DE3717280A1 - Medicagensaeure-derivate enthaltende mittel zur behandlung von pilzinfektionen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von Pilzinfektionen, die gegen eine Vielzahl von medizinisch wichtigen Pilzen eingesetzt werden können. Die Wirkstoffe der Mittel sind Verbindungen, die aus den Wurzeln der Luzerne isoliert werden können, die aber auch synthetisch hergestellt werden können, und Derivate davon. Die Wirkstoffe der erfindungsgemäßen Mittel sind bei niedrigen Konzentrationen wirksam und können in der Human- und Tiermedizin zur Hemmung des Wachstums von Pilzen und zu deren Abtötung verwendet werden.

Das Auftreten von Pilzinfektionen als Primär- oder Sekundärkrankheit ist in zunehmendem Maße zu beobachten, vor allem durch den weit verbreiteten Gebrauch von immunosuppressiven Arzneistoffen und Breitbandantibiotika. Die Entwicklung neuer Mittel zur Behandlung von Pilzinfektionen ist daher in der modernen Medizin von wesentlicher Bedeutung. Diese Entwicklung geht jedoch nur sehr langsam voran, vor allem da Pilze Eukaryonten sind und es daher schwierig ist, Mittel zu entwickeln, die nur den Pilz und nicht die Wirtszellen angreifen.

Zur Zeit steht daher nur eine relativ geringe Zahl von Arzneistoffen zur Behandlung von Pilzinfektionen zur Verfügung und die meisten dieser Stoffe sind zugleich auch toxisch. Die wichtigsten antimykotischen Arzneistoffe sind die Polyen-Makrolide und die erst kürzlich gefundenen Imidazolderivate. Beide greifen die Zellmembran an. Weitere antimykotische Wirkstoffe sind 5-Fluorcytosin, das die Nukleinsäuresynthese beeinflußt und Griseofulvin, das die Funktion der Mikrotubuli und die Zellteilung hemmt.

Beim Einsatz der antimykotischen Arzneistoffe treten mehrere Probleme auf. Dazu gehören die geringe Löslichkeit, Stabilität und Resorption von Polyen-Antibiotika und ihre hohe Toxizität, vor allem für die Niere. Kürzlich wurde eine Pilzresistenz gegen Amphotericin B beschrieben. Die Imidazole werden im Magen-Darm-Trakt gut resorbiert, aber eine langdauernde Verabreichung verursacht Änderungen und Störungen in der Leber- und Nierenfunktion. Außerdem sind sie unwirksam bei der Behandlung systemischer Mykosen. Der therapeutische Einsatz von Fluorcytosin ist wegen seines engen antimykotischen Spektrums und dem hohen Grad an Pilzresistenz gegenüber dem Arzneistoff begrenzt. Griseofulvin ist sehr wirksam gegen Dermatophyten, aber hat nur geringen oder gar keine Wirkung auf andere Pilze.

Alle diese Probleme, verbunden mit dem steigenden Auftreten systematischer Pilzinfektionen, vor allem bei gefährdeten Patienten, machen die Suche nach einer neuen Gruppe von antimykotischen Mitteln notwendig.

Saponine sind Glykoside, die in einer Vielzahl von Pflanzen vorkommen und die diesen Resistenz gegenüber Pflanzenkrankheiten verleihen. Es wurde gefunden, daß die Luzerne (Familie der Leguminosen) Saponine mit einer selektiven Toxizität gegen die bekannten pflanzenpathogenen Pilze Sclerotium rolfsii, Alternaria solani und Sclerotinia sclerotiourum enthält. Sie befinden sich hauptsächlich in der Rinde der reifen Wurzeln und schützen diese gegen das Eindringen von Pilzen. Die Wirksamkeit von Medicagensäure, dem Aglycon bestimmter Saponine aus der Luzerne, bei der Hemmung des Pilzwachstums wurde beschrieben. B. Gestetner, Y. Assa und M. Ratman, Experientia 29 (1973) 529-530, beschreiben die Wirkung von Medicagensäure und einiger ihrer Glycosid-Derivate gegen einen einzelnen pflanzenpathogenen Pilz, Sclerotium rolfsii, in einer Konzentration von 10^-4 M. Über eine Wirkung bei Pilzinfektionen von Säugern wird nicht berichtet.

