DE2629692B2

DE2629692B2 - Verfahren zum biologischen Festlegen von Enzymen oder nükrobiellen Zellen mittels durch Bestrahlung härtbarer Polymerer sowie danach hergestellte Erzeugnisse

Info

Publication number: DE2629692B2
Application number: DE2629692A
Authority: DE
Inventors: Saburo Nagaokakyo Kyoto Fukui; Kanagawa Hiratsuka; Takamitsu Iida; Tsutomu Yamamoto
Original assignee: Kansai Paint Co Ltd
Current assignee: Kansai Paint Co Ltd
Priority date: 1975-11-26
Filing date: 1976-06-29
Publication date: 1978-12-21
Also published as: DE2629692A1; DE2629692C3; JPS5266681A; GB1550465A; JPS5520676B2

Description

J5

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum biologischen Festlegen von Enzymen oder mikrobiellen Zellen, bei dem eine wäßrige Dispersion von Enzymen oder mikrobiellen Zellen einerseits und einem durch Bestrahlung härtbaren Polymeren andererseits hergestellt und die Mischung anschließend zum Härten bestrahlt wird, sowie danach hergestellte Erzeugnisse.

Um die Instabilität der Enzymaktivität auf ein Minimum zu bringen und kontinuierliche enzymatische Prozesse zu erleichtern, wird seit Neuerem das Verfahren der Immobilisierung und biologischen Festsetzung der Enzyme angewendet, wobei diese dann als fester Katalysator verwendet werden. Dies ist seit Kürzerem in verschiedenen Industriezweigen versucht worden.

Als Verfahren zum Herstellen der immobilisierten Enzyme sind ein Absorptionsverfahren, ein kovalentes Bindungsverfahren, ein Vernetzungsverfahren sowie ein Einschließungsverfahren bekannt. Bei dem letztgenannten Einschließungsverfahren wird das Enzym selbst nicht an eine Matrix gebunden, sondern wird im Feingitter eines Geles eingeschlossen oder in mikroskopischem Maßstab eingekapselt. Die Enzymaktivität des Produktes kann auf diese Weise wirksam gehalten m> werden, wobei verschiedene Arten von Enzymen und mikrobiellen Zellen nach diesem Verfahren behandelt werden können. Um das Verfahren ausführen zu können, ist es jedoch erforderlich, daß ein immobilisierendes Material zur Verfügung steht, welches Enzyme oder mikrobielle Zellen einschließt, ohne daß bereits eingeschlossene Enzyme freigelassen werden, wobei das Material weiterhin eine selektive Permeabilität für das

Substrat, wenn erforderlich, aufweisen muß.

Beim herkömmlichen Einschlußverfahren wird eine wäßrige Suspension von Enzymen oder mikrobiellen Zellen mit niedermolekularen, hydrophilen Monomeren, wie beispielsweise Acrylamidhydroxyäthylmethacrylat, Hydroxyäthylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat und Hydroxypropylacrylat, gemischt Die Mischung wird, wie sie ist, durch Polymerisation immobilisiert Bei diesem Verfahren ist es jedoch schwierig, in zuverlässiger Weise selektive Permeabilität der erhaltenen Polymermatrix zu steuern, wie es notwendig ist, damit die eingeschlossenen Enzyme oder mikrobiellen Zellen nicht freigegeben werden. Zusätzlich hierzu ist die Toxizität des immobilisierten Produktes zu beachten, die von Bedeutung ist, wenn das Produkt in der Nahrungsmittelindustrie und pharmazeutischen Industrie verwendet wird, da nicht umgesetzte molekulare Monomere im Reaktionsprodukt verbleiben.

