DE3717280A1 - Medicagensaeure-derivate enthaltende mittel zur behandlung von pilzinfektionen - Google Patents
Medicagensaeure-derivate enthaltende mittel zur behandlung von pilzinfektionenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von Pilzinfektionen,
die gegen eine Vielzahl von medizinisch wichtigen
Pilzen eingesetzt werden können. Die Wirkstoffe der Mittel
sind Verbindungen, die aus den Wurzeln der Luzerne isoliert
werden können, die aber auch synthetisch hergestellt werden
können, und Derivate davon. Die Wirkstoffe der erfindungsgemäßen
Mittel sind bei niedrigen Konzentrationen wirksam und
können in der Human- und Tiermedizin zur Hemmung des Wachstums
von Pilzen und zu deren Abtötung verwendet werden.
Das Auftreten von Pilzinfektionen als Primär- oder Sekundärkrankheit
ist in zunehmendem Maße zu beobachten, vor allem
durch den weit verbreiteten Gebrauch von immunosuppressiven
Arzneistoffen und Breitbandantibiotika. Die Entwicklung neuer
Mittel zur Behandlung von Pilzinfektionen ist daher in der modernen
Medizin von wesentlicher Bedeutung. Diese Entwicklung
geht jedoch nur sehr langsam voran, vor allem da Pilze
Eukaryonten sind und es daher schwierig ist, Mittel zu entwickeln,
die nur den Pilz und nicht die Wirtszellen angreifen.
Zur Zeit steht daher nur eine relativ geringe Zahl von Arzneistoffen
zur Behandlung von Pilzinfektionen zur Verfügung und die
meisten dieser Stoffe sind zugleich auch toxisch. Die wichtigsten antimykotischen
Arzneistoffe sind die Polyen-Makrolide und die erst
kürzlich gefundenen Imidazolderivate. Beide greifen die Zellmembran
an. Weitere antimykotische Wirkstoffe sind 5-Fluorcytosin,
das die Nukleinsäuresynthese beeinflußt und Griseofulvin,
das die Funktion der Mikrotubuli und die Zellteilung hemmt.
Beim Einsatz der antimykotischen Arzneistoffe treten mehrere
Probleme auf. Dazu gehören die geringe Löslichkeit,
Stabilität und Resorption von Polyen-Antibiotika und ihre hohe
Toxizität, vor allem für die Niere. Kürzlich wurde eine
Pilzresistenz gegen Amphotericin B beschrieben. Die Imidazole
werden im Magen-Darm-Trakt gut resorbiert, aber eine langdauernde
Verabreichung verursacht Änderungen und Störungen in
der Leber- und Nierenfunktion. Außerdem sind sie unwirksam
bei der Behandlung systemischer Mykosen. Der therapeutische
Einsatz von Fluorcytosin ist wegen seines engen antimykotischen
Spektrums und dem hohen Grad an Pilzresistenz gegenüber
dem Arzneistoff begrenzt. Griseofulvin ist sehr wirksam gegen
Dermatophyten, aber hat nur geringen oder gar keine Wirkung
auf andere Pilze.
Alle diese Probleme, verbunden mit dem steigenden Auftreten systematischer
Pilzinfektionen, vor allem bei gefährdeten Patienten,
machen die Suche nach einer neuen Gruppe von antimykotischen
Mitteln notwendig.
