DE2512583B2

DE2512583B2 - Verfahren zur Herstellung von e N-( γ -Glutamyl)lysin

Info

Publication number: DE2512583B2
Application number: DE2512583A
Authority: DE
Inventors: Raymond Aigle Bertholet; Paul-Andre Vevey Finot; Pierre Corseaux Hirsbrunner
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 1975-02-07
Filing date: 1975-03-21
Publication date: 1980-01-03
Also published as: JPS51105014A; OA05241A; IL48920A; CA1055046A; DE2512583C3; ES444938A1; FR2300075A1; IN140980B; AR207676A1; FR2300075B1; ZA76550B; JPS5744662B2; DE2512583A1; GB1471850A; IL48920A0; US4052372A; CH596150A5

Description

Die Erfindung betrifft das in den vorstehenden Patentansprüchen aufgezeigte Verfahren zur Herstellung von e-N-iy-GlutamylJ-lysin.

e-N-(y-Glutamyl)-lysin ist eines der möglichen Kondensationsprodukte aus Lysin, einer essentiellen basischen Aminosäure, und Glutaminsäure, einer sauren Aminosäure. Es handelt sich dabei nicht um ein Peptid im Sinne des Wortes, da das Lysin mit seiner in epsilon-Stellung befindlichen Aminogruppe und die Glutaminsäure mit ihrer in gamma-Stellung befindlichen Carboxylgruppe gebunden ist, während die Aminosäuren in echten Peptiden und in Proteinen über in «-Stellung befindliche Aminogruppen oder Carbonsäuregruppen gebunden sind.

Dieses ε-Derivat von Lysin hat jedoch besonderes Interesse als diätetischer Zusatz und als Ersatz für L-Lysin oder für an Lysin reichen Peptiden oder Proteinen, um Nahrungsmittel, die arm an Lysin sind, wie z. B. die Getreide, anzureichern.

Es ist deshalb klar, daß ein Interesse an einer praktischen und billigen Synthese besteht. Wegen der Vielzahl der reaktionsfähigen Aminogruppen und Carbonsäuregruppen wie auch wegen der Neigung der Glutaminsäure sich in Pyrrolidoncarbonsäurs oder in Pyroglutaminsäure zu zyklisieren, ist die Synthese durch direk'te Vereinigung der beiden Aminosäuren nur möglich, wenn man die klassichen chemischen Syntheseverfahren für Peptide anwendet, welche darin bestehen, gewisse Reaktionsstellen zu schützen und andere dabei zu aktivieren und anschließend die Schutzgruppen, bzw. Aktivierungsgruppen, nach Beendigung der Reaktion wieder abzuspalten, was viele Verfahrensstufen erfordert und mäßige Ausbeuten ergibt. Darüber hinaus müssen im vorliegenden Fall die Gruppen durch Hydrogenolyse unter Verwendung von Palladium entfernt werden, um Umlagerungen zu vermeiden (siehe beispielsweise J. Biol. Chem. 248, 2566, 1973), wodurch die Fabrikationskosten erhöht werden.

Demgegenüber lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von 6-N-(y-Glutamyl)-lysin zu schaffen. Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß man Lysinglutamat in einem inerten gasförmigen oder flüssigen Wärmeträger mindestens 5 Stunden auf eine Temperatur von mindestens 120° C erhitzt und 6-N-(y-Glutamyl)-lysin aus dem so erhaltenen Reaktionsgemisch isoliert.

Lysinglutamat ist ein Salz, dessen Schmelzpunkt bei 170—180⁰C (unter Zersetzung) liegt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren verliert es durch Erhitzen ein Molekül Wasser, wobei die Amidbindung des E-N-(y-Glutamyl)-lysins ausgebildet wird. Dieses Lysinglutamat kann dadurch hergestellt werden, daß man die beiden Ausgangsaminosäuren mischt, wobei man beispielsweise von einem nahezu äquimolekularen Gemisch aus Mononatriumglutamat und Lysinchlorhydrat ausgeht. Dieses Gemisch wird in Wasser aufgelöst, und das Lysinglutamatsalz wird durch Zusatz von Methanol und Animpfen mit Hilfe einer in einem vorhergehenden Herstellungsverfahren erhaltener Lysinglutamatkristal-Ie auskristallisiert, wobei leicht gekühlt wird. Dieses Lysinglutamat enthält einige Prozente Natriumchlorid. Man reinigt es durch Auflösen in Wasser und Kristallisation durch Zugabe von Methanol und Animpfen bei einer Temperatur in der Gegend von 0° C.

