DE2419838A1 - Verfahren zur herstellung einer optisch aktiven aminosaeure - Google Patents

Description

Priorität: 24. April 1973, Japan, Nr. 46 472/1973

Verfahren_zur Herstellung einer optisch aktiven Aminosäure

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Spaltung von Aminosäuren und insbesondere zur Trennung der Enantiomorphen durch selektive Entacylierung der N-Acylderivate von optisch aktiven Aminosäuren mit Hilfe von Acylase.

Es ist bekannt, daß N-Acyl-DL-aminosäuren durch Acylasen selektiv entacyliert werden, die nur das N-Acylderivat der einen optisch aktiven Form der Aminosäuren angreifen. Das N-Acylderivat und die Aminosäure unterscheiden sich ausreichend in ihren Eigenschaften, so daß die Trennung der beiden Verbindungen mit Hilfe einfacher Methoden ermöglicht wird, die zur Trennung der . Enantiomorphen der gleichen Verbindung nicht wirksam sind.

Die bekannten Verfahren sind jedoch aufwendig und/oder kompliziert. Das Enzym wird bei den üblichen anteilweise durchgeführten Verfahren nicht wirtschaftlich ausgenutzt, da es entweder nach der Durchführung jedes Versuchs zerstört wird oder mit störenden Verbindungen verunreinigt oder verdünnt wird, so daß seine Wirksamkeit für einen'anschließenden Entacylierungsvor-

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gang vermindert wird. Diese Nachteile werden bei kontinuierlichen Verfahren vermieden, in denen das Enzym stationär in Be-.zug auf eine sich bewegende Lösung der Acylaminosäure vorliegt, was mit Hilfe einer semipermeablen Ultrafiltrationsmembran öder durch Modifikation unter Bildung einer unlöslichen Form des Enzyms erfolgen kann. Die kontinuierlichen Verfahren sind jedoch im Hinblick auf die Materialien und Vorrichtungen kostspielig und führen zu anderen Schwierigkeiten, die ihre Anwendung in industriellem Maßstab verhindert haben.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur selektiven Entacylierung von N-Acyl-DL-aminosäuren in einem wässrigen Medium zur Verfügung zu stellen, das in der Weise durchgeführt werden kann, daß die Reaktionsprodukte und das Enzym gesondert mit möglichst geringem Verlust gewonnen werden. Dieses Verfahren soll einfach, nicht aufwendig und billig sein und soll nicht den Einsatz bedeutender Mengen von Fremdchemikalien in dem Prozeß erfordern.

Es wurde gefunden, daß diese Aufgaben dadurch gelöst werden können, daß die N-Acyl-DL-aminosäure mit Acylase in einem wässrigen Medium in Berührung gebracht wird, welches in Berührung mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel steht. Das Lösungsmittel wird so gewählt, daß die Konzentration der N-Acyl-DL-aminosäure und der Carbonsäure, von der sich ursprünglich die Acylgruppe ableitet, in dem Lösungsmittel mindestens gleich der Konzentration in dem wässrigen Medium ist, wenn Lösungsgleichgewicht zwischen dem Lösungsmittel und dem wässrigen Medium erreicht ist. Es ist ferner wesentlich, daß die Acylase in Wasser leicht löslich ist. 7/enn die entacylierte Aminosäure nur geringfügig in dem Lösungsmittel löslich ist, ist eine kontinuierliche Verfahrensweise in sehr einfacher Weise möglich.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminosäure aus einem razemischen IT-Acylderivat der Aminosäure, in welchem als Acylrest der Acyl-

