DE2226338A1

DE2226338A1 - Polyen-makrolid-antibiotikums-saeureadditionssalze und verfahren zur herstellung von deren estern

Info

Publication number: DE2226338A1
Application number: DE2226338A
Authority: DE
Inventors: Witold Stefan Mechlinski; Carl Paul Schaffner
Original assignee: Rutgers Research and Educational Foundation
Current assignee: Rutgers Research and Educational Foundation
Priority date: 1971-06-07
Filing date: 1972-05-30
Publication date: 1973-01-04
Also published as: CH580642A5; AR193264A1; NL7207700A; NO139174B; CA978519A; NO139174C; FR2140407A1; GB1386325A; IE36381L; IE36381B1; SE415020B; US3945993A; BE784207A; FR2140407B1; JPS5627519B1

Description

30. Kai 197Γ:

ΟφΙ.'/ng. A. Grünecktr

Dr.-lng. H. Kinkeldey Dr.-lng. W, Stockmair

β Mönchen 22, MaximiHanttr. 43

RUTGERS EHSSARCH AND EDUCATIONAL ·

FOUNDATION

New Brunswick, New Jersey

Polyen-?fakrolid-Antibiotilaims--Sfiureadditior;.'^:?^alrve und Verfahren zur Herstellungen von deren Estern

Die Erfindung betrifft Derivate, insbesondere Säureadditionssalze von Polyen-Makrolid-Antibiotika, und ist besonders auf die Herstellung neuer Verbindungen dieser"Klasse gerichtet, die bedeutende Vorteile oder Eigenschaften unter Entfaltung der antimikrobiellen/bioTögischen Wirksamkeit der zugrundeliegenden oder Stammsubstanzen aufweisen.

Die Polyen-Makrolid-Antibiotika sind eine anerkannte Verbindungsklaase, die in herkömmlicher V/eise durch Kultivieren verschiedener geeigneter Organismen und Extrahieren der Substanz auf der Kultur gewonnen werden. Sie sind in erster Linie als Mittel gegen Fungi anerkannt, obgleich sie im einen oder anderen Pa]JIe eindeutig brauchbare Wirksamkeit gegen andere Mikroorganismen entfalten können. Die Verbindungen zeichnen sich grundlegend und in einzigartiger V/eise durch einen grossen Lactpnring aus, der eine Kette von konjugierten Doppelbindungen, insbesondere mit 4-, 5, 6 oder 7 solchen Bindungen,

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umfasst, wobei die Verbindungen jeweils als Tetraene, Pentaene, Hexaene und Heptaene und zusammen als Polyene bezeichnet werden. So sind die Stararaantibiotika makrozyklische,/MaKrolide bekannte Laktone mit hohem Molekulargewicht (z.B. im Bereich von 700 - 1200), und da sie einen Aminozuckeranteil enthalten, können sie als ein Aminozuckerglykosid eines Makrolidkerns enthaltend beschrieben werden, der einen Ghromophor von 4 bis. 7 konjugierten Doppelbindungen aufweist.

Als Klasse ist die Molekülstruktur der Stammverbindungen sehr gut definiert, indem sie in allen Fällen in erster Linie aus einem raakrozyklischen Lactonkern besteht, der eine lange Kette von Kohlenstoffatomen (z.B. im Bereich von 20 bis 40) darstellt, die durch ein einziges Lactonsauerstoffatom zur Bildung des Makrolidrings geschlossen ist. Die Kohlenstoffatome sind direkt, aufeinanderfolgend jeweils miteinander durch Einfach- oder Doppelbindungen, überwiegend Einfachbindungen, aber in allen Fällen mit den oben genannten konjugierten Doppelbindungen zum Ring verbunden. Wie bereits" festgestellt, umfasst die Verbindung auch einen einzelnen Aminozucker, der als Substituent an den Ring gebunden ist und eine freie primäre Aminogruppe trägt. Auch liegen eine Reihe von -OH-Gruppen vor, die jeweils an eine Vielzahl von Kohlenstoffatomen des Rings (anderen als den doppelt gebundenen Atomen) gebunden sind und schliesslich liegt bei den Polyen-Makroliden, die die Erfindung betrifft, eine einzelne Carboxylgruppe vor, die auch als Substituent an den Ring gebunden ist. Normalerweise findet⁷man zusätzliche Substitution, die unter den speziellen Gliedern der Klasse variiert, von der man jedoch nicht annimmt, dass sie die grundlegend einzigartige Molekülstruktur oder die fundamentalen Eigenschaften dieser Verbindungen als Mittel gegen Fungi ändern. Zur zusätzlichen Substitution gehören

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Substituenten einer oder mehrerer Arten wie beispielsweise verschiedene Alkyle, Sauerstoff, Epoxy und in einer Reihe von Fällen Gruppen, die als Arylaminkomponenten bezeichnet werden können.

Die Strukturen sind nachfolgend näher definiert, einschliesslich einer Zahl speziell erläuterter Beispiele, aber es.ist klar, dass die gegen Fungi wirksamen Polyen-Stammantibiotika eine anerkannte Substanzklasse darstellen, die Makrolide sind, welche genau durch die oben definierte Zusammensetzung unterschieden sind, einschliesslich insbesondere der benannten Kette konjugierter Doppelbindungen, und sich so spezifisch von anderen chemischen Verbindungen, einschliesslich anderen makrozyklischen Lactonen, unterscheiden.

Wie erkennbar werden wird, wurden die Glieder der Klasse, auf die sich die Erfindung richtet und welche sich durch eine freie Carboxylgruppe auszeichnen, aufgrund des Vorliegens einer solchen Gruppe und auch des freien Aminorestes in dem Aminozucker als Amphoter erkannt. Tatsächlich hat der amphotere Charakter dieser wasserunlöslichen Verbindungen dazu beigetragen, wie weiter unten erkennbar werden wird, Schwierigkeiten bei dem Versuch, sie in wasserlösliche Form zu überführen, zu überwinden·

Beispiele dieser spezifischen Klasse gegen Fungi wirksamer amphoterer Antibiotika umfassen: Amphotericin A, Nystatin, Pimaricin und Rimocidin, alles Tetraene; Eurocidin, ein Pentaen; Cryptocidin und Mediocidin, Hexaene; und Amphotericin B, Candicidin, Candidin, Candimycin, Hamycin, Levorin und Trichomycin, die Heptaene darstellen.

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Obgleich die Antibiotika dieser Klasse als stark wirksam erkannt wurden, hauptsächlich gegen Fungi, und eine Reihe solcher Antibiotika ausgiebig verwendet wurden und im Handel erhältlich sind, waren sie im allgemeineren ihrer Verwendbarkeit beschränkt durch das Fehlen wirksamer Wasserlöslichkeit oder gleichwertiger Dispergierbarkeit in Wasser. Gelegentlich wurden sogenannte Salze, wie beispielsweise Natriumsalze, durch Umsetzung von Alkali mit der Carboxylgruppe hergestellt, um eine Substanz zu ergeben, die eine gewisse Wasserlöslichkeit hat, solche Produkte jedoch haben Löslichkeit nur bei verhältnismässig hohem pH entwickelt und litten unter einer Verschlechterung ihrer Stabilität. Andererseits waren Bemühungen zur Herstellung sogenannter Säuresalse durch Säureaddition an die Aminogruppe entweder erfolglos oder von geringer oder gar keiner Verwendbarkeit, da die Eigenschaft der Wasserlöslichkeit dann nur bei unerwünscht niedrigen pH-Werten und mit beträchtlicher Unbeständigkeit entwickelt wird.

In der US-PS 3 244 590 wird eine Klasse von N-Acylderivaten von Heptaen-Antibiotika offenbart, die eine gewisse antimikrobielle Wirksamkeit behalten und in wasserlösliche Salze (durch alkalische Reaktion mit einer Carboxylgruppe) zu überführen sind, was zu einer gewissen Verwendbarkeit in Wasser führt. Es wurde jedoch gefunden, dass zumindest bei einer Reihe von Fällen die biologische Aktivität erheblich vermindert wird, und so blieb, während diese wasserlöslichen N-Acylderivate eine gewisse Brauchbarkeit besitzen, ein beträchtlicher Bedarf an Produkten, die mit erheblicher Wirksamkeit in wässrigen Medien brauchbar sind.

