DE2428641A1 - Antibiotika und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE PROF. DR. DR. J. RE'TSTÖTTER

DR.-ING. WOLFRAM BUNTE ? A 0 8 6 U 1

DR. WERNER KINZEBACH ί. τ λ. ν ν-τ ι

D-BOOO MÜNCHEN 4Ο. BAUERBTRASSE 22 · FERNRUF (Οββ) S7 ββ 03 ■ TELEX 581020· ISAN D POSTANSCHRIFTt Ο-βΟΟΟ MÜNCHEN 49, POSTFACH 7SO

München, den 14. Juni 1974 M/15283

BRISTOL-MYERS COMPANY, 345 Park Avenue, New York, New York, V.St.v.A.

Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein halbsynthetisches Derivat von 4'-Desoxyambutyrosin A mit der Formel:

- 1 409882/1196

M/15283

CH₂NH₂

HO

HO -CH2

NH-G-CH-CH₂-CH₃NH₂ O OH

wobei diese Verbindung als 5"-AmInO-^_t5"-di-desoxyambutyrosin A (V, BB-K 137) bekannt ist und die Formel:

CH₂NH₂

H₂N-H₂C

NH-C-CH-CH, -CH₀ -NH, Il I 2 2 2 O OH

V (BB-K137)

besitzt.

409882/1196

m/15283 3 24286 A1

Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "nichttoxisches pharmazeutisch verträgliches Additionssalz" ein Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder Pentasalz, das durch die Wechselwirkung von 1 Mol der Verbindung V mit 1 bis 5 Mol einer nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säure gebildet wird. Zu diesen Säuren gehören Essigsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Ascorbinsäure, Apfelsäure und Zitronensäure und alle anderen Säuren, die allgemein zur Herstellung von Salzen amin-enthaltender Pharmazeutika verwendet werden·

Das folgende schematische Diagramm dient zur Erläuterung der Aufeinanderfolge von Stufen, die bei der Herstellung der er findungs gemäßen Verbindungen durchschritten werden. Es ist jedoch keine Beschränkung bezüglich der Typen von Reaktionsteilnehmern und Reagentien, die man zur Ausführung dieser Stufen verwenden kann.

409882/1196

1) 4·-Desoxyambutyrosin A (I)

Benzyloxycarbonylchlorid

VJl W

ω vx

IH₂NH-C-O-CH₂-C₆H₅

OH

Ha

C_CH_K-CH,-O-C-HII

K)

ro co ep

2) Verbindung II Tosylchlorid

HO

CH₂NII-C-O-CH₂-C₆H₅

OO CO NJ

C₆H₅-CH₂-O-C-NH J

SO₂-O-H₂C

It

NH-C-O-CH.-C-H,. ^ ο ο

I VJI H-C-CH-CII₂-CH₂

3) Verbindung IH

NaN,

CH^-NH-C-O-CH₂-C₆H₅

HO

O I

C₆H₅-CH₂-O-C-NH

NH-C-O-CH₂-C₆H₅

Il

NH-C-CH-CH₀-CH₀

²I²

OH

NII

c«o

ο I

IVa

Verbindung IV H₂/Pd

Verbindung V

OO

cn

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung der Formel V oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon.

Zu weiteren bevorzugten AusfUhrungsformen gehören das Mono- oder Polysulfatsalz der Verbindung der Formel V oder das Mono- oder Polyhydrat davon.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel

CH₂NH₂

NH-C-CH-CH₂-CH₂-NHj O OH

oder eines nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen

A) A-'-Desoxyambutyrosin A mit einem aminoblockierenden Acylierungsmittel, bevorzugt einem aminoblockierenden Acylierungsmittel, das durch Hydrierung abgespalten werden kann, beispielsweise Benzyloxycarbonylchlorid oder seinem funktioneilen Äquivalent in einem Verhältnis von

409 882/1196

mindestens 4 Mol, Jedoch bevorzugt 4 bis 4,5 Mol Acylierungsmittel pro Mol 4'-Desoxyambutyrosin A in einem polaren Lösungsmittel, bevorzugt ausgewählt unter Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyäthan, Methanol, Äthanol, V/asser, Aceton, Pyridin, N-(Niedrig)-alkyIpiperidin oder Mischungen davon, jedoch bevorzugt 20 % wäßrigem Aceton, bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 10⁰C bis ungefähr 50⁰C, jedoch vorzugsweise bei ungefähr 25⁰C, acyliert, um die Verbindung der Formel

CH₂NHB

NHB

NH-C-CH-CH₅-CH,

Il ^j

Ji NH-B

ZI

herzustellen,
B) die Verbindung II mit einem Sulfonylhalogenid der Formel

W - SO₀ - Z

worin Z die Gruppen Chlor, Brom oder Jod bedeutet und W Niedrigalkyl"oder einen Arylrest der Formel

409882/1 196

M/15283

darstellt, worin R .und R gleich oder verschieden sind und jeweils H, (Niedri^alkyl,-Nitro, (Niedri^alkoxy, Chlor, Brom, Jod und dergleichen bedeuten, in einem Verhältnis von mindestens 1 Mol Sulfonylhalogenid, jedoch bevorzugt 1,0 bis 1,2 Mol pro Mol Verbindung II in Gegenwart einer überschüssigen Menge einer organischen Base, beispielsweise einem tertiären Amin, wie Triäthylamin, jedoch bevorzugt Pyridin und gegebenenfalls in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, wie Benzol, Toluol, Dimethylformamid, Aceton und dergleichen, bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr -10⁰C bis ungefähr 15⁰C, jedoch bevorzugt im Bereich von O⁰C bis 10⁰C,' acyliert, um die Verbindung der Formel

CH₂NHB

• NHB

W-SO-O-H₂C

NH-C-CH-CH₀-CH₀

Il I ²I² ο oh

NH-B

III

OH

A09882/1198

M/15283

Jo

herzustellen, worin B und W die obigen Bedeutungen besitzen;

C) Verbindung III mit einem großen Überschuß eines Alkalimetallazids, beispielsweise Natrium- oder Kaliumazid in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Dimethylformamid, Dimethylacetamid und dergleichen mit ungefähr 5 bis 10 % Wasser bei erhöhten Temperaturen, vorzugsweise bei ungefähr 80 bis 120⁰C mindestens 4 Std. behandelt, um die Verbindung der Formel

CH₂NHB

NH-C-CH-CH₂-CH₂ OH

NH-B

herzustellen, und

D) Verbindung IV mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, bevorzugt ausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-Nickel, Rhodium, Ruthenium und Nickel, Jedoch bevorzugt Palladium und am bevorzugtesten Palladium auf Aktivkohle in einem aus Wasser bestehenden und mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bestehenden Lösungsmittel·

- 10 -

. 409882/1 196

system, vorzugsweise ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Athylenglykoldimethyläther, Propylenglykoldimethyläther oder dergleichen, jedoch bevorzugt 1:1 Wasser-Äthanol, hydriert, um die Verbindung der Formel Y herzustellen und gegebenenfalls diese Verbindung in ein nicht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon umwandelt.

