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Beschreibung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Stoffo N,N,N-Trimethylderivate
amphoterer Polyenantibiotika und ein Verfahren zu deren Herstellung.
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Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen haben eine antifungale Wirkung
und finden in der Medizin zur Behandlung on Pilzerkrankungen Verwendung.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in der Literatur nicht beschrieben.
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Erfindungsgemäß haben die neuen Verbindungen N,N,N-Trims thylderivate
amphoterer Polyenüntibio-
| tika die folgende allgemeine Formel: y |
| S R>O <0¼ |
| OH |
| vt(cX)3 |
worin R für Aglykon eines amphoteren Polyonantibiotikums ohne Carboxylgruppe
steht.
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Die kennzeichnenden Vertreter dieser Gruppe der Verbindungen sind
erfindungsgemäß N,N,N-Trimethylamphoterizin B der folgenden Formel:
und N,N,N-Trimethylnystatin der folgenden Formel:
Die genannten Verbindungen sind innere Komplexsalze mit positiver Ladung an der
quartären Aminogruppe und negativer ladung an der Carboxylgruppe, Sie stellen Pulver
von gelber Farbe dar, die in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd und in Gemisch von
Dimethylformamid und Essigsäure löslich sind.
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Das UV-Spektrum der genannten Verbindungen stimmt mit dem UV-Spektrum
der Ausgangsantibiotika überein, was eine Unveränderlichkeit des Systems konjugierter
Doppelbindungen im Molekül bestätigt. Der spezifische Absorptionsexponent des gereinigten
N,N,N-Trimethylamphoterizins bei der Wellen länge von 382 nm beträgt 1500. Das IR-Spektrum
zeigt das Vorliegen im Molekül einer vollkommen ionisierten Carboxylgruppo.
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Durch eine potentiometrische Titration ist das Vorliegen einer quartären
Aminogruppe nachgewiesen.
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N,N,N-Trimethylderivate amphoterer Polyenantibiotika weisen eine
antibiotische Aktivität auf und unterdrücken die Lebens tätigkeit von Hefen, Hefe-
und Fadenpilze.
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Bei einer Prüfung der Aktivität der Verbindungen in vitro nach dem
Verfahren der Serienverdünnung in flüssigem Medium üben sie eine fungistatische
Wirkung in Konzentrationen von 0,31 bis 1g,5 µg/ml gegenüber der Mehrzahl pathogener
Pilze aus. Die Ergebnisse der Aktivitätsprüfungen der N,N,N-Trimethylderivate von
Nystatin und Amphoterizin B sind in der folgenden Tabelle angegeben Tabelle 1 Mikroorganismen
N,N,N-Trimethyl- N,N,N-Triamphoterizin B methylnystatin Cand. alb. 0,39 6,25 Cand.
trop. 1,5 6,30 Crypt. neof. 3,2 1,57 Epiderm, K.W. 3,2 6,25 Trich. gyps. 3,2 12,5
sich. rub. 6,3 12,5 Pen. granul. 3,2 6,3 Fus. sol. 3,2 6,3 Die Untersuchung der
akuten Toxizität von N,N,N-Trimethylamphoterizin B und N,N,N-trimethylgystatin
wurde
in Versuchen an weißen Mäusen mit Gewicht 18-20 g durchgeführt. Dabei wurden wasserlösliche
Komplexe von N,N,N-Trimethylderivaten mit Polyvinylpyrrolidon mit einem Gehalt an
Wirkstoff von 22-24% geprUft. Die Präparate wurden in destilliertem Wasser gelöst
und in die Schwanzvene der Tiere eingeführt.
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Die nach Körber verarbeiteten Yersuchsergebnisse haben ergeben, daß
verschiedene Partien von N,N,N-Trimethylamphoterizin B und N,N,N-Trimethylnystatin
ihrer Toxizität nach einander sehr nahe sind. LD50 dieser Präparate lag zwischen
60,6 bis 100 mg/kg, der Mittelwert betrug 80,2#7,0 mg/kg.
