DE2629692A1

DE2629692A1 - Verfahren zum biologischen festlegen von enzymen oder mikrobiellen zellen, sowie danach hergestellte erzeugnisse

Info

Publication number: DE2629692A1
Application number: DE19762629692
Authority: DE
Inventors: Saburo Fukui; Kanagawa Hiratsuka; Takamitsu Iida; Tsutomu Yamamoto
Original assignee: Kansai Paint Co Ltd
Current assignee: Kansai Paint Co Ltd
Priority date: 1975-11-26
Filing date: 1976-06-29
Publication date: 1977-06-08
Also published as: JPS5266681A; DE2629692C3; DE2629692B2; GB1550465A; JPS5520676B2

Description

KAESAI PAUST CO. LTD., 365, Kanzaki, Amagasaki-shi, Eyogoken, Japan und SABUSO FJKlJI, 7~2Q3, Hagaoka-tenjin Haitsu, 4-, Hachijogaoka 1-chome, ITagaokakyo-shi, Kyoto-fu, Japan

Verfahren zum "biologischen Festlegen von Enzymen oder mikrobiellen Zellen, sowie danach hergestellte Erzeugnisse

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zum "biologischen Festlegen von Enzymen oder mikro"bieilen Zellen.

Gegenstand der Erfindung bildet also speziell ein Verfahren zum biologischen !festlegen oder Immobilisieren von iaikrobiellen Zellen, und insbesondere ein Verfahren zum Herstellen immobilisierter Enzyme oder laikrobiellen Zellen, die leicht verarbeitbar sind und durch Verwendung hydrophiler, photohärtbarer oder photopolymerisierbarer Harze erzeugt werden, v'3ic':"'-i? pro Molekül zveL oder nshr photopolyueTxsi

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äthylenisch ungesättigte Gruppen aufweisen.

Um die Instabilität der Enzymaktivität auf ein Minimum zu "bringen und kontinuierliche enzymatisch^ Prozesse zu erleichtern, wird seit !Teuerem -Jas Verfahren der Immobilisierung und logischen Pestsetzung der Enzyme angewendet, wobei diese dann als' fester Katalysator verwendet werden. Dies ist seit Kürzerem in verschiedenen Industriezweigen versucht worden.

Als Verfahren zum Herstellen der immobilisierten Enzyme sind ein Absorptionsverfahren, ein kovalentes Bindungsverfahren, ein Vernetzungsverfahren sowie ein Einschließungsverfahren bekannt. Bei dem letztgenannten Einschließungsverfahren wird das Enzym selbst nicht an eine Matrix gebunden, sondern wird im Feingitter eines Geles eingeschlossen oder in mikroskopischen Maßstab eingekapselt. Die Enzymaktivität des Produktes kann auf diese Weise wirksam gehalten werden, wobei verschiedene Arten von Enzymen und mikrobiellen Zellen nach diesem Verfahren behandelt werden können. Um das Verfahren ausführen zu können, ist es jedoch erforderlich, daß ein immobilisierendes Material zur Verfugung steht, welches Enzyme oder mikrobielle Zellen einschließt, ohne daß bereits eingeschlossene Enzyme· freigelassen werden, wobei das Material weiterhin eine selektive Permeabilität für das Substrat, wenn erforderlich, aufweisen muß.

Beim herkömmlichen Einschlußverfahren wird eine wässrige Suspension von Enzymen oder mikrobiellen Zellen mit niedermolekularen, hydrophilen Monomeren, wie beispielsweise Acrylamidhydroxyäthylmethacrylat, Hydroxyäthylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat und Hydroxypr^pylacrylat, gemischt· Die Mischung wird, wie sie ist, durch Polymerisation immobili-

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siert. Bei diesem Verfahren ist es jedoch schwierig, in zuverlässiger V/eise selektive Permeabilität der erhaltenen Polymermatrix zu steuern, wie es notwendig ist, damit die eingeschlossenen Enzyme oder mikrobiellen Zellen nicht freigegeben werden. Zusätzlich hierzu ist die Toxizität des immobilisierten Produktes zu beachten, die von Bedeutung ist, wenn das Produkt in der Nahrungsmittelindustrie und pharmazeutischen Industrie verwendet wird, da nicht umgesetzte molekulare Monomere im Reaktionsprodukt verbleiben.

