DE2512583A1 - Verfahren zur herstellung von epsilon(gamma-glutamyl)-lysin - Google Patents
Verfahren zur herstellung von epsilon(gamma-glutamyl)-lysinInfo
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Description
Patentanwalt
tag. E. IKl':™^
tag. E. IKl':™^
S 597
Societe des Prodults Nestle S.A. in Vevey / SCHWEIZ
"Verfahren zur Herstellung von £-( ^-Glutamyl)-lysin"
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von E-C^Glutamyl)-lysin aus Lysinglutamat.
-lysin ist eines der möglichen Kondensationsprodukte
aus Lysin, einer essentiellen basischen Aminosäure, und Glutaminsäure, einer sauren Aminosäure. Es handelt sich
dabei nicht um ein Peptid im Sinne des Wortes, da das Lysin mit seiner in epsilon-Stellung befindlichen Aminogruppe
und die Glutaminsäure mit ihrer in gamma-Stellung befindlichen
Carboxylgruppe gebunden ist, während die Aminosäuren in echten Peptiden und in Proteinen über in alpha-Stellung
befindliche Aminogruppen oder Carbonsäuregruppen gebunden
sind.
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Dieses £-Derivat von Lysin hat jedoch besonderes Interesse
als diätetischer Zusatz und als Ersatz für L-Lysin oder für an Lysin reichen Peptiden oder Proteinen, um an
Lysin armen Nahrungsmitteln, wie z.B. die Getreide, anzureichern, wie es in der DT-OS 2 4 23 089 beschrieben ist.
Es ist deshalb klar, daß ein Interesse an einer praktischen und billigen Synthese besteht. Wegen der Vielzahl der reaktionsfähigen
Aminogruppen und Carbonsäuregruppen wie auch wegen der Neigung der Glutaminsäure sich in Pyrrolidoncarbonsäure
oder in Pyroglutaminsäure zu zyklisieren, ist die Synthese durch direkte Vereinigung der beiden Aminosäuren
nur möglich, wenn man die klassischen chemischen Syntheseverfahren für Peptide anwendet, welche darin bestehen,
gewisse Reaktionsstellen zu schützen und andere dabei zu aktivieren und anschließend die Schutzgruppen, bzw.
Aktivierungsgruppen, nach Beendigung der Reaktion wieder abzuspalten, was viele Verfahrensstufen erfordert und mäßige
Ausbeuten ergibt. Darüberhinaus müssen im vorliegenden Fall die Gruppen durch Hydrogenolyse unter Verwendung von
Palladium entfernt werden, um Umlagerungen zu vermeiden (siehe beispielsweise J. Biol. Chem. 248 (8), 2536, 1973),
wodurch die Fabrikationskosten erhöht werden.
Die vorliegende Erfindung gestattet dagegen die Herstellung von £-(-jp-Glutamyl)-lysin für einen mäßigen Preis. Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung dieses Produkts, wobei von Lysinglutamat ausgegangen wird. Das Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, daß man Lysinglutamat mit Hilfe eines fluiden inerten Wärmeträgers während mindestens 5 st
auf eine Temperatur von mindestens 1200C erhitzt und an-
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schließend das £-(*y^-Glutamyl)-lysin vom so erhaltenen Umwandlungsprodukt
abtrennt.
Lysinglutamat ist ein Alkyl-ammonium-carboxylat-Salz, dessen
Schmelzpunkt bei 170 - l80°C (unter Zersetzung) liegt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren verliert es durch Erhitzung ein
Molekül Wasser, wobei die Amidbindung des £-(iT-Glutamyl)-lysins
ausgebildet wird. Dieses Lysinglutamat kann dadurch hergestellt werden, daß man die beiden Ausgangsaminosäuren mischt, wobei
man beispielsweise von einem nahezu äouimolekularen Gemisch aus Mononatriumglutamat und Lysinchlorhydrat ausgeht. Dieses
Gemisch wird in Wasser aufgelöst, und das Lysinglutamatsalz wird durch Zusatz von Methanol und Impfung mit Hilfe einiger in
einem vorhergehenden Herstellungsverfahren erhaltener Lysinglutamatkristalle auskristallisiert, wobei leicht gekühlt wird.
Dieses Lysinglutamat enthält einige Prozente Natriumchlorid. Man reinigt es durch Auflösen in Wasser und Kristallisation
durch Zugabe von Methanol und Impfung bei einer Temperatur in der Gegend von 00C.