Saponine sind Glykoside, die in einer Vielzahl von Pflanzen vorkommen
und die diesen Resistenz gegenüber Pflanzenkrankheiten
verleihen. Es wurde gefunden, daß die Luzerne (Familie der Leguminosen)
Saponine mit einer selektiven Toxizität gegen die bekannten
pflanzenpathogenen Pilze Sclerotium rolfsii, Alternaria
solani und Sclerotinia sclerotiourum enthält. Sie befinden sich
hauptsächlich in der Rinde der reifen Wurzeln und schützen diese
gegen das Eindringen von Pilzen. Die Wirksamkeit von Medicagensäure,
dem Aglycon bestimmter Saponine aus der Luzerne, bei
der Hemmung des Pilzwachstums wurde beschrieben. B. Gestetner, Y. Assa und
M. Ratman, Experientia 29 (1973) 529-530, beschreiben die
Wirkung von Medicagensäure und einiger ihrer Glycosid-Derivate
gegen einen einzelnen pflanzenpathogenen Pilz, Sclerotium
rolfsii, in einer Konzentration von 10-4 M. Über eine Wirkung bei
Pilzinfektionen von Säugern wird nicht berichtet.
Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel für die Human-
und Veterinärmedizin, zur Verwendung bei der Behandlung einer
Vielzahl von Pilzinfektionen. Die Mittel können oral oder durch
Injektionen verabreicht werden, sie können lokal oder topisch
eingesetzt werden.
Die Wirkstoffe sind Medicagensäure oder deren Derivate (siehe
Fig. 1) der folgenden allgemeinen Formel I
in der R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeutet,
R₂ ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe, β-Glucopyranose
oder α-Glucopyranosyl-(1→4)-β-Glucopyranose darstellt und
R₃ ein Wasserstoffatom oder einen Niederalkylrest bedeutet,
und wirksame Derivate davon.
Medicagensäure und die nachstehend mit G, G2 und F bezeichneten
Verbindungen bzw. Erzeugnisse können aus der Luzerne gereinigt werden.
Die Erfindung betrifft auch solche Verbindungen in chemisch
reiner Form und neue Derivate davon, wie sie vorstehend definiert wurden.
Die neuen Mittel haben eine niedrige hämolytische Wirkung und
sind in sehr geringen Konzentrationen des Wirkstoffes wirksam.
Die Wirkstoffe zeigen eine selektive Toxizität gegenüber einer
Vielzahl von klinisch wichtigen Hefen, wobei G2 die wirksamste
Verbindung ist. G2 wird durch weitere Reinigung von G erhalten.
Die Erfindung betrifft antimykotische Mittel, die eine der
vorstehend definierten Verbindungen enthalten.
Die antimykotischen Wirkstoffe G und G2 haben eine geringe Löslichkeit
in Wasser und müssen daher in einem geeigneten Lösungsmittel
oder Träger für die notwendigen hohen Konzentrationen
zur Verfügung gestellt werden. Die Verbindungen sind
in 0,1% Polyäthylenglykol mit 2 mM wäßrigem Natriumhydroxid
löslich.
Beim Test gegen elf der wichtigsten Hefen, die besondere klinische
Bedeutung haben, wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Mittel
bei niedriger Konzentration eine deutliche
Hemmwirkung aufweisen. Sowohl bei der Agar- als auch bei der
Mediumverdünnung werden MHK-Werte von 2 bis 15 µg/ml bei Verwendung
von G2 erreicht. Als empfindlichster Hefestamm erwies
sich Cryptococcus neoformans mit einem mittleren MHK-Wert
von 2 µg/ml. G2 weist bei niedrigen Konzentrationen eine fungizide
Wirkung auf und es wurden MHK-Werte von 4 bis 24 µg/ml
mit G2 erhalten. G2 ist eine relativ stabile Verbindung und
kann daher als Wirkstoff in fungiziden Präparaten zur Verwendung
gegen eine Vielzahl von Pilzinfektionen verwendet werden.
Die Wirkung von G ist etwa um den Faktor 15 geringer,
aber dieses Erzeugnis kann auch als Wirkstoff verwendet werden.
Auch die anderen Substanzen weisen eine hohe antimykotische
Wirkung auf.
Die neuen Mittel sind daher von beträchtlichem pharmazeutischem
Wert bei der Behandlung von Pilzinfektionen in der Human-
und Tiermedizin.