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel für die Human- und Veterinärmedizin, zur Verwendung bei der Behandlung einer Vielzahl von Pilzinfektionen. Die Mittel können oral oder durch Injektionen verabreicht werden, sie können lokal oder topisch eingesetzt werden.

Die Wirkstoffe sind Medicagensäure oder deren Derivate (siehe Fig. 1) der folgenden allgemeinen Formel I

in der R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe bedeutet, R₂ ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe, β-Glucopyranose oder α-Glucopyranosyl-(1→4)-β-Glucopyranose darstellt und R₃ ein Wasserstoffatom oder einen Niederalkylrest bedeutet, und wirksame Derivate davon.

Medicagensäure und die nachstehend mit G, G2 und F bezeichneten Verbindungen bzw. Erzeugnisse können aus der Luzerne gereinigt werden. Die Erfindung betrifft auch solche Verbindungen in chemisch reiner Form und neue Derivate davon, wie sie vorstehend definiert wurden.

Die neuen Mittel haben eine niedrige hämolytische Wirkung und sind in sehr geringen Konzentrationen des Wirkstoffes wirksam.

Die Wirkstoffe zeigen eine selektive Toxizität gegenüber einer Vielzahl von klinisch wichtigen Hefen, wobei G2 die wirksamste Verbindung ist. G2 wird durch weitere Reinigung von G erhalten.

Die Erfindung betrifft antimykotische Mittel, die eine der vorstehend definierten Verbindungen enthalten.

Die antimykotischen Wirkstoffe G und G2 haben eine geringe Löslichkeit in Wasser und müssen daher in einem geeigneten Lösungsmittel oder Träger für die notwendigen hohen Konzentrationen zur Verfügung gestellt werden. Die Verbindungen sind in 0,1% Polyäthylenglykol mit 2 mM wäßrigem Natriumhydroxid löslich.

Beim Test gegen elf der wichtigsten Hefen, die besondere klinische Bedeutung haben, wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Mittel bei niedriger Konzentration eine deutliche Hemmwirkung aufweisen. Sowohl bei der Agar- als auch bei der Mediumverdünnung werden MHK-Werte von 2 bis 15 µg/ml bei Verwendung von G2 erreicht. Als empfindlichster Hefestamm erwies sich Cryptococcus neoformans mit einem mittleren MHK-Wert von 2 µg/ml. G2 weist bei niedrigen Konzentrationen eine fungizide Wirkung auf und es wurden MHK-Werte von 4 bis 24 µg/ml mit G2 erhalten. G2 ist eine relativ stabile Verbindung und kann daher als Wirkstoff in fungiziden Präparaten zur Verwendung gegen eine Vielzahl von Pilzinfektionen verwendet werden. Die Wirkung von G ist etwa um den Faktor 15 geringer, aber dieses Erzeugnis kann auch als Wirkstoff verwendet werden. Auch die anderen Substanzen weisen eine hohe antimykotische Wirkung auf.

Die neuen Mittel sind daher von beträchtlichem pharmazeutischem Wert bei der Behandlung von Pilzinfektionen in der Human- und Tiermedizin.

Schema I

Die im wesentlichen reine Substanz G2 wurde als 2-β-Hydroxy- 3-β-O-(b-D-glucopyranosyl)-Δ¹²-oleanen-23,28-dionsäure identifiziert, sie wird auch als Medicagensäure-3-O-β-D-glucopyranosid bezeichnet und hat die folgende Formel:

Die Reinigung von G, G2 und F aus der Luzernewurzel ist in Schema I dargestellt.

Die Strukturen der Verbindungen G2 und F wurden folgendermaßen bestimmt:

Nach chemischem Abbau und enzymatischer Hydrolyse wurden die Zuckeranteile erhalten. Die Verbindung G2 war ein Substrat der β-Glucosidase, aber nicht der α-Glucosidase. Die Verbindung F war ein Substrat der α-Glycosidase, aber nicht der β-Glucosidase. Die Verdauung der Verbindung F mit beiden Enzymen führte zum Aglycon (Tabelle I). Das Aglycon, sein Dimethylester und sein Dimethylesterdiacetat zeigten in der Chromatographie das gleiche Verhalten und hatten die gleichen ¹H-NMR-Spektren wie Derivate einer bekannten Medicagensäure-Probe (II bzw. III). Im Falle der Verbindung G2 wurde durch ¹³C-NMR-Spektroskopie die Aufklärung der Struktur vervollständigt, wobei festgestellt wurde, daß die glycosidische Substitution des Aglycons am C-3-Atom statt am C-2-Atom erfolgt.