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rest einer Carbonsäure vorliegt, durch Spaltung mit Acylase ineinem wässrigen Lledium bis zur partiellen Entacylierung des ra- zenischen N-Acylderivats zu einem optisch aktiven Enantiomorphen der- Aminosäure und einem optisch aktiven Enantiomorphen des N-Acylderivats unter Bildung der freien Carbonsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß a) das Medium während der Spaltung mit einem organischen Lösungsmittel in Berührung gehalten wird, das ' mit dem Medium nicht mischbar ist, b) das organische Lösungsmittel so gewählt wird, daß die Gleichgewichtskonzentrationen des N-Acylderivats und der Carbonsäure in dem Lösungsmittel mindestens gleich den entsprechenden Konzentrationen in dem Spaltungsmedium sind, und c) der pH-Wert des Mediums unter 7 gehalten wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Wasser, N-Acyl-DL-aminosäure und Acylase mit dem organischen Lösungsmittel bei einer für die Entfaltung der Acylaseaktivität geeigneten Temperatur und einem pH-V/ert unterhalb 7 gerührt oder in anderer Weise in Kontakt gehalten, bis die gewünschte, selektive Entacylierung stattgefunden hat. Dabei liegt die Acylase vollständig in der wässrigen Flüssigkeit vor, die optisch aktive N-Aeylaminosäure und die durch Entacylierung gebildete Carbonsäure befinden sich in der organischen Lösungsmittelphase, und die gewünschte, entacylierte, optisch aktive Aminosäure reichert sich in der wässrigen Phase in gelöster Form oder in Form eines festen Niederschlags an.

Da das erfindungsgemäße Verfahren von den Losungsgleichgewich-. ten abhängt, um das Enzym von der Carbonsäure und um die gebildete Aminosäure von dem N-Acylderivat abzutrennen, ist es unwesentlich, in welcher Reihenfolge und in welcher Form die Ausgangsmaterialien in die Eeaktionszone eingeführt werden. Die gebildete Carbonsäure wird durch das Lösungsmittel entfernt, und der zur Entfaltung der optimalen Enzymaktivität in der wässrigen Phase notwendige pH-V/ert wird praktisch unverändert aufrechterhalten. Es ist nicht erforderlich, während der.Reaktion Kittel zum Alkalischmachen zuzusetzen, und ferner tritt auch nicht das Problem der Abtrennung des Enzyms von durch Neutrali-

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sation gebildeten Salzen auf. Es ist bekannt, daß derartige Salze die Enzymaktivität beeinträchtigen.

Wenn die freie IT-Acyl- DL- amino säure anfänglich in dem organischen Lösungsmittel gelöst ist, diffundiert sie in ausreichenden ilengen in die wässrige Phase, um ein Fortschreiten der Entacylierungsreaktion zu ermöglichen, obwohl die wässrige Phase einen pH-Wert von weniger als 7 hat, bei welchem die N-Acylaminosäure weit stärker in der organischen Phase als in der wässrigen Flüssigkeit löslich ist. Zu diesem Zweck wird ein pE-Yfert von 6,5 oder weniger bevorzugt. Wenn die N-Acylaminosäure in hohen Konzentrationen in der wässrigen Phase vorliegen würde, würde sie die Wirkung der Acylase beeinträchtigen und die Gewinnung der gewünschten Aninosäure erschweren,

V/enn die gelösten Substanzen zu Beginn der enzymatischen .Reaktion ein Gleichgewicht in der wässrigen Phase und in dem Lösungsmittel erreichen und das wässrige System den bevorzugten pH-v'/ert von 3|5 bis 6,5 aufweist, liegt die N-Acyl-DL-aminosäure in der wässrigen Phase weitgehend als Salz der Base vor, die zum Einstellen des fast neutralen pH-Werts der wässrigen Lösung verwendet wird. Freie N-Acyl-DL-aminosäure liegt weitgehend in dem. organischen Lösungsmittel vor. läit fortschreitender Reaktion reichert sich die freie Aminosäure in der wässrigen Phase an und kann.in kristalliner Form ausgefällt werden, wenn ihre Löslichkeit überschritten wird. Die optisch aktive N-Acylaminosäure, die durch die Acylase nicht angegriffen wird, liegt vorherrschend in der Lösungsmittelphase vor, und das gleiche gilt für die durch die Acylase freigesetzte Carbonsäure.