Die so erhaltenen Lysinglutamatkristalle besitzen die Form von Lysinglutamat-dihydrat. Es wurde festgestellt, daß es in zwei festen Phasen, die mit« und β bezeichnet werden, vorkommt. Diese Phasen können durch Röntgenbeugungsspektren (gemäß Debye-Scherrer)

D nachgewiesen werden. Die «Phase ist bei 10°C und darunter stabil und die /ϊ-Phase ist über 60⁰C stabil. Die bei der oben erwähnten Ausfällung erhaltene Phase ist die «-Phase.

Das Erhitzen kann in einem Gas als Wärmeträger,

4» wie z. B. Luft oder Stickstoff, ausgeführt werden, dessen Temperatur sorgfältig (beispielsweise durch einen Ofen) gesteuert wird. Es ist auch möglich, als Wärmeträger eine Flüssigkeit zu verwenden, die natürlich gegenüber dem Lysinglutamat inert sein muß, d. h„ daß sie sich

4~> darin nicht auflöst, auch nicht teilweise, und daß sie damit auch keine chemische Reaktion eingeht Beispiele hierfür sind Kerosin, Nonan, 1,1,2,2-Tetrachloräthan, Octanol-1, 2-Äthyl-butanol-l oder η-Amylalkohol sowie andere Flüssigkeiten der gleichen Art, die Siedepunkte

■)0 über 120⁰C aufweisen, welches die nötige Temperatur ist, um die Umwandlung des Lysinglutamats zustandezubringen.

Die verschiedenen Parameter, welche die Ausbeute beeinflussen, sind vor allem die Natur des als

» Ausgangsmaterial verwendeten Lysinglutamats («- oder j3-Phase) und die Temperatur und Dauer des Erhitzens. Es wurde allgemein festgestellt, daß die «-Phase zu besseren Ausbeuten als die Jj-Phase führt, daß die optimale Hrhitzungstemperatur in der Größen-

tio Ordnung von 135 bis 15O⁰C liegt und daß die optimale Erhitzungsdauer 16 bis 48 st beträgt. Vorzugsweise wird dieses Erhitzen in einer Stickstoffatmosphäre oder unter fließendem Stickstoff durchgeführt. Einige Anhaltspunkte sind in der folgenden Tabelle angegeben,

bi worin die Ausbeuten sich auf die Ausbeuten an e-N-(y-Glutamyl)-lysin nach der Isolierung und Reinigung beziehen und worin AmOH für n-Amylalkohol steht.

Natur des	Erhit-	Natur des	Zeit der	Aus
Lysin-	zungs-	fluiden	Erhit	beute
glutamats	tempe-	Wärme-	zung
	ratur	trägers
	(°C)		(h)	(<H>)

Natur des Salzes Behandlung Ergebnis

«-Phase

0-Phase

130 130 140 140 150 150 160

135
140
150

AmOH

Kerosin

AmOH

Nonan

AmOH
AmOH
Nonan

16
16
16
40
8
16
16

16
16
16

31

28,5

45

48

27,5

45

35

25
31
28

Ornithinglutamat
Arginin-glutamat

8 h/140°C
3 .h/l 70⁰C
3h/160°C

keine Umwandlung
Zersetzungsprodukt Zersetzungsprodukt

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert Im Hinblick auf die vorgesehene Verwendung

ίο des erhaltenen e-fr-GlutamylJ-lysins für Nahrungsmittel werden als Aminosäuren in diesem Beispiel natürliche Aminosäuren mit der L-Konfiguration verwendet. Es ist natürlich klar, daß das Verfahren auch auf Aminosäuren mit der D-Konfiguration angewendet werden kann und daß die Eigenschaften der erhaltenen Produkte die gleichen sind, wenn man vom Drehsinn absieht

Die Ausbeuten erscheinen auf den ersten Blick mäßig, aber es sol! darauf hingewiesen werden, daß die nicht-umgesetzten Ausgangsstoffe zurückgeführt werden können.

