DE2551966B2 - Verfahren zum reinigen von urokinase - Google Patents
Verfahren zum reinigen von urokinaseInfo
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Description
Urokinase ist ein komplexes Protein, das in Spurenmengen im Urin des Menschen zu finden ist. Sie
stellt ein wirksames, Blutgerinnsel auflösendes Mittel dar und fördert bei Injektion in Mengen, welche die
natürlich im Urin vorkommenden weit überschreiten, die Auflösung von Bilutgerinnseln. Auf Grund ihrer
guten Wirkungsei wartung für die Behandlung von Thrombusemboliestörungen ist versucht worden, sie zu
isolieren und auf ein Wirkungsvermögen zu reinigen, das für die Auflösung von Blutgerinnseln des menschlichen
Blutes von Wert ist, und einen Reinheitsgrad zu erzielen, der dem direkten Einsatz zur Blutgerinnselauflösung
beim Menschen entspricht.
Es sind verschiedene Methoden zur Isolierung und partiellen Reinigung von Urokinase bekannt, z. B. die
Methode nach US-PS 29 83 647 und 32 56 158, bei denen
von Urin herrührende Urokinase Verwendung findet. Moderne Techniken arbeiten mit Gewebekuhuren als
Urokinasequelle. In diesem Falle hat sich bedauerlicherweise aber keine der bisher bekannten Reinigungsmethoden
oder irgendeine Kombination derselben als genügend erwiesen, um eine Urokinase zu erhalten, die
direkt als injektionsfähige Lösung verwendet werden kann.
Eine der bisher bekannten Methoden besteht im Hindurchleiten einer klaren, wäßrigen Urokinaselösung
durch eine bestimmte lonenaustauschsäule, wodurch zahlreiche Verunreinigungen entfernt werden und eine
höhere Konzentration reiner Urokinase im Eluat erhalten wird. Eine andere, in der obengenannten
US-PS 32 56 158 beschriebene Methode besteht in der Behandlung einer Urokinaselösung mit einem partiell
vernetzten DextrangeL Keine dieser Methoden ergibt eine Urokinase'ösung, die direkt für medizinische
Zwecke verwendet werden kann. Eine Kombination dieser Methoden ist ebenfalls ungenügend, wenn die
Urokinase aus menschlichem Gewebe vermehrt wird.
Aus der DT-OS 22 46 969 ist ein Verfahren zur
ίο Reinigung von Urokinase bekannt, wobei man eine
Urokinaselösung mit einer Leitfähigkeit von 15 bis 25 Millisiemens und einem pH-Wert von 6 bis 9 mit einem
Diäthylaminoäthylcelluloseharz mehrfach in Berührung bringt. Dieses Verfahren ist zu umständlich und ergibt
keine befriedigenden Resultate.
Die vorliegende Erfindung zielt besonders auf die Erzeugung einer Urokinaselösung höchster Reinheit bei
Anwendung in Verbindung mit älteren, bekannten Methoden zur Urokinasereinigung ab. Die Erfindung ist
speziell auf eine Einzelstufe gerichtet, die bei Ausführung in einer Arbeitsfolge mit bisher bekannten
v Urokinasereinigungsstufen eine Urokinaselösung von
noch nie in solch leichter Weise erreichter Reinheit ergibt.
Gemäß der Erfindung wird Urokinase gereinigt, indem man eine klare Lösung derselben in einem
wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 6 bis 9 und einer lonenstärke von 2,0 bis 5,0 Millisiemens (mmho.)
bildet, die Lösung in Kontakt mit gequollenen Körnern basischen Anionenaustauschharzes bringt, an das
tertiäres oder quaternäres Amin in einer Menge von mindestens 3,0 MilliäquivVg chemisch gebunden ist und
das eine durchschnittliche Korngröße im Bereich von 40 bis 120 Mikron hat, genügend Zeit gibt, damit das
Ionenaustauschharz bei einer Temperatur im Bereich zwischen 0° und dem Siedepunkt der wäßrigen Lösung
wirkt, und von dem Harz, an das eine wesentliche Menge der anfänglich anwesenden Verunreinigungen
adsorbiert ist, die Flüssigphase trennt.