Ein weiteres Vorgehen zur Erlangung einer in V/asser dispergierbaren Zusammensetzung erfolgte durch Herstellung eines

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Komplexes aus Amphotericin B mit Desoxycholsäure, die als Detergens wirkt. Komplexe dieser Art bilden jedoch keine echten Lösungen; die Substanz scheint lediglich als Kolloid dispergiert zu sein, und dementsprechend ist der Anwendungsbereich beschränkt·

Im allgemeineren Sinne ist die Erfindung mit der Verbesserung der Polyen-Antibiotika nicht nur hinsichtlich der Erzielung wesentlicher Wasserlöslichkeit, sondern auch hinsichtlich anderer Anwendungsmöglichkeiten befasst. Obgleich die Grundverrbindungen in einer Reihe organischer Lösungsmittel· löslich sind, treten unter,gewissen Umständen von möglicher Bedeutung beispielsweise Schwierigkeiten auf, z.B. wenn- es erwünscht ist, das Antibiotikum in eine Lipidbase einzuarbeiten, z.B. eine Salbe oder Creme, die einen beträchtlichen Fettgehalt aufweist und praktisch nicht wässrig sein soll. Unter jedem dieser Aspekte, besonders aber im Hinblick auf die Schaffung wasserlöslicher Produkte ist es u.a. ein wichtiges Ziel der Erfindung, wie noch erkennbar werden wird, neue und ungewöhnlich wertvolle Derivate dieser Antibiotika zu schaffen·

Die Erfindung beruht in erster Linie darauf, dass die genannten Polyenverbindungen, wie oben definiert, wirksam in einen Ester, insbesondere einen Methyl-, Äthyl- oder Propylester, durch Umsetzung unter geeigneten Bedingungen, die in bevorzugter Form neue Verfahrensmerkmale, wie unten ausgeführt, darstellen, überführt werden können, dass das sich ergebende Derivat, der genannte Ester, dann in ein anderes Derivat, das Säureadditionssalz, durch Umsetzung mit der freien Aminogruppe des Aminozuckers überführt werden kann und dass solche Produkte, ganz speziell die Säuresalzderivate, neue Verbindungen von aussergewöhnlichem Vorteil darstellen.

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Speziell die definierten Ester selbst zeichnen sich durch Erhaltung der aritimikrobiellen Aktivität aus, die vergleichbar ist mit der der Stamm- oder Grundverbindung, wie reichlich durch Untersuchungen gezeigt wurde. Soweit festgestellt werden konnte, scheint ein solcher Ester eines gegen Fungi wirkenden Polyen-Antibiotikums zuvor weder hergestellt noch, was noch wichtiger ist, die erhebliche biologische Wirksamkeit solcher Ester verrautet oder vorhergesagt¹ worden zu sein. Obgleich der Ester selbst, der im wesentlichen in Wasser un-

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löslich bleibt, in der gleichen Weise wie die Stammverbindung von denkbarer Brauchbarkeit ist, liegt seine hauptsächliche Verwendbarkeit in der Bedeutung als Zwischenstufe oder Ausgangsmaterial zur Herstellung der beschriebenen Säuresalze, die hergestellt werden können, um z.B. praktische Wasserlöslichkeit bei pH-Werten bei oder nahe dem Neutralpunkt zu besitzen, d.h. also weit entfernt von im wesentlichen sauren oder alkalischen Bedingungen. Wie oben ausgeführt, waren Versuche, Löslichkeit durch Säurezusatz zu den Stammverbindungen zu erzielen, erfolglos und versprachen keinen Erfolg auf diesem Wege, da die beschränkte Wasserlöslichkeit, wenn überhaupt erzielt, im allgemeinen nur bei extrem niedrigen, d.h. sauren pH-Werten, und selbst dann mit erheblicher Unbeständigkeit des Polyens selbst, entwickelt werden konnte.

So umfasst die Erfindung in einem besonderen, aber ungewöhnlich wichtigen Sinne eine neue Klasse von Verbindungen, die die wasserlöslichen Säureadditionssalze eines niederen Alkylesters, insbesondere des Methyl-, Äthyl- oder Propylesters, der definierten Polyenmakrolide darstellen* Es wurde gefunden, dass sich solche Verbindungen durch erhebliche antimikrobielle Wirksamkeit auszeichnen, die mit der Wirksamkeit der Stammsubstanz vergleichbar ist, sowie durch echte und bedeutende Wasserlöslichkeit, z.B. bei oder nahe dem Neutralpunkt. PoIg-

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lieh sind die Produkte bei einer Vielzahl von Umständen brauchbar, wo die im wesentlichen wasserunlöslichen Antibiotikabasen, als gegen Fungi stark wirksame Substanzen bekannt, für ungeeignet befunden wurden, wie es z.B. unter Bedingungen, unter denen die Vermeidung oder Inhibierung des Auftretens oder Wachstums von Fungi und dgl. Organismen oder ein anderer Angriff unter Infektion durch sie ein wässriges Medium erfordert, und insbesondere, wo Bemühungen, das Mittel in ein nichtwässriges Medium einzubringen, unerwünschte Folgen hatten.

In einem allgemeineren Sinne lässt sich feststellen, dass die neuen Endprodukte, als die Säureadditionssalze der genannten Ester definiert, andere spezielle Verwendbarkeit besitzen, z. B. bei der Herstellung fettlöslicher Zusammensetzungen, zu unterscheiden von wasserlöslichen Verbindungen, die besonders zur Verwendung in entsprechenden Medien auf Lipidbasis geeignet sind. Dies ist von besonderem Vorteil für verschiedene Salben, Cremes oder dgl., die für lokale Anwendung bestimmt sind, und auch für andere Zwecke, z.B. für landwirtschaftliche Zwecke wie bei der Behandlung von pflanzlichen Pilzinfektionen, wo es wünschenswert sein kann, Mittel zu haben, die nicht leicht abgewaschen werden und eine verlängerte Wirksamkeit in äusserem Oberflächenkontakt besitzen.

Ein weiteres spezielles Merkmal der Erfindung·liegt in bestimmten neuen Arbeitsweisen zur Herstellung des Esters, insbesondere im Hinblick auf die Empfindlichkeit dieser Polyenmakrolide gegenüber vielen Reagentien. So sind gewöhnliche Veresterungsmethoden unter Verwendung von Chlorwasserstoffeäure oder Schwefelsäure und Alkohol in hohem Masse unerwünscht, weil die erforderliche Konzentration solcher Säuren dazu neigt', die Wirksamkeit gegen Funci zu zerstören. Es wurde nun gefun-

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den, dass unter zahlreichen anderen möglichen Reagentien zur Veresterung Verbindungen wie Diazomethan, Diazoäthan und Diazopropan hochwirksam und unerwartet selektiv für diese Antibiotika sind, d.h. bei der Vermeidung irgendwelcher gegenteiliger Nebenreaktionen.

Ein sehr bedeutendes Verfahrensmerkmal liegt in dem ungewöhnlichen Vorteil des Einsatzes eines speziellen Lösungsmittels, nämlich Tetrahydrofuran, zur Veresterung des Antibiotikums mit Diazomethan oder einem anderen Reagens dieser Gruppe und zur Durchführung der vorhergehenden Herstellung eines solchen Reagens . Während Äthyläther, in welchem Diazomethan oder dgl. normalerweise hergestellt und verwendet werden, verhältnismässig unwirksam ist, weil die Stammpolyen-Antibiotika im wesentlichen darin unlöslich sind, ist Tetrahydrofuran für beide Stufen geeignet, insbesondere, weil es in der Lage ist, diese amphoteren Antibiotika, die zunächst in Dimethylsulfoxyd gelöst werden, für die gewünschte Esterreaktion genügend in Lösung zu halten, ohne auf ihre biologische Wirksamkeit beträchtlich einzuwirken. Tatsächlich scheint das Stammantibiotikum in verhältnismässig kurzer Reaktionszeit nach und nach in dem Tetrahydrofuran in Lösung'gebaa, worauf sich der Ester in Lösung bildet und sammelt, und das Ende der Reaktion ist leicht bestimmbar durch das Verschwinden ungelösten Antibiotikums.