Das in der wässrigen Phase noch vorhandene H-Acylaminosäuresals ist bei dem bevorzugten pH-iYert im allgemeinen stärker löslich als die durch den Spaltungsvorgang gemäß der Erfindung gebildete Aminosäure, so daß es einfach ist, die reine, optisch aktive Aminosäure von der wässrigen Flüssigkeit abzutrennen, ohne die vorliegende Acylase zu desaktivieren oder in anderer weise zu

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zerstören. Die Acylase ist daher zur Behandlung eines weiteren Anteils der N-Acyl-DL-aminosäure verfügbar.

Das Verfahren kann kontinuierlich gestaltet werden, indem kontinuierlich oder periodisch ein Teil des organischen Lösungsmittels aus der Reaktionszone abgezogen und durch Lösungsmittel ersetzt wird, das einen geringeren Anteil der optisch aktiven N-Acylaminosäure und Carbonsäure enthält. Das abgezogene Lösungsmittel kann gereinigt und in das Verfahren zurückgeführt werden, und die optisch aktive N-Acylaminosäure kann razemisiert und ebenfalls zurückgeführt werden. Die optisch aktive Aminosäure kann in entsprechender Weise kontinuierlich oder periodisch aus der wässrigen Phase gewonnen werden, und diese Gewinnung wird besonders einfach, wenn die Aminosäure aus der wässrigen Flüssigkeit auskristallisiert. Es ist gewöhnlich vorteilhafter, N-Acyl-DL-aminosäure zusammen mit dem organischen Lösungsmittel in das kontinuierliche System einzuführen.

Das Lösungsmittel kann vorteilhaft so gewählt werden, daß es die Razemisierung der in dem Lösungsmittel gelösten optisch aktiven N-Acylaminosäure durch Erhitzen ermöglicht, so daß die resultierende Lösung oder Mischung aus Lösungsmittel und razemischem Ausgangsmaterial in die Reakt ions zone eingeführt v/erden kann, ohne daß die N-Acyl-DL-aminosäure isoliert werden muß. Die durch das Enzym freigesetzte Säure muß mindestens zum Teil aus dem zurückgeführten Lösungsmittel abgetrennt werden, da sie sich in dem Reaktionssystem nicht anreichern darf.

Wenn die optisch aktive Aminosäure aus der wässrigen Phase in fester Form abgetrennt wird, nachdem sie sich spontan abgeschieden hat, ist es nicht erforderlich, die anderen Bestandteile der wässrigen Phase, d.h. die Acylase, die zum Einstellen des Anfangs-pH-Werts erforderliche Base und die geringe !.!enge des Kobaltsalzes, die zur Aktivierung des Enzyms erforderlich ist, jemals zu entfernen, und es ist nur notwendig, diese Bestandteile gelegentlich zu ergänzen. Das erfindungsgemäße Verfahren erreicht daher bei kontinuierlicher Verfahrensweise die

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Vorteile der bekannten Llethode, bei der ein Enzym verwendet wird, das durch eine Ultrafiltrationsmembran oder durch Überführung in ein festes Addukt festgelegt wurde, ohne daß es die Nachteile aufweist, die den bekannten Verfahren eigen sind.

Die verwendeten Lösungsmittel können in weiten Umfang unter organischen Flüssigkeiten gewählt werden, die nicht axt Wasser mischbar sind und befähigt sind, die N-Acylaminosäure und die ' Carbonsäure zu lösen, aus der die Acylgruppen stammen, die durch Acylase entfernt werden. 2s ist offensichtlich, daß das Lösungsmittel inert gegenüber dem Enzym und der Aminosäure und deren N-Acylderivat sein muß. '»Venn beabsichtigt ist,- daß das Lösungsmittel als LIedium für die thermische Hazemisierung der optisch aktiven N-Acylaminosäure dient, soll sein Siedepunkt so-gewählt werden, daß er oberhalb der Razemisierungstemperatur liegt, die typischerweise 9o bis 2oo°G beträgt.