Dementsprechend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Herstellung neuartiger, immobilisierter Enzyme oder mirkobieller Zellen zu schaffen, welches verschiedene Vorteile aufweist. Dabei sollen nicht nur die Fachteile der bekannten Erzeugnisse verwendet werden, sondern die immobiliserten Enzyme oder mikrobiellen Zellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbar sind, sollen sich vom industriellen Standpunkt aus mit Nutzen und in wirtschaftlicher V/eise am/enden lassen, indem nämlich die Enzymaktivität stabil sein soll und die eingeschlossenen Enzyme oder mikrobiellen Zellen gut in der Matrix zurückerhalten werden sollen. Selbstverständlich betrifft die Erfindung auch die neuartigen, immobilisierten Enzyme oder mikrobiellen Zellen selbst, wobei diese gut verarbeitbar und nicht toxisch sein sollen.

Erfindungsgemäß wird die vorstehend definierte Aufgabe durch ein Verfahren nach der Erfindung gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zunächst eine wässrige Dispersion von Enzymen oder mikrobiellen Zellen einem photohärtbaren Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht: 500 bis 30.000), welches zwei oder mehr photopolymerisierbare, äthylenisch ungesättigte Gruppen pro Molekül sowie nicht ionische hydrophile Gruppen aufweist, gemischt wird; und daß dann die Mischung mit aktinischer

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Strahlung bestrahlt wird.

Nach dem Verfahren, wie es die Erfindung vorschlägt, wird also eine wässrige Suspension von Enzymen oder mikrobiellen Zellen mit einen nicht-ionischen hydrophilen Harz gut gemischt und in die gewünschte Form gebracht. Dann folgt eine Polymerisation durch Bestrahlung mit aktinischen Strahlen von 2.5OO bis 6.000 S Wellenlänge. Das nicht-ionische hydrophile Harz hat ein mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht von 300 bis 3O.OOO, vorzugsweise zwischen 500 und 20.000, und weist zwei oder mehr photopolymerisierbare, äthylenisch ungesättigte Gruppen pro Molekül auf.

Erfindungsgemäß wird das Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes bzw. Kunstharzes vor der Durchführung des Verfahrens so eingestellt, daß das Harz durch Substrate hindurchgeht, Jedoch eingeschlossene Enzyme odei" mikrobielle Zellen nicht freiläßt. Das Material wird durch photohärtbare aktinische Strahlen in einem einzigen Schritt gehärtet, xirodurch sich ein mechanisch stabiles, immobilisiertes Produkt ergibt. Das photohärtbare Harz weist vorzugsweise hydrophile Gruppen in einem derartigen Ausmaß auf, daß das Harz sich gleichmäßig mit der wässrigen Lösung (Pufferlösung oder dergleichen) mischt, welche die Suspension der hydrophilen Enzyme oder mikrobiellen Zellen enthält. Die Aktivität der Enzyme oder der mikrobiellen Zellen kann auf diese Weise in einem sehr stabilen Zustand gehalten werden.Weiterhin werden die Enzyme oder mikrobiellen Zellen immobilisiert, ohne daß sie ihre Aktivtät verlören. Im Unterschied von demjenigen Verfahren, bei dem Gammastrahlen oder Elektronen strahlen verwendet werden, erfolgt während des Härtens kein Abbau der Aktivität der Enzyme oder der mikrobiellen Zellen, da erfindungsgemäß aktinische Strahlen verwendet werden.

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Um die Enzyme oder mikrobiellen Zellen zu immobilisieren, sind zwei oder mehr photopolymerisierbare, äthylenisch ungesättigte Gruppen für jedes Molekül des photohärtbaren Harzes erforderlich. Venn das zahlenmäßig mittlere Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes unter JOO liegt, ist zu besorgen, daß das gehärtete Produkt spröde wird, und zwar deshalb, weil die Linearität der Vernetzung oder Yerzvieigung niedrig ist. Wenn andererseits das mittlere zahlenmäßige Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes höher als 30.000 ist, so xfird die Viskosität der Mischung aus Harzmaterial und der Enzym- oder mikrobiellen Zellsuspension hoch, wodurch die Verarbeitbarkeit des Harzes beeinträchtigt wird. Aus diesem Grunde sollte das mittlere zahlenmäßige Molekulargewicht des photohärtbaren Harzes innerhalb des Bereiches von 300 bis 30.000, vorzugsweise zwischen 500 bis 20.000, liegen.