Die im wesentlichen reine Substanz G2 wurde als 2-β-Hydroxy-
3-β-O-(b-D-glucopyranosyl)-Δ¹²-oleanen-23,28-dionsäure identifiziert,
sie wird auch als Medicagensäure-3-O-β-D-glucopyranosid bezeichnet
und hat die folgende Formel:
Die Reinigung von G, G2 und F aus der Luzernewurzel ist in
Schema I dargestellt.
Die Strukturen der Verbindungen G2 und F wurden folgendermaßen
bestimmt:
Nach chemischem Abbau und enzymatischer Hydrolyse wurden die
Zuckeranteile erhalten. Die Verbindung G2 war ein Substrat
der β-Glucosidase, aber nicht der α-Glucosidase. Die Verbindung
F war ein Substrat der α-Glycosidase, aber nicht der
β-Glucosidase. Die Verdauung der Verbindung F mit beiden
Enzymen führte zum Aglycon (Tabelle I). Das Aglycon, sein Dimethylester
und sein Dimethylesterdiacetat zeigten in der
Chromatographie das gleiche Verhalten und hatten die gleichen
¹H-NMR-Spektren wie Derivate einer bekannten Medicagensäure-Probe
(II bzw. III). Im Falle der Verbindung G2 wurde durch
¹³C-NMR-Spektroskopie die Aufklärung der Struktur vervollständigt,
wobei festgestellt wurde, daß die glycosidische
Substitution des Aglycons am C-3-Atom statt am C-2-Atom erfolgt.
Die Verbindung G2 wird normalerweise in annehmbarer Ausbeute
(0,12%, siehe Schema) aus gemahlenen Wurzeln der Luzerne erhalten,
der Anteil der Verbindung F ist jedoch geringer und
variiert je nach Charge. Unter Umständen sind nur Spuren von F
vorhanden. Daher wird die Verbindung F zur Zeit aus einem Medicagensäure-
Derivat mit Hilfe der Koenigs-Knorr-Synthese
(Merck-Index, 9. Aufl., S. ONR-52) synthetisiert.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel sind in einem geeigneten
Träger oder Verdünnungsmittel für die topische Anwendung geeignet.
Sie können auch oral oder durch Injektion verabreicht
werden. Zu den geeigneten Arzneimittelformen gehören orale
Tabletten, Lotionen, Cremes, Salben, Pulver für die topische Anwendung,
lyophilisierte Pulver zur Verdünnung und Injektion,
orale Gelzubereitung, Vanigalsuppositorien, Pulver
oder Suspensionen für Aerosole. Bei den topischen Präparaten
macht der Wirkstoff im allgemeinen etwa 0,2 bis etwa 2 Gewichtsprozent
aus. Die Dosiseinheitsformen liefern im allgemeinen
etwa 0,1 bis etwa 2 g des Wirkstoffes pro kg Körpergewicht
pro Tag.
200 g gemahlene Wurzeln der Luzerne (Medicago sativa L. Gilboa-
Art vom RAM-Gut, Beer-Sheva) werden mit 2,5 Liter 80prozentigem
Äthanol in Wasser 16 Stunden bei 60°C extrahiert. Der Feststoff
wird abfiltriert und das Äthanol unter vermindertem
Druck abgedampft. Die erhaltene wäßrige Lösung wird dreimal
mit je 400 ml Diäthyläther extrahiert, der anschließend unter
vermindertem Druck entfernt wird. Der Extrakt wird an 6 g
Silikagel (Merck, 0,210-0,068 mm, 70-230 mesh, ASTM) adsorbiert
und dann in 2-g-Portionen auf das gleiche Adsorbens (150 g)
aufgebracht und mit 350 ml Essigsäureäthylester-Wasser-Essigsäure
(7:2:2) chromatographiert. Die Fraktionen, die in der
Dünnschichtchromatographie (durchgeführt auf Merck-Silika 60-F₂₅₄-Platten,
als Laufmittel Essigsäureäthylester zu Wasser zu Essigsäure
= 7:2:2, Entwickeln durch Sprühen mit H₂SO₄ (5% in Äthanol)
und Erhitzen auf 100°C (für 10 min) den typischen blauen
Fleck mit einem Rf-Wert von 0,75 zeigten, werden vereinigt,
die Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand in 5 ml Wasser
resuspendiert und dann lyophylisiert. Es werden etwa 300 mg des
Erzeugnisses G erhalten.