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NN.N-Trimethvlderivate von Amphoterizin B und Nystatin haben die sich
um das 10-15 fache weniger toxisch als /Ausgangsantibio tika erwiesen, deren lD50
7,0 bzw. 11,0 mg/kg für entsprechende Komplexe mit Polyvinylpyrrolidon beträgt.
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In Dosen bis 5 mg/kg ruft N,N,N-Trimethylamphoterizin B bei Kaninchen
keine Steigerung der Rektaltemperatur um mehr als 100 hervor.
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ELne Untersuchung der ohemisch-therapeutischen Aktivität der N,N,N-Trimethylderivate
amphoterer Polyenantibiotika wurde an einem Modell generalisiertenr Candidiasis
weißer Mäuse durchgeführt.
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Inokulum für Ansteckung der Tiere hat man aus einer 48-stündigen
Kultur Candida albicans hergestellt und es introvenös in der Dosis von 10-12 Mio
Zellen pro tdaus eingeführt.
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In Versuchen hat man sich weißer unrassiger Mäuse von beiderlei
Geschlecht
mit Gewicht 18-20 g bedient.
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N,N,NTrimethylderivate amphoterer Polyenantibiotika in Form eines
wasserlöslichen Komplexes mit Polyvinylpyrrolidon , enthaltend 22-29% Wirkstoff,
hat man in 5%-Glukoselösung aufgelöst und intravenös einmal alle 24 Stunden eingeführt,
Als Effektivitätskriterium der Präparate hat die Lebenderhaltung der Tiere in verschiedenen
Gruppen im Vergleich mit der Gruppe infizierter, aber keiner Behandlung unterzogener
Mäuse gegolten. Im Behandlungsschema mit N,N,N-Trimethylderivaten vom Amphoterizin
B und Nystatin hat man entweder eine Kur im Laufe von 4 und 5 Tagen mit einer Pause
von 48 Stunden dazwischen oder eine ununterbrochene wöchentliche Kur vorgesehen.
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lile Kontrolltiere sind in verschiedenen Versuchen zwischen dem 9.
und dem 16. Tag eingegangen. Zu diesem Zeitpunkt sind in Mäusegruppen, die nach
dem 1. Behandlungsschema mit Dosen von 10 und 20 mg/kg N,N,N-Trimethylamphoterizin
B behandelt aind, 94-100% am Leben geblieben. Die minimale von den untersuchten
Dosen 1 mg/kg hat eine Lebenderhaltung von 50% der Mäuse gewährleiStet.
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Die Behandlungsergebnisee generalisierter Candidiasis der Mäuse mit
N,N,N-Trimethylamphoterizin B nach dem aussetzenden Behandlungsschema sind in der
Tabelle 2 angegeben.
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Tabelle 2 Mäusenan- Dosis, Anzahl eingegangener Mäuse nach zahl in
mg/kg 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen Gruppe 16 20 1 1 1 16 10 0 2 2 16 5 5 6 7 16 1
8 9 9 16 ohne Behandlung 14 16 16 Eine ausgeprägte Wirkung des Präparata auf die
Entwicklung der Infetion ist im Versuch mit dem kontinuierlichen Behandlungsscheaa
schon bei Einführung von 0,1-0,2 mg/kg festgestellt.
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Die Behandlungsergebnisse generalisierter Candidiasis der Mäuse mit
N,N,N-Trimethylamphoterizin B nach dem kontinuierlichen Behandlungsschema zeigt
Tabellle 3.
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Tabelle 3 Mäusean- Dosis, Anzahl eingegangener Mäuse nach zahl in
mg/kg 9 Tagen 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen Gruppe 16 0,8 8 8 9 10 31 0,4 11 13 15
19 31 0,2 19 22 27 29 16 0,1 10 13 14 15 16 0,05 11 14 15 16 16 0,025 16 16 16 16
31 ohne Behandlung 31 31 31 31
Die Behandlung mit N,N,N-Trimethylnystatin
hat man auch nach zwei Schemata durchgeführt, Bei der Behandlung nach dem aussetzenden
Schema hat zum Zeitpunkt, zu welchem slle Tiere der Kontrollgruppe eingegangen sind,
die Lebenderhaltung der Mäuse, welche das Präparat bekommen haben, 25-87% in Abhangig.