Zu Lösungsmitteln, welche diese stärker spezifizierten Bedingungen erfüllen, gehören Triester der Phosphorsäure, die mindestens 5, vorzugsweise mindestens 7 Kohlenstoffatome in den kombinierten Alkoholeinheiten aufweisen, wie Triäthyl-, Tripropyl-, Tributyl-, Tiiisobutyl-, Trichloräthyl-, Methyldibutyl- und Iviethylpropylbutylphosphat. Außerdem geeignet sind niedere Alkylester von niederen Alkancarbonsäuren, wobei die Bezeichnung "niedere Alkylgruppe" und deren Analoge bis viergliedrige Kohlenstoffketten bedeuten soll. Beispiele für derartige Fettsäureester sind'Methylacetat, Äthylacetat, Butylacetat und Athylpropionat. Diese Ester-Lösungsmittel werden hauptsächlich aufgrund ihrer leichten technischen Zugänglichkeit und ihrer Wirtschaftlichkeit gewählt. Zu anderen geeigneten Lösungsmitteln gehören Dialkylketone mit mindestens 4- Kohlenstoffatomen, wie Methyläthylketon, Diäthylketon, üethylisobutylketon, sowie Alkohole mit mindestens 4-. Kohlenstoffatomen, wie n-Butanol und Amylalkohol (Pentanol-1).

Die Phosphorsäureester werden bevorzugt, weil sie sicher während des gesamten Verfahrenskreislaufs einschließlich der thermischen

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Raz.emisierung der optisch aktiven "N-Acylamino säure gehandhabt werden können. Die Konzentration der .N-Acylaminosäure in dem · Razemisierungsgemisch ist vorzugsweise höher als in der Entacylierungszone, so daß ein Teil des Lösungsmittels vorzugsweise vor der Wärmebehandlung abdestilliert wird. Um diese Destillation zu erleichtern, sollte der Siedepunkt des verwendeten organischen Lösungsmittels nicht zu hoch sein. Trialkylphosphate mit weniger als 15 Kohlenstoffatomen in den kombinierten Alkoholeinheiten, wie Tributyl- und Triisobutylphosphat, sowie Dialkylketone mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen haben sich im Hinblick auf die Kombination wünschenswerter Eigenschaften unter den leicht zugänglichen technischen Lösungsmitteln als am vorteilhaftesten erwiesen.

Das optimale Verhältnis von organischem Lösungsmittel zu wässrigem Medium in der Reaktionszpne muß für eine gegebene Kombination der sonstigen Bedingungen experimentell bestimmt werden, weil es durch die Art des Lösungsmittels, die Art der zum Einstellen des pH-Werts der wässrigen Phase verwendeten Base, die Art und Konzentration der N-Acylaminosäure in der wässrigen Phase und dergleichen beeinflußt wird. Im allgemeinen werden gute Ergebnisse mit einer Volumenmenge des Losungsmittels erzielt, die mindestens 7o % des Volumens der wässrigen Phase ausmacht. Zur Bestimmung des besten Verhältnisses von Lösungsmittel zu V/asser können anfangs gleiche Volumteile der organischen und wässrigen Phase angewendet werden. Dieses Verhältnis ist jedoch nicht· kritisch.

Die Aminosäuren, deren N-Acylderivate als Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können, können frei unter natürlich vorkommenden Aminosäuren und synthetischen Aminosäuren, die in der Natur nicht aufgefunden werden, gewählt werden· Das Verfahren läßt sich auf neutrale Aminosäuren, v/ie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin oder Norleucin, · auf Kydroxyaminosäuren, wie Serin und Threonin» auf schwefelhaltige Aminosäuren, wie Cystein, Cystin und Methionin, auf