Zur weiteren Reinigung werden Fraktionen des ersten Chromatographieschrittes,
die G und F enthalten, an 2 g Silikagel
(Merck, 0,210-0,068 mm, 70-230 mesh, ASTM) adsorbiert und
weiter gereinigt, indem sie auf eine Flash-Chromatographiesäule
(15 g Silicagel 60, Merck, 0,068-0,037 mm, 230-400 mesh, ASTM)
aufgegeben und nacheinander mit Essigsäureäthylester-Methanol
(4:1, 2:1, 1:11) (jede Fraktion 250 ml) bei einer Fließgeschwindigkeit
von 10 ml/min eluiert werden. Fraktionen, die G oder F
enthalten (Rf = 0,75 bei der Dünnschichtchromatographie) werden
vereinigt und in 20- bis 40-mg-Proben auf eine präparative HPLC-Säule
aufgegeben. Die Elution erfolgt mit einem Gradienten von
Methanol-Wasser im Bereich von 70 bis 85% im Zeitraum von
60 Minuten. 4-ml-Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie
geprüft, solche, die G2 enthalten, werden weiter durch
Hochleistungsdünnschichtchromatographie getestet (durchgeführt
auf Merck RP-18-F₂₅₄-Platten, als Laufmittel Methanol zu Wasser =
4:1, Entwickeln wie Dünnschichtplatten). Fraktionen, die einen
einzigen blauen Fleck mit einem Rf-Wert von 0,28 aufweisen,
werden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und
lyophylisiert. Es wird ein weißer amorpher Feststoff erhalten
(G2) mit einem F. von 251-254°C;
[α] = +70,6° (Äthanol).
Die Verbindung ist Medicagensäure-3-O-β-D-Glucopyranosid (IV),
(Literatur-F. 253-254°C; [α] D = +70°). Fraktionen, die
F enthalten (Rf = 0,60 in der Dünnschichtchromatographie,
Rf = 0,42 in der Hochleistungsdünnschichtchromatographie),
werden ebenfalls konzentriert und lyophylisiert. Es wird die
Verbindung F, nämlich Medicagensäure-3-O-β-D-maltosid (VI) in
amorphem Zustand erhalten.
Das antimykotische Mittel hat eine geringe Löslichkeit in
Wasser. Daher wurde eine Lösung von 0,1% Polyäthylenglykol
(Molekulargewicht 20 000, Sigma, St. Louis, Mo) in 2 mM
Natriumhydroxid zur Lösung von G und G2 verwendet.
Geeignete arzneistoffreie Lösungen wurden als Kontrollen
in jedem Test eingesetzt. Die Konzentration des Arzneistoffes
in der Stammlösung betrug 2,5 mg/ml. Da der Arzneistoff
hitzebeständig ist, wurde er bei 121°C 15 Minuten
autoklaviert. Die Verdünnungen des Arzneistoffes wurden mit
sterilen destilliertem Wasser hergestellt.
Erythocyten (RBC) verschiedener Herkunft wurden mit Citrat
als Anticoagulans resuspendiert und viermal mit Phosphat-gepufferter
physiologischer Kochsalzlösung (PBS) pH 7,2 in
einer klinischen Zentrifuge gewaschen und
schließlich im gleichen Puffer zu einer Konzentration von 2%
(Volumen/Volumen) resuspendiert.
Mit Hilfe eines automatischen Verdünners wurde eine Reihenverdünnung
des antimykotischen Mittels in PBS hergestellt.