Es ist.für den Fachmann offensichtlich, daß beim obigen Verfahren zur Acylierung der Aminfunktionen der Zwischenverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung auch andere Mittel verwendet werden können. Diese Erfindung schließt alle solchen Acylierungsmittel ein, die zu labilen Aminblockierungsgruppen führen, wobei diese labilen Blockierungsgruppen bei der Synthese von Peptiden allgemein verwendet werden. Die labilen Blockierungsgruppen müssen leicht durch aus dem Stand der Technik bekannte Methoden entfernbar sein. Beispiele solcher labiler Blockierungsgruppen und deren Entfernung können dem Übersichtartikel von A. Kapoor, J. Pharm. Sciences 59, Seiten 1-27 (1970) entnommen werden. Zu den funktioneilen Äquivalenten als Acylierungsmittel für primäre Aminogruppen· gehören die entsprechenden Carbonsäurechloride -bromide, -säureanhydride einschl. gemischter Anhydride und insbesondere der .gemischten Anhydride, die aus stärkeren Säuren, wie den niedrigeren aliphatischen Monoestern der Kohlensäure, den Alkyl- und Arylsulfonsäuren und den sterisch gehinderteren Säuren, wie Diphenylessigsäure, hergestellt sind. Man kann auch ein Säureazid oder e inen aktiven Ester oder Thioester (beispielsweise mit p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, Thiophenol, Thioessigsäure) verwenden oder die freie Säure selbst kann mit dem k'-Desoxyambutyrosin Α-Derivat (I) gekuppelt werden, nachdem man zuerst diese freie Säure mit N,N'-Dimethylchlorforminiumchlorid (GB-PS 1 008 170 und Novak und Weichet, Experientia XXI/6, 360 (1965)) umsetzt, oder durch Verwendung von Enzymen oder eines NjN'-Carbonyldiimidazols oder

409882/119

eines N,N'-Carbonylditriazols (Sheehan und Hess, J. Amer. Chem. Soc, 77, IO67 (1955)) "oder eines Alkinylamin-Reagenzes (R. Buijile und H.G. Viehe, Angew.Chem., International Edition 3, 582 (1964)), oder eines Ketenimin-Reagenzes (CL. Stevens und M.E. Monk, J. Amer.Chem. Soc. 80, 4065 (1958)) oder eines Isoxazoliumsalz-Reagenzes (R.B.Woodward, R.A.Olofson und H.Mayer, J.Amer.Chem.Soc., 83, 1010 (I96I). Ein weiteres Äquivalent des Säurechlorids ist ein entsprechendes Azolid, d.h. ein Amid der entsprechenden Säure, deren Amidstickstoff Glied eines quasi-aromatischen 5-Rings ist, der mindestens zwei Stickstoffatome enthält, d.h. Imidazol, Pyrazol, die Triazole, Benzimidazol, Benzotriazol und deren substituierte Derivate. Als Beispiel für die'allgemeine Methode zur Herstellung eines Azolids wird Ν,Ν'-Carbonyld^imidazol mit einer Carbonsäure in äquimolaren Verhältnissen bei Raumtemperatur in Tetrahydrofuran, Chloroform, Dimethylformamid oder einem ähnlichen inerten Lösungsmittel umgesetzt, wobei das Carbonsäureimidazolid in praktisch quantitativer Ausbeute unter Freisetzung von Kohlenstoffdioxyd und einem Mol Imidazol gebildet wird. Dicarbonsäuren führen zu Diimidazoliden. Das Nebenprodukt Imidazol fällt aus und kann abgetrennt werden und das Imidazolid kann isoliert werden, jedoch ist dies nicht wesentlich. Diese Reaktionen sind aus dem Stand der Technik wohl bekannt (US-PSen Nr. 3 079 314, 3 117 126 und 3 129 224 und GB-PSen Nr. 932 644, 957 570 und 959 054).

Der im vorliegenden gebrauchte Begriff "(hiedrig)', beispielsweise bei Niedrig)"-alkyl oder '^TiedrigJ'-alkoxy bedeutet eine gesättigte gerade oder verzweigte Kohlenstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Methyl, Äthyl, Isopropyl, Äthoxy, Methoxy, Isopropoxy und dergleichen.

Zu den neuen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung go-

- 12 -

0 9 8 8 2/1 1 96

M/15283

hören die Verbindungen der Formel IV, worin B eine Aminoblockierungsgruppe, die bevorzugt durch Hydrierung abgespalten werden kann und noch bevorzugter die Benzyloxycarbonylgruppe oder ihr funktionelles Äquivalent und insbesondere die Benzyloxycarbonylgruppe bedeutet.

Herstellung von 4'-Desoxyambutyrosin A

Der antibiotische Komplex Bu-1975 wird aus Bacillus circulans subsp. n. croceus, Bacillus circulans subsp. n. proteophilus oder Bacillus circulans subsp. n. biotinicus fermentiert. Die zwei neuen Komponenten des Komplexes sind 4^f-Desoxyambutyrosin A (Ib) der Formel

)H

- 13 -

409882/1196

land 4^I-Desoxyambutyrosin B (Ic) der Formel CK₂IIH₂

OH OH

Die Komponente Ib ist chemisch als N -(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,4,6-tri-desoxy-D-glucopyranosyl) ■ 5-0-D-xylofuranosyl-2-desoxystreptamin bekannt.

Die Komponente Ic ist chemisch als N -(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,4,6-tri-desoxy-D-glucopyranosyl) 5-0-D-ribofuranosyl-2-desoxystreptamin bekannt.

Der antibiotische Komplex, Bu-1975, wurde aus der Fermentationsbrühe der drei Stämme von Bacillus circulans isoliert, die in der Bristol-Banyu culture collection als Stämme Nr. C308-B4, C436-B1 und C532-B2 bezeichnet sind. Das Antibiotikum ist ein Komplex aus mindestens fünf biowirksamen Komponenten: A₁, A«, B, Ib und Ic. Die Komponenten A₁ und A₂ wurden als Ambutyrosine A und B identifiziert (U.S.-Patent 3 541 078 und Tetrahedron Letters, 28, Seiten 2625-2628 (1971)) und die Komponente B war ein lösungsmittelextrahierbares Antibiotikum mit peptidartigen Eigenschaften.