Tabelle I

Bestimmung des Zuckeranteils in den Verbindungen G2 und F

Die Verbindung G2 wird normalerweise in annehmbarer Ausbeute (0,12%, siehe Schema) aus gemahlenen Wurzeln der Luzerne erhalten, der Anteil der Verbindung F ist jedoch geringer und variiert je nach Charge. Unter Umständen sind nur Spuren von F vorhanden. Daher wird die Verbindung F zur Zeit aus einem Medicagensäure- Derivat mit Hilfe der Koenigs-Knorr-Synthese (Merck-Index, 9. Aufl., S. ONR-52) synthetisiert.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel sind in einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel für die topische Anwendung geeignet. Sie können auch oral oder durch Injektion verabreicht werden. Zu den geeigneten Arzneimittelformen gehören orale Tabletten, Lotionen, Cremes, Salben, Pulver für die topische Anwendung, lyophilisierte Pulver zur Verdünnung und Injektion, orale Gelzubereitung, Vanigalsuppositorien, Pulver oder Suspensionen für Aerosole. Bei den topischen Präparaten macht der Wirkstoff im allgemeinen etwa 0,2 bis etwa 2 Gewichtsprozent aus. Die Dosiseinheitsformen liefern im allgemeinen etwa 0,1 bis etwa 2 g des Wirkstoffes pro kg Körpergewicht pro Tag.

Herstellungsbeispiel

200 g gemahlene Wurzeln der Luzerne (Medicago sativa L. Gilboa- Art vom RAM-Gut, Beer-Sheva) werden mit 2,5 Liter 80prozentigem Äthanol in Wasser 16 Stunden bei 60°C extrahiert. Der Feststoff wird abfiltriert und das Äthanol unter vermindertem Druck abgedampft. Die erhaltene wäßrige Lösung wird dreimal mit je 400 ml Diäthyläther extrahiert, der anschließend unter vermindertem Druck entfernt wird. Der Extrakt wird an 6 g Silikagel (Merck, 0,210-0,068 mm, 70-230 mesh, ASTM) adsorbiert und dann in 2-g-Portionen auf das gleiche Adsorbens (150 g) aufgebracht und mit 350 ml Essigsäureäthylester-Wasser-Essigsäure (7:2:2) chromatographiert. Die Fraktionen, die in der Dünnschichtchromatographie (durchgeführt auf Merck-Silika 60-F₂₅₄-Platten, als Laufmittel Essigsäureäthylester zu Wasser zu Essigsäure = 7:2:2, Entwickeln durch Sprühen mit H₂SO₄ (5% in Äthanol) und Erhitzen auf 100°C (für 10 min) den typischen blauen Fleck mit einem R_f-Wert von 0,75 zeigten, werden vereinigt, die Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand in 5 ml Wasser resuspendiert und dann lyophylisiert. Es werden etwa 300 mg des Erzeugnisses G erhalten.

Zur weiteren Reinigung werden Fraktionen des ersten Chromatographieschrittes, die G und F enthalten, an 2 g Silikagel (Merck, 0,210-0,068 mm, 70-230 mesh, ASTM) adsorbiert und weiter gereinigt, indem sie auf eine Flash-Chromatographiesäule (15 g Silicagel 60, Merck, 0,068-0,037 mm, 230-400 mesh, ASTM) aufgegeben und nacheinander mit Essigsäureäthylester-Methanol (4:1, 2:1, 1:11) (jede Fraktion 250 ml) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min eluiert werden. Fraktionen, die G oder F enthalten (R_f = 0,75 bei der Dünnschichtchromatographie) werden vereinigt und in 20- bis 40-mg-Proben auf eine präparative HPLC-Säule aufgegeben. Die Elution erfolgt mit einem Gradienten von Methanol-Wasser im Bereich von 70 bis 85% im Zeitraum von 60 Minuten. 4-ml-Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie geprüft, solche, die G2 enthalten, werden weiter durch Hochleistungsdünnschichtchromatographie getestet (durchgeführt auf Merck RP-18-F₂₅₄-Platten, als Laufmittel Methanol zu Wasser = 4:1, Entwickeln wie Dünnschichtplatten). Fraktionen, die einen einzigen blauen Fleck mit einem R_f-Wert von 0,28 aufweisen, werden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und lyophylisiert. Es wird ein weißer amorpher Feststoff erhalten (G2) mit einem F. von 251-254°C; [α] = +70,6° (Äthanol). Die Verbindung ist Medicagensäure-3-O-β-D-Glucopyranosid (IV), (Literatur-F. 253-254°C; [α] _D = +70°). Fraktionen, die F enthalten (R_f = 0,60 in der Dünnschichtchromatographie, R_f = 0,42 in der Hochleistungsdünnschichtchromatographie), werden ebenfalls konzentriert und lyophylisiert. Es wird die Verbindung F, nämlich Medicagensäure-3-O-β-D-maltosid (VI) in amorphem Zustand erhalten.