Die Verdünnungen wurden in Mikrotiterplatten durchgeführt.
Jedes Näpfchen enthielt 50 µl einer Verdünnung und wurde mit
dem gleichen Volumen RBC versetzt. Hämolyse und Hämagglutination
wurden nach 1stündiger Inkubation bei 37°C und einer weiteren
Inkubation für 24 Stunden in der Kälte makroskopisch
bestimmt. Eine partielle Hämolyse wurde als Endpunkt angesehen.
Die verwendeten Hefen stammen von klinischen Proben, die von
Patienten isoliert wurden. Pro Patient wurde ein Isolat untersucht.
Die Hefearten wurden nach üblichen Verfahren identifiziert.
Die Isolate wurden bis zu den Versuchen auf Sabourand-
Dextrose-Agar (SDA) gehalten. Von über Nacht bei 30°C auf
Sabourand-Dextrose-Agar (SDA) gewachsenen Hefekulturen wurden
Suspensionen hergestellt und mit sterilem destilliertem Wasser
mit Hilfe eines Hämacytometers auf eine Konzentration von 10¹⁵
Zellen/ml verdünnt. Vom Arzneistoff
wurden geeignete Verdünnungen mit sterilem Wasser in einem
Endvolumen von 1 ml hergestellt. Jeweils 1 ml der Arzneistofflösung
wurde zu 3 ml 3prozentigem, sterilem, verflüssigtem
Noble-Agar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) zugesetzt,
und nach Kühlung auf 50°C mit 0,5 ml 10fach konzentriertem,
nicht gepuffertem sterilem YNB (Yeast Nitrogen Base)-Medium
(Difco) und 0,5 ml 20prozentiger Glucose versetzt. Der pH-Wert betrug
5,1. Nach gründlichem Mischen wurde das Agarmedium auf
60×15 mm große sterile Petrischalen verteilt. Die Platten wurden
ohne Deckel 15 Minuten in einer Sterilbank getrocknet und
konnten bei 4°C 2 Wochen aufbewahrt werden. Jeweils 10 µl
der Hefesuspension wurden mit einer Mikropipette in Agarplatten
gegeben, die verschiedene Konzentrationen des Arzneistoffes
enthielten, so daß sich eine Impfmenge von 10³ Zellen
pro 10 µl-Tropfen ergab. Auf eine einzelne Platte konnten
7 Tropfen aufgegeben werden, ohne daß eine gegenseitige Störung
auftrat. Die beimpften Platten wurden bei 30°C inkubiert.
Bei jedem Test wurden auch zwei arzneistofffreie
Kontrollen durchgeführt, wobei eine das Lösungsmittel für
den Arzneistoff enthielt und die andere als Wachstumskontrolle
verwendet wurde. Um einen verwertbaren Test mit den
Proben zu erhalten, mußten beide Kontrollplatten Wachstum
zeigen. Zusätzlich wurde ein geeigneter Kontrollorganismus
(Candida tropicalis 908), dessen Empfindlichkeit bekannt
war, jeder Platte zugesetzt. Die Inkubationszeit hing von
der Schnelligkeit des Wachstums ab. Die Ergebnisse wurden
nach 24 und 48 Stunden Inkubation bei 30°C bestimmt. Jeder
Test wurde mindestens zweimal durchgeführt. Der MHK-Wert
wurde definiert als die niedrigste Konzentration des Arzneistoffes,
die makroskopisches Wachstum der Kolonien verhinderte.
Trübungen wurden als negativ angesehen.
Wenn in Tests die Wirkung des pH-Wertes geprüft wurde, so
wurden die folgenden Puffer zum nicht-gepufferten YNB-Medium
zugesetzt: 20 mM KH₂PO₄ pH 7 für einen pH-Wert von 7, 10 mM
KH₂PO₄ pH 7 für einen pH-Wert von 6,5 und 20 mM MES pH 6,1 für
einen pH-Wert von 6,0.
