umgesetzt.
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5,0 g des polymerisierbaren Harzes wurde mit 0,1 g Phenylglyoxylsäure
und 1,0 g Pufferlösung (0,01 M, pH 7) gemischt. Zu dieser Lösung wurde eine Mischung
aus 13,7 g Bäckerhefe (25 % Feststoffgehalt) und 13,7 g Pufferlösung pH 7 gegeben.
Die so erhaltene Mischung wurde anschließend in 200 ml einer Mischung aus Paraffinöl
und Siliconöl mit einer spez. Dichte von 0,9 g/cm3 unter Rühren und Durchleiten
von Stickstoff in Perlen zerteilt und mittels einer Quecksilberhochdrucklampe polymerisiert.
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15 g dieser Perlen wurden in einem 200 ml Erlenmeyerkolben mit 50
ml 0,01 M Kaliumphosphat, pH 8,0, 1 mM NADH (Grad II, Fa. Boehringer, Mannheim)
bei 250C auf einer Rundschüttelmaschine bei 230 rpm inkubiert.
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Die NADH-Oxidase Aktivität der immobilisierten Hefezellen wurde über
die Abnahme des NADH-Gehalts photometrisch gegen eine Blindprobe ohne Hefezellen
bestimmt.
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15 g immobilisiertes Präparat besaß eine Aktivität von 0,24 U (1 U
= 1 pMol NADH/min. oxidiert).
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Diese Rekation ist zur NAD-Regenerierung in gekoppelten Enzymsystemen
anwendbar.
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Beispiel D Immobilisierung von Bäckerhefe 218,9 g Polyethylenglykol
mit einem mittleren Molekulargewicht von 1550 (Chemische Werke Hüls) wurden mit
9,8 g Acrylsäure unter Zusatz von 2,3 g p-Toluolsulfonsäure, 0,23 g Di-tert.-butylhydrochinon
sowie 0,23 g p-Methoxyphenol in Toluol verestert.
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165,8 g des so erhaltenen Esters wurden mit 18,2 g Isocyanatoethylmethacrylat
(Dow Chemicals) unter Zusatz von 36 mg Desmorapid SO umgesetzt.
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9,0 g dieses polymerisierbaren Harzes wurden mit 90 mg Phenylglyoxylsäure
gemischt und mit 2,70 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) versetzt.
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Diese so erhaltene Lösung wurde zu einer Mischung aus 20,0 g Bäckerhefe
und 20,0 g Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7) gegeben und daraus analog Beispiel C Perlen
hergestellt.
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15 g feuchte Perlen wurden in einem 200 ml Erlenmeyerkolben mit 50
ml 0,01 M Kaliumphosphat pH 8,0, 1 mM NADH (Fa. Boehringer, Mannheim) bei 25"C auf
einer Rundschüttelmaschine, 230 rpm, inkubiert. Aufgrund der photometrischen NADH-Bestimmung
besaßen 15 g Perlen eine Aktivität von 0,14 U.
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Beispiel E Immobilisierung von Protaminobacter rubrum Zur Produktion
von Sucrose Mutase wird der Stamm Protaminobacter'rubrum (CBS 574.77) verwendet.
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Die Nährlösung besteht aus 5 % Dicksaft, 2 % Ilaisquellwasser und
0,05 % (NH4)2 HPO4, der pH-Wert beträgt 7,1.
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Mit 1 ml einer Protaminobacter Abschwemmung werden in einem 1 1 Erlenmeyerkolben
200 ml Nährlösung beimpft.
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Die Fermentation läuft 15 h bei 310C auf der Rundschüttelmaschine.
Mit dieser Vorkultur werden in einem 30 1 Fermenter 20 Liter obiger Nährlösung angeimpft
und 16 h bei 310C fermentiert. Die Fermentationslösung wird durch Mikrofiltration
konzentriert bis zu einem Feststoffgehalt von 5 %.
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10 g des in Beispiel D erhaltenen polymerisierbaren Acrylatharzes
wurden mit 3,0 g Phosphatpuffer 0,01 M pH 7 und 500 mg Irgacure (Ciba-Geigy) gemischt.
Zu dieser Lösung wurden 70 g einer durch Mikrofiltration konzentrierten Fermenterbrühe,
die Protaminobacter rubrum Zellen enthält, gegeben und diese Mischung in 460 g eines
Siliconöles mit einer spez.
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Dichte von 0,95 g/cm3 getropft. Durch intensives Rühren und durch
StickStoffeinleitung wurde eine Zerteilung der obigen zellenthaltenden Mischung
in Perlen erreicht, die mittels 2 Quecksilberhbchdrucklampen und 1/2-stündiger Bestrahlung
polymerisiert wurden.
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6,0 g der so erhaltenen Perlen wurden in 200 ml Erlenmyerkolben mit
50 ml 5.0 % Sucrose-Lösung, pH 7,0, auf der Rundschüttelmaschine be*i 230 rpm inkubiert.
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Die Analyse der Reäktionslösung erfolgte per HPLC.
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Die immobilisierten Protaminobacter Zellen setzten 0,32 g/h Sucrose
um.
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Beispiel F Immobilisierung von Protaminobacter rubrum Die Anzucht
von Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) erfolgte analog Bespiel E.
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110 g des Esters aus Beispiel b wurden mit 7,4 g Isophorondiisocyanat
unter Zusatz von 15 mg Desmorapid So umgesetzt.
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10 g des so erhaltenen polymerisierbaren Acrylatharzes wurden mit
4 g Phosphatpuffer 0,01 M, pH 7,0 und 500 mg 1,2-Diphenyl-2-hydroxy-3/Ñ(S-methyl)pyrrolidinium7-propan-1-on-methylsulçat
Ünd 35 g konzentrierter Fermenterbrühe gemischt und zu 300 g eines Siliconöl-Paraffinöl-Gemisches
mit einer spez. bichte von 0,9 g/cm3 gegeben und analog Beispiel t Perlen hergestellt.
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6,0 g der so erhaltenen Perlen wurden analog Beispiel A mit 50 % Sucroselösung
getestet. Die immobilisierten Protaminobacter Zellen setzten 0,69 g/h Sucrose um.
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Beispiel G Immobilisierung von Protaminobacter rubrum. Die Anzucht
von Protaminobacter rubrum (CBS 574.77) erfolgte analog Beispiel E.
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10 g des polymerisierbaren Harzes aus Beispiel F wurden mit 4 g Phosphatpuffer,
0.01 M, pH 7.0, und 35 g konzentrierter Fermenterbrühe gemischt und darin 0,3 g
Ammoniumperoxodisulfat gelöst. Diese Mischung wurde in 2000 g eines Siliconöls der
Dichte 0,97 g/cm3, in dem 0.3 g N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin gelöst waren,
unter starkem Rühren eingetropft, sodaß die wäßrige Mischung zu Perlen zerteilt
wurde und innerhalb kurzer Zeit polymerisierte.
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Die gesamte Perlmasse wurde in eine 25 cm lange Säule des Durchmessers
2 cm gepackt, das anhaftende Siliconöl durch 50 % Sucroselösung verdrängt und die
Säule bei 450C kontinuierlich betrieben.
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Bei einem Durchfluß von 28 ml/h wurden 54.5 % der 50 % Sucroselösung
zu Isomaltulose und Nebenprodukten umgesetzt.