Urokinase ist auch bei höheren Temperaturen verhältnismäßig stabil, so daß das erfindungsgemäße
Reinigungsverfahren bei Temperaturen bis zu etv/a 100° C durchgeführt werden kann. Bei einer Temperatur
von 100° C sind zwar Verluste an Urokinase zu erwarten, denn alle Proteine werden bei diesen
Temperaturen geschädigt. Aber diese Verluste sind minimal, denn das erfindungsgemäße Verfahren dauert
nur ein paar Minuten.
Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kann eine Urokinaselösung eingesetzt werden, die durch Hindurchleiten
durch eine zweckentsprechende Kationenaustauschsäule vorgereinigt worden ist. Wenn die
anfallende Urokinaselösung dann nach der Methode von US-PS 32 56 158 unter Verwendung eines nichtmodifizierten
Dextrangels behandelt wird, das mit etwa 6% Epichlorhydrin vernetzt ist, hat die anfallende Urokinase
einen höheren Reinheitsgrad als er jemals zuvor erzielt worden ist (von Methoden, die viel schwieriger
reproduzierbar, durchführbar oder in einem Maßstab, der über einen kleinen Laboratoriumansatz hinausgeht,
handhabbar sind, abgesehen). Eine solche: dreistufige, die neue Stufe gemäß der Erfindung umfassende
Arbeitsweise ergibt Urokinase in einer Reinheit, mit der die Urokinase unmittelbar für medizinische Zwecke
verwendbar ist.
Nach einer spezielleren Ausführungsform wird die Einstufenbehandlung gemäß der Erfindung durchgeführt,
indem man die lonenstärke der Urokinaselösung
auf 2,5 bis 3,5 Milliüiemens einstellt, wenngleich auch der
allgemeine Bereiclh von 2 bis 5 Millisiemens akzeptabel ist Bei einer ionenstiärke von unter 2 Millisiemens ist die
Urokinase nicht leicht löslich, und bei über 5 Millisiemens gehen die in der Lösung enthaltenden Verunreinigungen
eine zu schwache Bindung an das anionische Austauschharz ein, was zu einer unvollständigen
Entfernung derselben führt In ähnlicher Weise ergibt die Urokinase bei einem pH-Wert von unter 6 keine
richtige Bindung an das Harz, während sie bei einem pH-Wert von über 9 einer gewissen, unerwünschten
Modifizierung unterliegen kann, da Enzyme allgemein bei stark alkalischem Bedingungen unbeständig sind.
Bezüglich des an das anionische Austauschharz gebundenen tertiären oder quaternären Amins ist die
genannte Minimalmenge von 3,0 Milliiäquivalenten notwendig, um eine genügende Bindungskapazität für
die gewöhnlich mit Urokinase assoziierten Verunreinigungen sicherzustellen. In der Praxis wird die Menge
des an das Austauschbare gebundenen Amins 4,0 Milliäquivalante
nicht überschreiten; höhere Werte sind akzeptabel, aber nicht leicht erreichbar. Gewöhnlich
reicht etwa 1 g (Trockengewicht) des genannten Anionenaustauschharzes aus, um 2 bis 4 Millionen
Einheiten Urokinase zu reinigen, die man gewöhnlich in einem Volumen von etwa 7,51 Wasser vorlegen würde,
das entsprechend gepuffert ist und die obengenannte !onenstärke aufweist Vorzugsweise jedoch arbeitet
man mit dem etwa Doppelten der Harzmenge, um eine vollständige Entfernung von Verunreinigungen sicherzustellen.