Hefekulturen wurden über Nacht auf SDA bei 30°C wachsen gelassen.
Diese Kulturen wurden resuspendiert und zu einer Endkonzentration
von 10³, 10⁴ und 10⁵ Zellen/ml mit Hilfe eines
Hemacytometers verdünnt. Die Verdünnungen wurden in YNB-Medium
(Difco) hergestellt, Glucose zugesetzt und der pH auf einen
Wert von 6,5 mit 10 mM KH₂PO₄ pH 7 eingestellt. Nach Wachstum
über Nacht in einem Schüttler bei 30°C, wurden Kulturen
in der log-Phase (weniger als 25% Transmission bei 530 nm)
für den Empfindlichkeitstest eingesetzt. Der Test wurde in
Teströhrchen durchgeführt, die verschiedene Konzentrationen
des antimykotischen Mittels in 3 ml nicht-gepuffertem YNB-Medium
(pH 5,1, mit 2% Glucose) enthielten.
Die Impfmenge betrug 10³ bis 10⁵ Zellen/ml einer log-Phasenkultur,
je nachdem, welcher Stamm verwendet wurde. Zwei
Röhrchen, die arzneistofffreies Medium und die jeweilige
Impfmenge enthielten, wurden als Kontrollen verwendet. Alle
Röhrchen wurden mit einem lose sitzenden Deckel verschlossen
und bei 30°C in einem Schüttler inkubiert.
Nach Inkubation über Nacht wurde die Empfindlichkeit nur
dann bestimmt, wenn die Kultur in den Kontrollröhrchen nicht
weniger als 25% Transmission bei 530 nm ergab. Der MHK-Wert
wurde visuell als die niedrigste Arzneistoffkonzentration,
die klar blieb, bestimmt. Die Hemmkonzentration (IC₅₀) wurde
spektrophotometrisch als die niedrigste Arzneistoffkonzentration
bestimmt, die folgende Gleichung erfüllte:
%T %T Kontrolle + 0,5 (100% - %T-Kontrolle),
wobei %T = %Transmission bei 530 nm und Kontrolle = arzneimittelfreies Röhrchen bedeutet.
%T %T Kontrolle + 0,5 (100% - %T-Kontrolle),
wobei %T = %Transmission bei 530 nm und Kontrolle = arzneimittelfreies Röhrchen bedeutet.
Die minimale fungizide Konzentration (MFC) wurde durch Bestimmen
der koloniebildenden Einheiten (colony forming units (CFU))
auf SDA ermittelt. Drei Aliquots von 50 µl, die unmittelbar
nach dem Mischen von der anfänglichen Impfmenge in den
Kontrollröhrchen und direkt nach der Bestimmung des MHK-Wertes
aus den Röhrchen, die kein Wachstum zeigten, erhalten
wurden, wurden erneut auf SDA kultiviert. Der MFC-Wert wurde
als die niedrigste Konzentration des Arzneistoffes bestimmt,
bei der die Subkultivierung negativ verlief.
Die kinetischen Messungen der Abtötung wurden in 10 ml
nicht gepuffertem YNB-Medium, das mit Glucose ergänzt war
und die geeignete Arzneistoffkonzentration enthielt, durchgeführt.
Die Hefe-Impfmenge wurde hergestellt, wie es im
Empfindlichkeitstest mit der Mediumverdünnungsmethode beschrieben
ist, so daß eine Endkonzentration von 10⁵ Zellen/ml
vorlag. Der Versuch wurde bei 30°C in einem Schüttelwasserbad
durchgeführt. 0,4 ml Proben wurden in regelmäßigen Zeitabständen
entnommen. Drei Aliquots von 50 µl von geeigneter
Verdünnung wurden auf SDA geimpft, um die CFU zu testen. In
anderen Versuchen wurden die Proben für die CFU-Bestimmung
zweimal mit dem YNB-Medium gewaschen, um das antimykotische
Mittel zu entfernen, bevor für weiteres Wachstum erneut beimpft
wurde.