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saure Aminosäuren, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure, auf basische Aminosäuren, wie Lysin, Arginin und Histidin, auf aromatische Aminosäuren, die Phenylalanin, Tyrosin, 3 »4- Dihydroxyphenylalanin (DOPA), 3>4-Methylen-dihydroxy-phenylalanin, 3₅^-Dirne thoxyphenyl alanin und Phenylglycin, sowie auch auf heterocyclische Aminosäuren, einschließlich Tryptophan, Prolin, Hydroxyprolin, ot-Amino- S-caprolactam und 5-Hydroxytryptophan anv/enden. Die vorstehende Aufzählung ist keinesfalls erschöpfend und gibt nur einen Hinweis darauf, daß für die Durchführbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens die chemische Struktur der eingesetzten Aminosäure unerheblich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit besonderem Vorteil zur kontinuierlichen Spaltung von N-Acylderivaten von Aminosäuren angewendet, die bei den für die Acylaseaktivität günstigen pH-Werten nur geringfügig in V/asser löslich sind. Zu diesen Aminosäuren gehören Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Phenylalanin, Phenylglycin, 3>4~Methylendihydroxyphenylalanin, 3»4~Dimethoxyphenylalanin und Tryptophan.

Acylase, die zur Abspaltung von Acylgruppen befähigt ist, welche von substituierten oder unsubstituierten aliphatischen und aromatischen Carbonsäuren abgeleitet sind, ist bekannt, zugänglich und zur Spaltung der entsprechenden N-Acylaminosäuren bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar. Die Ii-Acylgruppen, die zur Zeit die größte praktische Bedeutung für razemische, insbesondere für synthetische Aminosäuren haben, sind die Acetyl-, Formyl-, Chloracetyl-, Propionyl- und Benzoylgruppe. Sie sollten in alle Aminogruppen in Acylderivaten von basischen Aminosäuren eingeführt werden, die mit Hilfe des erfindungsgemäfien Verfahrens gespalten werden können.

Die vorteilhafteste Konzentration der II-Acyl amino säure oder deren Salzen in der wässrigen Phase schwankt etwas in Abhängigkeit von der Arf der Verbindung, der zur pH-Einstellung verwendeten Base und der verwendeten Acylase. Ein-Konzentrationsbereich von

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"5 bis 6o g/dl ist gewöhnlich geeignet, und die vorteilhaftesten Ergebnisse werden häufig bei Eonsentrationen von 1o bis 4o g/dl erreicht.

Die zum Einstellen des gewünschten pH-Werts in der wässrigen Phase verwendete Base, durch die die anderen Verfahrensvariablen in möglichst geringem Maß beeinflußt v/erden sollen, stellt keinen Eeaktionsteilnehmer dar und ist daher nicht kritisch. So sind Alkalimetallhydroxide, wie Natrium- und Kaliumhydroxid; Calciumhydroxid, Ammoniumhydroxid und organische Amine wirksam, und die genaue V/ahl der Base· hängt gewöhnlich vom Preis und der Zugänglichkeit der Verbindung ab.

Alle bekannten Acylasen haben sich als für die Zwecke der Erfindung geeignet erwiesen, sofern sie befähigt sind, entweder die L- oder die D-Form der N-Acylaminosäure selektiv zu hydrolysieren. Acylasen, die sich als wirksam für das erfindungsgemäße Verfahren erwiesen haben, waren Produkte von Pilzen, wie Aspergillus und Penicillium, von Bakterien, wie Achromobacter, Pseudomonas,. Micrococcus und Alkaligenes und des Strahlenpilzes Streptomyces. Die erforderliche Menge der Acylase ist gering, hängt jedoch in offensichtlicher Weise von der enzymatischen Aktivität des Produkts ab. Die Acylase kann in geringer Menge, wie von o,1 Gewichtsprozent bis zu einer hohen Menge wie 3 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht der wässrigen Phase, vorliegen. Acylase mit geeigneter Reinheit wird jedoch gewöhnlich in Mengen von o,5 bis 1 Gewichtsprozent verwendet.