Zur Herstellung des gewünschten Säureadditionssalzes wird der Polyenmakrolidester aus der obigen Lösung gewonnen und dann in Wasser bei geeignetem pH, z.B. nicht weit vom Neutralpunkt entfernt, mit einer in geeigneter Weise verdünnten Konzentration der gewählten Säure, z.B. Salzsäure, Schwefelsäure oder einer anderen Säure j wie unten erklärt, behandelt. Das obige

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Verfahren wurde auf eine Reihe von Stamraverbindungen der genannten Klasse angewandt und die sich ergebenden Ester wurden in Säuresalze überführt, d.h. durch Additionsreaktion mit der freien Aminogruppe des Aminozuckers, wobei sich biologisch
wirksame Produkte mit verbesserten Eigenschaften und, wie
oben ausgeführt, stark erweiteter Verwendbarkeit ergaben.■ So wurden z.B. die Hydrochloride von Amphotericin B-Methylester, Candicidin-Methylester, Trichomycin-Methylester und _f
verschiedenen anderen in verhältnismässig hohem Reinheitsgrad hergestellt und zeigten gute Wasserlöslichkeit. Untersuchungen von Ester- und Salzprodukten haben deutlich gute antimikrobielle Wirksamkeit-von der Natur der Stammaterialien gezeigt.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen sowie der Figuren. Darin zeigt:

Fig. 1, 2 und 3 jeweils Molekülstrukturformeln nach derzeitiger Kenntnis von drei Beispielen erfindungsgemässer Produkte, nämlich der Hydrochloride der Methylester von Amphotericin B, Nystatin und Pimaricin;

Fig. 4 ein UV-Spektrum von Amphotericin B-Methylester

Fig. 5 eine graphische -Darstellung eines UV-Spektrums

von Amphotericin B-Methylester-Hydrochlorid
in wässriger Lösung und auch das UV-Spektrum für das Stamm-Amphotericin B, in Wasser dispergiert;

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Fig. 6 eine graphische Darstellung eines IR-Spek-

truras der Base Amphotericin B und ihres . Methylesters, in der gleichen Darstellung überlagert;

Fig. 7 eine ähnliche Darstellung des IR-Spektruns

des Amphotericins B-Äthylesters und zum Vergleich das Spektrum der Base Amphotericin

Fig. 8 bis 12 von Photgrafien von Dünnschichtchromato-

grammen kopierte Zeichnungen, die jeweils die verschiedenen chemischen Identitäten der Antibiotikabasen und ihrer Ester anzeigen, wobei die speziellen. Substanzen wie folgt sind: in Fig. 8 Amphotericin B und sein Methyl- und Äthylester; in Fig. 9 Nystatin . und Pimaricin, jeweils mit ihren Methylestern; Fig. 10 Mediocidin und sein Methylester; Fig.

11 Hamycin und sein Methylester; und in Fig.

12 Trichomycin und sein Methylester·

Wie oben angegeben betrifft die Erfindung die genannten Ester der definierten Klasse von Polyenmakroliden und am wichtigsten die Saureadditionssalze solcher Ester, z.B. hergestellt aus Stammverbindungen wie beispielsweise Amphotericin B, Nystatin, Trichomycin, Mediocidin, Candicidin, Pimaricin, Candidin, Hamycin und vielen anderen.

In allen Fällen ist das bevorzugte Verfahren zur Herstellung dieser Produkte im wesentlichen das gleiche das benötigte Reagens, z.B. Diazomethan zur Herstellung des Methylesters, wird

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zunächst hergestellt, wobei es in Lösung in Tetrahydrofuran anfällt. Darauf wird das gewählte Polyenmakrolid, bevorzugt in anfänglicher Lösung in Dimethylsulfoxyd, mit der Diazomethanlösung und, wenn gewünscht, mit weiterem Tetrahydrofuran gemischt, worauf die Veresterung aufgelöst wird, und der letztlich erhaltene Methylester wird darauf ausgefällt und in geeigneter Weise gewonnen. Schliesslich wird der Methylester mit der gewählten Säure, z.B. Salzsäure,'behandelt, um das gewünschte wasserlösliche Säuresalz zu erhalten, das in geeigneter Weise gewonnen wird, z.B. durch Lyophilisierung, was zu einem Endprodukt hoher Reinheit führt, d.h. einer Reinheit,' die mit der des bevorzugt reinen Antibiotikums vergleichbar ist, das der Veresterung unterworfen wurde.

Das bevorzugte Vorgehen wird am besten im einzelnen durch ein Beispiel der obigen Stufenfolge erläutert. Wie verständlich werden wird, ist es sehr erwünscht, Substanzen wie beispielsweise Diazomethan, Diazoäthan und Diazopropan in frischem Zustand zur sofortigen 'Verwendung bei der Esterreaktion herzustellen. Sie sind verhältnismässig instabil und erfordern darüber hinaus Sorgfalt bei der Handhabung aufgrund der Toxizität; so sollte die Herstellung solcher Verbindungen mit den nötigen Sicherheitsvorrichtungen aufgrund der Unbeständigkeit und der Notwendigkeit zur Entfernung und Beseitigung von Dämpfen durchgeführt werden.

Das spezielle Beispiel, angeführt unter Bezug auf die Herstellung von Derivaten von Amphotericin B, ist wie folgt:

Herstellung von Diazomethan; 2g Kaliumhydroxyd wurden in 1,5 ml Wasser in einem 100 ml-Destillationskolben gelost, der mit einem Tropftrichter und einem wirksamen Kühler ausgestattet

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war· Die Lösung wurde rait 4- ml 95#igem Äthanol und 20 ml Tetrahydrofuran (z.B. von Handelsquälitat, frei von Peroxiden) verdünnt. Der Kühler wurde mit einem geeigneten Vorlageadapter und einem 100 ml-Kolben als Vorlage verbunden, alle mit geeigneter Einrichtung zur sicheren Gasableitung. Der Vorlagekolben wurde mit Eis gekühlt. Nach dem Erhitzen des Inhalts des Destillationskolbens zum schwachen Sieden wurde durch den Tropftrichter eine Lösung eingebracht, die 8,Jg p-Tolylsulfonylmethylnitrosamid (das eines der bekannten Vorläufer oder Ausgangsmaterialien für Diazomethan ist) in JO ml Tetrahydrofuran enthält, wobei die Zutropfrate so eingestellt wurde, dass sie der Destillationsgeschwindigkeit etwa gleich war. Das Diazomethan, das in gelöster Form in Tetrahydrofuran erzeugt wurde, destillierte mit letzterem ab und kondensierte als gelbe Flüssigkeit in der Vorlage, Nach dem Entleeren des Tropftrichters wurde eine weitere Menge (10 ml) Tetrahydrofuran in der gleichen Weise wie zuvor zur Entfernung des Restprodukts aus dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Destillation wurde als abgeschlossen betrachtet, wenn das Destillat farblos wurde. Nachdem zuerst der Reaktionskolben in Eis gekühlt wurde, wurde die tiefgekühlte Vorlage entfernt und es wurde gefunden, dass sie etwa 1,0 bis 1,2gDiazomethan in etwa 40 ml Tetrahydrofuran enthielt. Es wurde bis zur Verwendung im Eis aufbewahrt· Aufgrund der Unbeständigkeit dieses Reagens sollte es tatsächlich gewöhnlich am selben Tage zur Veresterung eines Polyenmakrolids wie beispielsweise Amphotericin B verwendet werden·

Herstellung von Amphotericin B-Methylester:

1,0 g Amphotericin B (Squibb; hochrein, Probe 972 mcg/mg) wurde in 10 ml Dimethylsulfoxid unter Verwendung einer Gewebemühle (tissue grinder) gelöst. Die Lösung wurde in einen 100-

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ml-Erlenmeyer-Kolben mit Hilfe von 10 ml Tetrahydrofuran, das so zur Verdünnung verwendet wurde, überführt. Der Kolben-wurde mit einem Stabmagneten zum Rühren nach herkömmlicher magnetischer Aussenrührung versehen und_s bei 0 C in Eis gekühlt gehalten, während gerührt wurde. Während dieses Vorgehens wurde ein beträchtlicher Anteil des Amphotericins B ausgefällt, und eine solche Ausfällung erwies sich (in wiederholten Versuchen) als normal. Zu der gerührten und gekühlten Mischung (0 C) wurde langsam frisch (wie oben) hergestellteDiazomethanlosung in Tetrahydrofuran zugesetzt, wobei insgesamt 15 ml in etwa 10 Minuten verwendet wurden. Hierbei löste sich das Amphotericin B und die Veresterung erfolgte und lief zu Ende4 wenn gewünscht, kann der Abschluss der Reaktion durch Dünnschichtchromatographie, überprüft werden, die wie unten erklärt.durchgeführt wird.