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keit von der Dosis betragen.
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Die Behandlungsergebnisse generalisierter Candidiasis der Mäuse mit
N,N,N-Trimethylnystatin nach dem aussetzenden Behadlungsschema sind in der Tabelle
4 dargestellt.
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Tabelle 4 Mäusean- Dosis, Anzahl eingegangener Mäuse nach zahl in
mg/kg 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen Gruppe 16 40 2 2 2 16 20 5 5 5 16 10 10 10 10 16
5 10 12 12 16 ohne Behandlung 14 16 16 Ähnliche Ergebnisse hat man auch bei der
täglichen Präparateinführung im Laufe von 7 Tagen erhalten. Die Behandlungsergebnisse
generalisierter candidiasis der Mäuse mit N,N,N-Trimethylnystatin nach dem kontinuierlichen
Behandlungsschema in der Tabelle 5 angegeben.
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Tabelle 5 Mäusean- Dosis, Anzahl eingegangener Mäuse nach zahl in
mg/kg 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen Gruppo 20 10 . 7 10 13 19 5 7 10 12 18 2,5 11 14
16 20 1,0 . 16 18 20 30 ohne Behandlung 28 30 30 Die beiden Präparate haben bei
einer Behandlung mit höhe ren Dosen ein verhältnismäßig stabiles Ergebnis erzielt,
weil die Lebenderhaltung der Tiere bei deren Beobachtung im Laufe von 4 Wochen praktisch
unverändert geblieben ist.
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Erfindungsgemäß besteht das Verfahren zur Herstellung der angegebenen
neuen Verbindungen N,N,N-Trimethylderivate amphoterer Polyenantibiotika der allgemeinen
Formel
wo R für Aglikon eines amphoteren Polyenantibiotikums ohne Carboxylgruppe
steht, darin, daß ein amphoteres Polyenantibiotikum erschöpfender Methylierung bezogen
auf die Aminogrup pe durch ein methylierendes Agens unterzogen wird, als welches
man Methylhalogenid, Schwefelsäuremethylester oder Methylester einer organischer
Sulfonsäure verwendet. Das Verfahren wird im Medium eines organischen Lösungsmittels
unter darauffolgender Isolierung des Endproduktes durchgeführt.
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Als methylierendes Agens wird vorzugsweise Methyljodid oder Dimethylsulfat
verwendet. Es ist orwescht, den Prozeß im Medium von Dimethylaulfoxid oder Dimethylformamid
durchzuführen. Zur Bindung der sich im Methylierungsprozeß bildenden fi Säure führt
man diesen Prozeß in Gegenwart von Natriumhydrogenkarbonat, das vorzugsweise in
einem Gewichtsverhält nis von 0,5 bzw. 2,511 genommen wird, duroh. Zweckmäßig ist
es,die Methylierung bei einer Temperatur von 25-45°C durchzuführen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt verwirklicht.
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Das amphotere Polyenantibiotikum löst man in einem organischen Lösungsmittel
auf.
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Bevorzugte Lösungsmittel für diesen Zweck sind Dimethyl sulfoxyd
bzw. Dimethylformamid, weil in diesen Lösungsmitteln sich ein Polyenantibiotikum
gut auflöst, und außerdem tragen diese Lösungsmittel dazu bei, daß die Reaktion
der Methylierung am vollständigsten verläuft.
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D.er erhaltenen Lösung fügt man unter Vermischen das methylierende
Agens hinzu, wobei man als solches Methylhalogenide, Schwefelsäuremethylester oder
Methylester organischer Sulfonsäuren, zum Beispiel Methyljodid, Dimethylsuliat,
Methylester der Paratoluolsulfonsäure u.a.m. verwendet.
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Im Laufe der Methylierung kommt es zur Substitution der Protonen
der Aminogruppe durch Methylradikale, dabei wird die entsprechende Säure isoliert.
Zur Bindung der sich Dildenden Säure ist es zweckmäßig, das Verfahren in Anwevenhoit
des Natrtumhydrogenkarbonats durchzuführen, welches vorzùgsweino in einem Gewichtsverhältnis
zum Ausgangsantibiotikum 0,5 bzw. 2,5:1 einzuführen ist.