Die klinische Verwendung der Saponine kann durch ihre hämolytische
Wirkung beschränkt sein. Das Reinigungsverfahren, das
hier verwendet wurde, führte jedoch zu einer Absenkung der
hämolytischen und Hämagglutinationswirkung in einem Maß, daß mit
der Verbindung IV in vitro keine Hämolyse oder Hämagglutination mehr beobachtet
wurde, wenn die Verbindung in dem Konzentrationsbereich eingesetzt
wurde, der für die vollständige Wachstumshemmung
der elf wichtigsten Hefen benötigt wurde (siehe Tabelle V).
Verbindung IV war für Mäuse bei Konzentrationen
bis zu 500 µg/ml nicht toxisch und es wurde in Mäusen
keine hämolytische Wirkung bei dieser Dosis beobachtet. Dies
weist auf die praktische Bedeutung dieser Verbindung hin.
Weitere Hämolyse-Tests mit ähnlichen Ergebnissen (und sogar
verbesserten Ergebnissen im Falle der Verbindung F) wurden
mit anderen Medicagensäure-Derivaten erhalten (Tabelle VII).
Für Menschen und Tiere pathogene Hefen sind offensichtlich
von besonderem Interesse. Versuche an Einzelisolaten mit medizinisch
besonders wichtigen Hefen (C. tropicalis, C. albicans
und C. parapsilosis) ergaben, daß die Umwandlung der Verbindungen
I und IV zu ihren Methylestern (Verbindungen II bzw.
V) keinen großen Unterschied macht. Im Fall von T. glabrata,
dem zweithäufigsten Hefepilz aus Urin-Isolaten, war jedoch
die Verbindung II wirksamer als Verbindung I in einem
pH-Bereich, in dem die Deprotonierung der Medicagensäure stattfindet.
Von den vier getesteten Verbindungen war Verbindung IV
bei niedrigen pH-Werten die wirksamste gegenüber dem am meisten
patogen wirkenden Pilz C. neoformans (Tabelle VII).
Die Verbindung G2 wurde auch an klinischen Isolaten von Dermatophyten
(pathogen für Menschen und Tiere) auf
Kartoffeldextrose-Agar (PDA) getestet. Die in Tabelle VIII aufgeführten
Ergebnisse weisen auf die Nützlichkeit der Verbindung
G2 als Fungistat hin, möglicherweise in Ergänzung zu
Griseofulvin, einem Fungistat das regelmäßig gegen alle Formen
von Dermatophyten-Infektionen in Tieren und beim Menschen
eingesetzt wird.
Die MHK-Werte wurden mit der Agar-Verdünnungsmethode nach
7 Tagen bei 26°C bestimmt, die Impfmenge betrug 10⁴ Zellen/ml.
Die Versuche, bei denen Medicagensäure gegen Dermatophyten eingesetzt
wurde, wurden mit PDA-Medium durchgeführt. Die Ergebnisse sind
in Tabelle IX aufgeführt. Der einzige Fall, in dem Medicagensäure
wirksamer als die Verbindung G2 ist, ist gegenüber
T. violaceum (nur ein Stamm).
Es wurde ein Tiermodell für die Cryptococcose aufgestellt.
Als Arzneistoff wurde die Verbindung G2 eingesetzt. Für die
Konzentration, die in diesem Versuch eingesetzt wurde, genügte
ihre Löslichkeit in Wasser. Die Verdünnungen wurden daher
mit Wasser in den für die Agar-Verdünnungsmethode erforderlichen Konzentrationen
hergestellt. Die MHK-Werte wurden mit 1:2 Verdünnungsschritten
in Yeast Nitrogen Base Agar (YNB) durchgeführt.