Es hat sich gezeigt, daß die nachfolgenden Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren erzielt werden können, wenn Enzyme oder mikrobielle Zellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert werden; Das photohärtbare Harz, welches nicht-ionische hydrophile Gruppen aufweist, wird von Monomeren mit niedrigen Molekulargewichten erzeugt. Im nächsten Schritt wird die Mischung aus dem photohärtbaren Harz und der wässrigen Dispersion aus Enzymen oder mikrobiellen Zellen (nachfolgend als "Enzym-Harz-Zusammensetzung" bezeichnet) durch Bestrahlung mit aktinischen Strahlen gehärtet. Die Dimensionen der freien Räume im so erzeugten Polymergitter können also frei gesteuert werden. Das Freisetzen oder Abgeben von Enzymen oder mikrobiellen Zellen kann verhindert werden, wodurch sich wirtschaftliche Vorteile ergeben. Wenn das photohärtbare Harz durch Gammastrahlen oder Elektronenstrahlen gehärtet würde, so würde die Aktivität des Enzj/mes, v/elcaos in der Harzzusammen-

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Setzung enthalten ist, reduziert, weil die Energie von Gammastrahlen oder Elektronenstrahlen sehr groß ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren tritt ein derartiger- liachteil jedoch nicht auf, weil hier ultraviolette Strahlen oder sichtbare Lichtstrahlen verwendet werden, um die Enzymharzzusammensetzung zu härten. Infolgedessen kann die Enzynaktivität gut aufrecht erhalten werden. Weiterhin hat die Tatsache, daß das Harzgerüst vorher gebildet wird und die Enzymharzzusanimensetzung durch Kurzzeitbestrahlung mit aktinischen Strahlen gehärtet wird, zur Folge, daß eine Verringerung der Aktivität des Enzymes oder der.mikrobiellen Zellen nicht auftritt. Dies stellt einen Vorteil dar, der nicht erhalten werden könnte, wenn die Fhotohär— tung unmittelbar erfolgte, um Polymere direkt aus niedermolekularen Monomeren zu erzeugen.

V/eiterhin sind die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei also die Suspension des Enzymes oder der mikrobiellen Zellen und das photohärtbare Kunstharz gemischt und anschließend die Mischung mit aktinischen Strahlen behandelt werden, sehr einfach. Zusätzlich hierzu werden keine niedermolekularen Monomeren, die allgemein toxisch sind, verarbeitet. Die Arbeitsumgebung in welcher der Härtungsschritt erfolgt, kann auf diese Weise stark verbessert werden. Wenn Enzyme oder mikrobielle Zellen dadurch immobilisiert werden, daß niedermolekulare Monomere Anwendung finden, wie es bei den herkömmlichen Verfahren der Fall ist, so koexistieren die Enzyme oder mikrobiellen Zellen mit den restlichen Monomeren, so daß die Monomeren durch starkes Erhitzen, durch Säure- oder Alkalibehandlung oder auch duroh Behandlung mit organischen Lösungsmitteln entfernt werden müssen. Auf diese Weise wird die Aktivität der Enzyme oder mikrobiellen Zellen in nachteiliger Weise herabgesetzt. Beim Verfahren nach der Erfindung hingegen kann das Restmonomere