Der bevorzugte fluide Wärmeträger ist n-Amylalkohol da sein Siedepunkt unter atmosphärischem Druck (138°C) den optimalen Erhitzungstemperaturen entspricht, wodurch die Umwandlung des Lysinglutamats >5 in einer sehr einfachen Weise ermöglicht wird, nämlich unter Rückfluß des η-Amylalkohols. Darüber hinaus bildet er mit Wasser ein Azeotrop, wodurch eine gleichzeitige sehr einfache Abtrennung des während der Umwandlung gebildeten Wassers und des restlichen _M η-Amylalkohols ermöglicht wird.

Das erhaltene Umwandlungsprodukt ist ein Gemisch, das im allgemeinen 40 bis 50% 6-N-(y-Glutamyl)-lysin, 20 bis 35% nichtumgesetztes Lysinglutamat, 10 bis 15% Lysin und 2 bis 5% Undefinierte Nebenprodukte enthält, j-> Darüber hinaus finden sich 10 bis 15% der eingesetzten Glutaminsäure in Form von Pyroglutaminsäure, die in dem flüssigen Wärmeträger gelöst ist, wieder. Beim Isolieren von 6-N-(y-Glutamyr)-lysin wird zunächst der η-Amylalkohol vom Reaktionsgemisch abgetrennt, 4» beispielsweise durch Filtration. Hierauf wird das Produkt in Wasser aufgenommen, worauf dann der Rest des η-Amylalkohols durch azeotropes Destillieren mit Wasser entfernt wird. Schließlich wird das s-N-(y-Glutamyl)-Iysin durch Abkühlen und Zugeben von Methanol _A-, isoliert Die Mutterflüssigkeiten werden auf Lysin und Glutaminsäure aufgearbeitet, die zurückgeführt werden können. Das gleiche gilt für η-Amylalkohol und Methanol.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist spezifisch für -,o die Herstellung von 6-N-(y-Glutamyl)-lysin und läßt sich nicht allgemein für die Herstellung von Verbindungen aus basischen Aminosäuren und sauren Aminosäuren anwenden, wie z. B. Ornithin und Arginin, bzw. N-Acetyl-glutaminsäure, Asparaginsäure und Pyroglutaminsäure. Einige Salze bilden sich beispielsweise überhaupt nicht oder bilden keine kristalline Phase, wie dies beispielsweise für Lysin-N-acetyl-glutamat und Ornithin- sowie Argininpyroglutamat gilt. Andere Salze haben einen zu niedrigen Schmelzpunkt, wie z. B. _bo Lysin-pyroglutamat, das bei 120° C schmilzt. Wieder andere Salze ergeben nicht die gewünschte Umwandlung, wie dies aus der folgenden Tabelle hervorgehl.

Natur des Salzes Behandlung Ergebnis _b5

Lysinaspartat

8 h/l50°C
4h/200°C

keine Umwandlung
Zersetzungsprodukt

Beispiel 1
Herstellung von L-Lysin-L-glutamat

187 g Mononatrium-L-glutamat-monohydrat und 182 g L-Lysinchlorhydrat werden bei Raumtemperatur in 0,4 1 Wasser aufgelöst, worauf dann die erhaltene Lösung langsam in 1,4 1 Methanol eingebracht wird. Hierauf wird mit einigen Kristallen von L-Lysin-L-glutamat. 2 H₂O der «-Phase geimpft, worauf unter heftigem Rühren 0,61 Methanol zugegeben werden und das Rühren etwa 1 h fortgesetzt wird. Die erhaltene Suspension wird dann zentrifugiert Dabei werden etwa 31 Mutterflüssigkeiten, aus welchen das Methanol zurückgewonnen wird, und 365 g L-Lysin-L-glutatnatdihydrat, das etwa 1% NaCl enthält, erhalten.

Nach dem Absaugen wird das Salz in 0,81 Wasser aufgenommen, worauf dann zur erhaltenen Lösung rasch 3 1 Methanol zugegeben werden. Anschließend wird mit einigen Kristallen von L-Lysin-L-glutamat • 2 H2O in der α-Phase geimpft worauf die geimpfte Lösung unter heftigem Rühren auf 0°C abgekühlt wird. Nach etwa 4 h wird die erhaltene Suspension zentrifugiert, wobei etwa 4 1 Mutterflüssigkeiten, aus welchem das Methanol zurückgewonnen wird, sowie (nach Absaugen und Trocknen) 350 g L-Lysin-L-glutamat-dihydrat in der «-Phase erhalten werden. Die Ausbeute beträgt etwa 90%.