Das Produkt wird bevorzugt umgehend isoliert, um Nebenreaktionen zu vermeiden. Hierzu wurde das Reaktionsgemisch mit 15 ml trockenem Methylalkohol verdünnt und langsam in 250 ml trockenen iVfchyläther, der mit einem Magnetrührer gerührt wurde, gegossen. Es wurde etwa. 5 Minuten weitergerührt, und der Niederschlag wurde dann durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen (obwohl sie zur Gewinnung zusätzlichen Produkts, wenn gewünscht, behandelt werden kann), und der Niederschlag wurde mit 50 ml trockenem Äther gewaschen, worauf wieder zentrifugiert wurde. Diese Trennung wurde in vorteilhafter Weise noch zweimal wiederholt, und das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 85O bis 900 mg eines goldgelben Pulvers, das sich bei einer Bestimmung als der gewünschte Methylester von Amphotericin B erwies.

Herstellung von Amphotericin B-Methylester-Hydrochlorid: Eine bestimmte Menge, z.B. 1,6 g, Amphotericin B-Methylester

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(hergestellt wie vorstehend beschrieben) wurde in 50 ^l eiskaltem Wasser unter Verwendung einer Gewebemühle suspendiert. Die Suspension wurde in einen 100 ml-Erlenmeyer-Kolben gebracht, der mit einem Stabmagneten zum Rühren versehen war, und wurde in einem Eisbad gerührt, um die Temperatur auf etwa 0° G zu senken. Unter Rühren wurde langsam aus einem Tropftrichter 0,1 η Salzsäure in Wasser in genügender Menge und Geschwindigkeit zugetropft, so dass der pH des Reaktionsgemisches zwischen 6 und 5 gehalten wurde· Es zeigte sich, dass der suspendierte Methylester langsam in Lösung ging. V/enn das Gemisch nicht mehr Säure aufnahm, d.h..wenn ein weiterer leichter Zusatz von Säure den augenscheinlichen Gehalt an ungelöstem Material nicht weiter verringert^ wurde der Vorgang als beendet betrachtet. An diesem Punkt hatte der pH vorzugsweise einei Wert von 6, und es wurde gefunden, dass etwa 15 ml verdünnte Säurelösung verwendet wurden. Es erwies sich als nicht ratsam, den pH irgendwann unter 5 fallenzulassen. Ein gewisser Anteil ungelöster Feststoffe verblieb, und er wurde durch Zentrifugieren entfernt und als Verunreinigung verworfen; tatsächlich wird auf diese Weise jedes nichtumgesetzte, den Methylester verunreinigende Amphotericin B entfernt, so dass das Verfahren eine weitere Reinigungsstufe liefert. Die das Salzprodukt enthaltende überstehende Lösung wurde auf etwa 150 ml mit Wasser verdünnt und lyophilisiert, d.h. bei geringem Druck unter Gefriertrocknungsbedingungen getrocknet. Die Ausbeute betrug 1,5g eines goldgelben Produktes, das aus dem gewünschten Säureadditionssalz, d.h. dem Hydrochlorid des Amphotericin B-Methylesters, bestand, wie in Fig. 1 wiedergegeben.

Die Eigenschaften von Amphotericin B-Methylester, z.B„ des Derivats, wie es vor der Bildung des Säuresalses hergestellt wurde, waren wie folgt:

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Der Ester ist löslich in Methylalkohol, Äthylalkohol, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Er ist wenig löslich in Äthylacetat und in Wasser undunlöslich in Petroläther und Äthyläther. Die Substanz hat keinen Schmelzpunkt und zersetzt sich fortwährend beim Erhitzen, wobei die Zersetzung oberhalb 175° C rasch wird. Sie zeigt die typische Lichtabsorption von Heptaenen, wie dies das UV-Spektrum in Fig. 4 zeigt, mit grösseren Absorptionsmaxima bei 364, 383 und 406 m/U. Dieses Spektrum wurde in herkömmlicher Weise angefertigt und aufgezeichnet, wobei Amphotericin B-Methylester genau wie in dem obigen Beispiel hergestellt in Methanollösung in einer Konzentration von 5 Mikrogramrn pro ml ver-" wendet wurde. Die spezifische Extinktion eines solchen Produktes (ohne weitere Reinigung), bestimmt in der üblichen Weise als eI , war 1480, und im Vergleich mit dem Wert von 1680 für die Base zeigte reines Amphotericin B, dass das Produkt, der Ester, zu 88 % rein war. Wie oben erklärt, kann eine beträchtliche weitere Reinigung erzielt' v/erden, indem z.B. das Säureadditionssalz hergestellt und gewonnen wird.

Das bei X in Fig. 6 gezeigte Infrarotabsorptionsspektrum des Methylesters, der als Produkt in dem obigen Beispiel erhalten wurde, zeigt beim Vergleich mit einem ähnlichen Spektrum reinen Amphotericins B in der selben Darstellung bei X wiedergegeben, deutlich die Überführung der Carboxylgruppe von Amphotericin B in eine Estergruppe. Die sehr charakteristische Bande für eine ionisierte Carboxylgruppe C00~, die in Amphotericin B als antisymmetrische Schwingungen bei 1540 cm , zu erkennen bei YY der Kurve Y in Fig. 6, zugegen ist, verschwindet vollständig in dem Spektrum des Amphotericin B-Methylesters, wie bei XX der Kurve X zu erkennen ist. Selbstverständlich wurden diese Infra-rotspektren in herkömmlicher Weise angefertigt, sind aber in Fig. 6 in willkürlicher vertikaler Anordnung

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wiedergegeben, so dass, obwohl das Aussehen jeweils wie dargestellt ist, der tatsächliche Prozentsatz der Durchlässigkeitswerte zur Vermeidung von Verwirrung v/eggelassen wurde. Es versteht sich auch, dass das Fehlen einer gewissen Feinstruktur in der Kurve (X) für den Ester dem leicht verunreinigten Zustand zuzuschreiben ist, ohne jedoch die Bedeutung für den Nachweis der Veresterung zu beeinträchtigen.

Das Fehlen einer freien Carboxylgruppe in dem Veresterungsprodukt wurde auch durch quantitative Titration mit Natriumhydroxidlösung bei niedriger Temperatur bestätigt. Unter ähnlichen Bedingungen verbrauchte ein Mol Amphotericin B ein Mol Natriumhydroxid, während der Methylester nichts verbrauchte. Wie nachstehend erklärt trennt sich Amphotericin B-Methylester sehr gut von Amphotericin B mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie an Silicagel; der Ester bewegt sich deutlich schneller als die Stammverbindung.

Das Hydrochlorid als Endprodukt ist ein festes Produkt, das beträchtliche Wasserlöslichkeit zeigt, z.B. über 75 mg pro ml, im Gegensatz zur Stammverbindung, Amphotericin B, das sich zu nicht mehr als im"Umfang von Spuren von 0,0017 mg pro ml höchstens zu lösen scheint. Sowohl der Ester als auch sein Hydrochlorid entwickeln sehr erhebliche antimikrobielle Wirksamkeit, im wesentlichen, d.h. quantitativ, die gleiche wie das Stammantibiotikum. Die Aktivität wurde durch Standardtests in Vitro eines jeden Derivats und Base gegenüber repräsentativen Organismen wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans und Aspergillus niger nachgewiesen. Diese Ergebnisse sind zum Teil nachstehend in einer Tabelle zusammengefasst, zusammen mit einer Anzahl weiterer erfindungsgemässer Produkte, was die Brauchbarkeit der Substanz zeigt.