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leicht in dem Schritt, in dem das photohärtbare Harz erzeugt wird, entfernt werden, d.h. also, ehe die Enzyme oder mikrobiellen Zellen eingeschlossen werden. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt kann also in der Nahrungsmittelindustrie sowie in der pharmazeutischen Industrie sicher gebraucht werden, bei denen ansonsten-die Toxidität des verbleibenden Monomeres ein Problem darstellen würde. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß die Formgebung oder der G-ießvorgang ohne Schwierigkeiten stattfinden können, weil sich das Härten mittels Bestrahlung in kurzer Zeit erfolgt und das photohärtbare Harz in gewissem Ausmaß viskos ist. Wenn die Enzyme oder mikrobiellen Zellen in eine Membran oder einen Film eingebracht werden, können andere Harze in das photohärtbare Harz eingemischt werden, um die mechanische Festigkeit des so erzeugten Film- oder Folieproduktes zu verbessern. Auch können vorab starke Bindungen in die Moleküle des photohärtbaren Harzes eingeführt werden. Die mechanische Festigkeit der immobilisierten Enzyme oder mikrobiellen Zellen kann also frei kontrolliert werden. Je nach Bedarf kann eine photohärtbare Harzlösung, welche Enzyme oder mikrobielle Zellen enthält, imprägnierungsartig in ein anderes synthetisches oder natürliches Material eingebracht oder auf dieses aufgebracht werden, beispielsweise in bzw. auf Substrate, woraufhin dann die Härtung mittels Bestrahlung mit aktinischen Strahlen erfolgt.

Jedwedes der oben angegebenen photohärtbaren Harze kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, jedoch sind nachfolgend einige Beispiele angegeben.

Photohärtbare Harze:

Aus Polyäthylenglykol und Acryl- oder Methacrylsäure hergestellte Polyester; Diester aus ungesättigter Monokarbon-

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säure, hergestellt aus zwei Molen von Arcyl- oder Methacrylsäure und einem Mol von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 600 "bis 10.000; und Veresterungsprodukte aus ungesättigter Karbonsäure, hergestellt aus drei Molen Acryl- oder Methacrylsäure, η Molen einer tribasischen Säure, wie "beispielsweise Trimellitsäure und S (n + 1) Molen Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 600 "bis 10.000.

Urethan!sierte Adducte von Polyäthylenglykol und 2-Hydroxyäthylacrylat oder Msthacrylat:

Urethanisierte Produkte, die aus η Molen von Diisocyanate wie Tolylen Diisocyanat, ZyIo1 Diisocyanat, Isophoron Diisocyanat und Hexamethylendiisocyanat, n-1 Molen von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 800 "bis 10.000- und zwei Molen einer ungesättigten Konohyd rohrverbindung, wie "beispielsweise 2-Hydrosyäthylacrylat oder Methacrylat, hergestellt sind; urethanisierte Produkte, wie aus η Molen Triisocyanat, wie Desmodur L (Warenzeichen der Firma Farbenfabriken Bayer AG), n-1 Molen Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 800 bis 10.000 und n*2 Molen 2-Hydro3cyäthylacrylat oder Methacrylat hergestellt sind; und urethanisierte Produkte, die aus zwei Molen Diisocyanat, 1 Mol Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4-00 bis 10.000 und 2 Molen einer ungesättigten Konohydroxyverbindung, wie 2-Hydroxyäthylacrylat oder Methacrylat hergestellt sind.

Ungesättigte Cellulose:

Adduct von wasserlöslichen Cellulosen, wie Celluloseaeetatphthalat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat und Hydroxyäthylcellulose axt ungesättigten GlycidylvorbJ.acivrL^fia., v/iä G-lycidylacrylat und C-lycidylmethacrylat oder ungesättigten Säureanhydriden, wie Itakonsäureanhydrid und Maleinanhydrid.

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Ungesättigte Polyamide:

Ungesättigtes Polyamid, welches durch Hinzufügen des Adductes von 1 Mol Diisocyanat, wie Tolylendiisocyanat und Xyloldiisocyanat, und 1 Mol einer ungesättigten Hydroxylverbindung, wie 2-Hydroxyathylacrylat, zu einem wasserlöslichen Polyamid, wie "beispielsweise Gelatine, hergestellt sind.

Das Verfahren, nach der Erfindurs-j läßt sich a.uf verschiedene Arten von Enzymen und mikrobiellen Zellen anwenden. Diese werden effektiv immobilisiert, ohne daß ihre Aktivität verloren geht.

nachfolgend werden die Enzyme und mikrobielle Zellen, bei denen die Erfindung· angewendet xverden kann, anhand von Beispielen erläutert. Es ist aber zu beachten, daß es sich dabei um nicht-begrensende Beispiele handelt.