Durch die GB-PS 14 07 129 ist bereits ein Verfahren der eingangs genannten Art bekanntgeworden, bei dem eine wäßrige Lösung, die ein Enzym und wenigstens ein wasserlösliches Monomeres oder Polymeres enthält, eingefroren wird, woraufhin die eingefrorene Lösung mit ionisierender Strahlung behandelt wird, um so das Monomere oder Polymere bzw. die Monomeren oder Polymeren zu härten. Dieses bekannte Verfahren, bei dem also ionisierende Strahlung (Gamma- oder Elektronenstrahlung) eingesetzt wird, hat den Nachteil, daß während des Härtens die Aktivität der Enzyme oder der mikrobiellen Zellen beeinträchtigt werden kann, wobei das erforderliche Einfrieren der Lösung vor der Bestrahlung noch eine zusätzliche Komplikation des Verfahrens bedeutet Durch die US-PS 38 60 490 ist das Einschließen von Mikroorganismen in hydrophilen Acrylaten oder Methacrylaten bekanntgeworden, um so ein kontrolliertes In-Kontakt-Kommen der Mikroorganismen mit der Umgebung zu gewährleisten, jedoch treten bei derartigen Verfahren, wie bereits ausgeführt wurde, Schwierigkeiten hinsichtlich der Einstellung der selektiven Permeabilität der erhaltenen Polymermatrix sowie hinsichtlich der möglichen Toxizität des immobilisierten Produktes auf. Aus der US-PS 39 68 016 ist es bekannt, daß mittels aktinischer Strahlung bestimmte Polymermischungen gehärtet werden können, jedoch Findet sich hier keine Beziehung zum gattungsgemäßen Verfahren und den dabei auftretenden Problemen. In den US-Patentschriften 37 88 950 und 38 59 169 wird die Fotopolymerisation von Monomeren, zwecks Einschlusses von Mikroorganismen, beschrieben, wobei aber die weiter oben bereits erläuterten, auf die Verwendung von Monomeren zurückzuführenden Probleme auftreten. Dasselbe trifft für die US-PS 38 44 892 zu, bei der Enzyme durch Reaktion mit einem epoxyhaltigen Polymeren immobilisiert werden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, welches die Nachteile der bekannten Verfahren vermeidet und zu Produkten führt, die eine stabile Enzymaktivität aufweisen, wobei die eingeschlossenen Enzyme oder mikrobiellen Zellen in der Polymermatrix bei steuerbarer Permeabilität derselben zuverlässig festgehalten werden sollen. Dabei soll weiterhin erreicht werden, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten neuartigen immobilisierten Enzyme oder mikrobiellen Zellen selbst gut verarbeitbar und nicht toxisch sind.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, welches

dadu.-ch gekennzeichnet ist, daß als Polymeres ein fotohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht 300 bis 30 000) verwendet wird, welches zwei oder mehr fotopolymerisierbare, äthylenisch ungesättigte Gruppen pro Molekül sowie nichtionische hydrophile Gruppen aufweist; und daß diet Mischung in situ mit aktinischer Strahlung bestrahlt wird.

Im Unterschied zu dem Verfahren der gattungsgemäßen Art, bei dem wasserlösliche Monomere oder Polymere verwendet werden und die Härtung durch ionisierende Strahlung erfolgt, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren ein hydrophiles Polymeres, welches nicht wasserlöslich ist, in Suspension verwendet, wobei lediglich aktinische Strahlung zum Härten angewandt wird, die die Enzymaktivität nicht beeinträchtigt

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, dessen besonders bevorzugte Ausführungsformen! sich aus den Unteransprüchen ergeben, wird also eine wäßrige Suspension von Enzymen oder mikrobiellen Zellen mit einem nicht-ionisc&cji hydrophilen Harz gut gemischt und in die gewünschte Form gebracht. Dann folgt eine Polymerisation durch Bestrahlung mit aktinischen Strahlen von 2 500 bis 6000Ä Wellenlänge. Das nichtionische hydrophile Harz hat ein mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht von 300 bis 30 000, vorzugsweise zwischen 500 und 20 000, und weist zwei oder mehr fotopolymerisierbare, äthylenisch ungesättigte Gruppen pro Molekül auf.