Die in vivo-Wirkung von G2 wurde am Modell der Cryptococcose
in Mäusen bestimmt. Männlichen Albino-Mäusen mit einem Gewicht
von etwa 20 g wurden intravenös 8 × 10⁶ Cryptococcus
neoformans-Zellen injiziert. Unbehandelte Kontrolltiere starben
innerhalb einer Woche. Es ergab sich, daß im Tiermodell
100 mg/kg intraperitoneal in einer Dosis gegeben,
stark toxisch war, und alle Tiere innerhalb von 24 Stunden
starben. Eine Dosierung von 10 mg/kg erwies sich als nicht
wirksam. Eine Dosierung von 20 mg/kg war wirksam und führte zu
einer deutlichen Lebensverlängerung der so behandelten Tiere.
Ein weiterer Versuch mit der Verbindung F ergab MHK-Werte
für Cryptococcus neoformans von 20 µg/ml.
Claims (16)
1. Arzneimittel zur Verwendung als Antimykotikum in der
Human- und Tiermedizin, enthaltend eine antimykotisch
wirksame Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
in der R₁ ein Wasserstoffatom oder einen Acetylrest bedeutet,
R₂ ein Wasserstoffatom, einen Acetylrest,
β-Glucopyranose oder a-Glucopyranosyl-(1→4) β-Glucopyranose
darstellt und R₃ ein Wasserstoffatom oder
einen Niederalkylrest bedeutet, und funktionelle Derivate
davon, sowie pharmazeutisch verträgliche Träger-, Hilfs-
und Zusatzstoffe.
2. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen
Formel I R₁, R₂ und R₃ Wasserstoffatome bedeuten.
3. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen
Formel I R₁ und R₂ jeweils Wasserstoffatome bedeuten
und R₃ eine Methylgruppe darstellt.
4. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der
allgemeinen Formel I R₁ und R₂ jeweils Acetylreste bedeuten
und R₃ eine Methylgruppe darstellt.
5. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen
Formel I R₁ und R₃ Wasserstoffatome bedeuten
und R₂ β-Glucopyranose darstellt.
6. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen
Formel I R₁ ein Wasserstoffatom bedeutet, R₂
β-Glucopyranose darstellt und R₃ eine Methylgruppe bedeutet.
7. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen
Formel I R₁ und R₃ Wasserstoffatome bedeuten und R₂
α-Glucopyranosyl-(1→4)-β-Glucopyranose darstellt.
8. Mittel nach Anspruch 1, in dem der Wirkstoff eine der aus
Wurzeln der Luzerne isolierten Erzeugnisse G, G2 oder F
ist.
9. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in Dosiseinheitsform
für die orale Verabreichung oder für die Injektion.
10. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die lokale
oder topische Verabreichung.
11. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Verabreichung
als Aerosol.
12. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung
als Fungizid oder Fungistat gegen eine der folgenden Hefen:
Cryptococcus neoformans, Rhodotorula glutinis, Candida
tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida krusei,
Candida albicans, Torulopsis glabrata, Candida parapsilosis,
Torulopsis candida, Candida guilliermondii,
Greotrichum candidum, Trichophyton rubrum, Trichophyton
metagrophytes, Microsporum canis.
13. Antimykotisches Mittel, enthaltend eines der Erzeugnisse
G oder G2.
14. Fungizide und fungistatische Mittel, enthaltend eine Verbindung
der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1, zur Verwendung
in der Human- und Tiermedizin.
15. Verfahren zur Isolierung der Verbindungen G2 und F aus der
Luzerne, dadurch gekennzeichnet, daß man gemahlene Luzernewurzeln
mit Äthanol extrahiert, den Extrakt filtriert, aus
dem Filtrat das Äthanol abdampft, den Rückstand mit Äther
extrahiert, die Ätherschicht eindampft und aus dem erhaltenen
Extrakt durch Silikagel- und HPLC-Chromatographie
die gewünschten Verbindungen gewinnt.
16. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I nach
Anspruch 1 zur Behandlung von Pilzinfektionen.
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---|---|---|---|
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