409882/1196

Die Komponenten Ib und Ic sind neue Aminoglycosid-Antibiotika. Es wurde festgestellt, daß Ib aus D-Xylose, 2-Desoxystreptamin, L-(-)-Y-Amino-a-hydroxybuttersäure und 2,6-Diamino-2_f4,6-tri-desoxy-D-glucose, einem neuen Desoxyaminozucker, zusammengesetzt ist und wird als 4'Desoxyambutyrosin A bezeichnet.

Es wurde gefunden, daß Ic aus D-Ribose, 2-Desoxystreptamin, L-(-)-Y-Amino-a-hydroxybuttersäure und 2,6-Diamino-2,4,6-tri-desoxy-D-glucose zusammengesetzt ist und es handelt sich daher hierbei um 4'-Desoxyambutyrosin B.

Der Komplex wird aus einer der drei Unterklassen des Mikroorganismus Bacillus circulans fermentiert.

Eine Kultur von jedem lebenden Organismus wurde in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockvllle,- Maryland 20852, hinterlegt und wurde mit den folgenden Namen und'Katalognummern versehen.

Bacillus circulans subsp. n., croceus (Stamm Nr. C308-B4) A.T.C.C. 21820. ^;

Bacillus circulans subsp. n. proteophilus (Stamm Nr. C436-B1) A.T.C.C. 21821.

Bacillus circulans .subsp. n. biotinicus (Stamm Nr. C532-B2) A.T.C.C. 21822.

- 15 -

4 0 9 8 8 2/1 1 96

Antibiotikum-Herstellung

Eine gut gewachsene Agar-Schrägkultur des Bu-1975-produzierenden Organismus wird verwendet, um das Saatmedium zu inokulieren, das 1,5 % Glucose, 0,5 % Polypepton, 0,2 % Hefeextrakt, 0,05 % K₂HPO₄ und 0,05 % MgSO^·7H₂O besitzt, wobei der pH vor der Sterilisation auf 7»5 eingestellt wird. Die Saatkultur wird bei 37°C 24 Std. auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung (250 Upm) inkubiert und 2 ml der Züchtung werden auf 100 ml des Fermentationsmediums in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben übertragen, das eine Zusammensetzung aus 3 % Sojabohnenmehl, 2 % Maisstärke, 1 % Kalziumcarbonat und 0,33 % MgSO₄*7H₂O besitzt. Die Produktion an Antibiotikum erreichte nach 3 bis 6 Tage^/ Schütteln bei 28°C ein Maximum.

Die antibi-otische Aktivität in der Fermentationsbrühe wird durch den. Papiers ehe iben-Agar-Diffus ions te st unter Verwendung von Bacillus subtilis PC1219 und Klebsiella pneumoniae A20680 bestimmt. Alle Komponenten des Bu-1975-Komplexes (A₁, A₂, B Ib und Ic) zeigten"Aktivität gegenüber B. subtilis PCI219, jedoch waren nur zwei Komponenten, Ib und Ic, wirksam gegen K. pneumoniae A20680.

Die Produktivität der Komponenten Ib und Ic bezüglich der anderen Komponenten war unter den Stämmen verschieden. Bei der Schüttelkolben-Fermentation produzierte der Stamm C532-B2 50 bis 100 γ/ml der Komponenten I, was etwa 30 bis 50 % der durch B.subtilis festgestellten gesamten Bioaktivität bedeutet. Andere Stämme waren weniger produktiv an Komponenten I als der Stamm C532-B2.

- 16 -

409882/1196

Isolierung und Reinigung

Die geerntete Brühe wird unter Verwendung von Filterhilfe filtriert und die Bioaktivität im Piltrat (pH 8,0) wird durch eine Säule Amberlite IRC-50, (NH^-Form) absorbiert. Man wäscht die Säule mit Wasser und entwickelt dann mit 1n NH^OH-Lösung. Die aktiven Eluate vereinigt man, konzentriert im Vakuum und extrahiert mit n-Butanol, um die Komponente B im Konzentrat zu entfernen. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt und auf eine Säule mit Amberlite CG-50 (NH^-Form) aufgegeben. Man wäscht die Säule mit Wasser und anschließend n/4 NH^OH-Lösung und eluiert die Aktivität mit n/2 NH₄OH, wobei das Eluat fraktioniert aufj gefangen wird. · |

■ Die aktiven Komponenten werden in der Reihenfolge A_P, A₁, j

j Ib und Ic eluiert, wobei Jedoch eine beträchtliche Überlappung

; der Komponenten auftritt und die völlige Abtrennung jeder :

! Komponente wurde errreicht, nachdem man die GG-50-Säulenchromator

^: graphie wiederholte.

Wie in Tabelle I gezeigt, wurden zwei TLC (Dünnschichtchromatographie) -Systeme, nämlich S-110 und S-II7 als geeignet gefunden, die Komponenten A₁ und A₂ von den Komponenten Ib und Ic zu differenzieren und das System S-II5 erlaubte bei 16-stündiger Entwicklung die Trennung des A₁ von A₂ und des Ib von Ic.

Die Komponenten A₂ und A wurden als Ambutyrosine A bzw. B* identifiziert und zwar durch die physiochemischen Eigenschaften (TLC, IR und NMR) und das antibakterielle Spektrum. Die folgenden Beschreibungen sind in der Hauptsache auf die Komponenten Ib und Ic des antibiotischen Bu-1975 beschränkt.

- 17 -

40 9 882/1196

*Der antibiotische Komplex, der als Ambutyrosine A und B identifiziert wurde, wurde im Screening Programm isoliert und als Referenz-Substanz in der vorliegenden Untersuchung verwendet. ' \

- 18 -

409882/1196

TAB5IIS I

	Dünnschichtchromatographie der Bu-1	975 Komponenten	A1 A2	Ib	Ic	Ί528
System	Platte ' Lösungsmittelsystem	Rf	0,41 0,41	0,51	0,51
S-110*	Silicagel ' CHCl3-MeOH-SeJSNH4OH-H2O (1:4:2:1)

■ S-117 Silicagel CHCl,-MeOH-28?$NH,OH 0,20 0,20 0,26 0,26

^ . (1:3:2)

VO <-> λ λ erJLJi. «τ j_^„„^„ λ Λ(ττητ n/r-/-\rr oor/τιτττ ηττ "ζ rrCm « ^,CVH _c —Cm ,-. r-CIH

S-115** Aluminiumoxyd CHCl₅-MeOH-285SHH₄OH 3,7^Cm 0,2^cm 5,3°^m 0,5

(2:1:1)

* dreimalige Entwicklung

** 16 Std. Entwicklung; der Ort ist in cm vom Ausgangspunkt angegeben.

Physiko-chemische Eigenschaften der Komponenten Ib und Ic

Die Komponenten'Ib und Ic sind weiße, amorphe feste Basen, die in Wasser leicht löslich, etwas löslich in Methanol und Äthanol und praktisch unlöslich in n-Butanol, Aceton und
anderen organischen Lösungsmitteln sind. Beide Komponenten geben mit Ninhydrin- und Anthron-Reagentien positive Reaktionen, sprechen jedoch nicht auf Tollens-, Fehling-und
Sakaguchi-Reaktionen an.