Erfindungsgemäß wird das Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes bzw. Kunstharzes vor der Durchführung des Verfahrens so eingestellt, daß das Harz durch Substrate hindurchgeht, jedoch eingeschlossene Enzyme oder niikrobielle Zellen nicht freiläßt Das Material wird durch photohärtbare aktinische Strahlen in einem einzigen Schritt gehärtet, wodurch sich ein mechanisch stabiles, immobilisiertes Produkt ergibt. Das photohärtbare Harz weist vorzugsweise hydrophile Gruppen in einem derartigen Ausmaß auf, daß das Harz sich gleichmäßig mit der wäßrigen Lösung (Pufferlösung od. dgl.) mischt, welche die Suspension der hydrophilen Enzyme oder mikrobiellen Zellen enthält Die Aktivität der Enzyme oder der mikrobiellen Zellen kann auf diese Weise in einem sehr stabilen Zustand gehalten werden. Weiterhin werden die Enzyme oder mikrobiellen Zellen immobilisiert, ohne daß sie ihre Aktivität verlören. Im Unterschied von demjenigen Verfahren, bei dem Gammastrahlen oder Elektronenstrahlen verwendet werden, erfolgt während des Härtens kein Abbau der Aktivität der Enzyme oder der mikrobiellen Zellen, da erfindungsgemäß aktinische Strahlen verwendet werden.

Um die Enzyme oder mikrobiellen Zellen zu immobilisieren, sind zwei oder mehr photopolymerisierbare, äthylenisch ungesättigte Gruppen für jedes Molekül des photohärtbaren Harzes erforderlich. Wenn das zahlenmäßig mittlere Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes unter 300 liegt, ist zu besorgen, daß das gehärtete Produkt spröde wird, und zwar deshalb, weil die Linearität der Vernetzung oder Verzweigung niedrig ist. Wenn andererseits das mittlere zahlenmäßige Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes höher als 30 000 ist, so wird die Viskosität der Mischung aus Harzmaterial und der Enzym- oder mikrobiellen Zellsuspension hoch, wodurch die Verarbeitbarkeit des Harzes beeinträchtigt wird. Aus diesem Grunde sollte das mittlere zahlenmäßige Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes innerhalb des Bereiches von 300 bis 30 000, vorzugsweise zwiüchcn 500 bis 20 000, liegen.

Es hat sich gezeigt, daß die nachfolgenden Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren erzielt werden können, wenn Enzyme oder mikrobielle Zellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert wer-

den: Das photohärtbare Harz, welches nicht-ionische hydrophile Gruppen aufweist, wird von Monomeren mit niedrigen Molekulargewichten erzeugt Im nächsten Schritt wird die Mischung aus dem photohärtbaren Harz und der wäßrigen Dispersion aus Enzymen oder mikrobiellen Zellen (nachfolgend als »Enzym-Harz-Zusammensetzung« bezeichnet) durch Bestrahlung mit aktinischen Strahlen gehärtet Die Dimensionen der freien Räume im so erzeugten Polymergitter können also frei gesteuert werden. Das Freisetzen oder

is Abgaben von Enzymen oder mikrobiellen Zellen kann verhindert werden, wodurch sich wirtschaftliche Vorteile ergeben. Wenn das photohärtbare Harz durch Gammastrahlen öder Elektronenstrahlen gehärtet würde, so würde die Aktivität des Enzymes, welches in der Harzzusammensetzung enthalten ist reduziert weil die Energie von Gammastrahlen oder Elektronenstrahlen sehr groß ist Beim erfindungsgemäßen Verfahren tritt ein derartiger Nachteil jedoch nicht auf, weil hier ultraviolette Strahlen oder sichtbare Lichtstrahlen

verwendet werden, um die Enzymharzzusammensetzung zu härten. Infolgedessen kann die Enzymaktivität gut aufrechterhalten werden. Weiterhin hat die Tatsache, daß das Harzgerüst vorher gebildet wird und die Enzymharzzusammensetzung durch Kurzzeitbe- Strahlung mit aktinischen Strahlen gehärtet wird, zur Folge, daß eine Verringerung der Aktivität des Enzymes oder der mikrobiellen Zellen nicht auftritt Dies stellt einen Vorteil dar, der nicht erhalten werden könnte, wenn die Photohärtung unmittelbar erfolgte, um

S3 Polymere direkt aus niedermolekularen Monomeren zu erzeugen.