Überführung in 6-N-(y-Glutamyl)-L-lysin

Die 350 g L-Lysin-L-glutamat-dihydrat der α-Phase, die gemäß obiger Vorschrift erhalten worden sind und die etwa 15Gew.-% Methanol enthalten, werden in 0,851 η-Amylalkohol aufgelöst Es wird unter einer Stickstoffatmosphäre gearbeitet Der n-Amylalkohol wird dann erhitzt, wobei zunächst etwa 0,1 1 eines ternären Gemischs, das η-Amylalkohol, Methanol und Wasser enthält, und dann etwa 0,1 1 eines binären Gemischs, das η-Amylalkohol und Wasser enthält, übergehen. Die Erhitzung wird bei der Rückflußtemperatur des n-Amylalkohols, nämlich 138° C, fortgesetzt. Nach einer Erhitzungsdauer von insgesamt 20 h wird die Ausfällung durch Filtration abgetrennt. Es werden 400 g eines Rohprodukts, das 6-N-(>>-Glutamyl)-L-lysin enthält und ungefähr 1 1 Mutterflüssigkeiten (n-Amylalkohol) erhalten. Daraus werden 20 g L-Pyroglutaminsäure gewonnen. Dieser Stoff wird nach Umwandlung in L-Glutamirisäure zurückgeführt. Auch der n-Amylalkohol wird gereinigt und zurückgeführt.

Isolierung von E-N-(y-L-Glutamyl)-L-Iysin

Die 400 g des gemäß obiger Vorschrift erhaltenen Rohprodukts werden in 1,21 Wasser suspendiert, worauf der η-Amylalkohol durch Destillation unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 70 bis 80° C entfernt wird.

Auf diese Weise werden 0,21 eines Genischs aus Wasser und η-Amylalkohol erhalten. Letzterer wird gereiiigt und zurückgeführt Dann werden zur Suspension 0,8 1 Methanol zugesetzt, worauf das Gemisch unter Rühren auf 20⁰C abgekühlt wird. Dann wird noch 1 st gerührt, worauf die erhaltenen Kristalle abgetrennt werden. Die Mutterflüssigkeit wird von Methanol befreit, welches zurückgeführt wird, und dann nach einer Neutralisation auf pH 7 mit Hilfe von L-Glutaminsäure anstelle des Wassers für die Umkristallisation des L-Lysin-L-glutamats verwendet Die erhaltenen Kristalle werden mit 50 ml Methanol gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise werden 100 g e-N-(y-L-Glutamyl)-L-lysin erhalten, was eine Ausbeute von 36%, bezogen auf das Salz, bedeutet Die Reinheit, die durch Dünnschichtchromatographie und Elektrophorese ermittelt wurde, beträgt 98 bis 99%.

F 245 bis 250° C unter Zersetzung,
[el +6,5° (C=2; H₂O).

Der F, die IR- und NMR-Spektren stimmen mit den entsprechenden Werten einer Bezugsprobe überein.

Beispiel 2

Eine Probe von L-Lysin-L-glutamat-dihydrat mit ίο alpha-Phase wird hergestellt wie es in Beispiel 1 beschrieben ist Diese Probe wird dann in eine Kristallisierschale eingebracht, worauf das Ganze dann 5 h in einen Ofen gebracht wird, der auf eine Temperatur von genau 150° C gehalten wird. Das ii erhaltene Produkt wird dabei braun. Es wird dann in einem Gemisch aus 3 Teilen Wasser und 2 Teilen Methanol aufgenommen und gemäß Beitpiel 1 gereinigt Auf diese Weise wird e-()>-L-Glutaniyl)-L-lysin in einer Gesamtausbeute — unter Einschluß der Herste!- lung des Lysingiutamats — von 15% erhaliea

Wenn die Erhitzung auf weniger als 120⁰C vorgenommen wird, dann entsteht kein Glutamyllysin, sondern das L-Lysin-L-glutamat ■ 2 H₂O gibt lediglich 2 Mol Kristallisationswasser ab.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von e-N-(y-Glutamyl)-lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man Lysinglutamat in einem inerten gasförmigen oder flüssigen Wärmeträger mindestens 5 Stunden auf eine Temperatur von mindestens 120⁰C erhitzt und E-N-^-GlutamylJ-lysin aus dem so erhaltenen Reaktionsgemisch isoliert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

zeichnet, daß man dieses in η-Amylalkohol durchführt.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man auf eine Temperatur zwischen 135 und 150⁰C erhitzt

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man 16 bis 48 Stunden erhitzt