Eine Analysenprobe von Ib wurde in Form des Dicarbonats isoliert, das bei ungefähr 155⁰C (Zersetzung) schmilzt O]²J⁵= +26,7° (c 1,0, Wasser) und das als C₂₁ H₄₁ N₅O_{1 Λ} analysiert wurde.

Analyse:

	41	C	V	6	H	N	55
ber.:	41	,63	■ 6	,83	10,	47
gef.:	,52	,47	10,

Man erhält das Tetra-N-acetat vom Schmelzpunkt >250 C, [cc]_D »⁵ ■ +26,0° (c 0,5,.Wasser), das als C₂₁H₄₁N₅O₁₁ (C₂H₂O)₄*3/2 H₂O analysiert wird.

Analyse:

	C	40	7	H	9	N	*
ber.:	47,	30	7	,13	9	,53
gef.:	47,		,47	,65

Die Komponente Ic schmilzt bei 172 bis 178⁰C (Zersetzung) [a]_D ⁵ m +30,0° (c 1,0, Wasser) und wird als C₂₁H₄₁N₅O₁₁^H₂CO, analysiert.

Analyse:

	-	20	C	-	63	6	H	N	*
ber.:		41,		22	6	,83	10,55
gef.:		41,			,67.	10,82

409882/1196

Es wurde auch das Tetra-N-acetat von Ic hergestellt, das

einen Schmelzpunkt >250°C besitzt, [a]_D =» +43° (c 0,5, Wasser), und das als

C₂₁ H^₁ N₅O₁ ^ · (C₂H₂O)^*H₂O analysiert wird'; Analyse: ,·

	C	99	7,	H	9,	N
ber.:	47,	09	7,	08	9,	65
gef.:	48,		20	42

Die Antibiotika Ib und Ic zeigen eine Endabsorption nur im ultra-violetten bereich. Die Infrarotspektren (IR) von Ib und Ic sind denen des Ambutyrosin A und B sehr ähnlich. Das kernmagnetische Resonanzspektrum (NMR) von Ib zeigt zwei anomere Protonen bei cT5,28'(s) und 6,10 (d, J = 3,5 Hz) ppm, wobei das Signal bei tieferem Feld sich von dem im-NMR-Spektrum von Ic unterscheidet, das die anomeren Protonen bei cT5,28 (s) und 5,98 (d, J =» 3,5 Hz) ppm zeigt. Gleiche Unterschiede im Chemical Shift der zweiten anonreren Protonen wurden in den NMR-Spektren von Ambutyrosin A und B gesehen. Die NMR-Vergleichsdaten von Ib und Ic zusammen mit Ambutyrosin A und B sind in Tablle II dargestellt. In der Tabelle ist auch gezeigt, daß das Verhältnis der integralen Protonen bei den höheren (cfi,2 bis 2,4 ppm) und den niedrigeren (cT 2,5 bis 4,4 ppm) Methylen-Methin-Bereichen 6:18 für Ib und Ic beträgt, was im Gegensatz zum Verhältnis von 4:19 für Ambutyrosin A und B steht.

- 21 -

409882/1196

TABELLE II <

Vergleichende kernmagnetische Resonanz-Daten (NMR) der Komponenten S

Ib und Ic mit den Ambutyrosinen A und B

(60 MHz, in D₂O pH 2,0)

Chemical Shift · _Ä

(chemische Verschiebung) Anzahl von Protonen und Typ von Signalen

	I	(cT, ppm)	6H 18H	Ib-	-	(s)	Ic	*	1H (s)	-Ambutyrosin A	Ambutyrosin B
409882	ro ro	1,2 - 2,4 2,5 - 5,4		(m) (m)	,J=3,	6H (m) 18H (in)	1H (d, J»3,5Hz) ' 5Hz)	4H (m) 19H (m)	4H (m) 19H (m)
	I	5,16	1H	1H (s)	JH (s)
co OT		5,28	1H(d	—	-
	5,98 6,10	1H (d,J=3,6Hz)	1H (d, J=3,6Hz)

Beispiele für die Herstellung und Reinigung von 4'-Desoxyambutyrosin A

Beispiel 1

Man verwendet eine Agar-Schrägkultur von B. circulans Stamm C532-B2, um 100 ml des Mediums Nr. YGP-1 (1,5 % Glucose, 0,5 % Polypepton, 0,2 % Hefeextrakt, 0,05 % K₂HPO^ und 0,05 %. MgSO^H₂O) in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben zu inokulieren. Man inkubiert die Saatkultur 24 Std. bei 37°C auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung (250 Upm) und gibt Jeweils 2 ml des Wachstums auf 100 ml Fermentationsmedium Nr. 132 (3 % Sojabohnenmehl, 2 % Maisstärke, 1 % CaCO₃ und 0,33 % MgS0₄*7H₂0). Nach 6-tägigem Schütteln der Kultur bei 28⁰C zeigt der Papierscheibentest (8 mm) der Fermentationsbrühe, eine Inhibitionszone von 25 mm auf einer B. subtiles PCI219-Platte und eine 16 nun 2one auf einer K. pneumoniae A20680-Platte. Die vereinigte Fermentationsbrühe (200 Kolben, I7 Ltr.) wird filtriert und durch eine Säule von Amberlite IRC-50 (NH^-Form, 500 ml) absorbiert. Man wäscht die Säule mit Wasser und eluiert dann mit 2,2 Ltr. 1n NH^OH-Lösung. Die aktiven Eluate werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und mit n-Butanol extrahiert. Eindampfen des Butanolextrakts ergibt 1,3 -g rohen Feststoff (Komponente B) Die wäßrige Schicht wird"im Vakuum auf ungefähr 30 ml konzentriert, die auf eine Säule Amberlite CG-5Ö (NH^-Form) ' aufgegeben werden. Man wäscht die Säule nacheinander mit 500 ml ri/10 NH^OH und 700ml n/4 NH^OH und die Bioaktivität eluiert man mit n/2 NH^OH-Lösung. Das Eluat wird fraktioniert, gesammelt und durch Biountersuchung, Ninhydrin-Reaktion und TLC markiert. Die aktiven Komponenten werden in der Reihenfolge A₂, A₁, Ib und Ic eluiert.