Weiterhin sind die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei also die Suspension aes Enzymes oder der mikrobiellen Zellen und das photohärtbare Kunstharz gemischt und anschließend die Mischung mit aktinischen Strahlen behandelt werden, sehr einfach. Zusätzlich hierzu werden keine niedermolekularen Monomeren, die allgemein toxisch sind, verarbeitet Die Arbeitsumgebung, in welcher der Härtungsschritt erfolgt, kann auf diese Weise stark verbessert werden. Wenn Enzyme oder mikrobielle Zellen dadurch immobilisiert werden, daß niedermolekulare Monomere Anwendung finden, wie es bei den herkömmlichen Verfahren der Fall ist, so koexistieren die Enzyme oder

-,ο mikrobiellen Zellen mit den restlichen Monomeren, so daß die Monomeren durch starkes Erhitzen, durch Säure- oder Alkalibehandlung oder auch durch Behandlung mit organischen Lösungsmitteln entfernt v/erden müssen. Auf diese Weise wird die Aktivität der Enzyme

r> oder mikrobiellen Zellen in nachteiliger Weise herabgesetzt Beim Verfahren nach der Erfindung hingegen kann das Restmonomere leicht in dem Schritt, in dem das photohärtbare Harz erzeugt wird, entfernt werden, d. h. also, ehe die Enzyme oder mikrobiellen Zellen eingeschlossen werden. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt kann also in der Nahrungsmittelindustrie sowie in der pharmazeutischen Industrie sicher gebraucht werden, bei denen ansonsten die Toxidität des verbleibenden Monomeres ein Problem darstellen würde. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß die Formgebung oder der Gießvorgang ohne Schwierigkeiten stattfinden können, weil sich das Härten mittels Bestrahlung in kurzer Zeit erfolgt und

das photohärtbare Harz in gewissem Ausmaß viskos ist Wenn die Enzyme oder mikrowellen Zellen in eine Membran oder einen Film eingebracht werden, können andere Harze in das photohärtbare Harz eingemischt werden, um die mechanische Festigkeit des so erzeugten Film- oder Folienproduktes zu verbessern. Auch können vorab starke Bindungen in die Moleküle des photohärtbaren Harzes eingeführt werden. Die mechanische Festigkeit der immobilisierten Enzyme oder mikrobiellen Zellen kann also frei kontrolliert werden. Je nach Bedarf kann eine photohärtbare Harzlösung, welche ■Enzyme oder mikrobielle Zellen enthält, imprägnierungsartig in ein anderes synthetisches oder natürliches Material eingebracht oder auf dieses aufgebracht werden, beispielsweise in bzw. auf Substrate, woraufhin dann die Härtung mittels Bestrahlung mit aktinischen Strahlen erfolgt

Jedwedes der oben angegebenen photohärtbaren Harze kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, jedoch sind nachfolgend einige Beispiele angegeben.

Photohärtbare Harze

Aus Polyäthylenglykol und Acryl- oder Methacrylsäure hergestellte Polyester; Diester aus ungesättigter Monokarbonsäure, hergestellt aus zwei Molen von Acryl- oder Methacrylsäure und einem Mol von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 600 bis 10 000; und Veresterungsprodukte aus ungesättigter Karbonsäure, hergestellt aus drei Molen Acryl- oder Methacrylsäure, η Molen einer tribasischen Säure, wie

beispielsweise Trimellitsäure und ^ (n + 1) Molen

Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 600 bis 10 000.

Urethanisierte Adducte von Polyäthylenglykol und
2-Hydroxyäthylacrylat oder Methacrylat

Urethanisierte Produkte, die aus π Molen von Diisoc>anat, wie Tolylen Diisocyanat, Xylol Diisocyanat, Isophoron Diisocyanat und Hexamethylendiisocyanat, /J-I Molen von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 800 bis 10 000, und zwei Molen einer ungesättigten Monohydroxyverbindung, wie beispielsweise 2-Hydroxyäthylacrylat oder Methacrylat, hergestellt sind; urethanisierte Produkte, wie aus η Molen Triisocyanat, wie Desmodur L (Warenzeichen der Firma Farbenfabriken Bayer AG), n— 1 Molen Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 800 bis 10 000 und π + 2 Molen 2-Hydroxyäthylacrylat oder Methacrylat hergestellt sind; und urethanisierte Produkte, difc aus zwei Molen Diisocyanat, 1 Mol Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 400 bis 10 000 und 2 Molen einer ungesättigten Monohydroxyverbindung, wie 2-Hydroxyäthylacrylat oder Methacrylat hergestellt sind.