Die so erhaltenen Lysinglutamatkristalle besitzen die Form von Lysinglutamat-dihydrat. Es wurde festgestellt, daß es
in zwei festen Phasen, die mit ex. und ß bezeichnet werden,
vorkommt. Diese Phasen können durch Röntgenbeugungsspektren (gemäß Debye-Scherrer) nachgewiesen werden. Die ot-Phase ist
bei 100C und darunter stabil und die ß-Phase ist über 60°C
stabil. Die bei der oben erwähnten Ausfällung erhaltene Phase ist die ot-Phase.
Mit dem Ausdruck "fluider Wärmeträger" wird ein Fluid bezeichnet,
welches eine doppelte Funktion aufweist, nämlich die Zuführung von Wärme zum Lysinglutamat und die Wärmesteuerung.
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Hierfür kann man ein Gas, wie z.B. Luft oder- Stickstoff,
verwenden, dessen Temperatur sorgfältig (beispielsweise durch einen Ofen) gesteuert wird. Es ist auch möglich*
eine Flüssigkeit zu verwenden, die natürlich gegenüber dem Lysinglutamat inert sein soll, d.h., daß sie sich darin
nicht auflöst,, auch nicht teilweise, und daß sie damit auch keine chemische Reaktion eingeht. Beispiele hierfür
sind Kerosin, Nonan,. 1,1,2J2-Tetrachloräthan» Octanol-1,
2-Ithyl-butanol-l, η-Amy!alkohol oder Pentanol-1, sowie
andere Flüssigkeiten der gleichen Art» die Siedepunkte über 120°C aufweisen, welches die nötige Temperatur ist, um die Umwandlung
des Lyslnglutamats zustandezubringen.
Die verschiedenen Parameter, welche die Ausbeute beeinflussen, sind vor allem die Natur des als Ausgangsmaterial verwendeten
Lysinglutamats (oc-oder ß-Phase) und die Temperatur
und Dauer der Erhitzung. Es wurde allgemein festgestellt, daß die od-Phase zu besseren Ausbeuten als die ß-Phase führt, daß
die optimale Erhitzungstempe-ratur In der Größenordnung von 135 bis 150°C liegt und daß die optimale Erhitzungsdauer
16 bis 48 st beträgt. Vorzugsweise wird diese Erhitzung in
einer Stickstoffatmosphäre oder unter fließendem Stickstoff durchgeführt. Einige Anhaltspunkte sind in der folgenden
Tabelle angegeben, worin die Ausbeuten sich auf die Ausbeuten an s.-('J'-Glutamyl)-lysin nach der Isolation und
Reinigung beziehen und worin AmOH für η-Amy!alkohol steht.
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| Natur des Lysin- | Erhitzungs- | Natur des | Zeit der | Ausbeute |
| glutamats | temperatur | fluiden | Erhitzung | % |
| 0C | Wärmeträgers | St | ||
| I30 | AmOH | 16 | 31 | |
| oc-Ph as e | 130 140 |
Kerosin AmOH |
16 16 |
28,5 45 |
| 140 | AmOH | 40 | 48 | |
| 150 | N on an | 8 | 27,5 | |
| 150 | N on an | 16 | 45 | |
| 160 | N on an | 16 | 35 | |
| 135 | AmOH | 16 | 25 | |
| ß-Phase | 140 | AmOH | 16 | 31 |
| 150 | Nonan | 16 | 2R |
Die Ausbeuten erscheinen auf den ersten Blick mäßig, aber es soll darauf hingewiesen werden, daß die nicht-umgesetzten
Ausgangsstoffe zurückgeführt werden können.
Der bevorzugte fluide Wärmeträger ist η-Amylalkohol, da sein Siedepunkt unter atmosphärischem Druck (1380C) den
optimalen Erhitzungstemperaturen entspricht, wodurch die Umwandlung des Lysinglutamats in einer sehr einfachen
Weise ermöglicht wird, nämlich unter Rückfluß des n-Amylalkohols.
Darüberhinaus bildet er mit Wasser ein Azeotrop, wodurch eine gleichzeitige sehr einfache Abtrennung des
während der Umwandlung gebildeten Wassers und des restlichen η-Amylalkohols ermöglicht wird.