- 23 -

409882/1196

M/15283

Röhren- nummern	Volumen	A2 A1	TLC	Verhältnis, bestimmt zu	Feststoff
69-87 88-111 112-159	200 ml· 250 ml 200 ml	+ A1 + Ic Ib	4:6 3:7	228 mg 193 mg 201 mg

Wiederholte Säulenchromatographie (CG-50, NH^⁺-Form) der zweiten und dritten Feststoffe ergibt reine Präparationen von 120 mg Ic und 180 mg Ib.

Beispiel

Man untersucht B.circulans, Stamm C532-B2-H48, der durch die Monosporen-Isolationstechnik aus dem Ausgangsstamm C532-B2 erhalten wurde. Die gleiche Schüttelkolben-Fermentation wie in Beispiel 1 ergibt eine maximale Wirksamkeit am 5.Tag (pH 9*3), die eine 30' mm Inhibierungszone auf einer B. subtilis PCI 219-Platte und eine 21 mm Zone auf einer K. pneumoniae' A20680-Platte zeigt. Der Untersuchungswert zeigt an, daß die Brühe ungefähr 150 γ/ml an Komponente A und ungefähr 100 γ/ml an Komponenten Ib und Ic enthält.

Beispiel 3

Man verwendet B. circulans, Stamm C308-B4 als Saatkultur und führt die Schüttelkolben-Fermentation wie in Beispiel 1 durch. Die geerntete Brühe (18 Ltr.) enthält 75 mg der Komponente A (A₁ 4- A₂), 6,4 g der Komponente B und 75 mg der Komponenten Ib und Ic.

- 24 -

409882/Π96

M/15283 .

B e i s ρ i e 1

Man verwendet B. circulans Stamm C436-B1 als Saatkultur und führt die Schütielkolben-Fermentation wip in Beispiel 1 durch. Die geerntete Brühe (20 Ltr.) enthält 71 mg Komponente A (A-J + A₂), 4,1 g Komponente B und 66 mg der Komponenten Ib und Ic.

Beispiel

Man führt ein submerses und belüftetes Fermentationsexperiment in 20 Ltr. Fermentorbehältern durch. Man verwendet B. circulans Stamm C532-B2-H48, um 10 Ltr. Medium Nr. YGP-1 (pH 7,2 nach Sterilisation) zu inokulieren. Man rührt die Saatkultur mit 250 Upm bei 35°C unter einer Belüftungsrate von 10 l/min .. und erhält nach 11 Std. (pH 6,0) ein heftiges Wachstum. Nach 11,5 Std. werden 1 Ltr. der Saatkultur auf. 10 Ltr. sterilisiertes Produktionsmedium Nr. 132 übertragen. Die Fermentation wird bei 28°C mit einer BeIUftungsrate von 11,5 l/min durchgeführt. Häufige Zugaben von Silikonantischaummitteln (KM-70) sind erforderlich, um. das übermäßige Schäumen unter Kontrolle zu halten. Nach 70 Std. (pH 8,2) erhält man die Spitzenwirksamkeit und die differentielle Untersuchung unter Verwendung von B. subtilis PCI 219 und K. pneumoniae A20680 zeigt 79 γ/ml Komponente A (A₁ + A₂) und 49 γ/ml an Komponenten Ib und Ic

Beispiel

Eine Fermentation in größerem Ansatz wird in Pilotplant-Tanks durchgeführt, die die Fermentierung von 100 Ltr. und 300 Ltr. Volumen erlauben. Die Fermentationsbedingungen sind wie die in Beispiel 5 mit der Ausnahme, daß die RUhrrate 180 Upm beträgt; pH =: 8,7. . ... . ....

- 25 409882/1196

Die Brühenwirksamkeit erreicht 95 γ/ml für Komponente A und 45 γ/ml für die Komponenten Ib und Ic.

Beispiel

Man filtriert eine Brühe, die aus zwei 300 Ltr.-Tanks (650 Ltr.) geerntet wurde und die ungefähr 20 γ/ml an Komponente C enthält, bei pH 8,5 und rührt mit 8,6 Ltr. Amberlite IRC-50 (NH₄ ⁺-Form). Man trennt das Harz ab, wäscht mit 80 Ltr. Wasser und eluiert dann chargenweise mit 1n NH^OH-Lösung (10 Ltr. χ 3). Die Eluate werden vereinigt und im Vakuum bei 35 bis 40⁰C auf ein Volumen von ungefähr 500 ml konzentriert, das 11,3 g Einheiten an Komponente A und 7,3 g Einheiten an Komponenten Ib und Ic enthält. Das Konzentrat wird mit n-Butanol extrahiert, um

verunreinigte Komponente B zu entfernen und die wäßrige Schicht wird mit 200 ml Amberlite CG-5to (NH.⁺-Form) gerührt. Man trennt das Harz ab, wäscht mit 5 Ltr. Wasser und gibt es-dann auf das obere Ende einer CG-50-Säule (NH₄ ⁺-Form, I500 ml). Die Säule wird mit 7 Ltr. n/4 NH. OH entwickelt. Man eluiert die Aktivität mit n/2 NH₄OH und sammelt die Eluate fraktioniert auf, wobei man 7,2 g Komponente A aus den Röhren Nr. 491-800 und 4,2 g an Komponente Ia und Ib aus den Röhren Nr. 93-1-1370 erhält. Eine Mischung der Komponenten A und Ib und Ic, 1,8g, gewinnt man aus den Röhren Nr. 801-930.

Amberlite IRC-50 ist die Handelsbezeichnung für ein schwachsaures kationisches Austauscherharz eines Carbonsäure-PoIymethacryl-Typs.

Amberlite CG-50 ist die Handelsbezeichnung für ein schwachsaures Kationen-Austauscherharz eines Carbonsäure-Polymethacryl-Typs.

Γ ,;

- 26 -

409882/1196

Die erfindungsgemäße Verbindung ist wertvoll als antibakterielles Mittel, Beifuttermittel "bei Tierfutter, therapeutisches Mittel bei Geflügel und. Tieren, sowie dem Menschen und ist insbesonderte wertvoll'bei der Behandlung infektiöser Erkrankungen, die durch gram-positive und gram-negative Bakterien verursacht sind.

Bei oraler Verabreichung ist- die neue erfindungsgemäße Verbindung brauchbar als Zusatzbehandlung zur präoperativen Sterilisation des Darms. Sowohl die aerobe als auch die anaerobe Flora, die gegenüber diesen Arzneimitteln empfindlich sind, werden im Dickdarm vermindert. In Verbindung mit geeigneter mechanischer Reinigung ist sie brauchbar bei der Vorbereitung von Dickdarmoperationen.