Ungesättigte Cellulose

Adduct von wasserlöslichen Cellulosen, wie CeIIuIoseacetatphthalat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat und Hydroxyäthylcellulose mit ungesättigten Glycidylverbindungen, wie Glycidylacrylat und Glycidylmethacrylat oder ungesättigten Säureanhydriden, wie Itakonsäureanhydrid und Maleinanhydrid.

Ungesättigte Polyamide

Ungesättigtes P ,lyamid, welches durch Hinzufügen des Adductes von 1 Mol Diisocyanat, wie Toiylendiisocyanat und Xyloldiisocyanat, und 1 Mol einer ungesättigten Hydroxylverbindung, wie 2-Hydroxyätliylacrylat, zu einem wasserlöslichen Polysunid, wie beispielsweise Gelatine, hergestellt sind.

Das Verfahren nach der Erfindung läßt sich auf verschiedene Arten von Enzymen und mikrobipllen Zellen anwenden. Diese werden effektiv immobilisiei t, ohne daß ihre Aktivität verloren geht

Nachfolgend werden die Enzyme und mikrobielle

ίο Zellen, bei denen die Erfindung angewendet werden kann, an Hand von Beispielen erläutert Es ist aber zu beachten, daß es sich dabei um nicht-begrenzende Beispiele handelt

Enzyme

Urease, Glykoseoxidase, Küitalase, Glukoamylase, Glukoseisomerase, Invertase, Gl jkoseoxidase-Katalase, Lactase, D-Aminosäureoxidase, a-Galaktosidase, Aminoacrylase, Aspertase und Penizillinamidase.

MikrohieUc 2.?!!en

Zellen von Lactobacillus bulgaricus, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Azotobacter vinelandii und Proteus vulgaris.

Um die Photopolymerisation beim erfindungsgemäßen Verfahren zu beschleunigen, können bekannte Photosensibilisatoren der Enzymharzzusammensetzung zugesetzt werden.
Beispiele für derartige Photosensibilisatoren sind Λ-Karbonylalkohole, wie Benzoin und Acetoin; Acyloinäther wie Benzoinmethyläther, Benzoinäthyläther, Benzoinisopropyläther, Anisoinäthyläther und Pivaloinäthyläther; α-substituierte Acyloine, wie «-Methylbenzoin und «-Methoxybenzoin; Polycyclische aromatische Verbindungen, wie Naphthol und Hydroxyanthracen; Azoamide wie beispielsweise 2-Cyar.o-2-Butylazoformamid; und Metallsalze, wie Uranylnitrat und Eisenchlorid. Weiterhin können auch Merkaptane, Disulfide, Halogenide und Farbstoffe verwendet werden.

w Diese Photosensibilisatoren werden entweder allein oder ais Mischung von zwei oder mehreren derselben im Verhältnis von 0,2 bis 7 Gew.-%, bezogen auf die photohärtbaren Harze, verwendet

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Enzymharzzusammensetzung zunächst in die gewünschte Form gebracht, woraufhin dann die Zusammensetzung mit aktinischer Strahlung behandelt wird. Solange die aktinischen Strahlen auf die zu härtende Zusammensetzung auftreffen, kann die Zusammensetzung in jedwede

in gewünschte Form und Dicke gebracht werden, und zwar mit oder ohne Behälter oder Umhüllung. Beispielsweise kann die Zusammensetzung auf die Oberfläche eines Artikels aufgebracht werden. Auch kann die Zusammensetzung auf ein anderes Material auflaminiert verden, auch in einen transparenten Behälter eingebracht werden. Schließlich ist ein Einimprägnieren in ein poröses Material möglich. Fernerhin kann die Zusammensetzung auch unter Bestrahlung irei strömen. Die Artikel, die mit der

M> Zusammensetzung versehen werden wollen, können beliebiger natürlicher oder synthetischer Art sein, einschließlich gestrickter oder gewebter Bekleidungsstücke oder Textilien, Metallerzeiugnissen od. dgl.