Enzyme:

Urease, Glukoseoxidase, Katalase, Glukoamylase, Glukoseisoiaerase, Invertase, Glukoseoxidase-Katalase, Lactase, D-Aminosäureoxidase, oü-Galaktosidase, Aminoacrylase, Aspartase und Penizillinamidase.

Mikrobielle Zellen:

Zellen von Lactobacillus bulgaricus, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Azotobacter vinelandii und Proteus vulgar is .

TJ-Ji die Pliotopo^merisatiori beim erfindungsgemäßen Verfahren zu beschleunigen, können bekannte Photosensibilisatoren

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der.Enzymharzzusammensetzung zugesetzt werden.

Beispiele für derartige Photosensibilisatoren sind cL-Karbonylalkohole, wie Benzoin und Acetoin; Acyloinäther wie Benzoinmethyläther, Benzoinäthyläther, Benzoinis opropyläther, Anisoinäthyläther und Pivaloinäthyläther; oc-suhstituierte Acyloine, wie cÄ/-Methylbenzoin und d-Methoxybenzoin; Polycyclisch^ aromatische Verbindungen, wie Uaphthol und Hydroxyanthracen; Azoamide wie beispielsweise 2-Cyano-2-Butylazoformamid; und Metallsalze, wie üranylnitrat und Eisenchlorid. Weiterhin können auch Merkaptane, Disulfide, Halogenide und Farbstoffe verwendet werden.

Diese Photosensibilisatoren werden entweder allein oder als Mischung von zwei oder mehreren derselben im Verhältnis von 0,2 bis 7 Gew.-%, bezogen auf die photohärtbaren Harze, verwendet.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Enzymharzzusammensetzung zunächst in die gewünschte Form gebracht, woraufhin dann die Zusammensetzung mit aktinischer Strahlung < behandelt wird. Solange die aktinischen Strahlen auf die zu härtende Zusammensetzung auftreffen, kann die Zusammensetzung in jedwede gewünschte Form und Dicke gebracht werden, und zwar mit oder ohne Behälter oder Umhüllung. Beispielsweise kann die Zusammensetzung auf die Oberfläche eines Artikels aufgebracht werden. Auch kann die Zusammensetzung auf ein anderes Material auflaminiert werden, auch in einen transparenten Behälter eingebracht werden. Schließlich ist ein Einimprägnieren in ein poröses Material möglich. Fernerhin kann die Zusammensetzung auch unter Bestrahlung frei strömen. Die Artikel, die mit der Zusammensetzung versehen werden wollen, können beliebiger natürlicher oder synthetischer Art sein, einschließlich gestrickter oder gewebter Bekleidungsstücke oder Textilien,

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Metallerzeugnissen oder dergleichen.

Als Lichtquelle für die aktinische Strahlung ist jedwedes Gerät geeignet, welches Lichtstrahlen im Bereich von 2.5OO "bis 6.000 S Wellenlänge abgibt. Als Beispiele für derartige Lichtquellen sind Hochdruckquecksilberlampen, Hiederdruckquecksilberlampen, Fluoreseenzlampen, Xenonlampen, Kohlelichtbögen sowie Sonnenbestrahlung zu nennen· Die Bestrahlungszeit liegt allgemein zwischen 1 Minute und zehn Minuten. Es ist vorteilhaft, Lichtstrahlen in einer Atmosphäre aus einem Inertgas einwirken zu lassen, um die Bestrahlungszeit herabzusetzen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im einzelnen erläutert. In den Ausführungsbeispielen, wenn nicht anders angegeben, Teile und Prozente immer bezogen auf das Gewicht angegeben.