Die Reaktionstemperatur wird so gewählt, daß sie der verwendeten spezifischen Acylase angepaßt ist. Gewöhnlich ist eine Temperatur zwischen 2o° und 6o°C am besten geeignet, und Temperaturen nahe 35 oder 4o°C sind für viele Acylasen günstig.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht .

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.9o g N-Acetyl-DL-phenylalanin wurden in 25o ml Wasser und einer ausreichenden Llenge Ammoniumhydroxidlösung gelöst, so daß die Lösung neutral war. Das Endvolumen betrug Joo ml. Die Lösung wurde zusammen mit 9oo ml Tributylphosphat, das 9»73 g L-Phenylalanin enthielt, und 3o,6 g N-Acetyl-l)L-phenylalanin in ein 2-Liter-Reaktionsgefäß übergeführt. V/enn durch Rühren das Gleicii- - gewicht eingestellt worden war, hatte die wässrige Phase einen pH-Wert von 6,o5· In dieser Stufe wurden 71 »4- ^S GoCIp^K₂C und 6,o3 g Acylase (I9.000 E/g) zugesetzt, und der Reaktorinhalt wurde gerührt, wobei eine konstante Temperatur von 37°C aufrechterhalten wurde.

Während des Fortschreitens der enzymatischen Entacylierung des N-Acetyl-L-phenylalanins schieden sich Kristalle von L-Phenylalanin aus. Nach 43 Stunden wurde die organische Lösun£sniittelphase abgezogen, und die L-Phenylalanin-Kristalle wurden von der wässrigen Phase abfiltriert, die mit L-Phenylalanin gesättigt war. Die Kristalle wurden mit einer geringen L'enge eiskalten Wassers gewaschen und getrocknet. Es wurden 4-0,4-3 g L-Phenylalanin von I00 % optischer Reinheit gewonnen, was einer Ausbeute von 84-, 1 %, bezogen auf die Gesamtmenge des ursprünglich vorhandenen N-Acetyl-DL-phenylalanins, entsprach.

Es zeigte sich, daß die organische Phase 5»21 g Essigsäure und

25.0 g N-Acety!phenylalanin enthielt, das in 72,6 ;j optischer Reinheit das D-Snantiomorphe war."Die Essigsäure und ein Teil des Lösungsmittels wurden im Vakuum abdestilliert, und der Rückstand wurde bei etwa 18o°C gehalten, bis das H-Acetyl-D-phenylalanin razemisiert war. Die resultierende Suspension von N-Acetyl-DL-phenylalanin wurde zurückgeführt.

Die bei der Kristallisation des L-Enantiomorphen erhaltene wässrige Mutterlauge wurde zusammen mit 9oo ml Tributylphosphat und

29.1 g N-Acetyl-DL-phenylalanin in. das Reaktionsgefäß zurückgeführt. Die wässrige Schicht hatte einen pH-Y/ert von 5 »97· 2as

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Zweiphacengemisch wurde 12 Stunden bei 37°C G^erührt, wonach die. beiden Flüssigkeiten getrennt wurden,· und 11,6 g· kristallines L-Phenylalanin wurden aus der wässrigen Phase gewonnen. Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde viermal wiederholt, wobei eine Gesamtmenge-von 44, 5 6 kristallines L-Phenylalanin gewonnen wurde.

12o g N-Acetyl-DL-phenylalanin wurden in 35o ml V/asser und einer ausreichenden Menge Ammoniumhydroxidlösung gelöst, so daß eine Lösung mit einem pH-Vfert von 7_to erhalten wurde. 95 »2 mg Kobaltchlorid wurden zugesetzt, und das Volumen der Lösung wurde mit Wasser auf 4oo ml eingestellt. Die Lösung wurde in einen mit Überlaufstutzen versehenen Kolben übergeführt, mit 8 g Acylase (19.000 E/g) vermischt und mit I.I30 ml Tributylphosphat, das 4·ο,8 g gelöstes H-Acetyl-DL-phenylalanin enthielt, überschichtet. Der Inhalt des Kolbens wurde dann 48 Stunden bei 37⁰C gerührt.