Als Lichtquelle für die aktinische Strahlung ist jedwedes Gerüt geeignet, welches Lichtstrahlen im Bereich von 2 500 bis 6 000 A Wellenlänge abgibt. Als Beispiele für derartige Lichtquellen sind Hochdruckquecksilberlampen, Niederdnickqueckvlberlamperi,

Fluorescenzlampen, Xenonlampen, Kohlelichtbögen sowie Sonnenbestrahlung zu nennen. Die Bestrahlungszeit liegt allgemein zwischen 1 Minute und zehn Minuten. Es ist vorteilhaft, Lichtstrahlen in einer Atmosphäre aus einem Inertgas einwirken zu lassen, um die Bestrahlungszeit herabzusetzen.

Nachfolgend wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen iin einzelnen erläutert. In den Ausführungsbeispielen, wenn nicht anders angegeben, Teile und Prozente immer bezogen auf das Gewicht angegeben.

Beispiel I

Aus 90 Teiien NK-Ester 23G (Warenzeichen eines Dimethacrylates von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1 000, hergestellt durch die Firma Shin Nakamura Chemical Ind. Ltd., japan), IO Teilen einer 0J5%igen wäßrigen Lösung von Glukoseoxidase (mit Katalasegehalt), aufgelöst in einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung pH-Wert von 5,6, und einem Teil Benzoinäthyläther wurde eine einheitliche Mischung hergestellt. In die so hergestellte, gemischte Lösung wurde eine Plantinelektrode eingetaucht. Die gemischte Lösung, mit der darin befindlichen Elektrode, wurde bei einer Temperatur von weniger als 25°C fünf Minuten lang mittels einer Niederdruckquecksilberlampe aus um die Elektrode liegenden Richtungen bestrahlt. Auf diese Weise wurde die Elektrode mit einem immobilisierten Enzym bedeckt. Die genannte Elektrode und eine andere Bleielektrode, als Gegenelektrode, wurden in eine 0,l%igen Glukoselösung eingetaucht, woraufhin eine elektrische Messung erfolgte, als deren Ergebnis das durch die Glukose bewirkte Verhalten der Elektroden beobachtet wurde.

Beispiel 2

Ein photohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht: 2160) wurde aus einem Mol Xyloldiisocyanat, 750 g Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1 500 und 1,1 Mol von 2-Hydroxyäthylmethacrylat hergestellt. Weiterhin wurden 85 Teile des so hergestellten photohärtbaren Harzes, 15 Teile 0,l%iger Pufferlösung von Urease, und 2 Teile von Benzoinmethyläther innig miteinander vermischt. Eine Glasplatte von 3 mm wurde horizontal angeordnet. Auf der Glasplatte wurde ein quadratischer Rahmen (5 cm χ 5 cm) als Innenabmessung) mittels Abstandshaltern von 1 mm Dicke gebildet. Die so erhaltene Mischung würde in den Innenbereich des Rahmens auf der Glasplatte gegossen. Auf die Glasplatte wurde in dichter Anordnung eine Polyesterplatte mit einer Dicke von 04 mm aufgelegt Dann erfolgte eine Bestrahlung bei einer Temperatur von weniger als 35° C für 2 Minuten mittels einer 2-kW-Hochdruckquecksilberlampe, die in einem Abstand von 5 cm oberhalb der Polyesterplatte angeordnet wurde. Hierdurch entstand ein transparentes immobilisiertes Enzymprodukt Der Enzymfilm wurde dann dreimal mit jeweils 200 ml destillierten Wassers abgespült und in 100 ml einer 0,01 molaren Harnstofflösung eingetaucht, die mit einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung präpariert war. Dann ließ man Harnstoff 30 Minuten lang bei 30° C reagieren. Dann wurden 5 ml der Reaktionslösung herausgenommen. Nach der Zusetzung von 5 ml von 0,1 N-HCL zu der Lösung, wurde diese mit 0,1 N-NaOH zurücktitriert Als Resultat dieses Versuches ergab sich, daß das Aktivitätsverhältnis zu demjenigen des natürlichen Enzymes 68% betrug.