Wenn das Harz eine Menge an tertiärem oder quaternärem Amin von über 4,0 Milliäquivalenten
enthält genügen kleinere Harzmengen für die gleiche Menge an Urokinase. In allen Fällen gewinnt man mit
dem einstufigen Prozeß gemäß der Erfindung etwa 85 bis 95% der ursprünglich in der Lösung vorliegenden
Urokinase.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne daß diese auf sie beschränkt
ist. Alle für die verschiedenen Stufen bei dieser Arbeitsweise genannten Reinheitsgrade sind in CTA-Einheiten
(International Standard) bei Absorption bei 280 Millimikron angegeben, ausgedrückt als Trockengewicht
in Form von Einheiten/mg an Protein, das leicht aus dem UV-Spekitrum errechenbar ist.
a) Urokinase, aus Gewebekulturmedium isoliert und ungefähr 200 CTA-Einheiten/mg an Urokinase enthaltend,
wurde durch Absorption auf kationischem Austauschharz isoliert, das in 0,05molarem Natriumphosphatpuffer
bei pH 6,25 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Urokinase wurde mit 0,5molarem,
y.weibasischem Natriumphosphat von pH 9,0 von dem
Harz eluiert Der Reinheitsgrad der auf diese Weise erhaltenen Urokinase war auf etwa 3500 CTA-Einheiten/mg
erhöht
b) Diese Urokinase wurde dann gegen 0,1 molaren Tris-ihydroxymethyiyaminomethan-acetat-Puffer von
pH 6,0 dialysiert und mit einer Suspension im Handel erhältlichen schwach basischen Dextrangels vermischt,
das mit 5 bis 15Gew.% Vinylbenzol vernetzt war und chemisch an sich gebunden 3,ö bis 4,0 Miliiäquivalanie/g
an Diäthylaminoäthain aufwies und eine durchschnittliche
Korngröße zwischen 40 und 120 Mikron hatte. Nach langsamem Bewegen dieser Mischung von etwa
15 Minuten Dauer wurde filtriert In dem anfallenden Filtrat lag Urokinase in einer Reinheit von 22 000 CTA-Einheiten/mg
gelöst vor.
c) Diese Urokinaselösung wurde dann über eine Säule mit modifiziertem Dextran-Gel, entsprechend der
Methode von US-PS 32 56 158, das in 2%igem Natriumchlorid in Gleichgewicht gebracht war (mit
O,22°/oigem Dinatriumversenate auf pH 6,5 gepuffert). Die eluierte Urokinase hatte nun einen Reinheitsgrad
von 64 000 CTA-Einheiten/mg.
Bei Weglassung der Stufe b) bei der obigen
ic Arbeitsweise hat die anfallende Urokinase eine Reiheit
von nur 18 000 CTA-Einheiten/mg. Diese Reinheit ist für den medizinischen Einsatz ungenügend, da sie der
Mindestspezifikation des »Committee on Thrombolytic Agents« (CTA) von 35 000 CTA-Einheiten/mg nicht
genügt
Während in dem vorstehenden Beispiel ein schwach basischer Anionenaustauscher verwendet wurde, arbeitet
das vorliegende Beispiel mit einem stark basischen Anionenautauscher. Das hier verwendete Material
weist funktioneile Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylchlorid-Gruppen auf.
Die Ai^stauscherkörner wurden 24 Stunden in
destilliertem Wasser quellen gelassen und dann in 0,05rnolarem Natriumphosphat/0,05molarem Natriumchlorid
bei pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht und in eine Glassäule von 0,8 cm Durchmesser und 110 cm
Höhe gepackt Durch diese Säule wurde eine Lösung von Urokinase mit einer Reinheit von 3000 CTA-Einheiten/mg
geleitet; das anfallende Eluat zeigte als Gehalt an Urokinase eine Reinheit von 21 000 Einheiten/mg.
Bei einer Säulen-Endpassage entsprechend Stufe c) von Beispiel 1 erhöhte sich die Urokinasepotenz auf
über 60 000 Einheiten/mg.
Bei einer Wiederholung von Stufe b) von Beispiel 1 unter Verwendung jedoch eines 0,1 molaren Tris-(hydroxymethyl)-aminoäthanphosphat-Puffers
bei pH 0,8 und Arbeiten von 3 bis 5° C erhöhte sich die Einheit der Urokinaselösung von 1900 auf 50 000 Einheiten/mg.