Herstellung des Arzneimittels

Das antimykotische Mittel hat eine geringe Löslichkeit in Wasser. Daher wurde eine Lösung von 0,1% Polyäthylenglykol (Molekulargewicht 20 000, Sigma, St. Louis, Mo) in 2 mM Natriumhydroxid zur Lösung von G und G2 verwendet. Geeignete arzneistoffreie Lösungen wurden als Kontrollen in jedem Test eingesetzt. Die Konzentration des Arzneistoffes in der Stammlösung betrug 2,5 mg/ml. Da der Arzneistoff hitzebeständig ist, wurde er bei 121°C 15 Minuten autoklaviert. Die Verdünnungen des Arzneistoffes wurden mit sterilen destilliertem Wasser hergestellt.

Hämagglutinations- und Hämolyse-Test

Erythocyten (RBC) verschiedener Herkunft wurden mit Citrat als Anticoagulans resuspendiert und viermal mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) pH 7,2 in einer klinischen Zentrifuge gewaschen und schließlich im gleichen Puffer zu einer Konzentration von 2% (Volumen/Volumen) resuspendiert.

Mit Hilfe eines automatischen Verdünners wurde eine Reihenverdünnung des antimykotischen Mittels in PBS hergestellt. Die Verdünnungen wurden in Mikrotiterplatten durchgeführt. Jedes Näpfchen enthielt 50 µl einer Verdünnung und wurde mit dem gleichen Volumen RBC versetzt. Hämolyse und Hämagglutination wurden nach 1stündiger Inkubation bei 37°C und einer weiteren Inkubation für 24 Stunden in der Kälte makroskopisch bestimmt. Eine partielle Hämolyse wurde als Endpunkt angesehen.

Empfindlichkeitstest mit der Agar-Verdünnungsmethode

Die verwendeten Hefen stammen von klinischen Proben, die von Patienten isoliert wurden. Pro Patient wurde ein Isolat untersucht. Die Hefearten wurden nach üblichen Verfahren identifiziert. Die Isolate wurden bis zu den Versuchen auf Sabourand- Dextrose-Agar (SDA) gehalten. Von über Nacht bei 30°C auf Sabourand-Dextrose-Agar (SDA) gewachsenen Hefekulturen wurden Suspensionen hergestellt und mit sterilem destilliertem Wasser mit Hilfe eines Hämacytometers auf eine Konzentration von 10¹⁵ Zellen/ml verdünnt. Vom Arzneistoff wurden geeignete Verdünnungen mit sterilem Wasser in einem Endvolumen von 1 ml hergestellt. Jeweils 1 ml der Arzneistofflösung wurde zu 3 ml 3prozentigem, sterilem, verflüssigtem Noble-Agar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) zugesetzt, und nach Kühlung auf 50°C mit 0,5 ml 10fach konzentriertem, nicht gepuffertem sterilem YNB (Yeast Nitrogen Base)-Medium (Difco) und 0,5 ml 20prozentiger Glucose versetzt. Der pH-Wert betrug 5,1. Nach gründlichem Mischen wurde das Agarmedium auf 60×15 mm große sterile Petrischalen verteilt. Die Platten wurden ohne Deckel 15 Minuten in einer Sterilbank getrocknet und konnten bei 4°C 2 Wochen aufbewahrt werden. Jeweils 10 µl der Hefesuspension wurden mit einer Mikropipette in Agarplatten gegeben, die verschiedene Konzentrationen des Arzneistoffes enthielten, so daß sich eine Impfmenge von 10³ Zellen pro 10 µl-Tropfen ergab. Auf eine einzelne Platte konnten 7 Tropfen aufgegeben werden, ohne daß eine gegenseitige Störung auftrat. Die beimpften Platten wurden bei 30°C inkubiert. Bei jedem Test wurden auch zwei arzneistofffreie Kontrollen durchgeführt, wobei eine das Lösungsmittel für den Arzneistoff enthielt und die andere als Wachstumskontrolle verwendet wurde. Um einen verwertbaren Test mit den Proben zu erhalten, mußten beide Kontrollplatten Wachstum zeigen. Zusätzlich wurde ein geeigneter Kontrollorganismus (Candida tropicalis 908), dessen Empfindlichkeit bekannt war, jeder Platte zugesetzt. Die Inkubationszeit hing von der Schnelligkeit des Wachstums ab. Die Ergebnisse wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation bei 30°C bestimmt. Jeder Test wurde mindestens zweimal durchgeführt. Der MHK-Wert wurde definiert als die niedrigste Konzentration des Arzneistoffes, die makroskopisches Wachstum der Kolonien verhinderte. Trübungen wurden als negativ angesehen.