Beispiel 3

Ein photohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht: 2160) wurde aus einem Mol Xyloldiisocyanat, 750 g Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1 500 und 1,1 Molen 2-Hydroxyäthylmethacrylat hergestellt. Weiterhin wurden 65 Teile dieses photohärtbaren Harzes, 20Teile NK-Ester M-9G (Warenzeichen für Methacrylat aus Methoxypolyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 400, hergestellt durch die Firma Shin Nakamura Chemical Ind. Ltd.), 1 Teil Benzoinäthyläther und 15 Teile der durch Dispersion von 100 g Glukoseisomerase in 100 ml Pufferlösung hergestellten Lösung einheitlich miteinander vermischt.

Ein Teströhrchen aus Glas mit einem Außendurchmesser von 19 mm wurde konzentrisch in einem anderen Reagenzglas mit einem Innendurchmesser von 22 mm angeordnet. Die oben angegebene, gemischte Lösung wurde in den Zwischenraum zwischen den beiden Glasröhrchen eingegossen. Dann erfolgte die Bestrahlung bei einer Temperatur von weniger als 35° C 3 Minuten lang, wobei vier 500-W-Hochdruckquecksilberlampen aus vier Richtungen senkrecht an den Längswänden der Teströhrchen eingesetzt wurden. Hierdurch ergab sich ein rohrförmiges, transparentes, festes Produkt Das rohrförmige Produkt wurde mit 10 ml von 2%iger Glukosephosphatpufferlösung gefüllt, die Magnesiumionen enthielt und bei 50⁰C gehalten. Die Flüssigkeit, welche durch den rohrförmigen Film hindurchdiffundierte, wurde gesammelt Die Farbe wurde mittels der Zystein-Karbazol-Meihode entwikkelt, um so die Bildung von Fruktose durch Colorimetry bei 560 Γημ Wellenlänge zu messen. Als Resultat ergab sich, daß 93% der Glukose in Fruktose verwandelt

waren.

Beispiel 4

Eine Enzymlösung wurde hergestellt, indem 50 mg

4(i Invertase und 50 mg Glukoseisomerase zu 10 ml Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,0 hinzugefügt wurden. Zu dieser Enzymlösung wurden gleichmäßig 90 g Nk-Ester 23G (verwendet in Beispiel 1) und 1 g Benzoinäthyläther zugesetzt. Die vorstehende Mi-

4". schung wurde dann in den Beispiel 2 angegebenen Rahmen eingegossen, woraufhin ein 0,2 m dicke Polyesterfolie dicht auf die Mischung aufgelegt wurde. Dieser so erhaltene Film wurde bei einer Temperatur von weniger als 35°C 1 Minute lang unter Verwendung

>() einer Niederdruckquecksilberlampe bestrahlt, wodurch ein immobilisierter Enzymfilm entstand. Dieser Enzymfilm wurde in mehrere Stücke quadratischer Form mit einer Kantenlänge von 1 cm zerschnitten und dann dreimal mit 1 1 Wasser abgespült Die ausgeschnittenen Stücke wurden dann in 100 ml 2%iger Sucroselösung (pH: 7,0) als Substrat eingetaucht, woraufhin eine Reaktion für 60 Minuten bei 45° C erfolgte. Die erzeugte Fruktose wurde nach der Zystein-Karbazol-Methode analysiert, wobei sich ergab, daß das Verhältnis der

μ Aktivität zu derjenigen des ursprünglichen Enzyms 45% betrug.