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Das erhaltene Umwandlungsprodukt ist ein Gemisch, das Im
allgemeinen HO bis 50$ s-C^Glutamyl)-lysin, 20 bis 35%
nicht-umgesetztes Lysinglutamat, 10 bis 15$ Lysin und
2 bis 5% Undefinierte Nebenprodukte enthält. Darüberhinaus finden sich 10 bis 15$ der eingesetzten Glutaminsäure in
Form von Pyroglutaminsäure, die in dem flüssigen Wärmeträger gelöst Ist, wieder. Bei der Isolation von £-(^GlutamyI)--lysin
wird zunächst der η-Amylalkohol vom Umwandlungsprodukt
abgetrennt, beispielsweise durch Filtration. Hierauf wird das Produkt in Wasser aufgenommen, worauf dann der Rest
des η-AmylaIkohοIs durch azeotrope Destillation mit Wasser
entfernt wird. Schließlich wird das 'E.-C'j'^-Glutamyl)-lysin
durch Abkühlung und Zugabe von Methanol isoliert. Die Mutterflüssigkeiten werden auf Lysin und Glutaminsäure aufgearbeitet,
die zurückgeführt werden können. Das gleiche gilt für n-Amylalkohol
und Methanol.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist spezifisch für die Herstellung
von g-C^GlutamyD-lysin und läßt sich nicht allgemein
für die Herstellung von Verbindungen aus basischen Aminosäuren und sauren Aminosäuren anwenden, wie z.B.
Ornithin und Arginin, bzw. N-Acetyl-glutaminsäure, Asparaginsäure
und Pyroglutaminsäure.
Einige Salze bilden sich beispielsweise überhaupt nicht oder bilden keine kristalline Phase, wie dies beispielsweise für
LysIn-N-acetyl-glutamat und Ornithin- sowie Arginlnpyroglutamat
Andere Salze haben einen zu niedrigen Schmelzpunkt, wie z.B. Lysin-pyroglutamat, das bei 1200C schmilzt.
Wieder andere Salze ergeben nicht die gewünschte Umwandlung, wie dies aus der folgenden Tabelle hervorgeht.
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| Natur des Salzes | Behandlung | Ergebnis |
| Lysinaspartat Ornithin-glutamat Arginin-glutamat |
8 st/15O°C 4 st/2OO°C 8 st/l4O°C 3 st/17O°C 3 st/l6O°C |
keine Umwandlung Zersetzungsprodukt keine Umwandlung Zersetzungsprodukt Zersetzungsprodukt |
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert. Im Hinblick auf die vorgesehene Verwendung des erhaltenen
g,-(Tp-Glutamyl)-lysins für Nahrungsmittel werden
als Aminosäuren in diesem Beispiel natürliche Aminosäuren mit der L-Konfiguration verwendet. Es ist natürlich klar, daß
das Verfahren auch auf Aminosäuren mit der D-Konfiguration angewendet werden kann und daß die Eigenschaften der erhaltenen
Produkte die gleichen sind, wenn man vom Drehsinn absieht.
187 g Mononatrium-L-glutamat-monohydrat und 182 g L-Lysinchlorhydrat
werden bei Raumtemperatur in 0,4 1 Wasser aufgelöst, worauf dann die erhaltene Lösung langsam in 1,4 1
Methanol eingebracht wird. Hierauf wird mit einigen Kristallen von L-Lysin-L-glutamat. 2HpO der o(.-Phase ge imp ft5 worauf
unter heftigem Rühren 0,6 1 Methanol zugegeben werden und das Rühren etwa 1 st fortgesetzt wird. Die erhaltene Suspension
wird dann zentrifugiert. Dabei werden etwa 3 1 Mutter-
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flüssigkeiten, aus welchen das Methanol zurückgewonnen wird
und 365 g L-Lysin-L-glutamat-dihydrat, das etwa 1% NaCl
enthält, erhalten.
Nach dem Absaugen wird das Salz in O5B 1 Wasser aufgenommen,
worauf dann zur erhaltenen Lösung rasch 3 1 Methanol zugegeben werden. Anschließend wird mit einigen Kristallen
von L-Lysin-L-glutamat.2HpO in der oc-Phase geimpft, worauf
die geimpfte Lösung unter heftigem Rühren auf 00C abgekühlt
wird. Nach etwa 4 st wird die erhaltene Suspension zentrifugiert, wobei etwa 4 1 Mutterflüssigkeiten, aus
welchem das Methanol zurückgewonnen wird, sowie (nach Absaugen und Trocknen) 350 g L-Lysin-L-glutamat-dihydrat
in der oc-Phase erhalten werden. Die Ausbeute beträgt etwa
Die 350 g L-Lysin-L-glutamat-dihydrat der 06-Phase, die gemäß
obiger Vorschrift erhalten worden sind und die etwa 15 Gew.-/S Methanol enthalten, werden in 0,85 1 η-Amylalkohol
aufgelöst. Es wird unter einer Stickstoffatmosphäre gearbeitet.