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Das Natriumhydrogenkarbonat bindet die sich ausscheidende Säure,
und die Bedingungen des Reaktionsgleichgewichtes werden dadurch zur Endproduktbildung
verschoben.
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Der Methylierungeprozeß wird durch die Anlagerung von drei Methylresten
am Stickstoff der Aminogruppe beendet und der Stickstoff erhält dabei eine positive
Ladung. Auf die Weise stellt die gewonnene Verbindung ein inneres Komplexsalz dar,
welches eine positive Ladung am quartären Stickstoffatom und eine negative Ladung
an der vollkommen ionosierten Carboxylgruppe enthält.
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Es ist zweckmäßig, damit die Bildung der Nebenprodukte in der Reaktion
der Methylierung herabgesetzt wird, den Prozeß unter Erwärmung des Reaktionsgemischs
bis auf eine Temperatur von 25-4500 durchzuführen.
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Das gewonnene Endprodukt wird durch Fällen mit Wasser unter darauffolgendem
Zentrifugieren, Waschen und Trocknen
isoliert. Die Ausbeute an
Endprodukt beträgt 70-90 Gew.% der Theorie.
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Damit die vorliegende Erfindung besser verstanden wird, sind die
folgenden Beispiele der Verwirklichung des Verfahrens zur Herstellung der N,N,N-Trimethylderivate
amphoterer Polyensntibiotika angeführt, Beispiel 1.
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In einen mit einem Rührer versehenen Kolben füllt man 1,5 g Amphoterizin
B mit Extinktion E10m1% = 1500 bei Wellenein.
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länge 382 nm Dann gießt man 40 ml Dimethylsulfoxid hinzu und vermischt,
bis sich das Amphoterizin 3 vollkommen löst. Der erhaltenen Lösung fügt man 0,7
g Natriumhydrogenkarbonat und eine Lösung hinsu, enthaltend 1 g Methyljodid in 10
g Dimethylsulfoxid. Das Reaktionsgemisch im Kolben wird vermischt und bei einer
Temperatur von 40-45°C während 1,5-2 Stunden gehalten. Dann kühlt man den Kolben
ab und fällt den Inhalt mit Wasser aus, Den Niederschlag trennt man mittels einer
Zentrifuge, wäscht mit Wasser, dann mit Aceton und trocknet in einem Vakuumtrockenschrank.
Man erhält 1,2 g Produkt mit t dem Gehalt an N,N,N-Trimethylamphoterizin B von 70%.
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UV-Spektrum des gereinigten Produktes: Absorptionsmaximum bei einer
Wellenlänge 273#2nm; 283#2 nm; 345#2nm; 363#2nm; 382#2nm; 406#2nm; Extinktion bei
Wellenlänge 382 nm beträgt 1500.
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IR-Spektrum: 1720 cm-1; 1590 cm-1 (s. stark); 1420 cm-1; 1190 cm-1;
1080 cm-1; 1020 cm-1.
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Potentiometrische Titrierung von 1 g gereinigtem Produkts 0,1 N KOH
- 0,52 ml; 0,1 N HCl -10,1 ml.
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Die Verteilungskonstante im System Methanol-Chloroformboratpuffer
mit einem pH-Wert von 8,27, genommen in einem Verhältnis von 2:2:1, beträgt 0,82.
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Beispiel 2.
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In einen mit einem Rührer versehenen Kolben füllt man 5 g Nystatin
mit der Extinktion E%m n 850 bei Wellenlänge 304 nm. Dann gießt man 40 ml Dimethylsulfoxid
hinzu und vermischt, bis sich das Antibiotikum vollkommen auflöst.
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Der erhaltenen Lösung gibt man 13 g Natriumhydrogenkarbonat zu und
gießt die Lösung hinzu, bestehend aus 6 g Dimethylsulfat in 10 ml Dimethylsulfoxid
Das Reaktionagemisch vermischt man während 1,5 at. bei der Temperatur 300C, kühlt
dann den Kolben ab und fällt den Kolbeninhalt mit Wasser aus.