Beispiel 1

Aus 90 Teilen itfK-Ester 23G (Warenzeichen eines Dimethacrylates von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1.000, hergestellt durch die Firma Shin Hakamura Chemical Ind. Ltd., Japan), 10 Teilen einer 0,5 %igen wässrigen Lösung von Glukoseoxidase (mit Katalasegehalt), aufgelöst in einer 0,1-molaren Phosphatpufferlösung pH-Wert von 5,6, und einem Teil Benzoinäthyläther wurde eine einheitliche Mischung hergestellt. In die so hergestellte, gemischte Lösung wurde eine Plantinelektrode eingetaucht. Die gemischte Lösung, mit der darin befindlichen Elektrode, bei einer Temperatur von weniger als 25°C fünf Minuten lang mittels einer ITiederdruckquecksilberlampe aus um die Elektrode liegenden Eichtungen bestrahlt. Auf diese Weise wurde die Elektrode mit einem immobilisierten Snzyia bedeckt. Die

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genannte Elektrode und eine andere Bleielektrode, als Gegenelektrode, wurden in eine 0,1 %igen Glukoselösung eingetaucht, woraufhin eine elektrische Messung erfolgte, als deren Ergebnis das durch die Glukose "bewirkte Verhalten der Elektroden beobachtet wurde.

Beispiel 2

Ein photohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht: 2160) wurde aus einem Mol Xyloldiisocyanat, 750 g Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1.500 und 1,1 Mol von 2-Hydroxyäthylmethacrylat hergestellt. Weiterhin wurden 85 Teile des so hergestellten photohärtbaren Harzes, 15 Teile 0,1 %iger Pufferlösung von Urease, und 2 Teile von Benzoinmethyläther innig miteinander vermischte Eine Glasplatte von 3 mm wurde horizontal angeordnet. Auf der Glasplatte wurde ein quadratischer Rahmen (5 cm χ 5 c^ als Innenabmessung) mittels Abstandshaltern von 1 mm Dicke gebildet. Die so erhaltene Mischung wurde in den Innenbereich des Bahnsens auf der Glasplatte gegossen. Auf die Glasplatte wurde in dichter Anordnung eine Polyesterplatte mit einer Dicke von 0,5 sm aufgelegt. Dann erfolgte eine Bestrahlung bei einer Temperatur von weniger als 35°C für 2 Minuten mittels einer 2 kW-Hochdruckquecksilberlampe, die in einem Abstand von 5 cm oberhalb der Polyesterplatte angeordnet wurde. Hierdurch entstand ein transparentes immobilisiertes Enzymprodukt. Der Enzymfilm wurde dann dreimal mit jeweils 200 ml destillierten Wassers abgespühlt und in 100 ml einer 0,01-molaren Harnst off lösung eingetaucht, die mit einer 0,01-molaren Phosphatpufferlösung präpariert war. Dann ließ man Harnstoff 30 Minutenlang bei 30⁰C reagieren. Dann wurden 5 ml der Eeaktionslösung herausgenommen. Fach dem Zusetzung von 5 ml von 0,1 H-HCL zu der Lösung, wurde diese mit 0,1 IT-iiaOH zurücktitrierb. Als Resultat dieses Versuches ergab

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sich, daß das Aktivitätsverhältnis zu demjenigen des natürlichen Enzymes 68% "betrug.

Beispiel 3

Ein photohärtbares Harz (mittleres zahlenmäßiges Molekulargewicht: 2160) x^rurde aus einem Mol Xyloldiisocyanat, 750 S Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1.500 und 1,1 Molen 2-Hydroxyathylmethacrylat hergestellt. Weiterhin wurden 65 Teile dieses photohärtbaren Harzes, 20 Teile HK-Ester M-9G (Warenzeichen für Methacrylat aus Methoxypolyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4-00, hergestellt durch die Firma Shin Efakamura Chemical Ind. Ltd.), 1 Teil Benzoinäthyläther und 15 Teile der durch Dispersion von 100g Glukoseisomerase in 100 ml Pufferlösung hergestellten Lösung einheitlich miteinander vermischt.