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Nach im wesentlichen zu dem im obigen speziellen Beispiel ausgeführten Vorgehen, so dass eine tatsächliche Beschreibung der Massnahmen nicht erneut gebracht werden muss und die Bezugnahme auf die Substanzen alleine die entsprechenden Beispiele darstellt, wurden die folgenden weiteren Derivate hergestellt und es zeigte sich, dass sie entsprechende Eigenschaften besitzen, wie sie nachfolgend in getrennten Tabellen aufgeführt sind: Nystatin-methylester und sein Hydrochlorid (Tetraen); Pimaricin-methylester und sein Hydrochlorid (Tetraen); Mediocidin-methylester und sein Hydrochlorid (Hexaen); Candicidinniethylester und sein Hydrochlorid (Heptaen); Trichomycinmethylester und sein Hydrochlorid (Heptaen); Candidin-methylester und sein Hydrochlorid (Heptaen); Hamycin-methylester und sein Hydrochlorid (Heptaein); und/weiter unten erwähnt Amphotericin B-äthylester und sein Hydrochlorid- (Heptaen).

Um die neuen Verbindungen und tatsächlich auch die molekulare Struktur der Staramantibiotika dieser Klasse, wie sie in der Literatur berichtet sind, weiter zu veranschaulichen, zeigen die Figuren 1, 2 und J die Strukturformeln für die Hydrochloride der jeweils aus Amphotericin B, Nystatin und Pimaricin hergestelltem Methylester. In jedem Fall ist zu erkennen, dass die Polyenmakrolidsubstanz sich durch den genannten Lactonring sowie dadurch auszeichnet, dass der Substituent -COOH der Stammsubstanz verestert worden ist, um diesen Teil in eine Estergruppe -COOCH, zu überführen. Bbenso ist die freie Arainogruppe -NH₂, die den Aminozucker, z.B. Mycosamin, der an die Stellung 19 in Fig. 1 gebunden ist, charakterisiert, nun in die Additionssalzform überführt, hier z.B. -NHo'HCl« Das Vorliegen von solchen Ester- und Säüresalzgruppen wird durch Betrachtung der anderen Verbindungen, die in den Fig. 2 bzw· 3 dargestellt sind, offenbar. Auch ist festzustellen, dass Amphotericin B (Fig. 1) ein Heptaen ist, während Nystatin und

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ricin Tetraene sind (Fig. 2 und 3); ö-ie Grundformeln sind natürlich die ohne die beiden beschriebenen Veränderungen.

Die Reagentien zur Herstellung von Äthyl- und Propylestern, nämlich Diazoäthan und Diazopropan, werden gewöhnlich in einer zum Diazomethan identischen Weise hergestellt, z.B. in Lösung in Tetrahydrofuran unter Verwendung jeweils geeigneter Ausgängsverbindungen, wie sie für diese Mittel üblich sind. Demzufolge werden diese alternativen Ester der Starampolyenmakrolide in der gleichen V/eise wie die Methylester hergestellt, z.B. ausgehend von einer Lösung des Antibiotikums in die Methylsulfoxid'und dann durch Mischen einer solchen Lösung mit dem Hauptlösungsmittel Tetrahydrofuran, Einbringen des speziellen Reagens, d.h. Diazoäthan oder Diazopropan. Schliesslich wird der entstehende Äthyl- oder Propylester des Makrolids durch eine mit der für den Methylester identischen Verfahrensweise in da3 gewünschte Säures"alz überführt. Die verschiedenen Reaktionen sind in der Tat vollkommen analog und im Falle der abschliessenden Salzbildung tatsächlich identisch.

Als spezielles Beispiel wurde Amphotericin B-Äthylester und das Hydrochlorid dieses Derivats in der beschriebenen Weise hergestellt, was zu Produkten führte, die Eigenschaften besitzen, welche denen des Methylesters und seines Salzes äu^serst ähnlich sind· Fig. 7 zeigt das IR-Absorptionsspektrum des Äthylesters (X') im Vergleich mit dem wiederholten Spektrum reinen Amphotericins B (Y¹), in der gleichen Weise wie der Methylester in Fig. 6. Diese zeigen wieder deutlich die Überführung der Carboxylgruppe in eine Estergruppe durch Verschwinden an der Stelle XX¹ der Bande bei YY¹ in der Grundkurve.

In weiteren Beispielen für Methylester anderer Makrolide der

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genannten Klasse wurden IR-Spektren von Nystatin und Piraaricin, beides Tetraene, für die Stammsubstanz und den Methylester, ebenso für Mediocidin, einem Hexaen, in der Grund- und Methylesterform und schliesslich für Hamycin und Candicidin und ihre Methylester angefertigt. In allen Fällen ware.n die gleichen Unterschiede zwischen der Stammverbindung und dem Ester offenbar, wozu das Verschwinden der Banden gehört, die in federn Falle die Carboxylgruppe charakterisierten, was demzufolge die Tatsache der Herstellung des Esters belegte.

Ein weiterer Nachweis für die Bildung der neuen Verbindungen,■ d.h. der Ester, wurde durch Dunnschichtchroffiatographxe (oft als T.L.C. abgekürzt), wie in den Fig. 8 bis 12 einschliesslich gezeigt, geliefert. Bekanntlich führt die chromatographische Entwicklung "nach dieser Methode zu einer Wanderung einer jeden Verbindung mit einer für ihre chemische Zusammensetzung charakteristischen Geschwindigkeit, so dass nach einer bestimmten Zeit der für die Verbindung repräsentative Fleck in einem Abstand von der Basislinie der beschichteten Platte auftritt, welcher von dem einer anderen, aber verschiedenen Verbindung von selbst sehr ähnlicher Zusammensetzung verschieden ist. In Fig. 8 sind das Stammamphotericin B und die Derivate, nämlich der Methylester und der Äthylester, jeweils in den Spalten 1, 2 und 3 dargestellt. In Fig. 9 ist Nystatin in Spalte 1 angezeigt, sein Methylester in Spalte 2, Pimaricin in Spalte 3 und sein Methylester in Spalte 4-. Die Spalten 1 und 2 der Fig. 10 zeigen jeweils Mediocidin und seinen Methylester; das Auftreten von drei Flecken am oberen Ende in jeder Spalte zeigt an, dass dieses Makrolid, wie es derzeit verfügbar ist, ein Komplex ist, d.h. er umfasst vermutlich drei sehr geringfügig verschiedene Verbindungen,.z.B. mit geringen Umterschieden in unbedeutenden Substituenten am Makro- ■ liaring. In Fig. 11 zeigen die Spalten 1 und 2 jeweils Hamycin

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und seinen Methylester, während in Fig. 12, in den Spalten 1 und 2 Trichomycin und Trichomycin-methylester dargestellt sind. In allen Fällen ist ein erheblicher Unterschied offensichtlich, der wieder die Bildung des Esters' aus der Stammsubstanz bestätigt.

Das bei diesen Untersuchungen angewandte T.L.G.-Verfahren war im wesentlichen herkömmlicher Art, wobei eine dünne Schicht aus Silicagel mit geeignetem Binder auf einer Glanplatte verwendet wurde. Das zum Transport der gewählten Vorbindungen über die Schicht aus dem Silicageladsorbens verwendete Lösungsmittel wurde unter Systemen ausgewählt, von denen man aus Erfahrung wusste, dass sie für .Polyen-rAntibiotika geeignet sind· In jedem Falle wurde das gewählte Lösungsmittelsystem anfangs als ein Gemisch hergestellt und nach dem Schütteln wurde das Gemisch in zwei Phasen aufgetrennt, von welchen die untere eingesetzt wurde. Im Falle der Figur 8 wurde ein alkalisches Lösungsmittelsystem verwendet, das aus Chloroform, Methanol und Boratpuffer zur Einstellung eines pH von 8,3 erhalten worden war. Zur Bestätigung wurde ein .saures System aus Chloroform, Methanol und Natriumacetatpuffer mit pH 5»0 unabhängig eingesetzt, mit identischen Ergebnissen. Für die Überprüfung entsprechend Fig. 9 war das Lösungsmittelsystem Chloroform, Äthanol und

10 # Essigsäure; für Fig. 10 wurde das Chloroform-Methanol-Boratpuffer-System wiederum eingesetzt, während für die Fig.