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Den Niederschlag trennt man mittels einer Zentrifuge, wäscht mit
Wasser, denn mit Aceton und trocknet in einem Vakuumtrockenschrank. Man erhält 3,7
g Produkt mit dem Gehalt an N,N,N-Trimethylnystatin von 68%.
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UV-Spektrum des gereinigten Produktes: Absorptionsmaximum bei Wellenlängen
292@2 nm; 304@2 nm; 318@2 nm; Extinktion bei der Wellenlänge 304 na beträgt 800
Potentiometrische
Titrierung von 1 g gereinigtem Produkts 0,1 N KOH - 0,75 ml; 0,1 N HCl - 9,86 ml.
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Verteilungskons tante im System Methanol-Chloroformboratpuffer mit
pH= 8,27, genommen in einem Verhältnis von 2:2:1, beträgt 1,25.
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Beispiel 3 In einen mit einem Rührer versehenen Kolben füllt man 5
g Mykoheptin mit Extinktion E1cm1% = 1200 bei Wellenlänge 382 nm. Dann gießt man
80 ml Dimethylsulphoxyd hinzu und vermischt, bis sich das Antibiotikum vollkommen
löst. Der erhaltenen Lösung fügt man 3,0 g Natriumhydrogenkarbonat hinzu und gießt
dann die methylierende Lösung hinzu, enthaltend 3,5 g Methylester der Paratoluolsulfonsäure
in 20 ml Dimethylsulfoxid. Das Reaktionagemisch vermischt man während 1,5 St.
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bei einer Temperatur von 35°C, kühlt dann eb und isoliert das Produkt
wie im Beispiel 1 beschrieben.
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Man erhält 4,2 g Produkt mit dem Gehalt an N,N,N-Trimethylmykoheptin
56%.
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U7-8pektrum des gereinigten Produktes: Adsorptionsmaximum bei Wellenlängen
345#2 nm; 363#2 nm; 406#2 nm; Extinktion bei der Wellenlänge 382 nm beträgt 1150
Potentiometrische Titrierung von 1 g gereinigtem Produkt: 0,1 N KOH - 0,61 ml; 0,1
N HCl -10,8 ml.
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Die Verteilungskonstante beträgt 1,1 im System, das im Beispiel 1
angeführt ist.
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Beispiel 4 Es wird die im Beispiel 1 beschriebene Methodik mit der
Ausnahme wiederholt, daß man 5 g Amphoterizin B in 80 ml Dimethylformamid löst,
2,8 g Natriumhydrogenkarbonat hinzufügt und eine Lösung hinzugießt, enthaltend 4,4
g Methyljodid in 20 ml Dimethylformamid. Man erhält 4,3 g Produkt mit dem Gehalt
an N,N,N-Trimethylamphoterizin B von 65%.
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Die Kennwerte des goreinigten Produktes entsprechen jenen, die im
Beispiel 1 beschrieben sind.
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Beispiel 5 Es wird die im Beispiel 2 beschriebene Methodik mit der
Ausnahme wiederholt, daß man 6 g Dimethylsulfat durch 5 g Methyljodid ersetzt. Man
erhält 4,5 g Produkt mit dem Gehalt an N,N,N-Trimethylnystatin von 38%.
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Die Kennwerte des gereinigten Produktes entsprechen jenen, die im
Beispiel 2 beschrieben. sind.
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Beispiel 6 Es wird die im Beispiel 1 beschriebene Methodik mit der
Ausnahme wiederholt, daß man 5,0 g Amphoterizin B in 80 ml Dimethylsulphoxyd löst,
3,0 Natriumhydrogenkarb onat hinzufügt und dann die methylierende Lösung hinzugießt,
enthaltend 5,0 g Methyljodid in 20 mi Dimethylsulfoxid, Das ßeaktionsgemisch vermischt
man bei Raumtemperatur während 2,5 at. Man erhält 4,6 g Produkt mit dem Gehalt an
N,N,N-Trimethylamphoterizin
B von 35%.
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Die Kennwerte des gereinigten Produktes entsprechen Jenen, die im
Beispiel 1 beschrieben sind.