Ein Teströhrchen aus aus Glas mit einem Außendurchmesser von 19 mm wurde konzentrisch in einem anderen Reagenzglas mit einem Innendurchmesser von 22 mm angeordnet. Die oben angegebene, gemischte Lösung wurde in den Zwischenraum zwischen den "beiden Glasröhren eingegossen. Dann erfolgte die Bestrahlung bei einer Temperatur von weniger als 35°C 3 Minuten lang wobei vier 5OO W-Hochdruckquecksilberlampen aus vier Eichtungen senkrecht an den Längswänden der Teströhrchen eingesetzt worden. Hierdurch ergab sich ein rohrförmiges, transparentes, festes Produkt. Das rohrförmige Produkt wurde mit 10 ml von 2%iger Glukosephosphatpufferlösung gefüllt, die Magnesiumionen enthielt und bei 50⁰C gehalten. Die Flüssigkeit, welche durch den rohrförmigen Film hindurchdiffundierte, wurde gesammelt. Die Farbe wurde mittels der Zystein-Karbazol-Kethode entwickelt, um so die Bildung von Fruktose durch Coloeimetry bei 560 in/u Wellenlänge zu messen. Als Resultat ergab sich,, daß 93% der Glukose in Fruktose verwandelt waren.

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Beispiel 4-

Eine Enzymlösung wurde hergestellt, indem 50 mg Invertase und 50 mg G-lukoseisomerase zu 10 ml Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7*0 hinzugefügt wurden. Zu dieser Enzymlösung wurden gleichmäßig 90g NK-Ester 23G- (verwendet in Beispiel 1) und 1 g Benzoinäthyläther zugesetzt» Die vorstehende Mischung wurde dann in den Beispiel 2 angegebenen Rahmen eingegossen, woraufhin ein 0,2 m dicke Polyesterfolie dicht auf die Mischung aufgelegt wurde. Dieser so erhaltene Film wurde bei einer Temperatur von weniger als 35°C 1 Minute lang unter Verwendung einer Iiiederdruckquecksilberlampe bestrahlt, wodurch ein immobilisierter Enzymfilm entstand. Dieser Enzymfilm wurde in mehrere Stücke quadratischer Form mit einer Kantenlänge von 1 cm zerschnitten und dann dreimal mit 1 1 V/asser abgespült. Die ausgeschnittenen Stücke wurde dann in 100 ml 2%iger Sucroselösung (pH: 7,0) als Substrat eingetaucht, woraufhin eine Reaktion für 60 Minuten bei 4-5 C erfolgte. Die erzeugte Fruktose wurde nach der Zystein-Karbazol-Methode analyisert, wobei sich ergab, daß das Verhältnis der Aktivität zu derjenigen des ursprünglichen Enzyms 4-5% betrug.

Beispiel 5

Aus 90 Gewichtsteilen HK-Ester 23G- (verwendet in Beispiel 1), 10 Teilen Proteus vulgaris also mikrobiellen Zellen, suspendiert in einer 0,1-molaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7»O, und 1 Teil Benzoinmsthyläther wurde eine gleichförmige Mischung hergestellt. Diese Mischung wurde auf einen Gazestreifen aufgebracht, wobei sich ein 0,5 mm dicker Film ergab. Dann wurde eine 0,3 mm dicke transparente Polyesterplatte hierauf angeordnet. Dann erfolgte eine Bestrahlung bei einer Temperatur unterhalb 25°C für 3 Minuten mittels einer Fiederdruckquecksilberlampe,. die in 5 cm Ab-

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stand oberhalb angeordnet war. Naeh der BeSchichtung wurde die Polyesterplatte abgezogen, wodurch sich ein immobilisertes Produkt aus mikrobiellen Zellen ergab, welches die Gaze als Träger aufwies.

Beispiel 6

Aus einem Mol Hydroxyäthylacrylat, einem Mol Isophorondiisocyanat und 2.000g Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4.000 wurde ein photοhärtbares Harz hergestellt.

Dann wurden 100 Teile des so hergestellten photohärtbaren Harzes, 300 Teile einer 2%igen Pufferlösung (pH 4,5) von Glukoamylase, und 1 Teil Benzoinäthyläther innig mitein-■ and er vermi seht.