Das durch die vorliegende Erfindung geschaffene neue Medikament kann als pharmazeutisches Mittel formuliert werden, das außer dem aktiven Bestandteil einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthält. Die Verbindung kann sowohl oral als auch parenteral verabreicht werden. Die pharmazeutische Präparation kann in fester Form vorliegen, wie als Kapseln, Tabletten oder Dragees, oder in flüssiger Form, wie Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Bei der Behandlung bakterieller Infektionen beim Menschen kann die erfindungsgemäße Verbindung parenteral in einer wirksamen Menge von ungefähr 250 mg bis ungefähr 3000 mg/Tag in aufgeteilten Dosen drei- oder viermal täglich verabreicht werden. Im allgemeinen ist die Verbindung wirksam, wenn sie in einer Dosierung von ungefähr 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Std. verabreicht wird. So wird sie bei Menschen in Dosierungseinheiten verabreicht, die beispielsweise 125, 250 oder 500 mg aktiven Bestandteil mit 'geeigneten physiologisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln enthalten.

- 27 4098 82/1196

Tabelle III zeigt die vergleichenden in vitro antimikrobiellen Aktivitäten der Verbindung V im Vergleich mit 4'-Desoxyambutyrosin A (I) gegen eine Vielzahl gram-positi ver und gram-negativer Bakterien. '

Die MICs (minimale Hemmkonzentrationen) werden durch die Steers Agar-Verdünnungsmethode auf Nähragarmedium erhalten und sind in γ/ml angegeben.

- 28 -

409882/1196

TABELLE III

BBRI-Code

Organismus

	1 ! I	I IV5	Pa-1	P.aefuginosa	D-15
	i I I	VD	Pa-2	η
-fc"S	i	I	Pa-3	η	Η9 D-113
♦ O	i		Pa-4	π	Η9 D-113
CO	j
OO			Pa-5	η
cx> ro	i 1 ι		Pa-6	η
	i j		Pa-7	π
g f^	i		Pa-9	η	YaIe
(Sj CO	i		Pa-10	π
	I i		Pa-11	η
	j I		Pa-12	η
	I	Pa-13	π
	t	Pa-15	It
		Pa-16	η	#130
		Pa-17	η	Ε6 D-114
		Pa-19	η
		Pa-20	η
		Pa-21	η

	Minimale Hemiakon- zentration (MIC) (Y /ml)	I	MIC-Ver- hältnis I/V	UI N) CD VX	0
	V	1,6
	1,6	6,3	1
A9923	6,3	.0,2	1
A993O	0,2	25	1
	12,5	6,3	2
A15150	6,3	3,1	1
A15194	3,1	6.3.	1
A9843	6,3	6,3	1	ji
	6,3	6,3	1 ί	OO
A20479	6,3	6,3	1	CD
A20616	12,5	100	1/2
A2O653	25	12,5	4
A9843-A	6,3	3,1	2
A2O717	6,3	1,6	1/2
A20178	3,1	3,1	1/2
	3,1	0,8	1
A20229	1,6	. 3,1	1/2
A2O325	3,1	6,3	1
A20601	6,3	1

TABELLE III (Portsetzung):

	I VjI	BBRI-Code	Organismus	Α2Ο741	Minimale tration (Ύ	25	Eemmkonzen- (MIC) /ml)	MlC-Verhält- nis I/V
	O			Α20896	V	12,5	I
	I	Pa-23	P. aeruginosa	Α20897	50	12,5	f/2
		Pa-24	It		6,3	12,5	1
		Pa-25	Il	Α2Ο62Ο	1,6	50	1
O		Pa-26	" Ps. 32	Α20817	0,8	6,3	1
(O 00		Pl-1	P. Multophilia	Α2Ο355	0,8	0,8	1/2
00		Pe-1	P. melanogenum	Α2Ο358	3,1	0,8	1
■-ν		Px-1	Pseudomonasr sp.	Α20368	6,3	0,4	1/2
Il		Px-2	Il	Α20598 .	12,5	1,6 *	1/2
UJ co		Px-3	η	Α20600	3,1	12,5	2
		Px-4	π	Α2Ο6Ο3	6,3	12,5	1
		PX-5	ti	Α20618	>100	3,1	-"Ί
		PX-6	π	Α2Ο594	6,3	6,3	1
		Px-7	π	Α2Ο595	12,5	yioo	-
	Px-8	η	Α2Ο621	>100	6,3	1
	Px-9	η		0,8	12,5	1
	Px-10	η	Α15119	0,8	>100	-
	Ec-1	E. coli NIHJ	Α2Ο363	0,8	0,8	1
	Ec-3	" Juni	0,8	1
	Ec-5	η ML-163O	0,8	1

TABSLIS III (Fortsetzung):

BBRI-Code	Organismus	-	E. coli	■ *	Minimale	Hemmkonzen-	I	MIC-Verhältnis
		" ' K-12	A20365	tration	(MIC) M)	0,1	I/V
	" .' NR79/W677	A9632	Y	0,4
Ec-7	" JR35/C6OO	A20664	0,2	0,8	. 1/2
Ec-8	" W677 '	A20665	0,8	0,2	1/2
Ec-9	■" JR66/V677	A20684	1,6	0,4	1/2
Ec-10	fl	A2068.3	0,4	0,8	1/2
Ec-52	π	A9675	1,6	0,4	1/4
Ec-53	π	A20766	1,6	0,8 ..	1/2
Ec-58	η	A20898	0,4	3,1	1
Ec-59	E. Cloacae	A20895	0,8	0,4	1 O
Ec-60	π	A20364	6,3	0,4	1/2
Ec-62	K. Pneumoniae Ό—11	A2O65O	0,4	1,6	1 *
El-3	η Typ 22		0,8	0,2	,· 1/2
El-4	S. Marcescens	A20680	3,1	0,8	1/2
Kp-1	P. vulgaris	A20019	0,2	0,8 .	1
Kp-8	P. morganii	AO436	0,8	0,2	1
Sm-1	P. mirabilis	A9553	0,8	0,8	1
Py-1	Providencia	A9554	0,4	0,4	1/2
Pg-1		A20894	1,6	25	1/2
Pm-1		0,8	1/2
Py-1	6,3	4

K) CO CD

TABELLE III (Fortsetzung):