11 und 12 ein Chloroform-Äthanol-Essigsäure-System verwendet wurde. In jedem Falle wurde ein Fleck einer jeden überprüften Verbindung zuerst nahe der unteren Plattenkante, z.B. aus einer Lösung in Dimethylsulfoxid, aufgebracht und nach dem Trocknen und Eintauchen der unteren Kante in die gewählte LösungsmittelphasG wurde für eine bestimmte Zeitspanne entwickelt, wobei die in den Figuren gezeigten und vorstehend

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beschriebenen Ergebnisse erzielt wurden und die geeignet vorgerückten Stellen der verschiedenen Verbindungen leicht auf herkömmliche Weise erkannt wurden.

Was nun den Veresterungsvorgang betrifft, so ist klar, dass die Grundreaktion mit Diazomethan zur Herstellung des Methylesters einer Carbonsäure sehr üblich ist,- und ebenso verschiedene Vorläufer zur Herstellung von Diazomethan (CHpITo) einschliesslich des oben genannten speziellen Ausgangsmaterials· Obgleich die vorangegangenen Massnahmen wie zur Herstellung des Reagens eine herkömmliche Äther-Alkohol-Lösung verwandten, haben die hierin beschriebenen neuen Massnahmen, sov/ohl zur Herstellung des Reagens als auch zu seiner Verwendung bei der Veresterung unter Verwendung von Tetrahydrofuran als Lösungsmittel bedeutende Vorteile, ohne die gewünschten Reaktionen in irgendeiner Stufe zu beeinträchtigen. Obgleich die Löslichkeit der Ausgangsmakrolidantibiotika in diesem Lösungsmittel verhältnismässig begrenzt ist, reicht sie aus und sie ist tatsächlich sehr geeignet zur fortlaufenden Veresterungsreaktion, die den Ester ergibt, der in dem Masse, wie er sich bildet, vollständig in Lösung geht.

Wie ebenfalls vorstehend erklärt, werden Diazoäthan und Diazopropan in ähnlicher Weise hergestellt und können die Veresterung bewirken, d.h. nach grundlegend bekannten Reaktionsweisen. Für dieses Vorgehen wird wieder Tetrahydrofuran als Lösungsmittel in beiden Stufen verwendet,· mit der gleichen Wirksamkeit und den gleichen Vorteilen wie im Falle von Diazo-, methan. Natürlich werden geeignete Ausgangsreagentien für die Herstellung von Diazoäthan und Diazopropan,, wie in der Literatur ausgeführt, verwendet; so ist im Falle von Diazoäthan das Ausgangsmaterial üblicherweise N-Äthyl-N-nitroso-N-nitrogaanidin.

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Nachfolgend sind in einer Liste Folyenmakrolidantibiotika aufgeführt, die alle eine Grundwirksamkeit gegen Fungi besitzen und zur Veranschaulichung der Überführung in die hier beschriebene neue Derivatform geeignet sind, einschliesslich der Ester und der wichtigen Säureadditionssalze der letzteren. Dies ist tatsächlich in jedem Falle durch Herstellung des Methylesters und Nachweis der Herstellung einer solchen Verbindung durch eine oder mehrere der Nachweioarten wie Dünnschichtchromatographie oder IR-Spektrum gezeigt worden. In jedem Falle kann, was durch Versuche bei einer beträchtlichen Anzahl von Fällen bestätigt wurde, der hergestellte Ester in das Säureadditionssalz (wie etwa das Hydrochlorid oder ein anderes hierin erläutertes Salz) überführt werden, so dass die beschriebenen Ester aller Glieder dieser Tabelle amphoterer Verbindungen als erfindungsgemässe Beispiele angesehen werden können.

Tabelle I

Nystatin

Pimaricin

Rimocidin

Antibioticum PA-166

Amphotericin A

Ohromin

Eurocidin

Mediocidin

Cryptocidin

Amphotericin B

Levorin (Antibioticum 26/1)

Asconin

Tetraen

Pentaen

Hexaen

Heptaen

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Candicidin Heptaen

Candidin Heptaen

Candimycin Heptaen

Hamycin Heptaen

Trichomycin Heptaen

Aureofungin " Heptaen

Ayfactin A & B Heptaen

Heptaraycin ■ Heptaen

Weitere amphotere Polyenmakrolide, auf die die Erfindung anwendbar ist, sind die folgenden:

	Tabelle	II
Name		Ϊ2Ε
Protocidin		Tetraen
Luc e ns oicy c in	(Etruscomycin)	Tetraen
Tetrin	-	Tetraen
Antibioticum	ΡΔ-153	Pentaen
Antibioticum	2814-P	Pentaen
Endomycin B		Hexaen
Antibioticum	PA-150	Heptaen
Antibioticum	F-17-0	Heptaen
Mycoheptin		Heptaen

In allen Fällen besitzen die Makrolidverbindungen, aus denen die erfindungsgemassen Derivate erhältlich sind, eine wohldefinierte allgemeine Molekularstruktur, die beispielsweise gut veranschaulicht wird durch die Formeln der Derivate in den Fig· 1, 2 und 3· Die grundlegende Charakterisierung des Moleküls ist die eines makrosyklischen Lactonkerns, der eine lange Kette von Kohlenstoffatomen darstellt, welche durch ein einzelnes Lactonsauerstoffatom unter Bildung des Makro-

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lidrings geschlossen ist. Ein weiteres Merkmal eines Lactone ist ebenfalls vorhanden, nämlich ein Carbonylsauerctoffatom, welches an ein Kohlenstoffatom des Ringes gebunden ist, das unmittelbar neben dem Lactonsauerstoff sitzt. Die Ringkohlenstoffatome sind direkt und aufeinanderfolgend über den Ring durch Einfach- oder Doppelbindungen verbunden, aber ein entscheidendes Merkmal der Verbindung ist der Einbau einer nichtunterbrochenen Reihe von vier bis sieben konjugierten Doppelbindungen in dem Ring, wodurch eine nichtunterbrochene Reihe von jeweils acht bis vierzehn Kohlenstoffatomen verbunden sind, die jeweils eine Doppelbindung aufweisen.

Die übrigen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen im Ring sind ganz überwiegend gesättigte Einfachbindungen (ebenso wie die in der konjugierten Reihe liegenden Zwischenbindungen), obgleich im Falle einiger Verbindungen weitere ungesättigte Bindungen, z.B. Doppelbindungen auftreten können. Z.B. liegen im Falle von Nystatin, Fig. 2, zwei weitere Doppelbindungen im Abstand von der kennzeichnenden Polyenreihe vor, während im Amphotericin B, Fig. 1,alle übrigen Bindungen Einfachbindungen sind. Die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome ist stets mehr als die doppelte Zahl derselben in der konjugierten Reihe und im allgemeinen eine Zahl im Bereich von 25 bis 40, z.B. 37 für Amphotericin B, 37 für Nystatin und 25 für Pimaricin.

In jedem Falle der hier behandelten Polyene liegen zwei wichtige Substituenten vor, jeweils eine Carboxylgruppe (-COOH) und eine Aminozuckergruppe, wie aus den in den Fig. 1, 2 und 3 gegebenen Formeln hervorgeht. Während in aller Regel die Aminozuckergruppe, die in allen Fällen durch eine freie primäre Aminogruppe (-NHo) gekennzeichnet ist, Mycosamin ist, sind in einigen Verbindungen andere Aminozucker festgestellt

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worden, ohne Unterschied in der Wirkung, soweit grundlegende Merkmale betroffen sind, und insbesondere soweit die Erfindung betroffen ist, die einfach eine Aminozuckergruppe fordert, welche die genannte freie Aminogruppe mit entsprechend starker Basizität besitzt. Einige Polyeninakrolide mit gegen
Fungi wirkenden Eigenschaften, wie beispielsweise Filipin,
Fungimycin und Perimycin, besitzen keine Carboxylgruppe, und sie gehören daher nicht zu der Klasse, auf die sich dB Erfindung bezieht.