Ein Polyesterfilm mit einer Dicke von 0,2 mm wurde horizontal angeordnet, woraufhin darauf ein quadracischer Rahmen (5cei χ 5 cm als Innenabmessung) hergestellt wurde, indem Abstandshalter von 0,3 mm verwendet wurden.Dann wurde, die oben beschriebene Mischung in den so auf den Polyesterfilm gebildeten Rahmen eingegossen. Auf der gemischten Lösung wurde eine Polyesterplatte mit einer Dicke von 0,2 mm dicht angeordnet. Dann erfolgte eine Bestrahlung bei einer Temperatur von weniger als 35°C für 3 Minuten mittels einer 2-kW-Hochdruckquecksilberlampe, die mit einem Abstand von 5 cm oberhalb der Polyesterplatte angeordnet wurde, wodurch ein transparentes, immobilisertes Enzymprodukt erhalten wurd e.

Zehn Stücke dieses Enzymfilmes (5 mm χ 5 mm) wurden dreimal mit jeweils 10 ml destillierten Wassers abgewaschen und in 10 ml einer lO-mM-Maltaselosung eingetaucht, die mit Hcllvaine-Pufferlösung (pH: 4,5) prepariert war. Die Malfcase ließ man

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dann 30 Minuten lang "bei 40⁰G reagieren. Dann wurde 1 ml der Reaktionslösung herausgenommen. Die gebildete Glukose wurde mittels eines Glukostaten gemessen, der durch die Firma Worthingtom Biochemical Corp« hergestellt wurde. Als Resultat dioser Untersuchung ergab sich, daß das Aktivitätsverhältnis, bezogen auf native Enzyme, 65% betrug.

Die vorstehenden Ausführungsbeispiele dienen selbstverständlich nur zur Erläuterung des Erfindungsgedankens und begrenzen diesen nicht. Vielmehr sind innerhalb des Erfindungsgedankens mannigfache Abwandlungen und Ausgestaltungen möglich.

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Claims

262Ü6B2

ANSPRÜCHE

(T* "Verfahren zum "biologischen Festlegen von Enzymen oder mikrobiellen. Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst eine wässrige Dispersion von Enzymen oder mikrobiellen Zellen einem photohärbbaren Hars (mittleres zahlenmäßiges Kolekulargexiicht: JOO bis 30.000), welches zxirei oder -.-hr photopalymerisierbare, äthylenisch ungesättigte Grupp,·;:. pro Molekül sowie nicht-ionische hydrophile Gruppen aufweist, gemischt wird; und daß dann die Mischung mit aktinischer Strahlung bestrahlt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzyme Urease, Glukose oxidase, Eatalase, Glukoaaylase, Glukoseisomerase, Invertase, Glukoseoxidase-Katalase, Laktase, D-Amiriosäureoxidase, ©C-Galaktosidase, Aminoacylase, Aspartase und Penizillinamidase verwendet.werden; und daß als mikrobielle Zellen Zellen von Lactobacillus bulgaricus, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Azotobacter vinelandii und Proteus vulgaris "Verwendung finden.

3» Verfahren nach Anspruch 1 oder 2_t dadurch gekennzeichnet, daß das mittlere zahlenmäßige Molekulargewicht des photohärt-

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Daren Harzes zwischen 500 und 20.000 liegt.

l·. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das photohärtbare Harz wenigstens einer der Bestandteile der nachfolgenden Gruppe ist: Aus Polyäthylenglykol und Acryl- oder Methacrylsäure hergestellte Polyester, urethanisiertes Adduct aus dem aus Polyisozyanat und Polyäthylenglykol mit 2-Hydroxyäthylacrylat oder -methacrylat hergestellten Produktes, ungesättigte Zellulose ungesättigtes Polyamid oder dergleichen.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlänge der aktinischen Strahlung im Bereich von 2.500 bis 6.000 £ liegt.

6. Verfahren nach eines der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kisehung des photohärtbaren Harzes ein Reaktionszusatz aus einem Polymerisationsinitiator und/ oder einem Photoseiisibilisator zugesetzt wird.

7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionszusatz wenigstens einer der· Bastandteile der nachfolgenden Gruppe ist: st—Earbonylalkohol, Asyloinäther, o6-substituiertes Azyloin, polyzyklische aromatische Verbindungen, Azoamid, Metallsalze, Merkaptan, Disulfide, Halogenide und Farbstoffe.

8. Biologisch immobilisierende Enzyme oder mikrobieile Zellen, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche»

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