Die organische Lösungsmittelphase wurde abgegossen, und 43,6 g optisch reines, kristallines L-Phenylalanin wurden von der wässrigen Schicht abfiltriert. Danach wurde"die Mutterlauge zusammen mit dem vorher abgegossenen organischen Lösungsmittel in den Kolben zurückgeführt. Während der Kolbeninhalt bei 37°C gerührt wurde, wurde eine 1 ;o-ige Lösung von N-Acetyl-DL-phenylalanin in Tributylphosphat dem Kolben in einer Rate von 2ßo ml pro Stunde zugeleitet, und die organische Lösungsmittelphase floß in der gleichen Rate über. Nach 48 Stunden wurden die Lösungsmittelphäse und die wässrige Flüssigkeit in dem Kolben von den ausgefällten Kristallen von L-Phenylalanin abgetrennt. Diese Kristalle von L-Phenylalanin wurden nach dem Waschen und Trocknen in einer Menge von 41,6 g erhalten.

B eis piel 5

9o g IT-Acetyl-DL-methionin wurden in 25o ml ".Yasser und einer ausreichenden Uenge Amiaoniumhydroxidlösung gelöst, so daß die

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Lösung neutral war. Sie wurde dann auf 3oo ml verdünnt, in ein 2-Liter-Reaktionsgefäß gegeben und mit 1.2oo ml Tributylphosphat überschichtet. 15»61 g N-Acetyl-DL-methionin wurden zugesetzt, wobei der pH-V/ert der wässrigen Phase auf 5 »77 eingestellt wurde. Danach wurden 71 »4- g Kobaltchlorid und 18 g rohes Acylasepulver (5.600 E/g) zugesetzt, und <ler Inhalt des Kolbens wurde 24 Stunden bei 37 C gerührt.

Kristallisiertes L-Methionin, eine wässrige Flüssigkeit und eine organische Lösungsmittelphase wurden in gleicher '."eise wie vorher voneinander getrennt. Die Kristalle hatten ein Gewicht von 22,6 g (Ausbeute 5^»85 %)· Die organische Flüssigkeit wurde von Essigsäure befreit und erhitzt, um das D-Acetylmethionin zu razemisieren. Die wässrige Flüssigkeit wurde gemeinsam nit 1.2oc ml frischem Tributylphosphat und 15»ο g IT-Acetyl-DL-methionin in das Reaktionsgefäß zurückgeführt. Nach 5-stündigeci Rühren bei 37 C hatten sich 5»8 g kristallines L-Liethionin abgeschieden.

B e_i s p_ i e_l _ 4

45 g IT-Acetyl-DL-tryptophan wurden in 25o ml V/asser und ausreichend Natriumhydroxid, um eine neutrale Lösung zu erhalten, gelöst. Die Lösung wurde dann auf 3oo ml verdünnt und mit 9oo ml Methyläthylketon überschichtet. 17»7 S H-Acety1-DL-tryptophan in kristalliner Form wurden unter Rühren zugesetzt, und die wässrige Lösung wurde auf einen pH-V/ert von 5»98 eingestellt, nachdem die Kristalle sich gelöst hatten. Danach wurden ferner 71,4 mg Kobaltchlorid (CoCl₂.6H₂O) und 3,14- g Acylase (19.000 E/g) zugesetzt, und das Gemisch wurde 48 Stunden bei 37°C gerührt, wobei L-Tryptophan ausgefällt wurde.