Wenn in Tests die Wirkung des pH-Wertes geprüft wurde, so wurden die folgenden Puffer zum nicht-gepufferten YNB-Medium zugesetzt: 20 mM KH₂PO₄ pH 7 für einen pH-Wert von 7, 10 mM KH₂PO₄ pH 7 für einen pH-Wert von 6,5 und 20 mM MES pH 6,1 für einen pH-Wert von 6,0.

Empfindlichkeitstest mit der Medium-Verdünnungsmethode

Hefekulturen wurden über Nacht auf SDA bei 30°C wachsen gelassen. Diese Kulturen wurden resuspendiert und zu einer Endkonzentration von 10³, 10⁴ und 10⁵ Zellen/ml mit Hilfe eines Hemacytometers verdünnt. Die Verdünnungen wurden in YNB-Medium (Difco) hergestellt, Glucose zugesetzt und der pH auf einen Wert von 6,5 mit 10 mM KH₂PO₄ pH 7 eingestellt. Nach Wachstum über Nacht in einem Schüttler bei 30°C, wurden Kulturen in der log-Phase (weniger als 25% Transmission bei 530 nm) für den Empfindlichkeitstest eingesetzt. Der Test wurde in Teströhrchen durchgeführt, die verschiedene Konzentrationen des antimykotischen Mittels in 3 ml nicht-gepuffertem YNB-Medium (pH 5,1, mit 2% Glucose) enthielten.

Die Impfmenge betrug 10³ bis 10⁵ Zellen/ml einer log-Phasenkultur, je nachdem, welcher Stamm verwendet wurde. Zwei Röhrchen, die arzneistofffreies Medium und die jeweilige Impfmenge enthielten, wurden als Kontrollen verwendet. Alle Röhrchen wurden mit einem lose sitzenden Deckel verschlossen und bei 30°C in einem Schüttler inkubiert.

Nach Inkubation über Nacht wurde die Empfindlichkeit nur dann bestimmt, wenn die Kultur in den Kontrollröhrchen nicht weniger als 25% Transmission bei 530 nm ergab. Der MHK-Wert wurde visuell als die niedrigste Arzneistoffkonzentration, die klar blieb, bestimmt. Die Hemmkonzentration (IC₅₀) wurde spektrophotometrisch als die niedrigste Arzneistoffkonzentration bestimmt, die folgende Gleichung erfüllte:
%T %T Kontrolle + 0,5 (100% - %T-Kontrolle),
wobei %T = %Transmission bei 530 nm und Kontrolle = arzneimittelfreies Röhrchen bedeutet.

Die minimale fungizide Konzentration (MFC) wurde durch Bestimmen der koloniebildenden Einheiten (colony forming units (CFU)) auf SDA ermittelt. Drei Aliquots von 50 µl, die unmittelbar nach dem Mischen von der anfänglichen Impfmenge in den Kontrollröhrchen und direkt nach der Bestimmung des MHK-Wertes aus den Röhrchen, die kein Wachstum zeigten, erhalten wurden, wurden erneut auf SDA kultiviert. Der MFC-Wert wurde als die niedrigste Konzentration des Arzneistoffes bestimmt, bei der die Subkultivierung negativ verlief.