Der η-Amylalkohol wird dann erhitzt, wobei zunächst etwa 0,1 1 eines ternären Gemischs, -das η-Amylalkohol, Methanol
und Wasser enthält, und dann etwa 0,1 1 eines binären Gemischs, das η-Amylalkohol und Wasser enthält, übergehen. Die Erhitzung
wird bei der Rückflußtemperatur des η-Amylalkohols, nämlich 1380C, fortgesetzt. Nach einer Erhitzungsdauer von insgesamt
20 st wird die Ausfällung durch Filtration abgetrennt. Es werden 400 g eines Rohprodukts, das t-C^-Glutamyl)-L-lysin
enthält und ungefähr 1 1 Mutterflüssigkeiten (n-Amylalkohol)
erhalten. Daraus werden 20 g L-Pyroglutaminsäure gewonnen. Dieser Stoff wird nach Umwandlung in L-Glutaminsäure zurück-r
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geführt. Auch der η-Amylalkohol wird gereinigt und zurückgeführt.
Die 400 g des gemäß obiger Vorschrift erhaltenen Rohprodukts werden in 1,2 1 Wasser suspendiert, worauf der n-Amylalkohol
durch Destillation unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 70 bis 80°C entfernt wird.
Auf diese Weise werden 0,2 1 eines Gemischs aus Wasser und η-Amylalkohol erhalten. Letzterer wird gereinigt und zurückgeführt.
Dann werden zur Suspension 0,8 1 Methanol zugesetzt, worauf das Gemisch unter Rühren auf 200C abgekühlt
wird. Dann wird noch 1 st gerührt, worauf die erhaltenen Kristalle abgetrennt werden. Die Mutterflüssigkeit wird von
Methanol befreit, welches zurückgeführt wird,und dann nach einer Neutralisation auf pH 7 mit Hilfe von L-Glutaminsäure
anstelle des Wassers für die Umkristallisation des L-Lysin-L-glutamats
verwendet. Die erhaltenen Kristalle werden mit 50 ml Methanol gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise
werden 100 g £-(^f-L-Glutamyl)-L-lysin erhalten, was eine
Ausbeute von 36Ϊ, bezogen auf das Salz, bedeutet. Die Reinheit,
die durch DünnschichtChromatographie und Elektrophorese ermittelt
wurde, beträgt 98 bis 99?.
Pp = 245 bis 25O0C unter Zersetzung
[öl] I
+ 6,5° (C=2; H2O)
Der Pp, die IR- und NMR-Spektren stimmen mit den entsprechenden
Werten einer Bezugsprobe Überein.
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Claims (9)
1. /Verfahren zur Herstellung von £-Cj^-G lutamyl)-lysin
aus Lysinglutamat, dadurch gekennzeichnet, daß man
das Lysinglutamat mit Hilfe eines Inerten fluiden Wärmeträgers mindestens 5 st auf eine Temperatur von
mindestens-12O°C erhitzt und dann das E--(J~-Glutamyl)-lysin
vom so erhaltenen Umwandlungsprodukt isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß E.-C^L-GlutamyD-L-lysin aus L-Lysin-L-glutamat
hergestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Lysinglutamat-dihydrat in der <x.-Phase oder
Lysinglutamat-dihydrat in der ß-Phase erhitzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als fluiden Wärmeträger Luft oder Stickstoff verwendet, deren Temperatur sorgfältig geregelt wird,
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als fluiden inerten Wärmeträger Kerosin, Nonan,,
ljljS^-Tetrachloro-äthan, Octan.pl-1 oder 2-Äthyl-rbutanol^l
verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluiden Inerten Wärmeträger n~Amy !alkohol
verwendet.
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7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Erhitzung auf eine Temperatur zwischen 35 und 1500C durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Erhitzung l6 bis 48 st dauert.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das £-("J"-Glutamyl)-lysin dadurch
isoliert, daß man eine Suspension des Umwandlungsprodukts in einem Methanol/Wasser-Gemisch filtriert.
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