Wie-deutlich werden wird, ist der Ring verschieden durch andere Substitution gekennzeichnet, die natürlich zu Unterschieden unter den verschiedenen Polyenmakrolidantibiotika führt, aber eine solche Variation in den Substituenten ändert nicht die wesentlichen Merkmale der Verbindungen, auch nicht
ihre Eignung zur Überführung in die hier beschriebenen neuen Derivate. Beispielsweise sind alle Verbindungen durch Hydroxyl-(-OH)-Substituenten an verschiedenen Positionen am Ring gekennzeichnet, z.B. üblicherweise 5 oder mehr, wie aus den
Figuren hervorgeht. Zuweilen ist eine weitere Aminogruppe zugegen, die sich speziell als ein Arylamin klassifizieren lässt, wie in der Zusammensetzung des Trichomycin angegeben; insbesondere ist das Arylamin im Falle des Trichomycins eine p-Aminophenylgruppe, nämlich p-Aminoacetophenon. In anderen Verbindungen treten andere aromatische Aminogruppen auf; a.B. in Hamycin p-Aminophenylketon obgleich es denkbar ist, dass die erfindungsgemässe Säuresalzbildung bis zur Arainogruppe eines solchen aromatischen Substituenten weiterlaufen kann, ist dem keine Bedeutung beizumessen; die Säuresalzbildung betrifft in erster Linie das stärkeifbasische Amin im Aminozucker.

Eine weitere Substitution am Makrolidring wird für erheblich

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weniger folgenreich gehalten, insbesondere für die Reaktionen und hieran beteiligten Produkte, und besteht im wesentlichen aus einer oder mehreren Gruppen v/ie Niederalkyl-, hydroxilierten Niederalkyl-, Sauer.stoff- und Epoxydgruppen, wobei unter Niederalkyl Alkylgruppen mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen zu verstehen sind. In aller Regel sind die Alkylsubstituenten einfach Methylgruppen, gewöhnlich zumindest mehrere wie im Falle der Fig. 1 und 2.

Wie in den Figuren zu erkennen ist, können Säuerstoffsubstituenten einfach sein, wie etwa im Falle eines Ketonsauerstoffs, oder sie können durch Bindung von zwei nichtaufeinanderfolgenden Kohlenstoffatomen überbrückend vorliegen, so etwa im Falle von Amphotericin B und Nystatin unter Bildung einer geschlossenen sechsgliedrigen Konfiguration, die als Hemiketal anzusprechen ist· In anderen Fällen kann eine ähnliche Überbrückung durch Alkyl- oder hydroxylierte Alkylsubstituenten vorliegen. Wie schon bemerkt, kann in einigen Verbindungen eine Epoxydgruppe auftreten, z.B. in Pimaricin (Fig. 3)» als ein Substituent am Ring. Es können Doppel- oder Vielfach-äibstituentengruppen der gegebenen Arten, wie üblicherweise im Falle von -OH und Methyl (-CEU)-Gruppen vorliegen und sogar für komplexere Gruppen, wie mit dem Vorliegen einer zweiten Carboxylgruppe (die dann auch in identischer V/eise verestert würde), aber in allen Fällen ergibt, sich kein Unterschied in der Grundnatur der Stamraverbindung als Glied der genannten Polyenmakrolidklasse und keine Auswirkung auf die Anwendbarkeit der Erfindung.

Im allgemeinen sind natürlich die anderweitig nicht besetzten Bindungen der Kohlenstoffatome des Rings von Protonen, d.h. Wasserstoffatomen besetzt. Grösstenteils sind diese von den Strukturabbildungen weggelassen worden (Fig. 1 bis 3)t da es

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offensichtlich ist, wohin sie gehören, d.h. zu nichtbesetzten Bindungen an manchen Stellen und an den Ringkohlenctoffen, wo nichtbesetzte Bindungen augenscheinlich werden. Aus Gründen der Einfachheit wurden in üblicher Weise die Bezeichnungen der Ringkohlenstoffe weggelassen, z.B. bei den Positionen 1 bis 37 und im Zuckerring in Fig. 1. Die letztere Figur wurde zur Verarischaulxchung der dreidimensionalen Eigenschaften gezeichnet, aber die Fig. 2 und 3 stellen wohl in einfacher ebener Darstellung vollständig genug die Formeln nach derzeitiger Auffassung dar.

Obwohl aus Bequemlichkeitsgründen und zur Veranschaulichung die wasserlöslichen Salze hauptsächlich als Hydrochloride untersucht wurden, kann jede einer Vielzahl anderer Säuren zur Herstellung der Additionssalze eingesetzt werden, mit gleichermassen brauchbarer V/irkung, wobei der Mechanismus der Bildung eines Additionssalzes mit einem geeignet alkalischen Amin wohl bekannt ist. So sind nachfolgend einige Säuren aufgeführt, die als· besonders.geeignet für diesen Zweck angesehen werden, d.h. als Beispiele unter vielen, die als geeignet für wasserlösliche Salze anerkannt werden: anorganische Säuren: Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Borsäure, Jodwasserstoffsäure, Flussäure, Phosphorwolframsäure. Organische Säuren: Ameisen-, Essig-, Thioessig-, Acryl-, Propion-, Isobubfcer-, η-Bitter-, Brenztrauben-, Äthylmethylessig-, Chloressig-, Dichloressig-, Methoxyessig-, Alphabrompropion-, Bromessig-, Milch-, Äpfel-, Zitronen-, Malon-· und Glutaconsäure.

Wie auch ausgeführt, wird ein gewisser Vorteil mit unlöslichen Säuresalzen verwirklicht, insbesondere, wo eine lipidlösliche Verbindung erwünscht ist. Beispiele für Säuren, die zur Bildung solcher Säuresalze unter anderem poeignet sind, ■

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sind die folgenden: n-Capron, n-Heptan-Cn^heptoic), n-Capryl-, Caprin-, Undecan-, Undecylen-, Öl-, Laurin-, Pimelin-, Handel-, Salicyl-, Stearin-, Palmitin-, Linol- und Linolensäure. Besondere Brauchbarkeit kann bei einigen dieser Säuresalze erzielt werden, beispielsweise wo Undecylensäure eingesetzt wird, im Hinblick auf die herkömmlichen, stark wirksamen Eigenschaften gegen Fungi dieser Säure und ihrer Salze.

Die bemerkenswert hohe Wasserlöslichkeit der löslichen Säuresalzderivate gemäss der Erfindung wurde durch Untersuchungen repräsentativer Verbindungen im Vergleich mit den Stammsubstanzen festgestellt. Während die Löslichkeiten der Säuresalze der Ester leicht nach der sogenannten Trockengewichtsmethode bestimmbar waren (und so für die Tabelle weiter unten gemessen wurden), sind die wirklichen Löslichkeiten der Stammpolyenantibiotika zu gering, d.h. kleiner als 0,1 mg pro ml, um sie nach einer solchen Methode genau messen zu können. So wurde eine empfindlichere Analysenmethode angewandt, wobei die gesättigte wässrige Lösungmit einem organischen Lösungsmittel (Dimethylsulfoxid) zehnfach verdünnt wurde, das dann erhältliche UV-Spektrum der überwiegend organischen Lösung gemessen und schliesslich die Wasserlöslichkeit aus der bekannten Verdünnung aus dem bekannten (oder getrennt bestimmten) Wert des Extinktionskoeffizienten für die Substanz errechnet wurde. Die Loslichkeitsbestimmungen waren wie folgt:

Tabelle III

Antibiotika und Derivate Löslichkeit in Wasser _i mg/ml

Amphotericin B 0,0017

Amphotericin B-methylester-

Hydroohlorid ' > 75iO

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Amphotericin B-äthylester-

Hydrochlorid > 75,0

Candidin 0,116

Candidin-methylester-Hydrochlorid > 50,0 Nystatin 0,039

Nystatin-raethylester-Hydrochlorid > 80,0 Pimaricin · 0,052

Pimaricin-methylester-Hydrochlorid Ϊ80,0 Mediocidin 0,072

Mediocidin-methylester-Hydrochlorid > 50,0

Candicidin 0,032

Candicidin-methylester-Hydrochlorid > 20,0

Trichomycin 0,046

Trichomycin-methylester-Hydrochlorid > 20,0 Hamycin .. 0,032

Hamycin-methylester-Hydrochlorid > 20,0

Obgleich für die obigen Untersuchungen Hydrochloride verwen- ' det wurden, ist klar, dass in dieser und anderer Hinsicht vergleichbare Eigenschaften mit Additionssalzen aus vielen anderen Säuren, wie sie zuvor erwähnt wurden, z.B. Sulfaten, Acetaten, Phosphaten, Nitraten und dgl. erhältlich sind.