Kinetik der Abtötung

Die kinetischen Messungen der Abtötung wurden in 10 ml nicht gepuffertem YNB-Medium, das mit Glucose ergänzt war und die geeignete Arzneistoffkonzentration enthielt, durchgeführt. Die Hefe-Impfmenge wurde hergestellt, wie es im Empfindlichkeitstest mit der Mediumverdünnungsmethode beschrieben ist, so daß eine Endkonzentration von 10⁵ Zellen/ml vorlag. Der Versuch wurde bei 30°C in einem Schüttelwasserbad durchgeführt. 0,4 ml Proben wurden in regelmäßigen Zeitabständen entnommen. Drei Aliquots von 50 µl von geeigneter Verdünnung wurden auf SDA geimpft, um die CFU zu testen. In anderen Versuchen wurden die Proben für die CFU-Bestimmung zweimal mit dem YNB-Medium gewaschen, um das antimykotische Mittel zu entfernen, bevor für weiteres Wachstum erneut beimpft wurde.

Tabelle II

Vergleich der antimykotischen Wirkung von G und G2 a)

Tabelle III

Hämolyse- und Hämagglutinations-Eigenschaften des antimykotischen Mittels G2 a)

Tabelle IV

Tabelle V

MHK-Werte von G2 gegen verschiedene Hefe-Arten a)

Tabelle VI

IC₅₀, MHK und MFC-Werte von G2 gegen verschiedene Hefe- Arten a)

Die klinische Verwendung der Saponine kann durch ihre hämolytische Wirkung beschränkt sein. Das Reinigungsverfahren, das hier verwendet wurde, führte jedoch zu einer Absenkung der hämolytischen und Hämagglutinationswirkung in einem Maß, daß mit der Verbindung IV in vitro keine Hämolyse oder Hämagglutination mehr beobachtet wurde, wenn die Verbindung in dem Konzentrationsbereich eingesetzt wurde, der für die vollständige Wachstumshemmung der elf wichtigsten Hefen benötigt wurde (siehe Tabelle V).

Verbindung IV war für Mäuse bei Konzentrationen bis zu 500 µg/ml nicht toxisch und es wurde in Mäusen keine hämolytische Wirkung bei dieser Dosis beobachtet. Dies weist auf die praktische Bedeutung dieser Verbindung hin. Weitere Hämolyse-Tests mit ähnlichen Ergebnissen (und sogar verbesserten Ergebnissen im Falle der Verbindung F) wurden mit anderen Medicagensäure-Derivaten erhalten (Tabelle VII).

Für Menschen und Tiere pathogene Hefen sind offensichtlich von besonderem Interesse. Versuche an Einzelisolaten mit medizinisch besonders wichtigen Hefen (C. tropicalis, C. albicans und C. parapsilosis) ergaben, daß die Umwandlung der Verbindungen I und IV zu ihren Methylestern (Verbindungen II bzw. V) keinen großen Unterschied macht. Im Fall von T. glabrata, dem zweithäufigsten Hefepilz aus Urin-Isolaten, war jedoch die Verbindung II wirksamer als Verbindung I in einem pH-Bereich, in dem die Deprotonierung der Medicagensäure stattfindet. Von den vier getesteten Verbindungen war Verbindung IV bei niedrigen pH-Werten die wirksamste gegenüber dem am meisten patogen wirkenden Pilz C. neoformans (Tabelle VII).

Die Verbindung G2 wurde auch an klinischen Isolaten von Dermatophyten (pathogen für Menschen und Tiere) auf Kartoffeldextrose-Agar (PDA) getestet. Die in Tabelle VIII aufgeführten Ergebnisse weisen auf die Nützlichkeit der Verbindung G2 als Fungistat hin, möglicherweise in Ergänzung zu Griseofulvin, einem Fungistat das regelmäßig gegen alle Formen von Dermatophyten-Infektionen in Tieren und beim Menschen eingesetzt wird.

Tabelle VII

MHK-Werte von Medicagensäure-Derivaten gegen C. neoformans und T. glabrata a)

Tabelle VIII

MHK-Werte von G2 gegen verschiedene Dermatophyten-Arten

Die MHK-Werte wurden mit der Agar-Verdünnungsmethode nach 7 Tagen bei 26°C bestimmt, die Impfmenge betrug 10⁴ Zellen/ml.

Die Versuche, bei denen Medicagensäure gegen Dermatophyten eingesetzt wurde, wurden mit PDA-Medium durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX aufgeführt. Der einzige Fall, in dem Medicagensäure wirksamer als die Verbindung G2 ist, ist gegenüber T. violaceum (nur ein Stamm).