Bei einer Wiederholung dieses Beispiels mit einer 1100 Einheiten/mg enthaltenden Urokinaselösung ergab
sich eine Erhöhung der Reinheit auf 37 000 Einheiten/mg.
In ähnlicher Weise ergab eine Urokinaselösung, die mit 0,025molarem Natriumphosphat und 0,025molarem
Natriumchlorid bei pH 8 gepuffert war, bei Behandlung bei 3 bis 5°C eine Reinheitserhöhung von 900 auf
41 000 Einheiten/mg. Unter Einsatz des gleichen Puffersystems bei pH 6,0 wurde sowohl bei 0 bis 5° als auch bei
Raumtemperatur, ausgehend von einem Material mit 5500 Einheiten/mg eine Urokinase mit 15 000 Einheiten/mg
erhalten. Beide Produkte zeigten bei Passage über eine Sephadex-G-75-Säule, wie in Beispiel 1, c, eine
Potenzerhöhung auf 55 000 Einheiten/mg.
In den obigen Beispielen werden schwach oder stark basische Dextrangele als Anionenaustauscherharze
gemäß der Erfindungsdefinition eingesetzt, aber man kann als solche auch andere, routinemäßig als
Gelfiltrationsmaterialien verwendete polymere Materialien unter Erzielung gleich guter und zufriedenstellender
Ergebnisse einsetzen, wie Acrylharze.
Man erhält eine leichte Durchführbarkeit, indem man die entsprechend gepufferte Urokinaselösung der
obengenannten lonenstärke das Harz mindestens 15 Minuten kontaktieren läßt Eine längere Verweilzeit
ist für das Eintreten des Austausches nicht notwendig, da die Verunreinigungen einer fast sofortigen Bindung
an das anionische Austauschharz unterliegen. Im Ergebnis kann man das Verfahren gemäß der Erfindung
bei einer diskontinuierlichen Arbeitsweise anwenden, bei der das Harz in die Urokinaselösung eingeschlämmt
wird, oder auch gleich gute oder noch bessere Ergebnisse erzielen, wenn man die Urokinaselösung
durch eine Säule leitet, die d-is obengenannte schwach
oder stark anionische Austauschharz enthält.
Die Erfindung ermöglicht somit eine besonders gute Reinigung von Urokinase, insbesondere die Gewinnung
von Urokinase, die ein hohes Wirkungsvermögen besitzt und von gerinnungsfördernden Substanzen, wie
Thromboplastin, frei ist, durch Behandlung ihrer unreinen, wäßrigen Lösungen, insbesondere mit modifiziertem,
vernetzten! Dextrangel.
Claims (6)
1. Verfahren zum Reinigen von Urokinase, dadurch gekennzeichnet, dziß man eine
klare Urokinaselösung in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 6 bis 9 und einer
lonenstärks von 2,0 bis 5,0 Miilisiemeiis liilde!, die
Lösung in Kontakt mit gequollenen Körnern basischen Anionemaustauschharzts bringt, an das
tertiäres oder quaternäres Amin in einer Mienge von
mindestens 3,0 Mil]iäquiv7g chemisch gebunden ist und das eine durchschnittliche Korngröße im
Bereich von 40 bis 120 Mikron hat, genügend Zeit gibt, damit das Ionenaustauschharz bei einer
Temperatur im Bereich zwischen 0'° und dem Siedepunkt der wäßrigen Lösung wirkt, und von
dem Harz, an das im wesentlichen die gesamten, anfänglich anwesenden Verunreinigungen adsorbiert
sind, die Flüssigphase trennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Ionenaustausch bei etwa
Flaumtemperatur durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Urokinaselösung mit dem
anionischen Austauschharz aufschlämmt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Urokinaselösung durch eine Säule leitet, die das anionische Austauschharz
enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Urokinaselösung mit
Tris- (hydroxymethyl) -aminoäthan puffert.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer lonenstärke im Bereich
von 2,5 bis 3,5 Millisiemens arbeitet.
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