	BBRI-Code	Organismus	209Ρ	•	•	•	607(KM-R)	Minimale	V	Hemiikonzentration	I
						607(KM, SM-R)	(MIC)	0,2	(Ύ/ml)	0,2
					phi ei	0,8	0,8
	Sa-2	S. aureus Smith	B. subtilis >PCI 219	A2O239		0,4	0,8
	Sa-4	rt		A15O36	0,4	0,4
	Sa-10	n		A2O24O	0,4	0,8
O	' Sa-47	η	Mycobacterium 607	A20240	0,8	1,6
CD OO	Sa-48	It	π		<0,05	<0,05
OC K. ^	, Sa-49	If	It
	v» Bs-1	π		0,4	0,2
i	ro		>100	>100
*	1 M6-1	>100	>100
CO	M6-2	0,2	0,2
	M6-3
	Mp-1

MIC-Verhältnis I/V

1 1 2 1 2 2

1/2

Tabelle III zeigt die MIC-¥erte von V gegen 67 Stämme von Testorganismen einschließlich 34 Pseudomonas-Stämmen. Die letzte Kolonne der Tabelle III zeigt die MIC-Verhältnisse von V zu I an. \

Verbindung V ist so wirksam wie J gegenüber den meisten Testorganismen (die MIC-Verhältnisse sind 1/2-2), besitzt jedoch unerwartet überlegene Inhibierungswirkungen gegen PS. aeruginosa A 20653, das gegenüber V eine bescheidene Resistenz aufweist (MIC 25 γ/ml) und gegenüber I sehr resistent ist (> 100 γ/ml) und ebenso gegenüber Providencia sp. A 20894, das viermal empfindlicher gegenüber V (6,3 γ/ml) ist als gegenüber I (25 γ/ml).

Beispiele-für bevorzugte Ausfuhrungsformen

B e i spie 1

Herstellung von Tetra-N-*benzyloxycarbonyl-4'-desoxyambutyrosin A (Ha)

Man gibt 1,5 g (8,8 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid bei 10⁰C zu einer gerührten Mischung von 1,0 g (2 mMol) 4^f-Desoxyambutyrosin A (I) und 466 mg (4,4 mMol) Na₂CO, in 25 ml 20 %igem wäßrigem Aceton und rührt die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur. Man konzentriert die Reaktionsmischung zu ungefähr 10 ml und extrahiert das Konzentrat mehrmals mit n-Butanol. Die Extrakte werden zur Trockene eingedampft, wobei ein öliger Rückstand entsteht, der mit Äther verrieben'wird, wobei man 1,9 g (92 %) weißes Pulver (-1Ia) erhält.

- 33 - ■

409882/1196

MZI₅₂₈₃ . V,

Beispiel 2

Herstellung von Tetra-N-benzyloxycarbonyl-5"-tosyl-4·,5"-di-desoxyambutyrosin A (lila) -,

Man gibt 366 mg (1,93 mMol) Tosylchlorid bei -1O°C zu einer Lösung von 1,9 g (1,83 mMol) II' in 12 ml trockenem Pyridin. Die Mischung wird bei 4°C drei Tage gerührt, mit einer kleinen Menge Wasser 1 Std. bei 4⁰C behandelt und eingedampft, um das Pyridin zu entfernen. Man wäscht den Rückstand mit Wasser, trocknet unter vermindertem Druck und löst dann in einer kleinen Menge einer Mischung von CHCl j und CH,OH (20:1). Die Lösung wird auf einer Silikagelsäule (18 χ 70 mm) chromatographiert, wobei man dasselbe Lösungsmittelsystem verwendet. Nachdem man 180 ml des Eluats aufgefangen hat, tritt das gewünschte Produkt in den nächsten 120 ml aus. Diese Fraktion wird eingedampft, wobei man 723 mg (33 %) IHa erhält.

Beispiel

Herstellung von 5"-Amino-4·,5"-di-desoxyambutyrosin A (V, BB-K 137)

Zu einer Lösung von 428 mg (0,36 mMol) III in 13 ml DMF (Dimethylformamid) gibt man eine Lösung von 170 mg (2,6 mMol) NaN, in 0,7 ml Wasser und erhitzt die Mischung über Nacht bei 105°C und konzentriert anschließend im Vakuum zur Trockene. Der ölige Rückstand wird gründlich mit Äther und anschließend mit Wasser gewaschen, wobei man das 5"-Azido-tetra-N-benzyloxycarbonyl-4',5"-di-desoxyambutyrosin A (IV) erhält, das man in 40 ml 50 tigern wäßrigem Äthanol löst und mit 400 mg 10 %igem Pd-C unter Normaldruck bei* Raumtemperatur über Nacht hydriert. Die Reaktionsmischung wird filtriert und unter vermindertem

-34 -

0 9 8 8 2/1196

M/15283 3 S

Druck eingedampft. Man löst den Rückstand in einer kleinen Menge Wasser und gibt ihn auf das obere Ende einer Säule mit Amberlite CG-50 (NH^-Form, 20 ml) ,',die man mit 30 ml Wasser und nacheinander mit 240 ml 0,1n NH^OH, 600 ml 0,3n NH^OH und anschließend 1,2 Ltr. 0,5n NH^OH berieselt. Das Eluat wird in 15 ml Fraktionen aufgefangen und durch den Ninhydrin-Spot-Test (Scheibentest B.subtilis) und TLC (Silikagelplatte, CHCl^-CHjOH-28 % NH₄OH-H₂O » 1:4:2:1) markiert. Die Fraktionen 74 "bis 96,, die einen ninhydrin-positiven und bioaktiven Spot bei Rf 0,17 (durch TLC) zeigen', werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert, wobei man 102 mg (57 % von 10) an Verbindung V (BB-K 137) erhält. Schmelzpunkt =164 bis 167°.
^ C=O 1640 cm"¹.

Analyse C₂₁H₄₂N₅O₁₀*5/2 H₂CO₃* 1/2 H₂O:

	C	,17 *	6	H	11	N
ber..:	40	,13	6	,89	11	,96
gef.:	40		,85	,70

Beispiel 4

Herstellung des Monosulfatsalzes der Verbindung V

Man löst 1 Mol Verbindung V in 1 bis 3 Ltr. Wasser. Die Lösung wird filtriert, um ungelöste Feststoffe zu entfernen. Zu der gekühlten und gerührten Lösung gibt man 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser zu. Man läßt die Mischung 30 Min. rühren, worauf man zu der Mischung kaltes Äthanol zugibt, bis ein Niederschlag auftritt. Die Feststoffe werden durch Filtrieren gesammelt und werden als das gewünschte Monosulfatsalz bestimmt.

- 35 -

0 9 8 8 2/1196

M/15283
Beispiel

Herstellung des Pisulfatsalzes von Verbindung V

35 g Verbindung V werden in 125 ml entionisiertem Wasser gelöst. "Man stellt den pH mit 50 % V/V Schwefelsäure auf 7 bis 7,5 ein.