Die tatsächliche Löslichkeit der erfindungsgemässen Derivate wird weiter durch Fig. 5 veranschaulicht, worin Kurve A das UV-Spektrum für Amphotericin B-methylester-Hydrochlorid in Wasser, 7 Mikrogramm pro ml,und Kurve B ein gleiches Spektrum für die gleiche Konzentration den Stammamphotericins B in V/an-

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ser darstellt. Kurve A, die die gleichen charakteristischen Absorptionspeaks wie die Lösung des Stammantibiotikums und des Methylesters in seiner Nichtsalzform (Fig. 4) im organischen Lösungsmittel aufweißt, ist ein echtes Spektrum und zeigt deshalb eine echte Lösung in Wasser, während Kurve B, der diese charakteristische Gestalt fehlt, zeigt, dass die Stammsubstanz sich nicht gelöst hat und daher lediglich eine Dispersion war. Es war zuvor schon von anderen festgestellt worden, dass die offenbar lösungsähnliche Dispersion lyophilisierten Amphotericin-B-Natriumdesoxycholats im V/asser nur eine Spektralkurve liefert, die im wesentlichen der Kurve B gleicht, und dies ist tatsächlich nur eine Dispersion und keineswegs eine echte Lösung.

Wie schon bemerkt, haben eine grosse Zahl von Versuchen gezeigt, dass die antimikrobiä.le Wirksamkeit der erfindungsgemässen Derivate sowohl in der Veresterungszwischenstufe der Ester als auch in der endgültigen wasserlöslichen Salzform im wesentlichen die gleiche ist wie die der Stammantibiotika. So sind z.B. in der folgenden Tabelle einige der in Vitro-Messungen wiedergegeben, die von der gegen Fungi wirksamen Stärke einer Zahl der Basen und der Derivate unter Anwendung von Standardmethoden und Kulturtechniken mit Saccharomyces cerevisiae gemacht wurden, einem Organismus, der im allgemeinen der Kategorie der Fungi zugeordnet wird und gewöhnlich für einen repräsentativen 'Aktivitätstest verwendet wird. In der Tabelle bedeuten die Zahlenwerte minimal inhibierende Konzentration,und so ist, je kleiner der Wert ist, die Wirksamkeit zur Wachstumshemmung des Organismus um so grosser.

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Verbindungen

Nystatin Nystatin-methylester

Amphotericin B Amphotericin B-methylester-Hydrochlorid

Pimaricin Pimaricin-methyleste r

Mediocidin Mediocidin-methylester

Candicidin Candicidin-methylester-Hydrochlorid

Trichomycin Trichomycin-methylester-Hydrochlorid

Candimycin Candimycin-methylester

minimal inhibierende Konzentration/Ug/ml Saccharomyces cerevisiae

3,00 4,00

0,25

3,50 4,00

0,035 0,030

0,020

0,025 0,030

0,030

0,025 0,025

Im Falle des Amphotericin B. wurde diese Versuchsreihe auf andere Mikroorganismen ausgedehnt: die minimal inhibierenden Konzentrationen in Mikrogramm pro ml für Amphotericin B und sein Methylester-Hydrochlorid waren 0,5 bzw. 0,5 gegenüber Candida albicans, 0,5 bzw. 0,5 gegenüber Mucor rouxii, und 0,20 bzw· 0,25 E" gegenüber Aspergillus niger.

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Die Brauchbarkeit der neuen Verbindungen ist im wesentlichen erklärt worden oder sollte aus dem Voi'gcsagten zu entnehmen sein, insbesondere dahingehend, dass sie die gleiche biologische Aktivität wie die Grund- oder Stannylverbindungen besitzen und so im allgemeinen für die gleichen Zwecke verwendbar sind, Neue Verwendbarkeit von wesentlicher Bedeutung int offensichtlich, wie festgestellt, aufgrund der besonderen Löslichkeitseigenschaften. Beispielsweise war die Verwendung der Stammantibiotika zur Vermeidung oder zum Bekämpfen von Pilzinfektion oder -schaden oft erfolglos aufgrund der fehlenden Wasserloslichkeit, z.B. im Hinblick auf unbelebte Gegenstände oder auf belebte Körper, gleich ob Pflanzen (die Sprays auf Wasserbasis brauchen) oder Körper tierischer Art (wo die Polyene bei innerer Anwendung aufgrund der Wasserunlöslichkeit schlecht bewirkt haben); so bestand ein Bedarf an wasserlöslichen Mitteln, der durch die Erfindung befriedigt wird. Die wasserlöslichen Derivate besitzen wichtige weitere Verwendungsmöglichkeiten, z.B. zur Verhinderung oder Zerstörung von Pilzinfektionen in Gewebekulturen, wa sie in der gleichen Weise und zur Kultivierung der gleichen Vielfalt lebender Gewebematerialien, insbesondere unter Einschluss tierischer Gewebe, wie in der oben genannten US-PS 3 244- 590 aufgeführt, mit überragender Wirksamkeit eingesetzt werden können.

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Claims

Patentansprüche

f. Säureaddiditionssalz einer Polyen makrolidantibiotikum-(. / verbindung, die aus einem makrozyklischen Lactonkern beeteht, der eine lange Kette von Kohlenstoffatomen darstellt, die durch das Lactonsauerstoffatom geschlossen ist, wobei alle Kohlenstoffatome der Kette miteinander durch Einfach- oder Doppelbindungen verbunden sind, die Mehrzahl der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen Einfachbindungen sind, die Kette eine Reihe von 4- bis 7 konjugierten Doppelbindungen und als.Substituenten dne Estergruppe -COOR, worin R Methyl, Äthyl oder Propyl ist, einen primären Aminozucker, eine Vielzahl von -OH-Gruppen und einen oder mehrere der Substituenten ITiederalkyl, hydroxiliertes Niederalkyl, Sauerstoff, Epoxy und Arylamin umfasst.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R Methyl ist..

3· Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin dan Stammpolyenmakrolidantibiotikum Amphotericin B ist.

4·· Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Stammpolyenmakrolidantibiotikum Oandicidin ist.

5. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Stamrapolyen- makrolidantibiotikum Triehomycin ist.

6. Verbindung nach Anspruch Λ oder2, worin das Stammpolyenmakrolidantibiotikum Mediocidin ist.

7· Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Stammp.olyen-

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makrolidantibiotikum Piraaricin ist.

8· Wasserlösliches Säureadditionssalz der Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7·

9. Amphotericin B-methylester-Hydrochlorid.

10. Gandicidin-methylester-Hydrochlorid.

11. Trichomycin-methylester-Hydrochlorid.

12. Mediocidin-methylester-Hydrochlorid.

13· Pimaricin-methylester-Hydrochlorid.

14. Verfahren zur Herstellung eines Esters einer amphoteren Polyenmakrolidantibiotikumverbindung, die einen raakrozyklischen Lactonring umfasst, der einen Carboxylgruppensubstituenten und einen primären Aminozucker als Substituenten trägt,- und die in den Ring eine Reihe von 4 bis 7 konjugierten Doppelbindungen aufweist, gekennzeichnet durch Umsetzen der Verbindung mit Diazomethan, Diazoäthan oder Diazopropan zur Veresterung der Carboxylgruppe.

15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in Tetrahydrofuran als Lösungsmittel durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt der Ester gewonnen und mit einer Säure zur Herstellung eines Säureadditionssalzes umgesetzt wird.

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17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Säure Chlorwasserstoffcäure verwendet wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17» dadurch gekennzeichnet, dass als Antibiotikumverbindung -Amphotericin B, Mediocidin, Candicidin,. Pimaricin oder Trichomycin verwendet wird.

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