Die organische Lösungsmittelschicht wurde abgezogen und in der vorstehend beschriebenen Weise in eine Razemisierungsstufe übergeführt. 17»7 S kristallines L-Tryptophan (Ausbeute 68,1 ;j) »vurden aus der wässrigen Flüssigkeit abfiltriert, die dann gemeinsam mit 9oo ml frischem i.Iethylär.hylketon und 16,8 g N-Acetyl-LL-tryptophan in das Reaktionsgefäß zurückgeführt wurde. Der pH-'./ert

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-der wässrigen Phase "betrug 6,0. Der Inhalt des Reaktionsgefäßes wurde 12 Stunden bei 37°C gerührt, woi in kristalliner Form gewonnen wurden.

wurde 12 Stunden bei 37°C gerührt, wonach 7»26 g L-Tryptophan

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Claims (11)

1. ü c h. e

   / 1. Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminosäure aus einem razemischen N-Acylderivat der Aminosäure, in v/elchem der Acylrest einer Carbonsäure vorliegt, durch Spaltung mit Acylase in einem wässrigen Medium bis zur teilweisen Entacylierüng des razemischen N-Acylderivats unter Bildung eines optisch aktiven Enantiomorphen der Aminosäure, eines optisch aktiven Enantiomorphen des N-Acylderivats und der Carbonsäure und Abtrennung der gebildeten optisch aktiven Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, daß

   a) das Spaltungsmedium während der Spaltung mit einem organischen Lösungsmittel in Berührung gehalten wird, das mit diesem Medium nicht mischbar ist, -

   b) das organische Lösungsmittel so gewählt wird, daß die Gleichgewichtskonzentrationen des N-Acylderivats und der Carbonsäure in dem Lösungsmittel mindestens gleich den entsprechenden Konzentrationen in dem Spaltungsmedium sind und

   c) der pH-Wert des Mediums bei weniger als 7 gehalten wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-7/ert bei 3,5 bis 6,5 gehalten wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, 'daß das organische Lösungsmittel und das iledium während ihrer Berührung bewegt oder gerührt werden.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch g e-

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   -4Γ-

   •kennzeichnet, daß das Lösungsmittel in einer. Llenge verwendet wird, die mindestens 5o % des Volumens des Liediums entspricht.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch g ekennzeichnet, daß die Temperatur des Spaltungsmediums bei 2o bis 60⁰C gehalten wird.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch g ekennzeichnet, daß die Konzentration des razemischen N-Acylderivats in dem Wässrigen Liedium vor der Spaltung auf einen Wert zwischen 5 und 60 g pro I00 ml ein-' gestellt wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g ekennzeich.net, daß als organisches Lösungsmittel ein flüssiger Phosphorsäuretriester, dessen drei Alkylgruppen gemeinsam 5 bis 15 Kohlenstoffatome aufweisen, ein niederer Alkylester einer niederen Alkancarbonsäure, der 1 bis 4 Kohlenstoffatome im Alkoholrest und 2 bis 4-Kohlenstoffatome in dem Säurerest aufweist, ein flüssiges Dialkylketon mit mindestens 4 Kohlenstoffatomen oder ein flüssiger Alkohol mit mindestens 4· Kohlenstoffatomen verwendet v/ird.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch g ekennzeichnet, daß nach der Anreicherung der optisch ak-civen Aminosäure in dem Spaltungsnedium und der Anreicherung des optisch aktiven Enantiomorphen des'H-Acylderivats und der Garbonsäure in dem organischen Lösungsmittel

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   das organische Lösungsmittel gemeinsam mit dem angereicherten optisch aktiven Enantiomorphen des IT-Acylderivats und
   der Carbonsäure von der angereicherten optisch aktiven Aminosäure abgetrennt wird.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung des angereicherten optisch aktiven
   Enantiomorphen des. N-Acylderivats in dem organischen Lösungsmittel zur Razemisierung des IT-Acyl der iv at s erhitzt
   wird und die erhaltene Lösung des Razemats in das Spaltungsverfahren zurückgeführt wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Razemisierung durch Erhitzen auf 9o bis
    2oo°C erfolgt.
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1o, dadurch g ekennzeich.net, daß als Ausgangsmaterial ein IT-Acylderivat von Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Phenylalanin, Phenylglycin, 3,4— Methylendihydroxyphenylalanin, 314-Dimethoxyphenylalanin
    oder Tryptophan eingesetzt wird.

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