Man gibt 8 1/2 g Darco G-60 (aktivierte Aktivkohle) zu und die Mischung wird bei Umgebungstemperatur 0,5 Std. aufgeschlämmt. Der Kohlenstoff wird durch geeignetes Filtrieren entfernt und mit 40 ml Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird zum FiItrat zugegeben.

Das obige vereinigte Filtrat-Waschwasser wird mit 50 % V/V Schwefelsäure auf pH 2 bis 2,6 eingestellt. Es entweicht eine große Menge an Kohlendioxyd. Die Lösung wird unter Rühren 20 Min. am Laborvakuum gehalten, um zusätzliches j Kohlendioxyd zu entfernen.

i Man gibt zu der entgasten Lösung 8 1/2 g Darco G-60. Die

Mischung wird 0,5 Std.-bei Umgebungstemperatur aufgeschlämmt. j Der Kohlenstoff wird durch geeignetes Filtrieren entfernt und I mit 35 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Das Wasser wird j zum Filtrat zugegeben.

I Das vereinigte Filtrat-Waschwasser wird mit 50 % V/V Schwe- !feisäure auf pH 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung wird unter I schnellem Rühren im Verlauf von 10 Min. zu 600 bis 800 ml Methanol (3 bis 4 Vol. Methanol) zugegeben. Man rührt die Mischung 5 Min. bei pH 1 bis 1,3, gibt durch ein 0,147 mm Sieb (100 mesh screen), rührt 2 Min. und läßt 5 Min. absitzen. Die Hauptmenge der überstehenden Flüssigkeit wird dekantiert. Die

- 36 -

409882/ 1196

Μ/15283 3>

zurückbleibende Aufschlämmung wird in geeigneter Weise filtriert, mit 200 ml Methanol gewaschen und bei 50°C 24 Std. im Vakuum getrocknet, wobei das gewünschte Disulfatsalz V erhalten wird. '

- 37 -

409882/1196

Claims (18)

M/15283 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel CH₂NH₂

.H₂N-H₂C

NH-C-CH-CH₂-CH₂ O OH

oder eines nicht-toxischen pharmazeutisch' vertraglichen Säureadditionssalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen

A) 4'-Desoxyambutyrosin A mit einem aminoblockierenden Acylierungsmittel in einem Verhältnis von mindestens 4 Mol Acylierungsmittel pro Mol 4'-Desoxyambutyrosin A acyliert, um die Verbindung der Formel II

- 38 -

409882/1196

M/15283

CH₂NHB

NHB

H-C-CH₅-CH., O NH-B

worin B eine aminoblockierende Gruppe darstellt, zu erhalten;

B) Verbindung II mit einem Sulfonylhalogenid der Formel

W - SOp - Z

worin Z die Gruppen Chlor, Brom oder Jod bedeutet und W (Niedrig)alkyl oder einen Arylrest der Formel

^ k
bedeutet, worin Ir und R , die gleich oder verschieden sind, jeweils H, (Niedrigklkyl, Nitro, (Niedrigklkoxy-Chlor, Brom, Jod, darstellen, in einem Verhältnis von mindestens einem Mol Sulfonylhalogenid pro Mol Verbindung II in Gegenwart einer überschüssigen Menge an organischer Base, acyliert, um die Verbindung der Formel

- 39 -

409882/1196

M/15283

HO-^

,NHB

NH

W-SO₀-O-H₅C

NHB

H-C-CH-CH₂-CH₂

' · III

herzustellen, worin B und ¥ die obigen Bedeutungen besitzen;

C) Verbindung III mit einem großen Überschuß eines Alkali· metallazids in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel -behandelt, um die Verbindung der Formel IV

CH-NHb

NHB

Il

NH-C-CH-CH₉-CH₂ OH NH -B

herzustellen und

- 40 -

409882/ 1 196

D) Verbindung IV zur Herstellung der Verbindung der Formel V hydriert und gegebenenfalls diese Verbindung in ein nicht*-toxisches, pharmazeutisch verträgliches
Säureadditionssalζ davon überführt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe A) mit einem aminoblockierenden Acylierungsmittel durchgeführt wird, das durch Hydrieren abgespalten werden kann.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Benzyloxycarbonylchlorid oder sein funktionelles
Äquivalent als Acylierungsmittel verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acylierung mit Benzyloxycarbonylchlorid in 20 % wäßrigem Aceton durchführt.

5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acylierung der·.Stufe B) in Gegenwart einer überschüssigen Menge an tertiärem Amin in;
einem Temperaturbereich von ungefähr -10⁰C bis ungefähr 15⁰C durchführt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acylierung in Stufe B) in Pyridin in. einem
Temperaturbereich von ungefähr O⁰C bis ungefähr 10°C
durchführt.

7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung in Stufe B mit Tosylchlorid

durchgeführt wird.

- 41 -

409882/1196

M/15283 4^ 242864 Ί

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel III mit einem großen* Überschuß an Natrium- oder Kaliumazid in einem organischen Lösungsmittel, das ungefähr 5 bis 10 %

■ Wasser enthält, bei erhöhten Temperaturen behandelt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel III mit Natriumazid _r±n Dimethylformamid mit ungefähr 5 bis 10 % Wasser in einem Temperaturbereich von ungefähr 8O⁰C bis ungefähr 120⁰C behandelt.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung IV in Gegenwart eines Metallkatalysators in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel durchführt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung IV in Gegenwart von Palladium auf Aktivkohle in 1:1 Wasser/Äthanol hydriert.

12. Verbindung der Formel

NH₂

NH-C-CH-CH_-CH

IM ²I²

O OH

- 42 -

409882/119 6

M/15283

oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon.

13. Mono- oder Polysulfatsalz der Verbindung gemäß Anspruch 12,

14. Mono- oder Polyhydrat einer Verbindung gemäß den Ansprüchen 12 oder 13.

15. Verbindung der Formel

NH-B

NH-C-CH-CH₀ -CH₀ -NH-B Il I ² * O OH

! worin B eine aminoblockierende Gruppe bedeutet.

'

16. Verbindung gemäß Anspruch 15, worin B eine aminoblockierende Gruppe darstellt, die durch Hydrieren abgespalten werden kann.

17. Verbindung gemäß einem der Ansprüche I5 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß B die Gruppe Benzyloxycarbonyl dar-

' stellt.

18. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine Verbindung oder ein nicht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz gemäß den Ansprüchen 12 bis 14 und einen

- 43 4 0 9-882/. 1 196

pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

- 44 -

409882/1196