Tabelle IX

Antimykotische Wirkung von Medicansäure gegen Dermatophyten

Tiermodell

Es wurde ein Tiermodell für die Cryptococcose aufgestellt. Als Arzneistoff wurde die Verbindung G2 eingesetzt. Für die Konzentration, die in diesem Versuch eingesetzt wurde, genügte ihre Löslichkeit in Wasser. Die Verdünnungen wurden daher mit Wasser in den für die Agar-Verdünnungsmethode erforderlichen Konzentrationen hergestellt. Die MHK-Werte wurden mit 1:2 Verdünnungsschritten in Yeast Nitrogen Base Agar (YNB) durchgeführt.

Die in vivo-Wirkung von G2 wurde am Modell der Cryptococcose in Mäusen bestimmt. Männlichen Albino-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g wurden intravenös 8 × 10⁶ Cryptococcus neoformans-Zellen injiziert. Unbehandelte Kontrolltiere starben innerhalb einer Woche. Es ergab sich, daß im Tiermodell 100 mg/kg intraperitoneal in einer Dosis gegeben, stark toxisch war, und alle Tiere innerhalb von 24 Stunden starben. Eine Dosierung von 10 mg/kg erwies sich als nicht wirksam. Eine Dosierung von 20 mg/kg war wirksam und führte zu einer deutlichen Lebensverlängerung der so behandelten Tiere.

Ein weiterer Versuch mit der Verbindung F ergab MHK-Werte für Cryptococcus neoformans von 20 µg/ml.

Claims (16)

1. Arzneimittel zur Verwendung als Antimykotikum in der Human- und Tiermedizin, enthaltend eine antimykotisch wirksame Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) in der R₁ ein Wasserstoffatom oder einen Acetylrest bedeutet, R₂ ein Wasserstoffatom, einen Acetylrest, β-Glucopyranose oder a-Glucopyranosyl-(1→4) β-Glucopyranose darstellt und R₃ ein Wasserstoffatom oder einen Niederalkylrest bedeutet, und funktionelle Derivate davon, sowie pharmazeutisch verträgliche Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffe.

2. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen Formel I R₁, R₂ und R₃ Wasserstoffatome bedeuten.

3. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen Formel I R₁ und R₂ jeweils Wasserstoffatome bedeuten und R₃ eine Methylgruppe darstellt.

4. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen Formel I R₁ und R₂ jeweils Acetylreste bedeuten und R₃ eine Methylgruppe darstellt.

5. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen Formel I R₁ und R₃ Wasserstoffatome bedeuten und R₂ β-Glucopyranose darstellt.

6. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen Formel I R₁ ein Wasserstoffatom bedeutet, R₂ β-Glucopyranose darstellt und R₃ eine Methylgruppe bedeutet.

7. Mittel nach Anspruch 1, in dem in der Verbindung der allgemeinen Formel I R₁ und R₃ Wasserstoffatome bedeuten und R₂ α-Glucopyranosyl-(1→4)-β-Glucopyranose darstellt.

8. Mittel nach Anspruch 1, in dem der Wirkstoff eine der aus Wurzeln der Luzerne isolierten Erzeugnisse G, G2 oder F ist.

9. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in Dosiseinheitsform für die orale Verabreichung oder für die Injektion.

10. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die lokale oder topische Verabreichung.

11. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Verabreichung als Aerosol.

12. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung als Fungizid oder Fungistat gegen eine der folgenden Hefen: Cryptococcus neoformans, Rhodotorula glutinis, Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Candida parapsilosis, Torulopsis candida, Candida guilliermondii, Greotrichum candidum, Trichophyton rubrum, Trichophyton metagrophytes, Microsporum canis.

13. Antimykotisches Mittel, enthaltend eines der Erzeugnisse G oder G2.

14. Fungizide und fungistatische Mittel, enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1, zur Verwendung in der Human- und Tiermedizin.

15. Verfahren zur Isolierung der Verbindungen G2 und F aus der Luzerne, dadurch gekennzeichnet, daß man gemahlene Luzernewurzeln mit Äthanol extrahiert, den Extrakt filtriert, aus dem Filtrat das Äthanol abdampft, den Rückstand mit Äther extrahiert, die Ätherschicht eindampft und aus dem erhaltenen Extrakt durch Silikagel- und HPLC-Chromatographie die gewünschten Verbindungen gewinnt.

16. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1 zur Behandlung von Pilzinfektionen.