Beispiel 5

Aus 90 Gewichtsteilen NK-Ester 23G (verwendet in &5 Beispiel 1), 10 Teilen Proteus vulgaris also mikrobieUen Zellen, suspendiert in einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0, unds 1 Teil Benzoinmethyläther wurde eine gleichförmige Mi-

schung hergestellt. Diese Mischung wurde auf einen Gazestreifen aufgebracht, wobei sich ein 0,5 mm dicker Film ergab. Da'.w wurde eine 0,3 mm dicke transparente Polyesterplatte hierauf angeordnet. Dann erfolgte eine Bestrahlung bei einer Temperatur unterhalb 25°C für 3 Minuten mittels einer Niederdruckquecksilberlampe, die U 5 cm Abstand oberhalb angeordnet war. Nach der Beschichtung wurde die Polyesterplatte abgezogen, wodurch sich ein immobilisiertes Produkt aus mikrobiellen Zellen ergab, welches die Gaze als Träger aufwies.

Beispiel 6

Aus einem Mol Hydroxyäthylacrylat, einem Mol Isophorondiisocyanat und 2 000 g Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4 000 wurde ein photohärtbares Harz hergestellt.

Dann wurden 100 Teile des so hergestellten phntnhänharen Harzes. 300 Teile einer 2%igen Pufferlösung (pH 4,5) von Glukoamylase, und ! Teil Benzoinäthyläther innig miteinander vermischt.

Ein Polyesterfilm mit einer Dicke von 0,2 mm wurde horizontal angeordnet, woraufhin ein quadratischer Rahmen (5 cm χ 5 cm als Innenabmessung) hergestellt wurde, indem Abstandshalter von 0,3 mm verwendet wurden. Dann wurde die oben beschriebene Mischung in den so auf den Polyesterfilm gebildeten Rahmen eingegossen. Auf der gemischten Lösung wurde eine Polyesterplatte mit einer Dicke von 0,2 mm dicht angeordnet. Dann erfolgte eine Bestrahlung bei einer Temperatur von weniger als 35°C für 3 Minuten mittels einer 2-kW-Hochdruckquecksilberlampe, die mit einem Abstand von 5 cm oberhalb der Polyesterplatte angeordnet wurde, wodurch ein transparentes, immobilisertes Enzymprodukt erhalten wurde.

Zehn Stücke dieses Enzymfilmes (5 mm χ 5 mm) wurden dreimal mit jeweils 10 ml destillierten Wassers abgewaschen und in 10 ml einer 10-mM-Maltaselösung eingetaucht, die mit McElvaine-Pufferlösung (pH: 4,5) präpariert war. Die Maltase ließ man dann 30 Minuten lang bei 40⁰C reagieren. Dann wurde 1 ml der Rpalctinnslnsiin? hpraiiscennmmpn Dip tJphilHptp ΠΙπ-kose wurde mittels eines Glukostaten gemessen, der durch die Firma Worthingtom Biochemical Corp. hergestellt wurde. Als Resultat dieser Untersuchung ergab sich, daß das Aktivitätsverhältnis, bezogen auf native Enzyme, 65% betrug.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum biologischen Festlegen von Enzymen oder mikrobiellen Zellen, bei dem eine wäßrige Dispersion von Enzymen oder mikrobiellen Zellen einerseits und einem durch Bestrahlung härtbaren Polymeren andererseits hergestellt und die Mischung anschließend zum Härten bestrahlt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymeres ein fotohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht 300 bis 30 000) verwendet wird, welches zwei oder mehr fotopolymerisierbare, äthylenisch ungesättigte Gruppen pro Molekül sowie nicht-ionische hydrophile Gruppen aufweist; und daß die Mischung in situ mit aktinischer Strahlung bestrahlt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mittlere zahlenmäßige Molekulargewicht des fotohärtbaren Harzes zwischen 500 und 20 000 liegt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlänge der aktinischen Strahlung im Bereich von 2 500 bis 6 000 Ä liegt

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischung des fotohärtbaren Harzes ein Reaktionszusatz aus einem Polymerisationsinitiator und/oder einem Fotosensibilisator zugesetzt wird.

5. Biologisch immobilisierte Enzyme oder mikrobielle Zellen, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche.